Protena do lquido extracelular (ECFP) de Streptomycesespcies SS07 tem sido utilizado para reduzir corantessolveis em gua e azo a aminas

cancergenas liberados foram comparadas com a de reduo qumica. O efeito do pH, temperatura e contato tempo na recuperao de aminas usando ECFP foi estudada. A ECFP libera aminas cancergenas em um pHde 9,2 e uma temperatura de 37. C por um perodo de contato de 24 h. Os produtosforam analisados com reduo de HPLC e suas estruturasconfirmadas por LC.MS e GC.MS. Foi observado que ambos os ECFP e mtodos de reduo de substncia qumica liberada tipo similar deprodutos de amina. em caso de amostras de corante, em comparao comreduo qumica, 5,20% de aumento na liberao deaminas cancergenas pela ECFP foi observados. A percentagem de produtos de aminalanado pela reduo qumica foi maior para as amostras de vesturio em couro em comparao a ECFP tratamento. c 2003 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados. Palavras-chave:. Streptomyces spp; corantes Azo; Aminas;aromticos; protena do lquido extracelular; Protenas 1. introduo Corantes azicos so corantes importante ter ampla aplicao em tecidos, papis, couros, gasolina, aditivos, alimentos e cosmticos [1]. bem conhecido que corantes azo solveis quando incorporada ao corpo so divididos em correspondentes aminas aromticas pelo fgado enzimas e flora intestinal micro [2,3]. Aro-Vrios aminas matic incluindo benzidina, 4-bifenilamina e 2-napthylamine foram classificados pelo International Agncia de Pesquisa sobre o Cncer (IARC) humanos como agentes cancergenos conhecidos [4,6].estes aromticos aminas apresentam riscos de sade aos seres humanos em dois viz maneiras. contato direto e atravs de meio ambiente. A liberao de aminas aromticas a partir de produtos de consumo como roupas e artigos de couro j foi relatado [7,8]. Por isso, necessrio garantir que o nosso roupas, calados e roupas pessoais outros so livres a partir de aminas cancergenas. Embora a molcula do corante biologicamente inativo, microorganismos na pele ou em ambiente pode decompor as ligaes azo e liberao as aminas respectivos [9,11], e os subseqentes absoro de aminas aromticas via. pele por pele bactrias tem sido relatada [12]. O papel do Streptomyces sp. na descolorao de corantes azo, Poly B-411, Poly R-418 e azul brilhante foram relatados por vrios grupos de pesquisa [13,15]. Por isso, o papel dos micrbios na reduo de corantes azo a txicos compostos cancergenos de grande preocupao [16]. Em vista destes resultados, alguns estados da Unio Europeia (UE) introduziram uma proibio

sobre corantes azo utilizados em bens de consumo, que pode libertar qualquer um dos 20 aromticas enunciadas prejudiciais aminas. Atualmente, o mtodo alemo DIN 53316 o mtodo mais aceito analtico para a determinao de corantes azo em couro e corantes [17]. O presente estudo foi levado para o (i) avaliar a quantidade de aminas liberado pelo extracelular protena fluido (ECFP) de Streptomyces sp. e (Ii) comparar a recuperao percentual com qumicos reduo. Influncia da temperatura, concentrao ECFP e tempo de contato sobre a liberao de aminas compostos a partir de amostras corantes tambm foram avaliados. A liberao de aminas de vesturio em couro amostras tratadas com ECFP foi estudada em ambos os cidos e mdias suor alcalino. Tcnicas instrumentais tais como HPLC, espectrofotometria UV-Vis, LC.MS e GC.MS foram adotadas para quantificar e caracterizar os produtos liberados. 2. Experimental 2.1. Materiais A amostra xilidina corante ponceau-2R (XP-2R) tem foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). Direta black-38 (DB-38) e direta marrom-1 (DB-1) foram obtidos de fontes comerciais. Solues estoque padro de aminas foram preparadas em metanol na concentrao de 1000? g / ml. As solues padro foram diludas em metanol para a concentrao adequada. Todas as solues foram armazenadas no escuro a 4. C. Ditionito de sdio soluo (0,2 g / ml) utilizada para a reduo qumica foi preparada em gua destilada duas vezes. Novas solues foram usados sempre. gua grau HPLC anlise foi preparado com ELGASTAT maxima HPLC de ELGA, Bucks, Reino Unido. 2.2. Condies de Anlises Um espectrofotmetro UV-Vis (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, EUA), 14 lambda modelo impulsionado por UV-Win software verso 1.4 foi utilizado para todo o estudo. Separao por HPLC foi realizada com Waters Alliance 2695 mdulo de separao com uma presso alta bomba de gradiente, Alliance amostrador automtico e um fotodiodo detector de arranjo (PDA 996, Waters Milford, MA, EUA). As aminas foram separados em uma purosphere RP-18 coluna (5? M), Merck KA, Darmstadt, Alemanha. A fase mvel consistiu de acetonitrila (Eluente A) e gua (eluente B). Separaes foram realizado a uma taxa de fluxo de 0,7 ml / min, a 25. C e volume de injeo 10? l, em comprimentos de onda de 240 e 280 nm. Millennium 3.2, cromatogrfico Waters dados do software do sistema foi utilizado para processamento de

dados. Confirmao do produto foi feita com o cromatograma e os espectros UV correspondente de as aminas padro. Anlises espectro de massa foram realizada utilizando API-150 triplo quadrupolo de massa espectrmetro (Sciex, Toronto, Canad) operado com eltron de ionizao spray com fonte de ons de spray operado em modo on positivo. Controle de instrumentos e aquisies de dados foram realizadas com Macintosh G4/400 computador (Apple, Cupertino, CA, EUA) usando Mass Chrom 1.1.1 software (PE Sciex). O nebulizador fluxo de gs eo fluxo de gs de cortina (N2) foram fixado em 10 e 8 l / h, respectivamente. O spray de ons, orifcio e tenso do anel foram fixados em 4800, 40, 170V, respectivamente. A estrutura das aminas benzidina, e 4-aminobifenilo foram confirmados por LC.MS, enquanto xilidinas e trimethylaniline, que exibiu pobres detectabilidade em LC.MS foram analisados por GC.MS. GC.MS modelo 800 com VG verso do software Mass Lab 1.3 (Fisons Instruments, Milo, Itlia) foi usado para analisar e xilidinas trimethylaniline. DB-5 MS coluna polar meados de 30m? ~ 0,32 milmetros i.d. (Filme Espessura: 0,25 m) de J & W Scientific (Folsom,? CA, EUA) foi utilizado. Condio GC foi definido como: injeo no modo splitless; temperatura de injeco:. 250 C; temperatura do forno: 50,280 C; C ramped a 5, e.. temperatura da interface: 250 C.. Modo de deteco em massa ionizao de impacto foi de eltrons (EI) positivo, fixado em 70 eV, digitalizados 50-800 amu com total em ies de gs em 1,5 ml vazo em massa. Um microlitro do amostra em metanol foi injetado. 2.3. Isolamento de Streptomyces sp. Streptomyces sp. foi isolado do solo, que estava em contato com guas residuais da indstria de alimentos conforme o mtodo resumido em [18]. Identificao do isolado foi feita com base morfolgica e exame bioqumico de acordo com William et al. [19]. A natureza basoflico das espcies isoladas um adicionada funo deste organismo e, portanto, utilizada para a presente estudo. O pH timo para o crescimento mximo 9,2-9,5 e foi a temperatura tima foi de 37 C. Cultura pura foi obtida aps a verificao sequencial e as culturas estoque foram mantidas em 4 C. Peridico subculturas foram feitas no intervalo de 30 dias. O teor de protena da protena de fluido extra-celular foi estimada de acordo com o mtodo de Lowry et al. [20]. 2.4. Liberao de aminas pelo mtodo qumico Amostras de corante (0,1 g) foram tratados com o sdio ditionito (trs vezes com 1,5 ml de soluo 0,2 g / ml) em uma soluo aquosa tampo de citrato de sdio

(PH 6,0) a 70 C por 30 min em um recipiente fechado. O aminas liberado no processo de clivagem redutora foram extradas com 50 ml de clorofrmio [21] e, finalmente, concentrada a 2 ml. O solvente remanescente foi removidas por lavagem de nitrognio. O resduo foi ento dissolvido em metanol e analisados por HPLC-diodo deteco de array (DAD). 2.5. Liberao de aminas pelo lquido extracelular protena (ECFP) Cerca de 0,1 g de amostras de corante foi tratado com ECFP, dissolvido em gua e incubadas a 37 C. O cancergenos aminas liberados foram analisadas por UV-Vis, HPLC, LC-MS e GC-MS. Amostras com corante ECFP foram incubadas por um perodo e 24 h, a 37 C para avaliar o tempo de contato ideal entre ECFP e amostra o corante para a liberao de aminas. O concentrao tima de ECFP necessrio para completar degradao das amostras azo corante foi determinada atravs da variao da concentrao de 0,785 a ECFP 3,925 mg de protena / mg de corante. Todos os experimentos foram duplicados. 2.6. Liberao de compostos de amina de couro amostra de vesturio por tratamento qumico e ECFP Amostra de couro roupa tingida com DB-38 ou DB-1 foi escolhido para o estudo. As amostras de couro foram solo usando um moinho de laboratrio (Thomas Wiley modelo 4, Thomas Scientific, EUA). Para reduo qumica, cerca de 1,0 g da amostra do solo foi tratado de couro com hexano para remover leos e gorduras [17] reduo e foi realizado em meio de suor cido e alcalino com ditionito de sdio. As anlises da reduo produtos so as indicadas na Seo 2.4. Para a reduo enzimtica, a amostra foi lavada com gua e depois o resduo mido foi tratado com ECFP. Influncia de ECFP, relativa libertao de aminas aromticas de couro amostras de vesturio foi avaliada em ambos os cidos e alcalinos condies de suor [22]. O perodo de incubao e anlises dos produtos so de acordo com o procedimento em Seo 2.5. 3. Resultados e discusso 3.1. Anlises UV e HPLC Os valores max de tinturas-primas e produtos de ECFP tratamento esto descritos na Tabela 1. UV-Vis anlise de as amostras com ECFP no mostrou pico correspondente ao max dos corantes primas. Os resultados claramente mostram a reduo completa dos corantes azo ao correspondentes aminas aromticas. Anlises HPLC revelou que ambos os qumicos e reduo enzimtica lanado aminas aromticas semelhantes e os resultados so compilados na Tabela 1. Observou-se que o cancergenos

aminas lanado pelo tratamento ECFP foram 50-20% superiores aos obtidos em qumica reduo. Representante para HPLC cromatogramas reduo enzimtica so dadas na figura. 1. A estrutura de corantes e produtos de sua reduo so dadas na fig. 2. 3.2. LC-MS/GC-MS estudos A reduo de compostos azo correspondentes compostos aromticos depende do eltron 120 M. densidade em torno da-N = N-grupos. Descolorao inicial de amostras azo pelo bacterianas e fngicas espcies durante o contato com os corantes pode ser devido a a remoo de grupos cromforos [23]. LC-MS e GC-MS anlise das amostras tratadas fornecer evidncia para a presena de produtos de amina estvel na fase aquosa. LC-MS (modo ESI) analisa das aminas aromticas mostraram que a reduo produtos de DB-38 e DB-1 foram benzidina e 4 bifenilamina-que deu o padro de fragmentao com a formao de [M + H] + como a base picos em m / z = 185 para benzidina e m / z = 169 para 4-bifenilamina. XP-2R xilidinas lanado e trimetil anilina, que mostrou pouca sensibilidade em LC-MS, e eles foram analisados por GC-MS, que mostrou m / z = 121 para o 2,4-xilidina e 2,6-xilidina e m / z = 135 para 2,4,5-trimethylaniline. Para confirmar que a resposta somente a partir do correspondente aminas e no de qualquer outra orgnicos UV, espectros dos analitos com a referncia comTabela 2 Liberao porcentagem de aminas a partir de amostra de vesturio em couro Serial nmero Reduo enzimtica do corante (%) de reduo qumica (%) Suor cidas alcalinas suor suor suor cidas alcalinas Benzidina 4-Amino bifenilo Benzidina 4-Amino bifenilo Benzidina 4-Amino bifenilo Benzidina 4-Amino bifenilo Um IPC direta preto-38 25,10 12,70 57,74 28,05 70,55 31,20 85,77 42,64 2 IPC direta marrom-1 28,60 14,98 54,92 32,84 61,23 27,54 79,65 43,57 quilos foram analisados em condies semelhantes. Amostras apresentaram o cromatograma mesmo eo

Espectro UV com espectros de massa idnticos. O As amostras foram quantificadas com a rea do padro nas mesmas condies experimentais. O O Quadro 1 apresenta os espectros de massa dos correspondentes aminas. 3.3. Efeito do tempo de contato Em tratamento com ECFP, todos os trs corantes liberao produtos similares aos produtos obtidos atravs de reduo qumica. Quanto ao tempo de contato, ou seja, o perodo de incubao, a recuperao foi observada alta aps 24 h. Aps 24 h de tempo de contato, cerca de 75% de 2,4-xilidina, 32% de 2,6-xilidina, e 70% dos 2,4,5-trimetil anilina foram recuperados a partir do XP-2R. Da DB-38, cerca de 75% de benzidina e 5% de 4-ABP e da DB-1, 70% da benzidina e 13% de 4-ABP foram recuperados. M. Bhaskar et al. / J. Chromatogr. A 1018 (2003) 117-123 123 3.4. Liberao de aminas a partir de amostras com corante variando concentrao ECFP Para avaliar a quantidade de protena necessria ECF para a recuperao mxima de aminas, concentrao de ECFP foi variado 0,785-3,925 mg / mg de corante amostra. A concentrao otimizada de ECFP para recuperao mxima foi de 3,14 mg / mg de amostra de corante eo percentual mximo de aminas recuperado so apresentados na seco 3.3. Aumento na protena concentrao no efetuar qualquer reduo. 3.5. Lanamento de produtos de couro amina amostra de vesturio A porcentagem de aminas liberada a partir de couro amostras de vesturio pela ECFP e reduo qumica sob diferentes condies experimentais (cido e mdio suor alcalino) so apresentados na Tabela 2. interessante observar que a porcentagem de liberao compostos de amina por mtodo qumico maior do que o tratamento enzimtico. Mais de 40% de benzidina e 4-bifenilamina foram liberados sob qumica reduo e foi <20% com reduo enzimtica. Lanamento tambm aumentado de benzidina e 4-ABP foi observado em meio alcalino em comparao com o suor cidas mdias suor. A presena de ons hidroxila na fase aquosa aumenta a clivagem em relao de ons de hidrognio, que atribudo formao de maior percentual de produtos de couro amina amostra de vesturio em meio alcalino. 4. Concluso No presente estudo, reduo de corantes azo a correspondente aminas aromticas por fluido extracelular protena isolada de espcies de Streptomyces e um comparao com o mtodo de reduo ditionito tem

foram feitas. Embora ambos os qumicos e enzimticos reduo de aminas lanamento similar, reduo enzimtica rendeu percentagem mais elevada de aminas maiores e menores. Estrutura das aminas liberados foram confirmados por GC-MS e LC-MS tcnicas. No caso de amostras de vesturio em couro, o percentual de aminas liberado foi maior com reduo qumica, em comparao para a reduo enzimtica. Nosso estudo demonstra que a ECFP produzido por Streptomyces sp. desempenha uma chave papel na liberao de aminas cancergenas. Agradecimentos Sr. M. Bhaskar agradece ao Conselho Cientfico da e Industrial Research (CSIR), a ndia para financeira assistncia prestada na forma de Pesquisa Snior Companheirismo. So devidos agradecimentos ao Sr. Jyothi e P. Sr. Ramakrishnan, para suporte tcnico. Referncias [1] M.S. Reisch, Chem. Eng. Notcias 66 (1988) 7. [2] K.-T. Chung, s.e. Stevens, C. E. Cerniglia, Crit. Rev. Microbiol. 18 (1992) 175. [3] G. W. Levine, Drug Metab. Rev. 23 (1991) 253. [4] N. Irving Sax, que causam cncer Chemicals, Van Nostrand Reinhold, 1986, p. 457. [5] T.S. Scott, Riscos e Crnica da Carcinognicos Aromticas Aminas, Elsevier, Amsterdam, New York, 1962. [6] K.H. Feber, in: Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 3, 3 ed., Wiley, New York, 1978, p. 772. [7] S. Pakawadee, Anal. Chem. 72 (2000) 393A. [8] CS Eskilsson, R. Davidson, L. Mathiasson, J. Chromatogr. A 955 (2002) 215. [9] R.K. Lynn, D.W. Donielson, A.M. llias, J. M. Kennish, K. Wong, H.B. Matthews, Toxicol. Appl. Pharmacol. 56 (1980) 248. [10] M.K. Ellis, G.J. Mcpherson, N. Ashcroft, J. Soc. Couro Technol. Chem. 81 (1997) 52. [11] T. Platzek, C. Lang, G. Grohmann, U.-S. Gi, W. Baltes, Hum. Exp. Toxicol. 18 (1999) 552. [12] T. Platzek, U.-S. Gi, C. Lang, W. Baltes, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 356 (1997) R62. [13] M.B. Pasti, S.R. Hagen, R.A. Korus, D.L. Crawford, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34 (1991) 661. [14] N.S. Burke, D.L. Crawford, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 (1998) 523. [15] A. Paszczynski, M.B. Pasti-Grigsby, S. Goszczynski, R.L. Crawford, D.L. Crowfud, Appl. Environ. Microbiol. 58 (1992) 3598. [16] M. A. Brown, S. C. Devito, Crit. Rev. Environ. Sci. Technol. 23 (1993) 249. [17] DIN 53316, Nachweis Bestimmer Azofarbstoffe em Leder, Deutsches Institut fur Normung, Berlim, 1997.

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