Laboratorio Biologia: Enzimas Objetivos:

Comprender los mecanismos de accin enzimtica.

Conocer en ejemplos prcticos las funciones enzimticas.

Introduccin:

Las enzimas son protenas pero no todas las protenas son enzimas. Son especficas para actuar sobre un sustrato con el fin de acelerar la reaccin qumica que lo transforma. Esa especificidad est determinada por la obligacin de que la enzima y sustrato sean complementarios molecularmente. De acuerdo a su modo de accin tenemos las hidrolasas, lipasas, deshidrogenasas, descarboxilasas, isomerasas y las transferasas.

Como protenas algunos factores como las temperaturas altas las desnaturalizan en tanto las temperaturas bajas las inhiben. Los cidos y las bases fuertes tambin las pueden desnaturalizar. Un exceso de sustrato logra que la actividad enzimtica disminuya.

Las enzimas logran que nutrientes como protenas, triacilgliceridos y carbohidratos sean degradados en sus unidades bsicas.

En la saliva humana encontramos una enzima de tipo amilasa llamada ptialina que se encarga de degradar almidones en molculas de maltosa.

En el duodeno se encuentra la pepsina que acta a un pH2 para degradar pptidos.

En el hgado encontramos la catalasa enzima que acta sobre el perxido de hidrogeno (H2O2) que se acumula por el metabolismo. La catalasa la transforma en agua y oxigeno.

La renina es una enzima animal que acta sobre la casena de la leche hidrolizando los enlaces fosfoamidicos.

La tripsina se produce en el pncreas y tambin en vegetales como la pia. Es una proteasa. En la papaya encontramos la papana que es una proteasa.

Materiales:

Jugo de papaya, jugo de pia, hgado frescos, hgado cocinado, solucin de almidn, saliva fresca, leche, pastillas de cuajo (renina 1%), perxido de hidrogeno, tubos de ensayo, mechero, pinzas para tubo de ensayo, reactivo de benedict, reactivo de lugol, cajas de Petri, gradillas, oxalato de sodio 10%, cloruro de sodio 10%, trocitos de pia fresca,... EXPERIENCIAS CON PROTENAS

Desnaturalizacin o coagulacin de protenas

Hacer series de 4 tubos de ensayo con 2 ml de una disolucin de albmina al 2 % y numerar los tubos. Realizar la misma operacin con leche y con una disolucin de clara de huevo (una clara en 500 ml de agua con sal).

A los tubos n 1 aadir 2 ml de HCl, a los n 2 se les aade 2 ml de una disolucin concentrada (al 4 %) de NaCl, a los n 3 aadir 2 ml de NaOH al 20 % y a los n 4 se les calienta suavemente. Interpretar los resultados.

Prueba de Biuret

El Biuret es una reaccin tpica de los enlaces peptdicos, en la cual los tomos de cobre del reactivo se unen a varios grupos NH, lo que produce una coloracin rosa-violcea. Esta reaccin no sirve para dipptidos ni para aminocidos.

Colocar en tubos diferentes disoluciones protenicas, aadir igual cantidad de una disolucin de NaOH al 20 %, agitar y dejar caer 4 o 5 gotas de CuSO4 al 1 %. Interpretar los resultados.

Prueba xantoproteica

Esta prueba consiste en la nitracin de anillos de fenol presentes en ciertos aminocidos, con la consiguiente formacin de nitrocompuestos de color amarillo.

Aadir a cada tubo de ensayo 2 ml de cada disolucin de protena, verter la misma cantidad de HNO3 al 40 %, anotar la coloracin, calentar al bao Mara y anotar los resultados.

Prueba enzimtica: reconocimiento de la catalasa

La catalasa acelera la siguiente reaccin: 2 H2O2 = 2 H2O + O2

Colocar en tubos de ensayo aproximadamente el mismo peso de varios tejidos animales y vegetales, aadir a cada tubo 5 ml de H2O2 y anotar lo que sucede. Explicar lo que est ocurriendo y ordenar los tejidos segn su actividad enzimtica.

Repetir el mismo proceso anterior, pero hervir antes los tejidos durante unos diez minutos. Explicar los resultados obtenidos.

Prueba de la Catalasa Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas:

Mtodo del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Mtodo del tubo de ensayo: Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.\

Enzima catalasa
La catalasa en una enzima que la podemos encontrar en muchos organismos vivos, y cataliza la reaccin de descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno.

El perxido de hidrgeno es uno de los productos del metabolismo celular en diversos organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado enseguida por la enzima catalasa. En la industria, se tambin se utiliza la enzima catalasa, para diferentes fines. Por ejemplo, se usa en la industria textil, para eliminar residuos de perxido de hidrgeno. Adems, la catalasa cumple una funcin protectora contra determinados microorganismos patgenos, sobre todo anaerobios. Las bacterias anaerobias, mueren al estar en contacto con oxgeno, es por esta razn que el oxgeno producido por esta enzima tiene efecto bactericida sobre estos microorganismos. Tanto es as, que la ausencia de dicha enzima por defectos genticos, llamada acatalasemia o enfermedad de Takahara, causa importantes infecciones en la mucosa bucal, pudiendo llegar a causar la prdida de dientes y graves lesiones en los maxilares y tejidos blandos de la cavidad bucal. La reaccin catalizada por esta enzima, ocurre en dos etapas, en las cuales interviene el hierro del grupo hemo de la hemoglobina como cofactor. La presencia de la enzima catalasa en los tejidos de los organismos, se puede demostrar en un sencillo experimento de laboratorio. Tomamos un trocito de hgado, y lo colocamos en el fondo de un tubo de ensayo. Luego aadimos 5 ml de agua oxigenada (que es lo mismo que perxido de hidrgeno). Inmediatamente observaremos un intenso burbujeo, que se debe al desprendimiento de oxgeno de la reaccin catalizada por la enzima catalasa. Este sencillo experimento puede repetirse con distintos tejidos animales y vegetales, en los cuales encontraremos diferentes intensidades de burbujeo, dependiendo de la cantidad de catalasa presente en el tejido.

Todas las enzimas son protenas. Por lo tanto, todas las enzimas sufren desnaturalizarcin frente al calor. Esto quiere decir que cuando la temperatura es muy elevada, la enzima pierde su estructura terciaria, por lo tanto su sitio activo tambin se desnaturaliza, y ya no puede cumplir su funcin. Este hecho se puede demostrar repitiendo el experimento anterior, pero habiendo hervido previamente los trocitos de hgado. Cuando aadimos el agua oxgenada, no se observa el burbujeo.

La determinacin de presencia o ausencia de catalasa resulta til en el rea de bacteriologa, para diferenciar colonias de estreptococos, que son catalasa negativos, de estafilococos o micrococos, que son bacterias que contienen catalasa. Tambin se utiliza para diferenciar los gneros Bacillus (catalasa positivo) de Clostridium (catalasa negativo). Para realizar la prueba de la catalasa, se toma una colonia aislada del cultivo bacteriano y se coloca sobre un portaobjetos. Sobre ella se deja caer una gota de perxido de hidrgeno. Si el resultado es positivo, se observar la formacin de burbujas.

Si el cultivo bacteriano fue realizado en agar sangre, hay que tener precaucin de no llevar un trozo de agar con el asa cuando se levanta la colonia, porque de esta manera se pueden dar resultados falso positivos.

Las enzimas son sustancias que modifican la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas

Activadores: Son iones que aceleran la velocidad de un reaccin, y a menudo son indispensables para que se realice una funcin enzimtica. Frecuentemente son cationes: Mg+2, Ca+2, Mn+2, K+, Na+, etc.

Inhibidores: Son sustancias que disminuyen la velocidad de una reaccin que es catalizada por enzimas.

Moduladores: Son sustancias que actan sobre grupos de enzimas oligomricas con caracterstica de cooperatividad funcional; en las condiciones de la vida de la clula influyen sobre la velocidad de las reacciones enzimticas. Pudiendo ser positivos si estimulan la velocidad de la reaccin y negativos si la inhiben.

La complejidad de los sistemas enzimticos celulares es muy variable; los ms sencillos estn formados por una apoenzima, un sustrato y un producto; algunos muy complejos son isoenzimas con varias molculas proteicas que poseen dos sustratos, dos productos, un grupo prosttico, una coenzima, un activador y diferentes moduladores, cada uno especfico para cada un de las isoenzimas.

Prcticamente todas las reacciones qumicas que tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas por enzimas. Los enzimas son catalizadores especficos: cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos

Los enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres vivos. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una reaccin, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que slamente aceleran las que espontneamente podran producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiolgicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH.

OBJETIVOS

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Comparar la accion cataltica de la enzima catalasa, con la de un catalizador inorgnico como el cloruro de manganeso al descomponer el perxido de hidrogeno.

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Observar el efecto de la temperatura sobre la accin catalitica de una enzima y comparar el mismo efecto de temperatura sobre un catalizador inorgnico.

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Observar la accin de un inhibidor

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Medir la actividad cataltica en base a la produccin de calor

RESULTADOS

Prueba N 1:

Tubo N 1 contiene MnCl + H2O2 Tubo N 2 contiene Hgado + H2O2 Tubo N 3 contiene papa + H2O2

A una temperatura de 34C durante 5 minutos, se obtuvo que:

Tubo N 1, no hubo reaccin Tubo N 2, hubo reaccin inmediata

Tubo N 3, ocurri reaccin (mas que en el tubo 2)

Se sometieron a una temperatura de 37C durante 5 minutos, se obtuvo que:

Tubo N 1, sigui sin reaccionar Tubo N 2, continuo la reaccion

Tubo N 3, hubo mucha mas reaccin

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->

Prueba N 2:

Tubo N 1 contiene MnCl Tubo N 2 contiene Hgado Tubo N 3 contiene papa.

Las tres muestras se sometieron a una temperatura de ebullicin de agua durante 5 minutos, despus de retirarlos y agregarles a cada tubo H2O2 se obtuvo lo siguiente:

Tubo N 1, no reacciono Tubo N 2, se desnaturalizo la enzima por tanto no ocurri reaccion

Tubo N 3, se desnaturalizo y no ocurri reaccin.

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->

Prueba N 3:

Tubo N 1 contiene MnCl Tubo N 2 contiene Hgado Tubo N 3 contiene papa.

Los tubos se llevaron a 0C durante 5 minutos, luego se les agreg a cada tubo H2O2 y se ocurri lo siguiente:

Tubo N 1, no reacciono

Tubo N 2, hubo poca reaccin

Tubo N 3, reaccin poca pero moderada.

Prueba N 4:

Tubo N 1 contiene MnCl Tubo N 2 contiene Hgado Tubo N 3 contiene papa

Despus de agregarles NaCN y H2O2 se obtuvo:

Tubo N 1, hubo reacciono Tubo N 2, poca reaccin al inicio

Tubo N 3, poca reaccin al inicio

Al cabo de 5 minutos a temperatura de 37C se obtuvo:

Tubo N 1, se mantuvo igual Tubo N 2, reaccin numerosa

Tubo N 3, reaccin numerosa

ANALISIS DE RESULTADOS

Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgnicos catalizan reacciones especficas. Sin embargo hay distintos grados de especificidad. El enzima sacarasa es muy especfico: rompe el enlace b-glucosdico de la sacarosa o de compuestos muy similares. As, para el enzima sacarasa, la sacarosa es su sustrato natural, mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos anlogos. El enzima acta con mxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos anlogos. Entre los enzimas poco especficos estn las proteasas digestivas como la quimotripsina, que rompe los enlaces amida de protenas y pptidos de muy diverso tipo.

La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y vegetales.

La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolimo celular, se forma una molcula txica que es el perxido de hidrgeno, H2O2 (agua oxigenada).

Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxgeno, por lo que se soluciona el problema.

La reaccin de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:

<!--[if !vml]--><!--[endif]-->

La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patgenas son anaerobias (no pueden vivir con oxgeno), mueren con el desprendimiento de oxgeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos acta sobre el agua oxigenada.

Como se observa en la prueba nmero uno, hay mayor presencia de catalasa en la papa que en el hgado, por eso, hubo mayor reaccin en el tubo que contena la papa.

En la prueba numero dos hubo una desnaturalizacin de la catalasa, Ya que la catalasa qumicamente es una proteina, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin cataltica, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada y no se observar ningn tipo de reaccin. En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.

Para el caso del tubo numero tres ocurre que la enzima a llevarse a una temperatura de 0C no se desnaturaliza, pero si baja la velocidad de reaccin de la catlisis.

El cianuro de sodio o cianuro sdico (NaCN) es la sal sdica del cido cianhdrico (HCN). Se trata de un compuesto slido e incoloro que hidroliza fcilmente en presencia de agua y dixido de carbono para dar carbonato sdico y cido cianhdrico:

2 NaCN + H2O + CO2 -> Na2CO3 + 2 HCN

Tal y como ocurre en la prueba numero cuatro, al combinarse el perxido de hidrogeno con el cianuro sodico, este acta como un inhibidor competitivo de la reaccin por tanto, la reaccin no se da en gran intensidad en comparacin a la prueba numero uno, pero esta despus de llevarse a 37C durante 5 minutos aumenta su velocidad de reaccin debido a que se a alcanzado una mejor temperatura de activacin de la enzima catalasa.

CONCLUSION

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgnicos catalizan reacciones especficas. Sin embargo hay distintos grados de especificidad.

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Ya que la catalasa qumicamente es una proteina, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin cataltica.

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Prcticamente todas las reacciones qumicas que tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas por enzimas. Los enzimas son catalizadores especficos: cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.

<!--[if !supportLists]--> <!--[endif]-->Las enzimas al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.

Las enzimas aliadas de la industria

Todos los procesos biotecnolgicos que permiten obtener determinada sustancia a partir de ciertas seres vivos, en ltima instancia son provocados por la actividad enzimtica que en cada una de las clulas acta.

Una vez que los cien tficos dominaron las tcnicas de cultivo de microorganismos en grandes cambios donde se controlaban, entre otras variables, la temperatura, la acidez, el sustrato y los productos obtenidos, se propuso otra lnea de investigacin: obtener sustancias a partir de enzimas purificadas que se encuentran separadas de los microbios. Estas enzimas, llamadas industriales, se extraen de bacterias y de hongos. Son en general enzimas extracelulares. Esto quiere decir que son enzimas que los microorganismos liberan al exterior. La mayora de las enzimas industriales son peoteasas y amilasas que actan sobre protenas y almidn, respectivamente. La industria textil y las pasteras amplan enzimas celulazas, cuyo sustrato es la celulosa. Algunas telas han sido tratadas con estas enzimas para ablandar las fibras vegetales o para provocar ciertos efectos que han marcado la tendencia de la moda. Los pantalones de Denia gastados (lase jeans gastados) de la dcada de los `90 se obtena por el tratamiento de las telas a la accin de proteasas y celulosa que dejaban esa apariencia vegetuoria en la prendas fashion de esos das. Pero no es necesario ir a una fbrica para encontrar enzimas industriales. Si leen con detenimiento el envase de los detergentes y jabones en polvo que se usan en los hogares estn compuestos por lipasas y proteasas que actan, tal como cita la propaganda los verdes enzolves actan directo sobre la mancha reconociendo la sustancia que se trata

En el laboratorio. lunes, 14 de julio de 2008, 18:53:26 | noreply@blogger.com (Enzimas para todos) Estuvimos trabajando con una enzima para representar in vitro una reaccin que ocurre en las clulas. Para ello, utilizamos perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno (mejor conocido como agua oxigenada) es una sustancia que se forma continuamente como subproducto en las reacciones de las clulas vivas. Es txico y la clula lo descompone inmediatamente antes de que la destruya. Estas reacciones se producen en unas pequeas organelas: los peroxisomas. Estas organelas celulares contienen alta concentracin de catalasa, enzima que degrada al agua oxigenada.

Nuestra hiptesis de trabajo:

"Si la catalasa obtenida de un trozo de hgado desdobla al agua oxigenada a 20 C entonces, registraremos el desprendimiento de oxgeno como producto de la descomposicin del agua oxigenada".

Para poder contrastar nuestra hiptesis armamos el siguiente dispositivo:

OBSERVACIONES:

Al colocar un trozo de hgado en el Erlenmeyer observamos que en el agua oxigenada se desprenden burbujas inmediatamente (seal que hay desprendimiento de algn gas). Tambin las paredes del recipiente se empaan.

En el tubo de ensayo recolectamos el gas desprendido.

IDENTIFICACIN DEL GAS

Sabemos que el oxgeno es una sustancia necesaria para que se produzca una combustin. Si acercamos una astilla de madera en punto de ignicin al oxgeno, la llama se aviva.

Si el gas recolectado fuera dixido de carbono, la llama se apaga. En cambio, si el gas liberado fuera hidrgeno, se producira un breve chispazo.

Elresultado obtenido:

Por un error experimental, se perdi el gas recolectado en el tubo de ensayo. Por este motivo, se introdujo una astilla de madera en ignicin en el Erlenmeyer. Observamos que la llama se aviva.

CONCLUSIONES

Se evidencia la accin enzimtica de la catalasa al reconocer el desprendimiento de oxgeno gaseoso.

La ecuacin qumica de la reaccin es la siguiente:

4 H2O2 2 H2O + 2 O2

Que crees que hubiera pasado si...

1- ... Se utilizaba hgado triturado?

2 ... Se herva el trozo de hgado antes de realizar la experiencia?

3 ... Si mantendramos el dispositivo a 0 C?

4 ... En lugar de utilizar un trozo de hgado se hubiera experimentado con un trozo de algn vegetal?

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