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AMINAS HETEROCCLICAS EN ALIMENTOS COCINADOS.

M Teresa Galceran Departament de Qumica Analtica. Facultat de Qumica. Universitat de Barcelona

Introduccin Diversos estudios epidemiolgicos han puesto de manifiesto que existe una estrecha relacin entre el tipo de vida y la incidencia del cncer en los seres humanos [1,2].As, ms de un 30% de los cnceres, especialmente de pulmn se han asociado con el consumo de tabaco [3]. Sin embargo, es la dieta el factor que contribuye en una mayor proporcin al desarrollo de tumores y de hecho, entre un 35% y un 45% de los cnceres se asocian a este factor. Hora bien, el efecto de la dieta vara en funcin del tipo de alimento, del modo de coccin, de su valor nutricional y de su composicin. Por lo que hace referencia a los mutgenos presentes en los alimentos hay que indicar que pueden provenir de distintas fuentes; as, pueden ser de origen natural como por ejemplo, las micotoxinas, las hidracinas y algunos alcaloides y flavonoides o bien pueden encontrarse en los alimentos como resultado de una contaminacin de los mismos como es el caso de los pesticidas, herbicidas o disolventes. Existe adems, una tercera categora de compuestos genotxicos entre los que se pueden citar las nitrosaminas, las nitrosoamidas, los hidrocarburos aromticos policclicos y las aminas heterocclicas y que son productos que se generan durante el procesado y coccin de los alimentos. Los compuestos pertenecientes a esta tercera categora presentan una caracterstica especial que los diferencia de otros contaminantes alimentarios y que hay que tener en cuenta en la evaluacin de la seguridad de los alimentos. Esta caracterstica se refiere a que para minimizar el riesgo de ingesta de los mismos puede ser necesario modificar algunos de los hbitos culinarios de la poblacin o bien los procedimientos de preparacin industrial de algunos alimentos. Las aminas heterocclicas: formacin e importancia Los primeros compuestos cancergenos que se detectaron en alimentos procesados trmicamente fueron los hidrocarburos aromticos policclicos. Sin embargo, a finales de los aos 70 Sugimura y colaboradores [4] descubrieron que en determinadas condiciones, el humo procedente de la coccin de alimentos ricos en protenas contena cantidades apreciables de sustancias mutgenas. Estudios posteriores pusieron de manifiesto que las partes ms tostadas de carnes y pescados asados presentaban un actividad mutgena notable debida a la presencia de unas substancias bsicas. Actualmente se han identificado 23 de estas substancias, todos ellas pertenecientes al grupo genrico de las aminas heterocclicas (HAs). Dependiendo del mecanismo de generacin y de los precursores, las HAs se pueden clasificar en dos grandes grupos, las carbolinas y los aminoimidazoazarenos. En la Figura 1 se muestran las estructuras de algunas de las aminas ms importantes. Las carbolinas tambin conocidas como aminas pirolticas, se forman a temperaturas superiores a los 300C por pirlisis de aminocidos o protenas va reacciones radicalarias. Estas aminas contienen en su estructura grupos piridoindol (Trp-P-1, Trp-P-2, A C, MeA C, harman, norharman) o piridoimidazol (Glu-P-1, Glu-P-2). El segundo gran grupo, los aminoimidazoazarenos (AIA), recibe el nombre genrico de aminas trmicas ya que se forman al cocinar alimentos ricos en protenas, como la carne o el pescado, a temperaturas inferiores a los 300C. Todas ellas contienen en su estructura el grupo 2-aminoimidazo y una quinolina 39

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(IQ, MeIQ), una quinoxalina (MeIQx, DiMeIQx) o un anillo de piridina (PhIP, DMIP). En general, los imidoazoazarenos son compuestos algo ms polares que las carbolinas, caracterstica que se utiliza para la agrupacin de las aminas heterocclicas en dos familias. Desde el punto de vista de su actividad mutagnica, y por tanto de su potencial cancergeno, se ha establecido, utilizando el test de Ames, que algunas de las aminas presentan un ndice de mutagenicidad ms de 1000 veces superior al del benzo(a)pireno lo que pone de manifiesto su elevada toxicidad potencial. De hecho, existen datos que demuestran que estos compuestos son cancergenos en ratones, ratas y primates en los que se han detectado tumores en diversos rganos como por ejemplo el hgado, los intestinos, el estmago, el pulmn, la piel y las glndulas mamarias [5].

Aminoimidazoazaarenos (AIAs)

Carbolinas

NH2 N N CH3 N IQ NH2 N CH3 N N MeIQx NH2 N C H3 C H3 N N 7,8-DiMeIQx CH3 N N PhIP N NH2 N DMIP N C H3 C H 3 C H3 N N CH3 C H 3 N N N MeIQ

NH2 N N CH3 CH3 N H AC N NH2 N N H MeAC C H3 N H2

NH 2 N N CH3 CH 3 N C H3 N H N N H Norharman

4,8-DiMeIQx NH 2 N N CH 3 CH3

Harman

CH3 N N NH2 H CH 3 Trp-P-1 N H Trp-P-2

CH 3 N N H2

N TriMeIQx

CH 3 N N

NH2

NH 2

N N Glu-P-2

NH 2

N C H3 Glu-P-1

Figura 1.- Estructuras de las aminas heterocclicas ms importantes

La formacin de las aminas heterocclicas durante el procesado industrial y/o culinario de los alimentos crnicos puede estar influida por algunos factores composicionales como la creatina presente en el tejido muscular, la grasa o el agua as como los azcares y los aminocidos. As, diversos estudios han puesto de manifiesto que la creatina es necesaria para la formacin de los aminoimidazoazarenos y que existe una relacin directa entre la cantidad de aminoacidos o pptidos de cadena corta y la actividad mutagnica resultante. En cuanto a los azcares, se ha demostrado que su presencia es necesaria para la formacin de las aminas aunque algunos autores han puesto de manifiesto que la adicin de glucosa o lactosa a la carne inhibe en parte la formacin de aminas y en consecuencia, disminuye la actividad mutagnica generada por la coccin. En la Tabla 1 se indican los precursores de algunas de las aminas 40

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heterocclicas ms frecuentemente estudiadas. El agua y los lpidos que contienen los alimentos parece que tambin tienen importancia en la generacin de compuestos mutagnicos dado que durante el proceso de coccin los precursores solubles en agua migran junto con sta a la superficie de los alimentos donde son expuestos a temperaturas relativamente altas que favorecen la reaccin de formacin de dichos compuestos. Esto explica que el nivel de actividad mutagnica de la superficie de la carne frita sea superior a la de la zona central, donde la temperatura es normalmente ms baja. El papel desempeado por los lpidos no est tan claro dado que algunos estudios sugieren que las grasas pueden hacer aumentar la formacin de las aminas heterocclicas al favorecer la transmisin del calor mientras que otros indican que la posible dilucin de los precursores en las grasas puede hacer disminuir la produccin de estos compuestos. Los antioxidantes tanto naturales como sintticos, como por ejemplo el butilhidroxianisol, parece que hacen disminuir la actividad mutagnica de la carne frita. TABLA 1.- PRINCIPALES PRECURSORES DE LA AMINAS
HETEROCCLICAS

Acrnimo
IQ MeIQ MeIQx 4,8-DiMeIQx 7,8-DiMeIQx PhIP Trp-P-1 Trp-P-2 Glu-P-1 Glu-P-2 A C MeA C

Precursores
creatina, glicina, fenilalanina, serina, prolina, fructosa, glucosa creatina, lanina, fructosa creatina, glicina, alanina, treonina, lisina, fructosa, glucosa, ribosa creatina, alanina, treosina, lisina, fructosa, glucosa, ribosa creatina, glicina, glucosa creatina, fenilalanina, glucosa triptfano triptfano cido glutmico cido glutmico globulina de semillas de soja globulina de semillas de soja

Diversos estudios llevados a cabo con modelos fisico-qumicos han puesto de manifiesto que la creatina y los productos de la reaccin de Maillard, originados a partir de la glucosa y algunos aminocidos tienen un papel importante en la formacin de los aminoimidazoazarenos. En la Figura 2 se muestra el proceso de formacin de estos compuestos propuesto por Jgerstad [6] donde se sugiere que la parte aminoimidazlica de la amina es aportada por la creatinina originada por ciclacin de la creatina mientras que el resto de la molcula proviene de la condensacin aldlica de una piridina o una piracina con un aldehdo, ambos generados a partir de la degradacin de Strecker de una hexosa y un aminocido. Adems de los factores composicionales, la aparicin de estos contaminantes en el tratamiento trmico de los alimentos proteicos est influida por otros factores como por ejemplo el material en el que se lleva a cabo el tratamiento, el tiempo, la temperatura y el tipo de coccin. Se ha observado que las aminas heterocclicas se empiezan a formar a los 100C y que la actividad mutagnica aumenta con la o temperatura hasta los 170 C - 200C. As en general, los tipos de coccin que implican temperaturas alrededor de los 100C como hervir en agua, hacer al vapor o estofar generan pocos agentes mutagnicos. Sin embargo, los tratamientos trmicos que implican un calentamiento mediante procesos conductivos como frer o asar conducen a un aumento de la actividad mutagnica.

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OC 6 H 12 O 6 R +NH 3 O

NH 2 HN N CH 3 HOOC

hexosa

aminocido Degradacin de Strecker

creatina
- H 2O
N H2 N CH 3

Y X

Z N CH 3

O C R

+
O

piridina o pirazina

aldehdo

creatinina

N Y X Z N

NH 2 N CH 3 R R, X e Y pueden ser H o CH 3 Z puede ser CH o N

aminoimidazoazaareno
Figura 2.- Formacin de los aminoimidazoazarenos (AIA)

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Mtodos de determinacin de las aminas heterocclicas Para evaluar el riesgo que supone la presencia de aminas heterocclicas en los alimentos es imprescindible disponer de metodologas analticas capaces de identificar y determinar estos compuestos a niveles de concentracin muy bajos, del orden de los ppb. Pero no es suficiente que la metodologa analtica utilizada sea sensible, tambin debe ser lo ms selectiva posible ya que los alimentos contienen una elevada cantidad de compuestos interferentes. Adems, la complejidad de las muestras requiere frecuentemente la utilizacin de etapas de preconcentracin y purificacin laboriosas que hacen aumentar el tiempo de anlisis y disminuir la reproducibilidad de los resultados. Por ello, es necesario establecer mtodos de anlisis que adems de ser selectivos y sensibles, sean rpidos, robustos e independientes de la matriz de la muestra. Las estrategias para conseguir una buena preconcentracin de las aminas heterocclicas y una adecuada limpieza de la muestra han sido ampliamente estudiadas en los ltimos aos [7] y el resultado ha sido el establecimiento de complejas metodologas analticas que incluyen varias etapas generales. En la primera de ellas se procede a una homogeneizacin y dispersin de la muestra utilizando disolventes orgnicos o bien disoluciones acuosas cidas, bsicas o neutras. El siguiente paso consiste en la separacin de las proteinas mediante centrifugacin, filtracin o adsorcin y a continuacin, las aminas heterocclicas se extraen con disolventes orgnicos y el extracto se somete a una limpieza ms exhaustiva utilizando varias etapas de particin cido-base o bien sorbentes suficientemente especficos, como por ejemplo adsorbentes polimricos, resinas de intercambio inico, fases de otadecilsilano sobre slice, inmunoadsorbentes y ms recientemente polmeros de huella molecular (imprinted polymers). Finalmente, se debe concentrar el extracto a fin de conseguir un nivel de concentracin de los analitos adecuado a la tcnica de determinacin a utilizar. De todos los mtodos de tratamiento de muestra propuestos en la bibliografa, el de ms amplia aceptacin es el que propuso Gian Gross [8] el ao 1990 y que utiliza una serie de columnas en tndem que permiten llevar a cabo las distintas etapas del proceso de tratamiento de la muestra con una cierta rapidez y seguridad. En la primera columna se coloca la muestra que se ha dispersado en hidrxido de sodio y mezclado con tierra de diatomeas. Al eluir con diclorometano los analtos quedan retenidos en una segunda columna que contiene propilsulfonato sdico (PRS). Posteriormente se activa el intercambior inico, se conecta la columna con una de octadecilsilano (C18), y se eluyen las aminas heterocclicas con acetato de amonio. En el extracto obtenido se encuentran los aminoimidazoazarenos. En la bibliografa se encuentran numerosas variantes de este mtodo de entre las cuales la ms utilizada es la propuesta por G. Gross y A. Grter en 1992 [9] que ha sido modificada por nuestro grupo de trabajo [10] y que es la que se indica en la Figura 3. En este mtodo se recogen los lavados procedentes de la columna de PRS y se procede a su tratamiento en una columna de C18 lo que permite recoger la fraccin denominada de las aminas apolares que contiene las carbolinas. As, adems de las ventajas aportadas por el tndem original, este mtodo permite el anlisis de las dos familias de aminas heterocclicas. Otra variante introducida por nuestro grupo de investigacin en el mtodo original consiste en la activacin del intercambior inico previamente a la retencin de los analitos [11], de manera que se preconcentran todas las aminas heterocclicas en una nica fraccin. Esta propuesta supone una reduccin tanto de material utilizado como del tiempo de anlisis aunque hay que sealar que el extracto es menos limpio que el obtenido utilizando el procedimiento comentado previamente. Algunos autores [12] recomiendan utilizar una etapa adicional de clean-up con resinas de intercambio inico que aunque consigue una mayor limpieza de los extractos tambin provoca un aumento del tiempo de anlisis y una disminucin en las recuperaciones ya de por s bastante bajas, entre el 40 y el 100% dependiendo del compuesto y del procedimiento.

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Extracto de carne 12 ml NaOH 1 M Extraccin con Extrelut-20 Elucin con 75 ml DCM Extraccin con PRS , 500 mg 1 elucin: a) 6 ml HCl 0,01 M b) 15 ml MeOH:HCl 0,1 M (60:40) c) 2 ml H 2 O Neutr. con 500l NH 3 Adic. 25 ml H 2 O Preconc. con C18, 500 mg Lavado con 2 ml H 2 O Elucin: 1,4 ml MeOH:NH 3 (9:1) Cambio de disolvente, 50l MeOH HPLC Aminas Apolares

2 elucin: 20 ml AcONH 4 0,5 M pH=8

Preconc. con C18 , 100 mg Lavado con 5 ml H2 O Elucin: 0,8 ml MeOH:NH 3 (9:1)

Cambio de disolvente, 50l MeOH HPLC Aminas Polares

Figura 3.- Esquema del procedimiento de clean-up.

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En cuanto a las tcnicas utilizadas para el anlisis de los extractos purificados, es de destacar el uso de la cromatografa de lquidos (LC) con deteccin espectrofotomtrica (UV), fluorimtrica o electroqumica y ms recientemente su acoplamiento a la espectrometra de masas [13]. De todos estos sistemas de deteccin el que se ha utilizado tradicionalmente es la espectrofotometra UV con instrumentos de series de diodos que permiten obtener informacin de los compuestos analizados [14]. Sin embargo, la selectividad y sensibilidad de los espectrofotmetros es baja y por esta razn con frecuencia, se utilizan simultneamente con un detector fluorimtrico que proporciona una mayor selectividad y sensibilidad para las aminas fluorescentes que son algunas carbolinas (Glu-P-1, Glu-P-2, Trp-P-1, Trp-P-2) y la PhIP [15]. Dado que las aminas heterocclicas pueden ser fcilmente oxidadas, la deteccion electroqumica es tambin una buena opcin para la determinacin de estos compuestos [16] aunque hay que sealar que con este tipo de deteccin no se puede obtener fcilmente informacin adicional que ayude a la identificacin. Sin embargo, la sensibilidad es elevada como puede observarse en la tabla 2 donde se dan los lmites de deteccin obtenidos con un detector amperomtrico y uno espectrofotomtrico (UV).

Tabla 2 - Lmites de deteccin obtenidos con distintos detectores (pg inyectados). Compuesto LC-EC LC-UV LC-MS (ESI-IT)
DMIP IQ MeIQx MeIQ 4,8-DiMeIQx Trp-P-2 Trp-P-1 PhIP A C MeA C 16 40 44 65 41 5 54 11 22 33 1300 1400 200 1300 200 200 200 1500 800 1000 67 22 9 8 5 7 4 13 27 15

Durante los ltimos aos y a raz del desarrollo de las tcnicas de ionizacin a presin atmosfrica (API), el acoplamiento de la cromatografa de lquidos a la espectrometra de masas (LC-MS) ha pasado a ser la tcnica ms recomendada para la determinacin de aminas heterocclicas en alimentos [17,18]. La ventaja ms importante del acoplamiento LC-MS es que permite la identificacin inequvoca de los analtos a partir del espectro de masas pero es que adems, los lmites de deteccin son muy buenos y similares o incluso mejores que los que pueden obtenerse por ejemplo con deteccin electroqumica como puede observarse en los valores recogidos el la tabla 2 que se han obtenido utilizando una fuente de ionizacin de electrospray y un ion-trap como analizador. Aunque la espectrometra de masas es una tcnica de elevada selectividad, cuando las concentraciones son muy bajas y las muestras son complejas puede resultar difcil cuantificar los analtos y en estos casos, resulta ventajoso trabajar con espectrometra de masas en tndem (LC-MS/MS) aunque este modo de trabajo requiere la utilizacin de instrumentos ms complejos que los espectrmetros de masas convencionales de un nico cuadrupolo. Niveles de aminas heterocclicas en alimentos cocinados Las aminas heterocclicas se han detectado en carnes de distinto origen (bovino, ovino, porcino y aves de corral) y en pescados fritos, a la plancha o a la parrilla y procedentes tanto de restaurantes como de casas particulares as como en productos precocinados, en extractos de carne, en aromatizantes comerciales y en los residuos que quedan en las sartenes o las planchas despus de la coccin. Tambin se ha descrito su presencia en muestras medioambientales y en algunas bebidas alcohlicas como el vino o la cerveza aunque lo ms frecuente es encontrarlas en alimentos proteicos que han sido 45

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sometidos a tratamientos trmicos a elevadas temperaturas. En la Tabla 3 se dan a modo de ejemplo, los intervalos de concentracin de las aminas heterocclicas que con ms frecuencia se encuentran en algunos tipos de alimentos, carnes y pescado, sometidos a diferentes procedimientos de coccin [19, 20]. Aunque los niveles de concentracin son muy variados, oscilan entre los 0.1 y los 40 ng/g, es de inters sealar que los valores ms elevados corresponden siempre a alimentos tratados a temperaturas altas y en algunos de estos casos, las concentraciones, especialmente para la PhIP, pueden alcanzar los 400 ng/g. En general, las cantidades de aminas producidas aumentan con la temperatura y el tiempo y se ha demostrado que para algunos compuestos, por ejemplo la PhIP, su formcin est favorecida a temperaturas elevadas. Tambin es interesante remarcar que las temperaturas relativamente bajas y los tiempos de coccin relativamente largos, favorecen la presencia de las aminas en los residuos de la sartn lo que es explicable por el transporte de los precursores de las aminas desde la carne a la sartn lo que produce como consecuencia una disminucin de estos compuestos en la superficie de los alimentos y un aumento en los residuos. Algunos estudios recientes indican que la concentracin de estos compuestos en la superficie de la carne puede disminuir si se cocina a temperatura relativamente baja y girando con frecuencia la carne. Uno de los problemas a remarcar en relacin con los datos de la bibliografa es que en la mayor parte de los trabajos en los que se indican los niveles de estos compuestos en alimentos no se describe con exactitud el procedimiento de coccin utilizado y adems, en algunos casos sobre todo en los trabajos ms antiguos, la temperatura se ha aumentado a fin de favorecer la formacin de las aminas y as poderlas detectar. Cabe destacar tambin que los mtodos de anlisis utilizados por los laboratorios que generan los datos pueden ser distintos y con frecuencia no han sido validados. Por ello, los valores de la bibliografa son difcilmente comparables entre s lo que lleva a pensar que pueden resultar poco representativos de la cantidad real de aminas heterocclicas que contienen los alimentos y que por tanto, puede afectar a la poblacin.

Tabla 3.- Contenido (ng/g) de varias HAs en diferentes muestras de alimentos cocinados. Muestra IQ MeIQx 4,8-DiMeIQx PhIP Ternera Frita n.d.-1.9 n.d.-12.3 n.d.-3.9 n.d.-67.5 A la plancha n.d-0.2 n.d.-6.0 n.d.-1.2 n.d.-290 a la parrilla n.d.-1.6 n.d.-4.4 n.d.-2.7 n.d.-38 Extracto n.d.-15 n.d.-20 n.d.-4.0 n.d.-10 Pollo Frito n.d. n.d.-3.0 n.d.-2.0 n.d.-70 A la plancha n.d. n.d.-6.1 n.d.-4.0 n.d.-315 a la parrilla n.d. n.d.-9.0 n.d.-3.1 n.d.-390 Cerdo Frito n.d.-0.1 n.d.-4.6 n.d.-3.3 n.d.-13.4 A la plancha n.d. n.d.-0.6 n.d.-0.2 n.d-6.6 Cordero Frito n.d. n.d.-0.6 n.d.-0.6 n.d.-2.3 A la plancha n.d. n.d.-1.6 n.d.-0.7 n.d.-11 Pescado Frito n.d.-0.2 n.d.-6.4 n.d.-0.1 n.d.-6.4 A la plancha n.d.-1.0 n.d.-4.6 n.d.-0.1 n.d.-51
n.d.: no detectado

En Espaa no existen estudios sobre la concentracin de estos compuestos en los alimentos y en este campo incide el trabajo que estamos llevando a cabo en nuestro grupo de trabajo que pretende establecer y validar metodologa analtica para la determinacin de las aminas heterocclicas en alimentos. Adems, tambin se pretende llevar a cabo una estimacin de la ingesta de aminas heterocclicas basada en encuestas sobre los platos de carne y pescado ms frecuentemente consumidos por la poblacin y en el anlisis de muestras de alimentos cocinados de modo tradicional y con distintos grados de coccin tanto en domicilios particulares como en restaurantes. 46

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Bibliografa R. Doll, R. Peto, The Causes of Cancer, Oxford Medical Publications. Oxford University Press, Oxford (1981) 1226-1235. [2] G. M. Williams, Nutr. International 1 (1985) 49. [3]J. H. Weisburger, Amer. J. Clin. Nutr. 71 (2000) 1710s. [4] M. Nagao, M. Honda, Y. Seino, T. Yahagi, T. Sugimura, Cancer Lett. 2 (1977) 221. [5] B. C. Pence, C. L. Shen, D. M. Dunn, M. Landers, M. Purewal, S. San Francisco, Z. Lebensm. Unters. Forsch. A 207 (1998) 455. [6] M. Jgerstad, A.Laser Reuterswrd, R. ste, R. Dahlqvist, S. Grivas, K. Olsson, T. Nyhammar, The Maillard Reaction in Foods and Nutrition, eds. G. Waller, M. Feather, ACS Series, 215 (1983) 507-519, Washington D.C. [7] F. Toribio, L. Puignou, M. T. Galceran, J. Chromatogr. B 747 (2000) 171. [8] G. Gross, Carcinogenesis 11 (1990) 1597. [9] G. Gross, Grter, J. Chromatogr. 592 (1992) 271. [10] M. T. Galceran, P. Pais, L. Puignou, J. Chromatogr. A 719 (1996) 203. [11] F. Toribio, L. Puignou, M. T. Galceran, J. Chromatogr. A 836 (1999) 223. [12] G. A. Perfetti, J. AOAC Int. 79 (1996) 813. [13] P. Pais, M. G. Knize, J. Chromatogr. B 747 (2000) 139. [14] R. Sinha, N. Rothman, C. P. Salmon, M. G. Knize, E. D. Brown, C. A. Swanson, D. Rhodes, S. Rossi, J. S. Felton, O. A. Levander, Food Chem. Toxicol. 36 (1998) 279. [15] P. Pais, C. P. Salmon, M. G. Knize, J. S. Felton, J. Agr. Food Chem. 47 (1999) 1098. [16] C. Krach, G. Sontag, Anal. Chim. Acta 417 (2000) 77. [17] P. Pais, E. Moyano, L. Puignou, M. T. Galceran, J. Chromatogr. A 775 (1997) 125. [18] F. Toribio, E. Moyano, L. Puignou, M. T. Galceran, J. Chromatogr. A 869 (2000) 307. [19] K. Skog, M. A. E. Johansson, M. I. Jgerstad, Food Chem. Toxicol. 36 (1998) 879. [20] M. G. Knize, C. P. Salmon, E. C. Hopmans, J. S. Felton, J. Chromatogr. A 763 (1997) 179. [1]

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