Protocolo de Extrao de DNA de folhas de feijoeiro (Miniprep) (Modificado de Doyle & Doyle, BRL Focus 12:13-15, 1990) 1) Pesar

200 a 300 mg de folha congelada e macerar em nitrognio lquido, utilizando almofariz de porcelana previamente congelado, at o tecido virar p. Transferir o p para microtubos eppendorf (1,5ml) congelados, devidamente marcados. Procurar fazer este passo o mais rpido possvel para evitar oxidao. OBS. Resfriar o tubo e a esptula em N2 lquido. 2) Adicionar 650-800 l de tampo de extrao previamente aquecido a 65oC e incubar os tubos em banho-maria a 65oC por 30-40 min. Durante a incubao, agitar suavemente os tubos a cada 10 min. 3) Retirar os tubos do banho-maria e deixar esfriar temperatura ambiente. Centrifugar por aprox. 5 min a 14000 rpm (microcentrfuga Eppendorf) e transferir o sobrenadante para novos tubos, tambm marcados. 4) Adicionar ao sobrenadante 650-800 l de clorofrmio-lcool isoamlico (24:1), agitar o tubo por suaves inverses por aprox. 10 min at ficar turvo. Centrifugar como no passo 3. 5) Transferir a fase superior (aquosa) para novo tubo devidamente identificado, tendo cuidado de no transferir a interfase e a fase inferior. Utilizar, para isso, micropipeta de 200 ou de 1000 l, com ponteiras cortadas para facililtar a operao.
6) Adicionar 650-800 l de clorofrmio-lcool isoamlico (24:1) ao sobrenadante. Agitar os tubos e centrifugar como no passo 3.

7)Transferir a fase superior (aquosa) para um novo tubo e adicionar 2/3 do volume de isopropanol gelado. Inverter suavemente os tubos algumas vezes e incub-los a -20oC por 2-3 horas ou 4oC durante a noite. 8) Centrifugar por 10 min a 14000 rpm. Um precipitado branco* dever se formar no fundo do tubo. Remover o sobrenadante. Lavar este precipitado 1-2 vezes com etanol 70% para retirar o sal presente, e uma vez com etanol 95%. Secar o precipitado temperatura ambiente por 15-20 minutos.
* - Obs. Ocasionalmente o pellet obtido se apresenta muito grande, viscoso e/ou escuro, o que sinal de excesso de contaminantes. Para se obter um DNA mais limpo, pode se usar uma lavagem adicional com sal que freqentemente auxilia na remoo de protenas e polissacardeos agregados. Para isso, adicione ao pellet 500 l de uma soluo 1M NaCl. Dissolva o pellet ao mximo, mesmo que para isso sejanecesrio aquecer o tubo em banhomaria a 60-65oC por alguns minutos. A este ponto, o DNA estar necessariamente em soluo e o que no entrar em soluo consiste basicamente de contaminantes indesejveis. Incube o tubo a 4oC por 30 a 60 minutos. Em seguida centrifugue o tubo a velocidade mxima (12 a 15000 rpm) por 10 minutos, se possvel a 4oC. Neste ponto o DNA estar em soluo e o material que precipitar ser contaminante indesejvel. Retire o sobrenadante para um novo tubo e promova a precipitao do DNA adicionando 2/3 do volume (~ 350 l) de isopropanol e faa duas lavagens subsequentes com etanol 70%. FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introduo ao uso de marcadores moleculares em

anlise gentica. 2.ed. Braslia: EMBRAPA, CENARGEN, 1996. 220p. (Documento, 20)

9) Ressuspender o precipitado em 200-300 l de TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0) contendo RNAse na concentrao final de 40 g/ml. 10) Incubar em banho-maria a 37oC por 30 min. Todo o DNA deve estar ressuspenso ao final deste passo. 11) Adicionar NaCl 5M na proporo de 1:10 (NaCl : DNA ressuspenso). Adicionar 2/3 do volume de isopropanol gelado para precipitar o DNA novamente. 12) Incubar em geladeira a 4oC durante a noite ou a -20oC por 3 horas. 13) Repetir o item 8 e ressuspender o precipitado final em 200-300 l de TE. 14) Preparar um minigel (0,8% de agarose) e aplicar 10 l de soluo de DNA (+ 3 l de corante tipo IV) para verificar sua qualidade. 15) Quantificar o DNA em espectro fotmetro.

Tampo de extrao:
Estoque

Conc. Final 1% 1,4M 20mM 100mM 1% 0,1% -

P/ 15ml 3ml 4,2ml 0,6ml 1,5ml 0,15g 15 l

Completar o volume p/ 15ml

CTAB 5% NaCl 5M EDTA 0,5M Tris-HCl (pH8) 1,0M PVP* slido -Mercaptoetanol H2O *PVP polivinilpirrolidona