Sistemas selectivos que permiten el crecimiento de mutantes deseadas e impiden el crecimiento de las silvestres Ejplo: detectar mutaciones que

causen reversin de fenotipos auxtrofo a prottrofo Auxotrfo para adenina: se hacen crecer en medio con A, luego se siembra en M.M sin A, las nicas que crecen son las prototrfas para A, que surgen por mutacin reversa. ad------ad+

Bacteria sensible a penicilina, se manifiesta en su estado proliferativo

Se aade pen a cell en M liquido, todas las prototrofas mueren, las auxotrofas sobreviven (resistentes)

La penicilina se elimina lavando las cells sobre un filtro

Se obtienen muchos tipos de mutaciones auxotroficas, pero en medios diferentes c/u con suplementos especificos puede averiguarse el requerimiento de cada auxotrofo

1.

Replica su propio DNA pudindose mantener en una poblacin de clulas en divisin

2.

Las cells portadoras del plsmido F sintetizan el pili (singular: pilus), los pili son minsculos tbulos proteicos que le permiten a la cell F+ adherirse a otras cells, mantenerse en contacto y conjugar

Las cells F+ y F- pueden conjugar, F+ acta como donante de F El DNA del plsmido F se replica y la molcula recin sintetizada es transferida al recipiente F La cell recipiente se convierte en F+ La transferencia es instantnea y el plsmido F puede propagarse rapida/ en la poblacin de una bacteria a otra
3.

1. El crs Hfr libera una molecula de DNA monocatenario que se transfiere linealmente a la cell F2. Los genes proximos al origen se transfieren primero, el factor F se transfiere al finsal, pero en la mayoria de las cells la transferencia cesa antes de la entrada del factor F

3. Dentro de la cell F-, el DNA monocatenario se convierte en doble cadena (exogenote)

4. Como el exogenote y el endogenote son homologos puede existir la recombinacin donde se integra una parte del genoma donante dentro del recipiente

El gen contraselectivo str debe estar prximo al factor F, para que no entre a la cell FEstirpes parentales Hfr Strs azir gal+ lac+ tonr F Strr azis gallac-tons Resultados: El gen azir es el primero en detectarse entra a los 8min Seguidos de tonr(10min), lac+(17min), gal+(25min)

 Los alelos transferidos al principio se encuentran en un alto % de exconjugantes F Los alelos tardios solo se encuentran en una pequea proporcin: esto se debe a que la transferencia cesa espontanea/ o a que el crs se parte Este exp permite deducir las posiciones relativas de los genes, sin embargo la regin cromosmica que contiene estos loci podra ser solo una pqa porcin del crs Para obtener el mapa cpto se deben realizar mltiples exp de conjugacin interrumpida

Para cartografiar 3 genes (met, arg y leu) por fcias de recombinacin tenemos que pensar en un merocigoto que sea heterocigoto para los 3 alelos Esto se consigue si mediante el anlisis de conjugacin interrumpida, podemos establecer que gen entra de ultimo El ltimo gen que transfiere la Hfr se selecciona entre los exconjugantes FAl seleccionar el ltimo gen sabemos que los otros 2 tambin deben estar en el merocigoto

Si a partir de los exp de conjugacin interrumpida conocemos el orden de los genes: primero met y luego arg y leu. El merocigoto de este cruzamiento es:

El ltimo gen que entra es leu+, as que seleccionamos los exconjugantes leu+: se siembra en un medio que contiene met y arg pero no leu

A continuacin se calculan las distancias en el mapa. Una unidad de mapa=una fcia de recombinacin de 1% Se mide la proporcin de exconjugantes totales leu+, independientes de como sean los otros marcadores Para que leu+ se integre debe haber ocurrido un doble entrecruzamiento: uno a la izquierda del gen leu, el otro puede producirse en cualquier punto a la derecha del gen.

Los genotipos resultantes son: De la recombinacin de leu y arg: leu+,arg-,met+; el % de bacterias con este genotipo nos indica el valor de la fcia de recombinacin para el intervalo leu-arg Entre los loci met y arg y que sean leu+: leu+, arg+, met Los recombinantes leu+, arg-,met+; requieren 4 entrecruzamientos en lugar de 2 por lo que son infrecuentes

Si al contar el % de bacterias obtenemos:

Podemos deducir que: La distancia entre leu y arg es de 4 unidades mapa La distancia entre arg y met es de 9 unidades mapa

A mayor DNA strr utilizado, mayor obtencin de transformant es strr entre las cells strs

Se infecta una cell bacteriana con 2 fagos gentica/ diferentes para facilitar la recombinacin entre ellos y la segregacin de marcadores Ejemplo: 2 fagos T con genotipos h-r+ y h+rh-: infecta 2 estirpes diferentes de E. coli (estirpe 1 y 2) h+: infecta exclusivamente la estirpe 1 r-: lisa la cell con rapidez, halos grandes r+: lisa la cell lentamente, halos pequeos

Se cruzan los 2 fagos parentales T2 en la estirpe 1 de E.coli, con una relacin fago: bacterias suficientemente alta para asegurar que una gran proporcin de cells sean infectadas simultneamente por ambos tipos de fagos

El lisado de los fagos (descendencia) se analiza en cultivo mixto de estirpes 1 y 2 de E.coli Pueden distinguirse 4 tipos de halos

Estos 4 genotipos pueden clasificarse como parentales (h-r+ y h+r-) y recombinantes (h+r+ y h-r-) Se puede calcular la frecuencia de recombinacin: RF= (h+r+) + (h-r-) # de halos totales

 1.

2.

El cromosoma de este fago en estado libre es circular. El sitio de integracin se alinea con un sitio del cromosoma bacteriano situado entre los genes gal y bio en el caso del fago Tiene lugar un entrecruzamiento recproco entre el fago circular y el crs de la bacteria, cuyo resultado es la integracin del fago en el crs de E.coli La integracin que convierte al fago en profago aumenta la distancia gentica entre los marcadores bacterianos situados a ambos lados de la insercin Esta integracin es promovida por los genes del fago y no por el sistema de recombinacin bacteriana.

1. Se deja que el fago P1 infecte una estirpe donante met+, arg+

2. Recoger los fagos descendientes para infectar una estirpe recipiente de genotipo met-, arg-

3. Se selecciona un alelo donante (ejplo met+) sembrando las cells en medio sin metionina. Las colonias met+ se utilizan para analizar el marcador no seleccionado, comprobando que proporcin de ellas es tambin arg+

4. De esta manera determinamos el % de cotransductantes met+ arg+

El grado de ligamiento se expresa como frecuencias de cotransduccin Si 20 de las colonias met+ resulta ser tambin arg+ ( es decir, 20% son met+ arg+, el 80% restante son met+ arg-) Entonces la frecuencia de cotransduccin es del 20% Los cotransductantes met+arg+ deben haberse originado de un fragmento de DNA transducido que contena ambos genes. Los cuales se integraron a la vez en el cromosoma de la estirpe recipiente mediante 2 entrecruzamientos, uno a cada lado de ambos loci Los transductantes met+ arg- surgen de un fragmento transducido que no inclua el locus arg+ o por que los 2 entrecruzamientos se produjeron a los lados de solo el locus met A mayor frecuencia de cotransduccin, ms cercanos estarn los loci y menor ser la distancia de ellos en el mapa

1.

4 estirpes Hfr de E.coli transfieren los siguientes marcadores en el orden que se indica:

Las 4 estirpes derivan de la misma cepa F+. Cual es el orden de estos marcadores en el crs circular de la estirpe F+ original

2.

Se utiliza un fago transductor generalizado para transducir una estirpe recipiente de E.coli: a-, b-, c-, d-, e- con una donante a+, b+, c+, d+, e+. El cultivo recipiente se siembra en varios medios diferentes. (el alelo a- determina que la cell requiere el nutriente A para crecer y sucesivamente/. Que puede concluirse sobre el ligamiento y orden de los genes?

En un experimento de transduccin se recogen fagos de una estirpe donante de E.coli cys+ leu+ thr+ y se utilizan para transducir una recipiente cys- leu- thr-. La poblacin recipiente se siembra en M.M + leu y thr. Se obtienen muchas colonias. a. Cuales son los genotipos posibles de estas colonias b. Se replican esas colonias en 3 medios diferentes, que genotipos pueden crecer? 1. M.M + thr 2. M.M + leu 3. M.M c. Cuales son los genotipos reales que crecen en 1, 2 y 3. tenga en cuenta el 56% crece en 1, el 5% crece en 2, en M.M no crece nada d. Haga un mapa e indique el orden de los 3 genes y cual de los 2 genes esta ms prximo al central.
3.

1.

4 estirpes Hfr de E.coli transfieren los siguientes marcadores en el orden que se indica:

Las 4 estirpes derivan de la misma cepa F+. Cual es el orden de estos marcadores en el crs circular de la estirpe F+ original SOLUCIN

El orden del mapa circular es: MZXWCNALBRUMZ

1.

Se utiliza un fago transductor generalizado para transducir una estirpe recipiente de E.coli: a-, b-, c-, d-, e- con una donante a+, b+, c+, d+, e+. El cultivo recipiente se siembra en varios medios diferentes. (el alelo a- determina que la cell requiere el nutriente A para crecer y sucesivamente/. Que puede concluirse sobre el ligamiento y orden de los genes?

SOLUCIN Donde se obtuvo presencia de colonias significa que la bacteria recibi el alelo del compuesto que no se adicion al medio, mediante transduccin asi que: El cultivo BCE recibi a+d+ BCD a+e+ ABD c+e+ El orden es: d+ a+ e+ c+ B no cotransduce nunca y debe estar distanciado de este grupo de genes

En un experimento de transduccin se recogen fagos de una estirpe donante de E.coli cys+ leu+ thr+ y se utilizan para transducir una recipiente cys- leu- thr-. La poblacin recipiente se siembra en M.M + leu y thr. Se obtienen muchas colonias. a. Cuales son los genotipos posibles de estas colonias Como el medio se suplement con leu y thr y crecieron muchas colonias, eso indica que las cells pueden producir cys, todas son cys+ y pueden ser o + para leu y thr asi: cys+ leu-thrcys+leu-thr+ cys+ leu+thr+ cys+leu+thrb. Se replican esas colonias en 3 medios diferentes, que genotipos pueden crecer? 1. M.M + thr: cys+ leu+ thr+; cys+ leu+ thr2. M.M + leu: cys+ leu+ thr+; cys+ leu- thr3. M.M: cys+ leu+ thr+ c. Cuales son los genotipos reales que crecen en 1, 2 y 3. tenga en cuenta el 56% crece en 1, el 5% crece en 2, en M.M no crece nada 1: cys+ le+ thr2: cys+ leu- thrLos restantes son cys+ leu- thr- que corresponde al 39% d. Haga un mapa e indique el orden de los 3 genes y cual de los 2 genes esta ms prximo al central. El gen que todos poseen es el central (cys), como todos fueron thr- es el ms lejano
3.