Universidad Complutense

FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II

GUA DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA CLNICA
Cuarto Curso

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Cualquier alumno que sufra alguna alteracin de sus defensas o inmunocompetencia debe comunicarlo al profesor antes de comenzar las prcticas. El acceso al laboratorio de prcticas slo se permite a los alumnos que estn realizando las prcticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. Los laboratorios de investigacin son de acceso exclusivo del personal del Departamento. Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se est trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prcticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio. Debe respetarse la prohibicin de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningn objeto (bolgrafos...) o tocarse los ojos, nariz y boca. En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningn momento ropa u objetos personales. Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, as como de los microscopios que haya usado. Se deben usar los mecheros Bunsen con precaucin, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobar que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio. Est prohibido pipetear con la boca. Ante un vertido accidental de material microbiolgico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo. No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos. No se manejarn los autoclaves o el material recin esterilizado si no se dispone de guantes apropiados. La eliminacin de residuos, material desechable y material reciclable se realizar utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. Se deben lavar las manos con jabn antisptico ante cualquier sospecha de contaminacin y siempre antes de marcharse del laboratorio.

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PRCTICA 1. ANLISIS MICROBIOLGICO DE ORINA

2.1. INTRODUCCIN.
El anlisis microbiolgico de la orina va encaminado al diagnstico de las infecciones del aparato urinario, esencialmente cistitis y pielonefritis. Tambin es til para ayudar al diagnstico de las infecciones no estrictamente urinarias, cuando afectan a tejido renal o se excretan bacterias por orina, como tuberculosis, leptospirosis o fiebre tifoidea.

2.2. TOMA DE MUESTRA.

La muestra ms adecuada es la primera orina de la maana. Debe evitarse la contaminacin por la microbiota normal de la uretra o del perineo, mediante un lavado de los genitales externos, aclarado con abundante agua y secado, si es posible, con gasa estril. Se recoge la porcin media de la miccin en un frasco estril de boca ancha, desechando los primeros y los ltimos mililitros. La muestra debe analizarse inmediatamente, o refrigerarse a 4C hasta un mximo de 24 horas.

2.3. ANLISIS MICROBIOLGICO PRELIMINAR.

Cuando el nmero de muestras es muy elevado es necesario un mtodo que permita descartar las negativas sin proceder al cultivo. Algunos de los criterios empleados son los siguientes: Depositar una gota de la muestra de orina (que previamente se ha homogeneizado muy bien) sobre el porta, sin extenderla, dejarla secar y fijarla a la llama. Teirla por el mtodo de Gram. Si se aprecia al menos una bacteria en la mayora de los campos observados, la muestra debe cultivarse. Considerar los resultados del examen del sedimento. Puede utilizarse un equipo automtico para detectar bacteriuria. Las pruebas basadas en la reduccin de nitratos, de trifenil-tetrazolio, la prueba de la glucosa-oxidasa y otras similares no son fiables, por dar un exceso de falsos negativos.

2.4. UROCULTIVO CUANTITATIVO.

El recuento de bacterias en orina es, por el momento, el mtodo aconsejado para distinguir una infeccin urinaria de la contaminacin por microbiota normal. Puede hacerse mediante diluciones seriadas o mediante siembra con asa calibrada. Este ltimo mtodo es ms utilizado por su sencillez. 2.4.1. Material: Muestra de orina problema. Asa calibrada de 1 l.

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2.4.2. Tcnica: Homogeneizar bien la orina mediante inversiones del frasco. Sumergir verticalmente el asa y retirarla asegurndose que lleva una gota de orina (Figura 2.1). Extender la orina contenida en el asa a lo largo de un dimetro de la placa, pasando varias veces (Figura 2.2.-1). Extender el inculo con la misma asa en estras muy apretadas perpendicularmente a la primera estra (2) y Figura 2.1. Recogida de una luego perpendicularmente a la segunda con gota de orina con mltiples pasadas del asa, que se superpongan, el asa para la hasta cubrir toda la placa (3). siembra. Incubar las placas en posicin invertida 18 h a 35-37 C. 2.4.3. Interpretacin. Estimar el nmero de colonias y multiplicarlo por mil, para obtener el nmero de bacterias por ml de orina. Un recuento de ms de 100.000 bacterias/ml es indicativo de infeccin (el nmero no se correlaciona con la gravedad de la misma). Un recuento de menos de 10.000 bacterias/ml hace sospechar una contaminacin de la muestra, especialmente si hay varios tipos distintos de colonias, pues las infecciones urinarias son casi siempre Figura 2.2. Siembra en placa para el debidas a un slo microorganismo. urocultivo cuantitativo. Las cifras intermedias son dudosas, y requieren la consulta al clnico y la repeticin del anlisis. Hay que tener presente que las muestras obtenidas por puncin suprapbica o cateterismo asptico no llevan contaminacin, y debe considerarse positivo cualquier recuento. En caso de infeccin se procede siempre a la identificacin y al antibiograma.

Una placa con medio CLED (Cistina, Lactosa, Electrolito-Deficiente). En su lugar puede utilizarse una placa de Agar-sangre y otra de MacConkey o Levine.

2.5. IDENTIFICACION.
Los microorganismos responsables ms frecuentemente de infeccin urinaria varan segn el origen comunitario o nosocomial de la infeccin. En lneas generales son: Escherichia coli, y con mucha menor frecuencia otras enterobacterias, como Proteus, Klebsiella, Enterobacter y Serratia. Entre los cocos Gram-positivos, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus. 6

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Microorganismos oportunistas, como Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes spp. Corynebacterium urealyticum y levaduras, como Candida albicans. Basndose en el aspecto de la colonia y en su tincin, proceda a identificarla segn las tcnicas descritas en la Prctica 4. 2.5.1. Observacin de las colonias. El agar CLED ha sido diseado para el anlisis de orina. Permite apreciar la fermentacin de lactosa, al llevar azul de bromotimol como indicador de pH, y su deficiencia en electrolitos impide la invasin de la placa por especies de Proteus. Es de color verde algo amarillento. Las colonias de bacterias fermentadoras de lactosa hacen virar el medio al amarillo; es el caso de E. coli, Klebsiella y Enterobacter. Las no fermentadoras de lactosa, como Proteus, o fermentadoras lentas, como algunas estirpes de Serratia, lo dejan de color azul o verde azulado. Esto mismo ocurre con las bacterias que no fermentan azcares (Pseudomonas, Alcaligenes). Los cocos Gram-positivos presentan colonias ms pequeas y dejan el color del medio inalterado o ligeramente amarillo; S. aureus suele formar colonias muy amarillas por el pigmento que produce. Corynebacterium urealyticum forman colonias apenas visibles; es necesario incubar las placas 48-72 horas. 2.5.2. Tincin de Gram de una colonia. Deposite con el asa de siembra una gota pequea de agua en un portaobjetos limpio. Tome una muestra de una sola colonia, tocndola con el asa de siembra. Resuspndala en la gota de agua, extendindola uniformemente sobre una pequea porcin del porta. Djela secar, sin calentar. Fije a la llama y tia por el mtodo de Gram. Una vez seca la tincin obsrvela con el objetivo de inmersin.

2.6. ANTIBIOGRAMA.
Se realiza el antibiograma segn se describe en la Prctica 6, y se redacta el Informe Final con los datos de recuento, identificacin y antibiograma.

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PRCTICA 2. ANLISIS MICROBIOLGICO DE EXUDADO FARNGEO

1.1. INTRODUCCIN.
El protocolo que se detalla a continuacin representa el anlisis rutinario en busca de Streptococcus -hemoltico grupo A (Streptococcus pyogenes), pero permite detectar otros patgenos bacterianos o fngicos.

1.2. TOMA DE MUESTRAS, EXAMEN PRELIMINAR Y CULTIVO.

1.2.1. Material: Torunda estril de polister. Placas de agar-sangre. 1.2.2. Tcnica: 1.2.2.1. Toma de muestra. Se introduce la torunda en la boca, evitando el contacto con la lengua y otras zonas de la boca, y se frota contra la mucosa inflamada de la amgdala o faringe (Figura 1.1).

Figura 1.1. Toma de exudado farngeo.

1.2.2.2. Siembra. Frotar el hisopo sobre un segmento de la placa, hacindolo girar a la vez para descargar toda la muestra (Figura 1.2.-1). Extender el inculo inicial con el asa bacteriolgica (2). Con el asa flameada y fra extender el inculo sobre otro segmento (3). Flamear el asa y repetir dos veces el paso 2, sin llegar a tocar el inculo inicial (4). Clavar el asa dos o tres veces en el agar, al principio de la siembra, para obtener cultivo bajo la superficie. Incubar las placas 18 h a 35-37C.

Figura 1.2. Tcnica para el aislamiento de colonias en placa.

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1.3. IDENTIFICACIN.
Examinar las placas en busca de las colonias -hemolticas. La -hemlisis puede ser ms evidente donde se clav el asa en el agar. Adems de los estreptococos del Grupo A (Streptococcus pyogenes), son hemolticos los de los grupos B (Streptococcus agalactiae), C (como Streptococcus equisimilis), D (como Streptococcus bovis), F (Streptococcus milleri) y G, as como los enterococos (Enterococcus spp.). Entre ellos pueden estar implicados en faringitis, adems del patgeno habitual (S. pyogenes), los de los grupos C y G. Si se encuentran colonias -hemolticas sospechosas, se comprueba mediante tincin de Gram el aspecto tpico de los estreptococos (cadenas de cocos Grampositivos) y se inicia su identificacin mediante la prueba de la CATALASA. Para la identificacin presuntiva de S. pyogenes, se hace una resiembra en otra placa de agar sangre, donde se coloca un disco de bacitracina para determinar su sensibilidad (ver apartado 4.3). Arcanobacterium haemolyticum es un bacilo Gram-positivo que tambin puede ser causa de faringitis; sus colonias -hemolticas son semejantes a las de S. pyogenes, y carecen as mismo de catalasa. Las colonias -hemolticas corresponden a estreptococos comensales del grupo "viridans", aunque podra tratarse de Streptococcus pneumoniae. Dentro de las colonias no-hemolticas, las secas y amarillentas suelen corresponder a especies comensales de Neisseria (comprubese mediante tincin de Gram). No se identifican. Las colonias no-hemolticas blancas y cremosas pueden corresponder a Staphylococcus sp. o a Candida albicans (ver identificacin en Prctica 8). S. aureus suele dar colonias amarillas, cremosas. Las enterobacterias y Pseudomonas dan colonias ms grandes, a veces mucosas, de color gris a negruzco, y pueden ser ocasionalmente -hemolticas.

1.4. INTERPRETACIN.
En caso de amigdalitis o faringitis se considera resultado positivo el aislamiento de Streptococcus -hemoltico grupo A. No procede realizar antibiograma, por ser de sensibilidad uniforme a penicilina. El aislamiento de otros patgenos bacterianos responsables de faringitis es mucho menos frecuente. El aislamiento de Candida albicans permite confirmar un diagnstico de candidosis oral. El aislamiento de otro patgeno en proporcin significativa puede ser el reflejo de una infeccin de otra zona del aparato respiratorio y debe investigarse.

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PRCTICA 3. ANLISIS MICROBIOLGICO DE HECES

3.1. INTRODUCCIN.
La tcnica de coprocultivo que aqu se describe es un mtodo de rutina para el aislamiento de Salmonella, Shigella y cepas comensales y patgenas de Escherichia coli. El aislamiento de Yersinia enterocolitica requiere medios selectivos (medio CIN) y/o enriquecimiento en fro. Para el aislamento de Campylobacter es necesario utilizar medio Campy-BAP e incubarlo en microaerofilia a 42C. Para aislar Staphylococcus aureus es recomendable aadir una placa de Chapman-manitol, y para detectar Candida albicans otra de agar Sabouraud. Estos microorganismos se aslan e identifican en otras prcticas, por lo que no se utilizarn aqu esos medios.

3.2. TOMA DE MUESTRAS Y TRANSPORTE.

3.2.1. Material: Recipiente estril de boca ancha, o hisopo estril con medio de transporte. 3.2.2. Tcnica: Recoger 5-10 g de heces en el recipiente estril. En algunos casos es aceptable hacer la toma mediante una torunda rectal (este el mtodo que se emplear en estas prcticas). Si no puede sembrarse la muestra antes de 2 horas, debe utilizarse un medio de transporte, como Cary-Blair o Glicerol/Tampn fosfato (50:50, pH 7).

3.3. COPROCULTIVO.
3.3.1. Material: Un tubo de caldo selenito para enriquecimiento. Una placa de cada uno de los siguientes tipos de medios de cultivo: o Medios moderadamente selectivos, como MacConkey o Levine (EMB). o Medios selectivos, como SS (Salmonella-Shigella), XLD (Xilosa, Lisina y Desoxicolato) o Hektoen. o Medios muy selectivos, como BG (Verde Brillante) o BS (Bismuto-Sulfito) Una placa de medio CIN (cefsulodina-irgasan-novobiocina) para Yersinia. Una placa de medio Campy-BAP para Campylobacter. 3.3.2. Tcnica: Inocular directamente las heces con esptula estril, asa bacteriolgica o el hisopo empleado para tomar la muestra. Comincese por los ms selectivos (BS), que deben inocularse abundantemente porque son muy inhibitorios. El inculo se extiende con el asa para obtener colonas aisladas (Figura 1.2). Las placas se incuban a 36C en aerobiosis durante 48 horas, para que puedan manifestarse las caractersticas diferenciales de las colonias; la lectura prematura conduce a errores de interpretacin. Para el aislamiento de Salmonella puede hacerse adems un enriquecimiento en medio de selenito. Inoclese con la muestra de heces un tubo de 10 ml de caldo selenito, e incbese a 37 C. Si no se ha aislado Salmonella, se har un subcultivo a partir del tubo de caldo selenito en medio selectivo para Salmonella.

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Para la bsqueda de Yersinia conviene incubar tambin una placa de MacConkey a 30 C, si no se utiliza medio selectivo CIN. Las placas de medio Campy-BAP para Campylobacter se incuban a 42C en microaerofilia.

3.4. EXAMEN DE LOS CULTIVOS.

Las placas se examinarn en busca de colonias sospechosas de pertenecer a alguno de los patgenos intestinales. Para ello se tendr en cuenta las caractersticas de crecimiento en los distintos medios, como se expone a continuacin: Agar MacConkey Caractersticas: Es un medio moderadamente selectivo. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben a la mayora de las bacterias Gram-positivas y algunas Gramnegativas. La fermentacin de lactosa hace virar el indicador a rojo. Aspecto de las colonias: Los fermentadores tpicos de lactosa (E. coli, Klebsiella y Enterobacter) dan colonias rosas o rojas rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. Los fermentadores dbiles o lentos de lactosa (Citrobacter, Serratia) pueden dar colonias incoloras a las 24 h y rosadas a las 48 h. Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia dan colonias incoloras. Enterococcus forma pequeas colonias. Agar Levine Caractersticas: Es un medio ligeramente ms selectivo que el MacConkey. La eosina y el azul de metileno inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas y algunas Gram-negativas. La fermentacin de lactosa precipita ambos colorantes al acidificar el medio. Aspecto de las colonias: E. coli forma colonias oscuras con brillo metlico verdoso. Los fermentadores no tan fuertes de lactosa (Klebsiella, Enterobacter y Serratia) forman colonias moradas en 24 a 48 h. Los no fermentadores de lactosa (Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia) dan colonias transparentes. Agar Salmonella-Shigella (SS) Caractersticas: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. La alta concentracin de sales biliares y citrato inhibe todas las bacterias Gram-positivas y muchas Gram-negativas, incluidos los coliformes. La fermentacin de lactosa hace virar el rojo neutro a rojo. El SH2 formado a partir de tiosulfato da un precipitado negro al reaccionar con hierro. Aspecto de las colonias: Los fermentadores de lactosa estn bastante inhibidos y dan colonias rojas. Las colonias de Salmonella aparecen sin inhibir, transparentes, con el centro negro. Las especies de Shigella son ms o menos inhibidas y dan colonias transparentes sin centro negro. Las colonias de Proteus son similares a las de Salmonella. Agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato) Caractersticas: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. El desoxicolato inhibe a las bacterias Gram-positivas y frena la invasin por Proteus. Lleva citrato y tiosulfato para completar el efecto selectivo, los azcares lactosa, xilosa y sacarosa, y rojo de fenol como indicador de pH. No se esteriliza. Aspecto de las colonias: Salmonella comienza por acidificar el medio por fermentacin de xilosa, pero sta se agota rpidamente y el medio se alcaliniza por descarboxilacin de la lisina. Las colonias de Salmonella aparecen rojas con el centro negro por la produccin de SH2. Las colonias de Proteus pueden ser semejantes. Los coliformes mantienen el medio cido por fermentacin de lactosa y sacarosa, que se hallan en exceso, y forman colonias amarillas. Las colonias de Shigella aparecen rojas al no fermentar ninguno de los azcares.

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Agar entrico Hektoen Caractersticas: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. La alta concentracin de sales biliares inhibe todas las bacterias Gram-positivas y retrasa el de muchos coliformes. La fermentacin de los azcares hace reaccionar la fuchsina con el azul timol, dando color amarillo a pH cido. Aspecto de las colonias: E. coli y otros fermentadores rpidos de lactosa son moderadamente inhibidos y dan colonias naranjas o rosadas. Las colonias de Salmonella aparecen azul-verdosas con el centro negro por la produccin de SH2. Las colonias de Shigella son ms verdosas y sin centro negro. Las colonias de Proteus estn inhibidas y son pequeas y transparentes. Agar BS (Sulfito de Bismuto) Caractersticas: Es un medio altamente selectivo para Salmonella. El sulfito de bismuto y el verde brillante inhiben a la mayora de los coliformes y a otras bacterias. La produccin de SH2 se detecta como en los medios anteriores. No lleva azcares ni indicador de pH. No se esteriliza. Aspecto de las colonias: E. coli y otros coliformes estn fuertemente inhibidos, y si crecen dan colonias pequeas, color verde o pardo. Las colonias de Salmonella aparecen con el centro negro por la produccin de SH2, el borde ms claro y un halo oscuro en el medio de cultivo que tiene reflejos metlicos, debido a la reduccin del bismuto a metal. Las colonias de Proteus estn inhibidas y son pequeas y negras, por la produccin de SH2. Agar con Verde Brillante Caractersticas: Es un medio altamente selectivo para Salmonella, a excepcin de Salmonella typhi. El efecto inhibitorio se debe al colorante verde brillante. La fermentacin de lactosa o sacarosa hace virar el indicador, rojo de fenol, dando coloracin amarilla. Aspecto de las colonias: Las colonias de Salmonella aparecen de color rosa blanquecina. Algunas cepas de S. typhi y Proteus pueden crecer dando colonias rojas. Los fermentadores de azcares, como E. coli, forman colonias amarilloverdosas, muy inhibidas. Agar CIN (para Yersinia) Caractersticas: Es un medio selectivo y diferencial. La selectividad se debe a la presencia de sales biliares, cristal violeta e Irgasan, que inhiben el crecimiento de Gram-positivos y cierto nmero de Gram-negativos. La cefsulodina y la novobiocina son dos antimicrobianos que inhiben los organismos entricos normales. La propiedad diferencial se basa en la fermentacin de manitol con produccin de cido que hace virar el rojo neutro a rojo y que produce una precipitacin de sales biliares alrededor de las colonias. Aspecto de las colonias: Las colonias de Yersinia enterocolitica son translcidas con centro rojo debido al indicador de acidez rojo neutro que indica la fermentacin del manitol y pueden estar rodeadas por una zona de bilis precipitada. Adems de esta especie bacteriana, pueden crecer en el medio otros microorganismos: Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Aeromonas y Pseudomonas aeruginosa. Agar Campy-BAP (para Campylobacter) Caractersticas: Es un medio nutricionalmente rico que permite el crecimiento de especies de Campylobacter. Suplementado con agentes antimicrobianos (cefalotina, trimetoprm, vancomicina, polimixina B y anfotericina B) proporciona un menor crecimiento de bacterias entricas a la vez que permite la recuperacin de Campylobacter de muestras fecales. Aspecto de las colonias: Las colonias de Campylobacter aparecen no hemolticas, de color gris con bordes irregulares o elevadas y con aspecto mucoide.

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Se puede observar un rastro o cola tras la colonia si la superficie del medio est hmeda.

3.5. INTERPRETACIN.
Los medios menos selectivos (MacConkey o Levine) permiten apreciar la composicin de la microbiota normal aerobia facultativa. En un sujeto sano debe predominar E. coli, con pequeos porcentajes de otras enterobacterias: Klebsiella, Enterobacter y Proteus. En MacConkey suelen detectarse tambin enterococos (como pequeas colonias incoloras) que son inhibidos en el medio Levine. Los medios selectivos se examinarn en busca de colonias tpicas de Salmonella o Shigella. En ellos pueden aparecer otras enterobacterias; las colonias de Proteus suelen prestarse a confusin, mientras que las de enterobacterias lactosa-positivas estn mucho ms inhibidas y se diferencian claramente. En caso de no detectar Salmonella se sembraran nuevas placas a partir del enriquecimiento en Caldo selenito. La identificacin se realizar siguiendo las tcnicas habituales (Prctica 4). En el caso de Salmonella es necesaria la confirmacin serolgica (Prctica 5), y si se sospecha de una gastroenteritis por E. coli debe determinarse si se ha aislado una cepa patgena, mediante serologa u otras tcnicas. En el medio CIN selectivo para Yersinia enterocolitica, las colonias tpicas debern ser analizadas como el resto de las enterobacterias, bien sembrando las pruebas tradicionales (ver Prctica 4) o utilizando mtodos comerciales (Prctica 7). Para la identificacin de Campylobacter vase el apartado 4.5.2.

3.6. INFORME.
Se comunicar el aislamiento del patgeno identificado, o se informar del hallazgo de microbiota normal o alterada. Como el tratamiento antimicrobiano no suele estar indicado, slo se practicar el antibiograma cuando el caso lo aconseje.

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PRCTICA 4. IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS PATGENOS

4.1. INTRODUCCIN.
Se ofrecen aqu mtodos sencillos para la identificacin de los microorganismos que pueden haber sido aislados en las prcticas anteriores. La identificacin completa puede requerir otras pruebas, descritas en los manuales de laboratorio de Microbiologa Clnica (ver Bibliografa). Recurdese que para proceder a la identificacin debe partirse siempre de un cultivo puro, o por lo menos de una colonia aislada. Debe tenerse siempre en cuenta la diversidad que presentan los microorganismos, que hace que una cepa en concreto no presente exactamente las caractersticas que definen a la especie. Por tanto, hay que considerar la totalidad de los resultados coincidentes y no coincidentes, y valorar la importancia taxonmica de cada uno.

4.2. TCNICA.
El primer paso es la tincin de Gram a partir de una colonia aislada, que nos informar si se trata de una bacteria, de su morfologa, y de si es Gram-positiva o Gram-negativa. A partir de estos datos pueden seguirse los protocolos de los siguientes apartados.

4.3. COCOS GRAM POSITIVOS.

Slo se describen aqu los patgenos pertenecientes a los gneros Streptococcus y Staphylococcus. Material necesario: Cultivo puro de la bacteria problema. Colorantes para la tincin de Gram. Agua oxigenada de 30 volmenes. Tcnica: a) Forma y disposicin: Se realiza una tincin de Gram. Los estreptococos suelen aparecer en cadenas, los estafilococos en agrupaciones irregulares como racimos. b) Catalasa: Poner en un portaobjetos una gota de agua oxigenada de 30 volmenes e introducir el asa con las bacterias. En caso positivo se desprenden burbujas. CATALASA (+): Staphylococcus COCOS GRAM(+) CATALASA (-): Streptococcus 4.3.1. Identificacin de estafilococos. Material necesario: 1 tubo con 0,5 ml de caldo comn. Plasma de conejo.

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1 placa con medio Chapman-Manitol (Manitol-Sal). Este medio es selectivo para Staphylococcus al contener un 7,5% de ClNa, y se detecta la fermentacin del manitol al virar el indicador de pH (rojo de fenol) de rosa a amarillo.

Tcnica: Identificar las colonias sospechosas (catalasa positiva) segn el siguiente esquema: +, MANITOL + : Staphylococcus aureus COAGULASA NOVOBIOCINAR: Staphylococcus saprophyticus , MANITOL + NOVOBIOCINAS: Staphylococcus epidermidis a) Fermentacin del manitol: Sembrar la bacteria en placa de Chapman-manitol. Incubar a 37C, 24-48 horas. Observar si hay fermentacin por viraje del indicador a color amarillo. b) Coagulasa: Sembrar la colonia en 0,5 ml de caldo comn. Incubar 18 horas a 37C. Aadir una gota de plasma de conejo. Incubar a 37C. En caso positivo aparece un cogulo a las pocas horas (puede leerse la prueba al da siguiente). La coagulasa puede detectarse tambin mediante tcnicas comerciales (Prctica 7). c) Sensibilidad a novobiocina: Inocular una placa segn la tcnica del antibiograma de difusin (Prctica 6). Colocar un disco de 5 g de novobiocina. Incubar una noche a 37C. Un halo de menos de 16 mm significa resistencia. 4.3.2. Estreptococos. La identificacin de estreptococos, una vez comprobada la tincin de Gram y el carcter catalasa-negativa parte de la observacin de la hemlisis en agar sangre: Examinar las colonias crecidas 24 horas en una placa de agar sangre. Observar si hay -hemlisis: halo transparente alrededor de las colonias (S. pyogenes); hemlisis: halo verdoso (los grupos Streptococcus milleri, S. mutans, S. salivarius y S. sanguis, denominados globalmente estreptococos viridans, y Streptococcus pneumoniae); o no hay hemlisis (S. lactis y otros). BacitracinaS BacitracinaR OptoquinaS OptoquinaR BacitracinaR OptoquinaR S. pyogenes (Grupo A). Confirmar serolgicamente S. agalactiae (Grupo B). Hacer prueba CAMP e hidrlisis del hipurato. Otros serogrupos (C, G) S. pneumoniae. Confirmar por solubilidad en bilis o serologa Bilis-esculina ( ): estreptococos viridans Bilis-esculina (+): Enterococcus (Grupo D)

-hemlisis:

-hemlisis:

Sin hemlisis, o variable

Enterococcus spp. puede dar cualquier tipo de hemlisis (aunque no suele ser hemoltico), y si se sospecha su presencia (por ejemplo, en orina) no es preciso este primer paso. Material necesario: Placa con agar sangre. Discos de optoquina y bacitracina. Pinzas. 1 tubo con 0,5 ml de caldo glucosado. NaOH 0,5 N.

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Desoxicolato sdico al 10 %. Pipetas de 1 ml. estriles. 1 tubo de agar bilis-esculina.

Tcnicas: Sensibilidad a la bacitracina: Sembrar la bacteria por estra apretada en placa de agar sangre, poniendo en la superficie un disco impregnado con 0,2 U de bacitracina en la zona donde se espera crecimiento confluente. Incubar 24 horas a 37 C. Streptococcus pyogenes (Grupo A) es sensible, producindose un halo de inhibicin alrededor del disco. Sensibilidad a la optoquina: Se siembra la bacteria en la superficie de una placa de agar sangre donde se deposita un disco impregnado con una solucin de 1/4000 de optoquina. Incubar a 37C, 24 horas. Streptococcus pneumoniae no crece en la zona de accin de la optoquina, los dems estreptococos s. Solubilidad en bilis: Se resiembra la bacteria en 0,5 ml de Caldo glucosado. Incubar a 37 C, 18 horas. Aadir una gota de sosa 0,5 N y una gota de desoxicolato sdico al 10 por 100. En caso positivo se observar inmediatamente el aclaramiento de la suspensin. Streptococcus pneumoniae se lisa en presencia de bilis, los dems estreptococos no. Hidrlisis del hipurato: Esta prueba se describe en el apartado 4.5.2.1. Streptococcus agalactiae da positiva esta prueba; son los nicos estreptococos -hemolticos que lo hacen. Prueba de bilis-esculina: Sembrar por estra en la superficie del agar inclinado bilis-esculina. Incubar 24 horas. Si la bacteria crece e hidroliza la esculina, el producto de su hidrlisis (esculetina) reacciona con el citrato de hierro dando coloracin negruzca. Los enterococos dan positiva esta prueba. Prueba CAMP: Inocular una cepa de Staphylococcus Staphylococcus Streptococcus aureus productora de -lisina aureus agalactiae en una placa de agar sangre, trazando una sola estra siguiendo un dimetro. Inocular las bacterias a identificar trazando estras perpendiculares a la primera, pero que no lleguen a tocarla (Figura 4.1). Incubar a 37C durante 18-24 h. El resultado positivo se manifiesta por una zona de hemlisis intensa en la confluencia de las estras, en Listeria forma de flecha apuntando a la monocytogenes estra de S. aureus. Los Figura 4.1. Prueba CAMP. estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae) producen una hemolisina cuyo efecto es potenciado por la -lisina de S. aureus, una fosfolipasa C que afecta a la membrana de los hemates.

4.4. COCOS GRAM-NEGATIVOS.

Nos referiremos slo a los pertenecientes a los gneros Neisseria y Moraxella.

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Se caracterizan preliminarmente por su morfologa de cocos Gram-negativos en parejas, semejando granos de caf, y por dar positivas las pruebas de la catalasa y de la oxidasa. La identificacin se completara mediante pruebas bioqumicas. Los ensayos de oxidacin de azcares son difciles de realizar, y se recomienda el empleo de alguno de los mtodos comercialmente disponibles. 4.4.1. Material necesario: Colonias aisladas de la bacteria problema. Colorantes para tincin de Gram. Agua oxigenada de 30 volmenes. Tira de papel con reactivo de oxidasa. 4.4.2. Tcnica: Catalasa: Ya descrita en el apartado 4.3. Oxidasa: Se trazan rayas con el asa cargada de bacterias sobre tiras de papel impregnadas en solucin acuosa al 1 por 100 de tetrametil-p-feniln-diamina. En caso positivo el papel cambia de color pasando a azul oscuro o negro.

4.5. BACILOS GRAM-NEGATIVOS.

Dada la variedad de especies existentes, es preciso tener en cuenta el origen de la muestra, la etiologa posible y los medios de cultivo empleados en su aislamiento. En principio pueden distinguirse aquellas que crecen en medios no enriquecidos y en medios propios para enterobacterias, que pueden pertenecer al grupo de las enterobacterias o al de los no fermentadores de azcares. Son bacterias que se aslan muy frecuentemente en laboratorios clnicos. Otras bacterias se aslan slo como resultado de un bsqueda especfica, utilizando medios especiales; podemos citar Vibrio y Campylobacter, y por otra parte los nutricionalmente exigentes como Haemophilus, Brucella, Bordetella y Legionella. Consideraremos aqu nicamente la identificacin de enterobacterias y de algunos otros bacilos Gram-negativos. 4.5.1. Identificacin de bacilos Gram-negativos no fermentadores. La identificacin puede iniciarse por la prueba de la oxidasa y la de oxidacin/fermentacin de glucosa (O/F) como se indica a continuacin, pero a menudo las bacterias no fermentadoras se identifican tras un fracaso en el intento de clasificarlas como enterobacterias, al comprobar que no fermentan ni lactosa ni glucosa en el medio de Kligler (tubo "rojo/rojo"). Material necesario: Cultivo puro de la bacteria problema. Tiras de papel con reactivo de oxidasa. Dos tubos con medio de Hugh y Leifson. Este medio contiene glucosa y azul de bromotimol, como indicador de pH. Se dispensa en tubos estrechos y largos, para dificultar la difusin del oxgeno, y se hierve brevemente antes de utilizarlo, para eliminar el oxgeno disuelto. Permite distinguir el metabolismo oxidativo del fermentativo. Vaselina estril. Pipetas Pasteur estriles. 1 placa con medio agar F (medio King B). 1 placa con medio agar P (medio King A).

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Tcnicas: a) Oxidasa: Se realiza como se explic en 4.4.2. El resultado de esta prueba permite iniciar la clasificacin atendiendo al siguiente esquema: OXIDASA + + + O/F +/ / +/+ +/ +/ +/+ BACTERIA Pseudomonas Alcaligenes Vibrio Acinetobacter (INMVIL) Stenotrophomonas maltophilia (MVIL) Enterobacteriaceae

b) Oxidacin/Fermentacin (O/F): Sembrar la bacteria en picadura en dos tubos con medio Hugh y Leifson, utilizando una pipeta Pasteur con la punta cerrada. Cubrir uno de ellos con vaselina estril. Incubar a 37 C, 48 horas. Las bacterias fermentadoras producen cido de la glucosa independientemente de la existencia de oxgeno; por tanto, los dos tubos viran a amarillo (+/+). Las bacterias oxidativas (metabolismo respiratorio) slo utilizan la glucosa en el tubo descubierto; el medio es capaz de detectar la acidificacin producida por el CO2 disuelto y por tanto vira al amarillo slo el que est sin cubrir de vaselina (+/-). Si no vira ninguno (-/-), la bacteria no utiliza azcares. c) Deteccin de pigmentos: A partir de una colonia aislada sembrar dos o tres estras paralelas en una placa de agar F y otra de agar P. Incubar a 37C. La presencia de Pseudomonas aeruginosa sobre la placa de agar F se manifiesta por la aparicin de un pigmento amarillo fluorescente (fluorescena) difusible en el medio, y un pigmento azul (piocianina) sobre la placa de agar P. Pseudomonas fluorescens slo produce fluorescena. La composicin de sales de cada uno de estos medios potencia la produccin de uno de los pigmentos e inhibe la del otro. Extraccin de piocianina: aadir 1-2 ml de cloroformo al medio para extraer el pigmento piocianina que es soluble en cloroformo. Dejar en reposo el tubo y esperar a que se formen dos capas: en la parte superior quedar el cloroformo con el pigmento. Observacin de fluorescencia: Iluminar las placas con una lmpara de luz ultravioleta, en la oscuridad. La fluorescena emite fluorescencia, la piocianina no. P. aeruginosa : CRECE A 42 PIOCIANINA +; FLUORESCEINA + C; C; Pseudomonas P. fluorescens : CRECE A 4 PIOCIANINA ; FLUORESCEINA + Otras especies 4.5.2. Identificacin de Campylobacter jejuni El gnero Campylobacter agrupa bacilos Gram-negativos de morfologa curvada (a menudo con doble curvatura) y mviles. nicamente pueden cultivarse en condiciones de microaerofilia. Si se aslan a partir de muestras de heces colonias sospechosas (grises, dejando algunas de ellas un rastro alargado en la direccin de la siembra) en un medio selectivo para Campylobacter (como el medio de Campy-BAP), se proceder a su identificacin. Comprubese primero la tincin de Gram y la morfologa; puede hacerse tambin una prueba de movilidad al microscopio. Las colonias deben dar positivas las pruebas de la catalasa (4.3) y oxidasa (4.4). Con estos resultados puede clasificarse como Campylobacter sp. Campylobacter jejuni es la especie que suele causar diarrea en el ser humano, y se caracteriza por su capacidad de hidrolizar el

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hipurato. Campylobacter coli no hidroliza el hipurato, y Campylobacter fetus no crece a 42 C, por lo que no puede haberse aislado en las condiciones empleadas. 4.5.2.1. Hidrlisis rpida del hipurato. Esta tcnica puede emplearse tambin para otras bacterias. Material necesario: Cultivo puro de la bacteria problema. Cultivo puro de una bacteria hipurato-negativa (Enterococcus faecalis). Solucin de hipurato sdico al 1% en agua destilada (recin preparada o conservada congelada como mximo durante 6 meses). Reactivo de ninhidrina: 3,5 g de ninhidrina en 100 ml de acetona/butanol a partes iguales (v/v). Tcnica: Inocular una suspensin densa de bacterias en un tubo de hipurato. Preparar tambin un control negativo. Incubar 1-2 horas a 35C en bao de agua. Aadir 0,2 ml de reactivo de ninhidrina. Si aparece un color morado intenso la prueba es positiva (puede necesitar 15 minutos ms de incubacin). 4.5.3. Identificacin de enterobacterias (Enterobacteriaceae). Son bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, oxidasa-negativa, catalasa-positiva, que fermentan la glucosa y reducen los nitratos. Su identificacin se basa en pruebas bioqumicas, que pueden realizarse en una batera de tubos o utilizando un sistema comercial (Prctica 7). Con fines didcticos, la batera de pruebas se dividir en dos partes, escogiendo las pruebas de la segunda parte en base a los resultados de la primera. La prueba ms importante es la que se realiza en medio Kligler o T.S.I. 4.5.3.1. Primera batera de identificacin. Material necesario: 1 tubo con medio de Kligler o T.S.I. (Hierro-Tres- Azcares) 1 tubo con agua de peptona. 1 tubo con medio agar movilidad. 1 tubo con agar citrato de Simmons. 1 tubo con agar urea Christensen. Reactivo de Ehrlich (p-dimetil-amino-benzaldehdo). Tcnicas: a) Siembra en medio Kligler: Con el hilo recto se toma de la colonia y se siembra en picadura; despus se siembra en la superficie por estra. Incubar a 37C durante 24 horas. Observar los resultados: Fermentacin de glucosa: fondo amarillo. Fermentacin de lactosa: superficie amarilla. Produccin de SH2: picadura negra. Produccin de gas: burbujas o rotura del agar. Como la concentracin de glucosa es baja, su fermentacin afecta slo al fondo del tubo, en condiciones poco aerbicas. En la superficie del agar la bacteria respira, con lo que la produccin de cido es menor, ya que el CO2 se elimina. La concentracin de lactosa es diez veces mayor, con lo que la produccin de cido es suficiente para el viraje del indicador incluso en la superficie del agar inclinado. En realidad, la fermentacin de lactosa enmascara la de glucosa, pero esto no importa, pues para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar glucosa. El SH2 producido se detecta en forma de sulfuro de hierro.

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b) Produccin de indol: Se siembra en agua de peptona. Incubar a 37C, 24-48 horas. Aadir unas gotas de reactivo de Ehrlich resbalando por la pared del tubo. En caso positivo aparece un anillo rojo en la interfase. Esto es debido a la reaccin con el indol producido por la bacteria a partir del triptfano. c) Movilidad: Sembrar por picadura con hilo recto en medio agar movilidad. Incubar a 37C, 48 horas. Observar si el crecimiento est slo en la picadura o se extiende a los lados de ella. La baja concentracin de agar de este medio (3 por mil) permite que las bacterias lo invadan si son mviles. d) Crecimiento en citrato: Sembrar en la superficie inclinada del medio de Simmons. Cultivar a 37C, 24 horas. En caso positivo el medio vira de verde a color azul. El medio contiene citrato sdico como nica fuente de carbono. Las bacterias capaces de utilizarlo alcalinizan el medio, y hacen virar el indicador azul de bromotimol, a la vez que muestran crecimiento en superficie. e) Produccin de ureasa: Sembrar en estra en la superficie inclinada del agar urea de Christensen. Incubar a 37 C, 24 horas. En caso positivo aparece color rojo cereza. Es debido a la alcalinizacin del medio por produccin de amonio a partir de la urea que contiene el medio, lo que hace virar el rojo de fenol. Intentar la identificacin mediante la Tabla 4.1. Si no se puede completar, prepare una segunda batera de pruebas. 4.5.3.2. Segunda batera de identificacin. Si la bacteria no ha fermentado la lactosa en el medio de Kligler es imprescindible hacer la prueba del O.N.P.G. para determinar si es fermentadora lenta o si realmente no es fermentadora de lactosa. Las dems pruebas se escogern segn necesidades de identificacin. Material necesario: 2 tubos con medio de Clark y Lubs (caldo tamponado con glucosa) 1 tubo con agar de fenilalanina. 1 tubo con 0,5 ml de agua destilada estril. 1 disco de papel impregnado con O.N.P.G. Solucin de alfa naftol al 6% en etanol de 60. Solucin de sosa al 16 por 100. Solucin de rojo de metilo al 0,5% en etanol de 60. Solucin de cloruro frrico al 10%. Tcnicas: a) O.N.P.G. (orto-nitrofenil--D-galactopiransido): Hacer una suspensin espesa de la bacteria en 0,5 cc de agua destilada estril, poner un disco de O.N.P.G. Incubar a 37C, 2 horas. En caso positivo aparece color amarillo. El O.N.P.G. penetra en la bacteria y es hidrolizado por la -galactosidasa, liberndose nitrofenol de color amarillo. b) Rojo de metilo: Sembrar en medio Clark y Lubs e incubar 48 h a 37C. A 2 ml del cultivo se aaden dos gotas de la solucin de rojo de metilo. En caso positivo aparece color rojo. El rojo de metilo vira a pH muy bajo, detectando nicamente la produccin de grandes cantidades de cidos, tpico de la ruta fermentativa cido-mixta. c) Voges-Proskauer: Sembrar en medio Clark y Lubs e incubar 48 h a 37 C. A 1 ml del cultivo se agrega 0,5 ml de solucin de alfa naftol y 1 ml de solucin sosa. Se agita. En caso positivo a los 10 minutos aparece un color rosa. El alfa-naftol da un complejo coloreado al reaccionar con la 2,3-butanodiona, formada por

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oxidacin en medio alcalino del 2,3-butanodiol, que han producido las bacterias que llevan a cabo la fermentacin butiln-gliclica. d) Desaminacin de la fenilalanina (APP): Sembrar la bacteria en la superficie del medio agar-fenilalanina. Incubar a 37C, 24 horas. Aadir unas gotas de solucin de cloruro frrico. En caso positivo aparece coloracin verde. Las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa transforman dicho aminocido en cido fenil pirvico (APP), que da reaccin coloreada con el cloruro frrico. Esta prueba puede sustituirse por la desaminacin del triptfano (TDA: triptfanodesaminasa), que da lugar a la formacin de cido indolil-pirvico. Una vez realizadas todas las pruebas, determinar el gnero y la especie con ayuda de la Tabla 4.1.

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TABLA 4.1. CLASIFICACIN DE ALGUNAS ENTEROBACTERIAS SEGN PRUEBAS BIOQUMICAS. MEDIO DE KLIGLER TSI INCLINADO FONDO GAS SH2 Escherichia coli Klebsiella spp. Enterobacter spp. Citrobacter freundii Citrobacter diversus Serratia spp. Shigella spp. Salmonella typhi Salmonella spp. Proteus mirabilis Proteus vulgaris Yersinia enterocolitica A A A V V K K K K K K K* A A A A A A A A A A A A + + + + + -/+ -/+ + + +/+ + INDOL + -/+ + V + +/CITRATO + + + + V + +/-/+ UREASA +/V +/+/-/+ + + +/APP + + ONPG + + + + + + -/+ + MVIL + + + + +/+ + + + - ** RM + V + + V + + + + + + VP V + V +/-

A: acidifica; K: alcaliniza; V: variable segn especies (los resultados pueden variar segn la cepa, y muchos de ellos slo pueden considerarse orientativos). RM: Rojo de metilo; VP: Voges-Proskauer. *En TSI acidifica por fermentacin de sacarosa. **Inmvil a 37C; mvil a 25C.

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PRCTICA 5. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIN EN AGAR

6.1. INTRODUCCIN.
Se pretende evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de difusin en agar. El mtodo de dilucin se describe en la Prctica 7. Se utilizarn dos mtodos; el mtodo clsico puesto a punto por Kirby y Bauer, conocido vulgarmente como el mtodo "disco-placa", y el ms reciente epsilmetro o -test, que permite determinar directamente la concentracin mnima inhibitoria (CMI). La tcnica de antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa (Figura 1.2).

6.2. PREPARACIN DEL INCULO:

6.2.1. Material: Tubo con 10 ml de solucin salina. Cultivo de la bacteria problema. 6.2.2. Tcnica: Cultivar la bacteria aislada en un tubo de medio lquido apropiado (Caldo nutritivo, Infusin cerebro-corazn), o preparar una suspensin directa usando el siguiente mtodo: Tomar de una colonia aislada con el asa, y resuspender en el tubo de solucin salina frotando en la pared del tubo (Figura 6.1). Homogeneizar bien, y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez n 0.5 de McFarland (0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 M). Esto equivale aproximadamente a una densidad de 108 clulas/ml. Diluir si es necesario la suspensin, o aadir ms inculo.

Figura 6.1. Preparacin de una suspensin bacteriana.

6.3. ELECCIN DE LOS ANTIBITICOS A ENSAYAR:

Al no poder ensayarse todos los antibiticos existentes, debe hacerse una seleccin basada principalmente en la especie aislada y el tipo y lugar de la infeccin.

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Tabla 6.1. Eleccin de antimicrobianos para el antibiograma.

Antimicrobiano
Enterobacteriaceae

Pseudomonas aeruginosa y otros BGNNF*

Staphylococcus spp.

Enterococcus spp.

-LACTMICOS Penicilina 1a Oxacilina 1 Amipicilina o Amoxicilina 1 1 Amox.-c. clavulnico 1 2 2 Amp.-Sulbactam 2b Pipe.-tazobactam 2 2 Piperacilina o Ticarcilina 2 1b Cefazolina 1 1 Cefuroxima 2 Cefoxitima 2 Cefotaxima o Ceftriaxona 1 3 Ceftazidima 2 1 Cefepima 2 2 3 Imipenem o Meropenem 2 1 3 2 AMINOGLICSIDOS Estreptomicina 1c Gentamicina 1 1 1c Amikacina 2 1 3 Tobramicina 3 1 FLUOROQUINOLONAS Norfloxacino 4 2 Ciprofloxacino u Ofloxacino 1 1 2 Levofloxacino 1 1 3 2 MACRLIDOS Eritromicina o 1 Claritromicina o Azitromicina OTROS Clindamicina 2 Nirtrofurantona 4 4 4 Trimetoprim/Sulfametoxazol 2,4 1d 1 Cloranfenicol 3 3 3 Tetraciclina o Doxiciclina 3 3 3 3 Fosfomicina 2,4 2 2 3,4 Rifampicina 2 3 Vancomicina 1 1 Colistina 3 2 * BGNNF: bacilos gram-negativos no fermentadores. 1: Ensayar e informar siempre. 2: Ensayar e informar selectivamente. 3: Ensayar en un segundo nivel e informar selectivamente. 4: Ensayar e informar en patgenos urinarios. a Determinar la produccin de -lactamasas. b Slo ampicilina-sulbactam para Acinetobacter spp. c Alto grado de resistencia. d Para Stenotrophomas maltophilia y Burkholderia cepacia.

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6.4. ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIN SEGN KIRBY-BAUER

Se basa en la formacin en el gel de agar de un gradiente de concentracin de antibitico a partir de un disco impregnado con una determinada cantidad. Al crecer las bacterias inoculadas previamente sobre la superficie de la placa se forman halos de inhibicin alrededor de los discos, que define la zona en la que la concentracin de antibitico es mayor que la CMI. Por lo tanto, su dimetro est directamente relacionado con la CMI del antibitico, y permite determinar la sensibilidad o resistencia siempre que se respeten una serie de parmetros: espesor del medio en la placa, su composicin, inculo bacteriano y tiempo de incubacin, principalmente. No puede utilizarse para bacterias de crecimiento lento (> 24 h), porque desaparece el gradiente de concentraciones.

6.4.1. Material: Una placa con agar Mueller-Hinton. Hisopo o pipeta Pasteur. Pinzas. Discos de 6 mm de dimetro, impregnados cada uno con un antibitico, escogidos segn se ha descrito en el apartado anterior. 6.4.2. Tcnica: Impregnar una torunda con la suspensin del inculo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrar con ella toda la superficie de la placa, mediante estras cruzadas en varias direcciones. Antes de 15 minutos deben colocarse los discos de antibiticos. Con pinzas flameadas y fras (o con un aplicador automtico) se disponen los discos sobre las placas, de forma que disten unos 15 mm del borde de la placa y unos 30 mm entre s. En una placa de 9 cm caben 6 discos. Adherir cada disco al agar presionando ligeramente con las pinzas. A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 35-37 C (a 35 C como mximo para poder detectar Staphylococcus resistentes a meticilina) 6.4.3. Lectura. Se realiza a partir de las 16 horas (24 para detectar Staphylococcus resistentes a meticilina). Medir los halos con calibrador o regla graduada, considerando la zona que esta libre de crecimiento. En caso de bacteriostticos es aceptable un ligero velo dentro del halo. La presencia de colonias en el interior del halo indica contaminacin, cultivo mixto o aparicin de resistencia. Consultar la Tabla 6.2 para interpretar el antibiograma.

6.5. EPSILMETRO ( -TEST )

El epsilmetro o Epsilon-test (-test) es un mtodo cuantitativo de determinacin in vitro de sensibilidad a antibiticos por difusin. El sistema consiste en una tira de plstico impregnada con un antibitico en un gradiente de concentracin, que difunde en un medio de agar inoculado con el microorganismo. Tras la incubacin aparece un rea de inhibicin de forma elipsoidal (de ah el nombre de la tcnica). La concentracin mnima inhibitoria (CMI) se lee directamente en una escala dibujada sobre la tira, en el punto donde el elipsoide de inhibicin intersecciona con la tira. 27

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Mediante esta tcnica se puede determinar la sensibilidad a varios antibiticos en la misma placa, disponiendo las tiras segn los radios de la placa. En esta prctica se utilizar un slo antibitico, ya que se hace de forma complementaria al mtodo de Kirby-Bauer. 6.5.1. Material Una placa con agar Mueller-Hinton. Tiras de -test (conservadas congeladas hasta el momento de su utilizacin). Un tubo con 5 ml de agua destilada estril. Torundas estriles de algodn. Pinzas. Un cultivo puro del microorganismo problema. 6.5.2. Tcnica. Utilizar el inculo preparado como se ha descrito en el apartado 6.2. Impregnar la torunda con la suspensin del inculo y sembrar con ella toda la superficie de la placa de Mueller-Hinton. Con la ayuda de las pinzas (previamente flameadas y fras) coger una tira de -test y colocarla sobre la superficie del agar. Incubar a 37 C, 18-24 horas y realizar la lectura de la CMI. 6.5.3. Interpretacin. Leer la CMI sobre la tira de -test Interpretar el resultado en trminos de sensibilidad o resistencia, comparando la CMI con las concentraciones crticas indicadas en la Tabla 6.2.

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Tabla 6.2. Interpretacin del antibiograma (puntos de corte)

Antimicrobiano

Carga del disco (g)

Dimetro del halo de inhibicin (mm)

Resistente Intermedia Sensible

Punto de corte (CMI en g/ml)

Resistente Sensibl e

Penicilinas (y carbapenemas)
Ampicilina (Enterococcus) Amoxicilina/cido clavulnico Carbenicilina Mezlocilina Penicilina G (Staphylococcus) (Enterococcus) Oxacilina (S. aureus) (Estafilococos coagulasa ) Piperacilina Ticarcilina Ticarcilina/cido clavulnico Imipenem Meropenem 10 20/10 100 75 10 U <13 <16 <13 <19 <17 <28 <14 <10 <17 <17 <14 <14 <13 <13 14-16 -14-17 20-22 18-20 --11-12 -18-20 15-19 15-19 14-15 14-15 >17 >17 >18 >23 >21 >29 >15 >13 >18 >21 >20 >20 >16 >16 >32 >16 >16/8 >64 >128
lactamasa

<8 <8 <8/4 <16 <64

>16 >4 >0.5 >128 >128 >128/2 >16 >16 <0.1 <8 <16 <16 <16/2 <4 <4

1 100 75 75/10 10 10

Cefalosporinas (y monobactamas)
Cefalotina, Cefazolina,Cefamandol Cefuroxima (oral) Cefixima Cefoxitina Cefoperazonaa Cefotaxima
a, d

30 30 5 30 75 30 30 30 30

<14 <14 <15 <14 <15 <14 <13 <14 <15

15-17 15-22 16-18 15-17 16-20 15-22 14-20 15-17 16-21

>18 >23 >19 >18 >21 >23 >21 >18 >22

>32 >32 >4 >32 >64 >64 >64 >32 >32

<8 <4 <1 <8 <16 <8 <8 <8 <8

Ceftriaxona Cefepima, Ceftazidima Aztreonam

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Tabla 6.2. (Cont.) Interpretacin del antibiograma (puntos de corte)

Carga del disco (g) Dimetro del halo de inhibicin (mm)
Resistente Intermedia Sensible

Antimicrobiano Aminoglicsidos
Amikacina
Gentamicina (Enterococcus) Estreptomicina (Enterococcus) Kanamicina Netilmicina Tobramicina

Punto de corte (CMI en g/ml)

Resistente Sensible

30
10 120 300 30 30 10

<14
<12 6 6 <13 <12 <12

15-16
13-14 7-9 7-9 14-17 13-14 13-14

>17
> 15 >10 >10 >18 >15 >15

>32
>8 >500 >25 >32 >8

<16
<4 <500 <6 <12 <4

Fluoroquinolonas
Ciprofloxacino Levofloxacino Norfloxacino Ofloxacino 5 5 10 5 <15 <13 <12 <12 16-20 14-16 13-16 13-15 >21 >17 >17 >16 >4 >8 >16 >8 <1 <2 <4 <2

Otros antimicrobianos
Eritromicina Clindamicina
e

15 2 30 200 300 30 1,25/23,75 30 30

<13 <14 <12 <12 <14 <14 <10 -<14

14-22 15-20 13-17 13-15 15-16 15-18 11-15 -15-16

>23 >21 >18 >16 > 17 >19 >16 >15 >17

>4 >4 >32 >256 >128 >16 >8/152 >32 >32

<1 <0.5 <8 <64 <32 <4 <2/38 <4 <4

Cloranfenicol Fosfomicina (+ G6P) Nitrofurantoina Tetraciclina Trimetoprim/sulfametoxazol Vancomicina (Staphylococcus) (Enterococcus)

a

Elaborada con datos del NCCLS, 2000 (ahora, CLSI). No debe usarse con fines clnicos sin actualizar; vase http://www.srga.org/eucastwt/WT_EUCAST.htm; http://www.clsi.org. o o Sensible: Indica que la bacteria es inhibida por las concentraciones de antibitico que se alcanzan normalmente con la dosificacin recomendada para el lugar de la infeccin Intermedio: Indica eficacia clnica slo en tejidos donde se concentra fisiolgicamente el antibitico, o cuando la baja toxicidad permite utilizar dosis ms altas de lo normal. Tambin indica que los resultados pueden situarse en una zona de error atribuible a variaciones normales en la metodologa del ensayo. Resistente: Indica que la bacteria no es inhibida por las concentraciones de antibitico que se alcanzan normalmente, o que los resultados son indicativos de la existencia de un mecanismo de resistencia, o que el tratamiento no va a ser eficaz segn la experiencia disponible.

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PRCTICA 6. IDENTIFICACIN BACTERIANA Y DETERMINACIN DE LA CMI MEDIANTE PANELES COMERCIALES

7.1. INTRODUCCIN.
Los paneles de micropocillos que contienen sustratos o distintas concentraciones de antibiticos, en forma liofilizada o congelada, permiten identificar bacterias y determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de varios antibiticos de forma rpida y sencilla. Es suficiente aadir el inculo bacteriano al panel (con lo que se hidrata a la vez el sustrato o el antibitico), incubar unas 18 horas, y detectar el crecimiento o las reacciones bioqumicas. La deteccin puede hacerse en la mayora de los casos mediante equipos informatizados, que interpretan los resultados. El sistema escogido en este caso es el panel Wider MIC/ID para bacterias Gram-negativas, que permite determinar la CMI de 16 antibiticos por microdilucin en caldo e identificar la bacteria a nivel de especie mediante 26 pruebas bioqumicas. 7.2. Material: Colonias aisladas de la bacteria problema. Tubo con 3 ml de agua destilada. Tubo con 10 ml de agua destilada/0,5% Tween 80. Paneles Wider GRAM-NEGATIVOS REV2. Aplicador. 7.3. Preparacin del inculo: Tomar 4 5 colonias (ms si son muy pequeas) con el asa de siembra y resuspenderlas homogneamente en 3 ml de agua destilada frotando en la pared del tubo (Figura 6.1). Ajustar a la turbidez del patrn 0,5 de McFarland, aadiendo ms cultivo o ms agua, segn sea preciso. Pasar 0,1 ml a un tubo con 25 ml de agua destilada/0,5% Tween 80. 7.4. Inoculacin del panel: Verter los 10 ml de inculo en la placa de inoculacin. Cargar el inoculador y descargarlo sobre los pocillos del panel. Cubrir con aceite mineral los pocillos que aparecen subrayados (GLU, URE, H2S, LYS, ARG, ORN y DCB). Apilar unos 5 paneles y cubrir con una tapa o un panel vaco. Incubar 18-20 horas a 36C.

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Tabla 7.1. Antibiticos utilizados en el panel Wider GRAM-NEGATIVOS REV2 y puntos de corte para su interpretacin.
Antimicrobiano Penicilina* Amoxicilina Amoxicilina/Clavulnico Piperacilina/Tazobactam Cefalotina Cefuroxima Cefoxitina Ceftazidima Ceftazidima/Clavulnico** Cefotaxima Cefotaxima/Clavulnico** Cefepima Imipenem Ertapenem Meropenem Kanamicina** Gentamicina Tobramicina Amikacina Nitrofurantona Acido nalidxico Ciprofloxacino Minociciina Aztreonam Trimetoprim/Sulfametoxazol Fosfomicina Colistina Abreviat. P AMX A/C P/T CF CFX CX TAZ TZ/C CTX CT/C CFP IMI ETP MER K GM TO AK FD NA CIP MIN AZT T/S FOS CL Concentraciones 4 1684 16/88/44/2 64/432/416/ 4 8 1684 168 168421 8/41/4 8421 8/41/4 8421 8421 42 842 4 842 84 1684 64 16 210,12 842 81 4/762/38 6416 4 4 4 8 64 4 0,12 2138 16 2 16 16 32 128 32 4 8/152 64 8 4 4 16 32 16 1 4 8 2/38 64 2

MENSURA S 8 8/4 16/4 4 4 4 1 1 1 1 1 2 -*** 1 R 32 32/16 128/4 32 32 32 8 8 8 8 8 16 16 S 8 8/4

CLSI R 32 32/16 128/4 32 32 32 32 32 64 64 32 16 8 16 16 16 64 128 32 4 16 32 4/76 256 8

16/4 8 8 8 8 8 8 8 8 4 2 4

* Estos antibitico se emplean en el panel slo con fines de identificacin. ** Estas combinaciones no se usan en teraputica, sino para detectar lactamasas de espectro ampliado (ESBL). La sensibilidad a la combinacin, unida a resistencia al antibitico solo, indica produccin de ESBL. ***En estos casos el panel est validado slo para los criterios CLSI.

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Tabla 7.2. Interpretacin de las pruebas bioqumicas del panel Wider REV2

7.5. Lectura del panel: Quitar el agua de condensacin del fondo del panel El pocillo control (-) debe estar transparente, y el control (+) mostrar crecimiento. En caso contrario, deschese el panel. 33

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7.5.1. Pruebas bioqumicas. Para la lectura de pruebas bioqumica consulte la Tabla 7.2. En algunos pocillos es necesario aadir los correspondientes reactivos. Rellene con los resultados la plantilla que aparece en el Informe de la Prctica. Utilice la siguiente clave dicotmica para una primera identificacin:

+ Escherichia Klebsiella Enterobacter Citrobacter Serratia Yersinia ONPG Salmonella Shigella Proteus Providencia
Morganella

+ Klebsiella Enterobacter Serratia Citrobacter CITRATO Escherichia coli

Yersinia

+ Enterobacter (INDOL,VP,LACTOSA+) Serratia (INDOL, LACTOSA TARDA) Citrobacter diversus (INDOL+ VP+) ODC Klebsiella (INMVIL, UREASA RPIDA) Citrobacter freundii (MVIL, UREASA /+) + E. coli (MVIL, LACTOSA+) LDC Yersinia (INMVIL, LACTOSA) + Proteus mirabilis (INDOL,SH2+) Morganella morganii (INDOL+, SH 2 ) ODC Proteus vulgaris (SH2+)
Providencia (SH2 )

+ Proteus Providencia Morganella APP Salmonella Shigella

+ Salmonella (MVIL, SH2+) CIT Shigella (INMVIL, SH2)

Confirme los resultados de la identificacin con los datos de la Tabla 7.3. Algunas pruebas del panel WIDER no aparecen en la citada tabla; es necesaria la informacin de la casa comercial para su interpretacin.

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Tabla 7.3. Identificacin bioqumica de algunos bacilos Gram-negativos. Pseudomonas aeruginosa Enterobacter aerogenes

Prueba bioqumica:

Siglas:

Oxidasa1 + Oxidacin/Fermentacin O/F F F F F F F F F F F F O ONPG + + + + + + -galactosidasa 2 Produccin de Indol IND + v v + + Rojo de metilo RM + (-) + (-) + + + + + + Voges-Proskauer VP + + + v Produccin de SH2 H2S - (+) + + + Ureasa URE + v (-) (+) + + v v APP (TDA) TDA + + + Lisina descarboxilasa LYS + + + + + Arginina dihidrolasa ARG (-) v v + Ornitina descarboxilasa ORN (+) + (-) + + (+) v + Utilizacin de citrato CIT + + + + - (+) (-) v + + Utilizacin de malonato MAL + + (-) + Utilizacin de tartrato TAR v + + + (+) (+) + v (+) (+) + v Hidrlisis de esculina ESC (-) + + + (-) V Produccin de cido a partir de: Glucosa GLU + + + + + + + + + + + Adonitol ADO + + v Arabinosa ARA v + + + + (+) v Inositol INO + + - (+) v v + Lactosa + + + v Melobiosa MEL v + + v + v Rafinosa RAF (-) + + v v Ramnosa RHA (+) + + + - (+) v Sorbitol SOR (+) + + + + + + v Sacarosa SUC (-) + + v + + + (-) v (+): habitualmente positivo; (-): habitualmente negativo; v: variable segn cepas. 1 Si es necesaria la prueba de la oxidasa debe realizarse por separado (ver apartado 4.4) 2 El pigmento de Serratia marcescens puede simular un falso positivo en la prueba del Indol.

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Aeromonas hydrophila + O + + + + v + + + + v +

Klebsiella pneumoniae

Yersinia enterocolitica

Serratia marcescens

Citrobacter freundii

Providencia stuartii

Proteus mirabilis

Proteus vulgaris

Escherichia coli

Salmonella sp.

Shigella sp.

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7.5.2. Antibiograma. Aplique la definicin de CMI a cada antibitico, teniendo en cuenta que los pocillos que aparecen transparentes el crecimiento ha sido inhibido, y en los que aparecen turbios hay crecimiento. Algunas situaciones dudosas se comentan en la Figura 7.1.

Figura 7.1. Interpretacin del crecimiento para la determinacin de la CMI en los paneles Wider.

Para determinar en cada caso si la bacteria es sensible o resistente utilice la Tabla 7.1.

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PRCTICA 7. TCNICAS DE AGLUTINACIN

5.1. INTRODUCCIN
Se describen dos tcnicas de aglutinacin aplicadas al diagnstico microbiolgico. Una de ellas es una aglutinacin pasiva, y se utiliza para la identificacin de Staphylococcus aureus. La otra tcnica es una aglutinacin directa para el serotipado de Salmonella.

5.2. IDENTIFICACIN DE Staphylococcus aureus POR AGLUTINACIN EN LMINA.

Los sistemas disponibles se basan en la actividad coagulasa de Staphylococcus aureus y en la presencia de protena A en la superfice de sus clulas. El reactivo consta de partculas de ltex (o de hemates de cordero, segn la marca comercial empleada) recubiertos de fibringeno (sensibilizados) y de anticuerpos IgG. La aglutinacin se produce tanto a travs de los anticuerpos (unin de la protena A a la regin Fc) como de la reaccin de coagulacin con el fibringeno, por lo que es suficiente que la cepa posea uno de los dos factores (coagulasa o protena A) para obtener un resultado positivo. 5.2.1. Tcnica. En una lmina o portaobjetos limpio se deposita una gota de reactivo. En ella se emulsiona con el asa una o dos colonias a analizar tomadas de una placa de medio Chapman-manitol. Se hace rotar suavemente el porta durante unos segundos. 5.2.2. Lectura e interpretacin. La aglutinacin debe aparecer en unos 15 segundos.

5.3. SEROLOGA DE Salmonella.

Las pruebas bioqumicas por s solas son insuficientes para diferenciar las cepas de una misma especie, y en el caso de Salmonella para asegurar que se trate de esa bacteria. Por tanto, las cepas que dan reacciones bioqumicas tpicas se someten a reacciones de aglutinacin para determinar los antgenos O y H (Tabla 5.1) 5.3.1. Material: Antisuero 1 tubo de solucin salina. Portaobjetos. Pipetas Pasteur. Cepa problema. Asa de cultivo. 37

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5.3.2. Tcnica: Depositar una gota de solucin salina en un portaobjetos limpio, con el asa de cultivo o con una pipeta Pasteur y emulsionar una colonia. Si el microorganismo est en fase lisa, no deben formarse agrupaciones ni grumos. Depositar una gota de antisuero polivalente en otro portaobjetos, tomar una colonia con asa de cultivo y emulsionarla hasta obtener una suspensin uniforme. La lectura se realiza de 1 a 3 minutos, observndose la presencia o ausencia de aglutinacin. 5.3.3. Interpretacin: Aglutinacin con suero polivalente. Si se ha utilizado un suero polivalente anti-Salmonella, un resultado positivo confirma la identificacin bioqumica. Los sueros polivalentes suelen contener anticuerpos contra los antgenos representativos de los grupos A, B, C, D y E, y contra el antgeno capsular Vi. De este modo se detectan los serovares ms comunes, as como Salmonella typhi, que puede dar reaccin negativa al enmascarar su antgeno Vi los antgenos somticos O. Un resultado negativo indica que no se trata de Salmonella o que pertenece a otros serogrupos diferentes, y requerira su comprobacin por un laboratorio de referencia. Aglutinacin con sueros especficos. Para identificar el serovar (por ejemplo, S. typhimurium o S. enteritidis ) es necesarios utilizar antisueros monovalentes contra antgenos O y H (Tabla 5.1). Tabla 5.1. Composicin antignica de algunos serotipos de Salmonella. Serotipo Serogrupo Antgenos O (y K) Antgenos H* Paratyphi A A 1,2,12 a/1,5 Paratyphi B B 1,4,5,12 b/1,2 Typhimurium B 1,4,5,12 i/1,2 Paratyphi C C 6,7,(Vi) c/1,5 Enteritidis D 1,9,12 g,m/1,7 Typhi D 9,12,(Vi) d * Antgenos correspondientes a la expresin de flagelos fase 1/fase 2

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PRCTICA 8. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Candida albicans

8.1. INTRODUCCIN.
En esta prctica se plantea la deteccin de levaduras patgenas y la identificacin presuntiva de Candida albicans. La muestra utilizada proviene de un supuesto exudado, por ejemplo vaginal o farngeo, tomado con el fin de diagnosticar una posible candidosis.

8.2. MATERIAL:
Torunda con muestra de exudado. Tubo con agua destilada estril. Tubo con 0,5 ml de suero de caballo. Una placa de agar-sangre (ver Prctica 1). Una placa de agar glucosado de Sabouraud. Es un medio selectivo para hongos, debido a su pH cido (5,6). El efecto inhibitorio puede completarse por adicin de antibiticos antibacterianos, como tetraciclina o cloranfenicol.

8.3. TCNICA:
8.3.1. Siembra. Se realiza con el hisopo segn el mtodo ya descrito (Prctica 1). Cuando se pretende aislar nicamente hongos se emplear el medio de Sabouraud; en caso contrario se utilizar agar-sangre. Lo mismo ocurre con la temperatura de incubacin: 25C para hongos, y 37C para levaduras y bacterias indistintamente. 8.3.2. Identificacin. Las colonias de Candida albicans son blancas y cremosas, con olor a levadura. Pueden observarse en fresco (a 40x) o teidas por el mtodo de Gram (los hongos salen Gram-positivos, aunque no lo sea su pared) y a 100x. 8.3.2.1. Prueba de la filamentacin: Resuspender una colonia aislada en 1 ml de agua destilada; tomar 2 3 gotas de esa suspensin y aadirlas al tubo con suero de caballo. Incubar a 37C durante 3 horas. Examinar una gota entre porta y cubre (a 40x) en busca de filamentos.

8.4. INTERPRETACIN.
La morfologa celular permite asegurar que se trata de una levadura. La produccin de filamentos permite identificar presuntamente a Candida albicans (tambin los produce Candida stellatoidea). La identificacin puede confirmarse mediante pruebas bioqumicas y de necesidades nutricionales (auxonograma).

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BIBLIOGRAFIA

Microbiologa Clnica. Prats G. Editorial Mdica Panamericana, Madrid, 2006. Bailey-Scott Diagnostic Microbiology, 11th Ed. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y Weisfsfeld, A.S. Editorial Mdica Panamericana, Madrid, 2004. Diagnstico Microbiolgico. Texto y atlas color, 5 Ed. Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger y W.C. Winn. Editorial Mdica Panamericana, 1999. Bacteriologa Clnica. Struther, J.K. y Westran, R.P. Masson, 2005. Microbiologa Sanitaria y Clnica. Rotger, R. Sntesis, 1997. Microbiologa Mdica, 2 Ed. Mims, C., J.H. Playfair, I.M. Roitt, D. Wakelin y R. Williams. Harcourt-Brace, 1999. Manual of Clinical Microbiology, 8th Ed. Murray, P.R. ASM Press, 2003.

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CALENDARIO DE PRCTICAS (normal)

1 SEMANA
LUNES

Teora:
Organizacin del laboratorio Infecciones del Tracto Urinario
PRCTICA 1: UROCULTIVO SIEMBRA (INDIVIDUAL)

Prctica:
PRCTICA 2: EXUDADO FARNGEO: (POR PAREJAS)TOMAR MUESTRA, TINCION DE GRAM SIEMBRA EN AGAR SANGRE

MARTES

Infecciones farngeas

PRCTICA 1: RECUENTO, TINCIN DE GRAM Y SIEMBRA DE PRUEBAS DE IDENTIFICACIN (PRCTICA 4) Recoger torunda para la toma de heces.

PRCTICA 2: OBSERVAR COLONIAS, TINCIONES DE GRAM, RESIEMBRA DE -HEMOLTICOS Y PRUEBA DE LA BACITRACINA (PRCTICA 4)

MIRCOLES

Gastroenteritis infecciosas (1)

PRCTICA 1: LEER PRUEBAS DE IDENTIFICACIN. SEMBRAR PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PRCTICA 3: COPROCULTIVO (INDIVIDUAL)

PRCTICA 2: LEER PRUEBA DE LA BACITRACINA HACER INFORME

JUEVES

Mtodos de difusin para el ensayo de la sensibilidad a antibiticos Gastroenteritis infecciosas (2)

PRCTICA 1 LEER PRUEBAS COMPLEMENTARIAS. PRCTICA 3: IDENTIFICACIN DE Campylobacter

PRCTICA 7: AGLUTINACIN DE Staphylococcus PRCTICA 6: ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIN Y TEST (sobre bacteria del urocultivo) PRCTICA 6: LEER ANTIBIOGRAMA Y TEST Y HACER INFORMES 2 Y 6.

VIERNES

PRCTICA 3: INTERPRETACIN DEL COPROCULTIVO. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PARA IDENTIFICACIN. PRCTICA 8 y 4: AISLAMIENTO DE Candida y Streptococcus agalactiae (POR PAREJAS)

2 SEMANA LUNES MARTES

Vaginitis y vaginosis

PRCTICA 6: INOCULACIN DE PANELES WIDER (Y MOVILIDAD) CON EL AISLAMIENTO DEL COPROCULTIVO. PRCTICA 6: LECTURA DE LOS PANELES WIDER: IDENTIFICACIN Y ANTIBIOGRAMA. PRCTICA 7: AGLUTINACIN DE Salmonella

PRCTICA 4: PRUEBA CAMP PARA Streptococcus PRCTICA 8: PRUEBA DE FILAMENTACIN DE Candida. PRCTICAS 4 y 8: LEER PRUEBAS CAMP Y FILAMENTACIN

Mtodos de antibiograma por dilucin

EXAMEN

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INFORME DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA CLNICA

APELLIDOS, NOMBRE:

GRUPO:

FECHA:

PRACTICA 1. ANLISIS MICROBIOLGICO DE ORINA.

Muestra n: Urocultivo Recuento: colonias/ml Bacteriuria: Significativa No significativa Identificacin (Prctica 4) Tincin de Gram:

Pruebas Bioqumicas:

Resultados:

Aglutinacin, si procede:

Resultado de la identificacin:

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Antibiograma: (Prctica 6) Antibitico (carga del disco): del halo: R/I/S

Antibitico recomendado (teniendo en cuenta el lugar de la infeccin y sus conocimientos de farmacocintica y toxicologa puede intentar escoger el antibitico ms apropiado entre los que son utilizables desde el punto de vista microbiolgico):

Resultado de Epsilon Test

Bacteria ensayada: Antibitico: CMI: Resultado (S R):

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PRACTICA 2. ANLISIS MICROBIOLGICO DE EXUDADO FARNGEO

Muestra propia: Descripcin y abundancia relativa de las distintas colonias: Hemlisis Tincin de Gram:

Pruebas de identificacin realizadas y resultado (si ha lugar):

Muestra facilitada en el laboratorio: Descripcin y abundancia relativa de las distintas colonias: Hemlisis Tincin de Gram:

Pruebas de identificacin realizadas y resultado:

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PRACTICA 3. COPROCULTIVO
Descripcin y abundancia relativa de las distintas colonias: Medio: Muestra propia: Muestra clnica:

Indique cul(es) de las colonias aisladas seleccionara para la identificacin mediante panel Wider, de qu muestra y medio proceden y por qu las identifica.

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PRACTICA 6. IDENTIFICACIN Y ANTIBIOGRAMA CON PANELES WIDER

Resultado de las pruebas bioqumicas:

*Estas pruebas de sensibilidad a distintos antimicrobianos slo pueden interpretarse utilizando el programa informtico suministrado por el fabricante 5

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Procedencia de la bacteria aislada:

Resultado de la identificacin segn el panel WIDER:

Aglutinacin, si procede:

Resultado del antibiograma segn el panel WIDER:

Antimicrobiano Amoxicilina Amoxicilina/Clavulnico Piperacilina/Tazobactam Cefalotina Cefuroxima Cefoxitina Ceftazidima Cefotaxima Cefepima Imipenem Ertapenem Meropenem Gentamicina Tobramicina Amikacina Nitrofurantona Acido nalidxico Ciprofloxacino Minociciina Aztreonam Trimetoprim/Sulfametoxazol Fosfomicina Colistina Abreviat. AMX A/C P/T CF CFX CX TAZ CTX CFP IMI ETP MER GM TO AK FD NA CIP MIN AZT T/S FOS CL CMI S R

Es productora de ESBL?

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PRACTICA 8. ANLISIS MICROBILOGICO DE EXUDADO VAGINAL

Resultado del cultivo (descripcin de las distintas colonias): En agar-sangre: 1: 1:
Tincin de Gram y/o observacin en fresco (esquema):

2:

2:

En agar Sabouraud:

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LEVADURAS Prueba de filamentacin (dibujo):

Resultado de la identificacin: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS Describa las pruebas de identificacin utilizadas y el resultado obtenido:

Resultado de la identificacin: