UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

AISLAMIENTO, SELECCIN, IDENTIFICACIN Y PRESERVACIN DE CEPAS QUERATINOLITICAS PARA LA DEGRADACIN DE PLUMAS DE POLLO

INTEGRANTES: - BUSTIILLOS MA. BELN - CARTUCHE DIANA - ESPINOSA CAROLINA - ESTRELLA MIGUEL - FEIJO TATIANA - PORRAS DIEGO

NOVENO SEMESTRE ALIMENTOS

2009 - 2010

INDICE

1. TEMA.......................................................................................................................................... 3 2. INTRODUCCIN ....................................................................................................................... 3 3. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 4 3.1 OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................... 4 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS.................................................................................................. 4 4. MARCO TEORICO ..................................................................................................................... 4 4.1 Plumas de Pollo ...................................................................................................................... 4 4.1.1 Caractersticas ................................................................................................................. 4 4.1.2 Usos ................................................................................................................................ 4 4.2 Microorganismos.................................................................................................................... 5 4.2.1 Degradadores Queratinolticos ......................................................................................... 5 4.2.2 Caractersticas Microbiolgicas ....................................................................................... 5 4.2.3 Metabolismo de las Bacterias Queratinolticas ................................................................. 5 4.2.4 Pares Oxido Reduccin ................................................................................................. 5 4.2.5 Reaccin de Degradacin de la Queratina ........................................................................ 6 4.2.6. Diagrama de Obtencin de Harina de Plumas sin Aplicaciones Biotecnolgicas ............. 6 4.2.7. Diagrama de Obtencin de Harina de Plumas con Aplicaciones Biotecnolgicas ............ 7 5. MARCO METODOLOGICO ...................................................................................................... 8 5.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS ............................................................................ 8 5.1.1 Muestreo ......................................................................................................................... 8 5.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS ......................................................................... 8 5.2.1 Diseo del Medio de Cultivo para Aislamiento y Seleccin de Cepas Queratinolticas ..... 8 5.2.3 Aislamiento y Enriquecimiento de Cepas Degradadoras de Plumas.................................. 8 5.2.4 Seleccin de Cepas Queratinoliticas................................................................................. 8 5.2.4.1 Criterios de Seleccin ................................................................................................... 9 5.2.5 Produccin de Biomasa ................................................................................................... 9 5.2.6 Preservacin de los Microorganismos .............................................................................. 9 6. RESULTADOS ......................................................................................................................... 10 6.1 Tabla de Caractersticas de las Cepas Degradadoras de Queratina......................................... 10 6.2 Tabla de Variacin de pH de las Cepas Degradadoras de Queratina ...................................... 11 6.3 Tabla de Variacin de Temperatura de las Cepas Degradadoras de Queratina ....................... 11 6.4 Tabla de Variacin de Concentracin de Sustrato de las Cepas Degradadoras de Queratina .. 12 6.5 Grfica de la Eficiencia de Degradacin Queratinoltica con respecto a los Criterios de Seleccin.................................................................................................................................... 12 6.6 Tabla de Resultados de las Pruebas Bioqumicas realizadas a la Cepa Seleccionada ............. 12 6.7 Curva de Crecimiento para el Bacillus spp. (Terica) ........................................................... 13 7. DISCUSIONES ......................................................................................................................... 13 7.1 Discusin sobre los Resultados ............................................................................................. 13 7.2 Discusin sobre la Industrializacin del Bioproceso ............................................................ 14 7.3 Discusin sobre las Modificaciones de Anteriores Investigaciones ....................................... 14 8. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 14 9. RECOMENDACIONES ............................................................................................................ 15 10. ANEXOS ................................................................................................................................. 16 11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ...................................................................................... 19

1. TEMA AISLAMIENTO, SELECCIN, IDENTIFICACIN Y PRESERVAC IN DE CEPAS QUERATINOLITICAS PARA LA DEGRADA CION DE PLUMAS DE POLLO

2. INTRODUCCIN

Es normal que en la mayora de plantas avcolas, los subproductos obtenidos del procesamiento de carne no son debidamente aprovechados, constituyendo un alto porcentaje de desechos que producen daos al medio ambiente debido al aumento de la carga microbiana presente en los suelos, constituyendo una fuente potencial de enfermedades que afectan tanto a los animales de granja como a los humanos obreros y consumidores. Generalmente las plumas, uno de estos subproductos, son destinadas a la elaboracin de harinas utilizadas como suplemento alimenticio para aves y otros animales de abasto. Este producto es obtenido mediante la combinacin de tratamientos trmicos (coccin a altas presiones) con tratamientos qumicos (cidos o alcalinos); procesos que no solo impiden la fragmentacin de los enlaces disulfuro presentes en la queratina de la pluma, convirtindola en una protena muy resistente que dificulta la degradacin enzimtica por parte de las aves, sino que tambin disminuyen el valor proteico de la harina a un 45% por la destruccin de algunos aminocidos. La produccin nacional de aves de corral es de 19,595.058, de los cuales un 44% corresponde a la produccin de pollo. El rendimiento de carne obtenido por el procesamiento de esta ave es de aproximadamente 75 %, lo que indica que el 25% restante pertenece a desperdicios o subproductos, en donde las plumas constituyen la mayor parte. (5) Dadas las tendencias actuales dirigidas hacia la bsqueda de procesos biotecnolgicos aplicables al tratamiento de los residuos agroindustriales y a la existencia de un alto potencial microbiano en la naturaleza capaz de utilizar una amplia variedad de sustratos orgnicos, se sostiene que la produccin de harina de plumas puede ser llevada a cabo por medio de mtodos ms meticulosos a travs de tratamientos fermentativos con microorganismos queratinolticos capaces de degradar la queratina presente en la pluma, mejorando as la digestibilidad de este producto y la calidad nutricional en un 67% debido a su enriquecimiento con protena microbiana. Aproximadamente, el total de plumas procesadas en el mundo es de 50,000 Ton/ao, en donde Per es el principal exportador para Sudamrica, siendo uno de sus principales compradores el Ecuador. La venta de 1Ton de harina de plumas cuesta aproximadamente 320 dlares, sin embargo, comparando con las harinas que actualmente se comercializan en el mercado existe una marcada diferencia en cuanto al costo; teniendo la harina de soya un costo de 450 dlares/Ton y la harina de pescado 900 dlares/Ton. (14) Por estas razones se desea conseguir una harina de plumas de alta calidad proteica y que a la vez posea bajo costo, capaz de competir a nivel industrial con los diferentes tipos de harinas ya mencionadas.

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL Aislar, seleccionar, identificar y preservar cepas queratinolticas para la degradacin de plumas de pollo.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Obtener muestras de plumas blancas de pollo y muestras de suelo de los galpones avcolas. Seleccionar el medio de cultivo ms adecuado para el crecimiento ptimo de los microorganismos degradadores de queratina a partir de plumas de pollo. Aislar las cepas queratinoliticas utilizando el medio de cultivo adecuado. Seleccionar la cepa con mayor capacidad de degradacin queratinoltica. Realizar pruebas bioqumicas para identificar gnero y especie de la cepa con mayor velocidad de transformacin. Realizar la medicin del crecimiento de biomasa, y determinar los parmetros cinticos. Realizar las grficas de ln de biomasa (ln X), biomasa (X), velocidad especfica () y velocidad instantnea (rx), para la cepa seleccionada en el medio seleccionado. Preservar las cepas puras mediante la tcnica de crioconservacin.

4. MARCO TEORICO 4.1 Plumas de Pollo 4.1.1 Caractersticas Las plumas son estructuras queratinosas de la piel de la aves. Son fundamentales en el vuelo aviar, pues forman la superficie sustentadora del ala. El conjunto de todas las plumas de un ave recibe el nombre de plumaje, y forma una capa densa, aislante, que protege al animal frente al agua y el fro. COMPONENTES Materia Seca Protena Cruda Grasa Fibra Cruda Cenizas Calcio Fsforo % 88.5 54,5 26 1,0 4,5 1,0 0,7

4.1.2 Usos Las plumas pueden ser procesadas y utilizadas en decoracin, acolchado y adornado, haciendo uso de sus caractersticas de retencin de calor y peso ligero. Pueden se tratadas en las manufactureras de chaquetas, bolsas de dormir, colchas, almohadas, colchones, etc. Adems se las emplea como harina de plumas (HP) que sustituye a la harina de pescado en alimentos acucolas. (12)

4.2 Microorganismos 4.2.1 Degradadores Queratinolticos

BACTERIAS Bacillus spp Bacillus licheniformes Kocuria rosea Streptomyces fradiae

HONGOS Rhizopus oryzae Arthroderma Ctenomyces Chrysosporium Aphanoascus Sporothrix

Los microorganismos citados son aquellos que presentan la mayor capacidad de degradacin de queratina. Sin embargo el grupo de las bacterias presentan una velocidad de transformacin ms alta en comparacin con los hongos. Estudios realizados anteriormente demuestran que la cepas de Bacillus spp. degradan con mayor eficiencia el sustrato queratina en comparacin con el resto de bacterias ya indicadas. 4.2.2 Caractersticas Microbiolgicas Nivel de Bioseguridad Taxonoma Tipo de Cepa Tipo de Enzima Condiciones Aerbicas Forma Pared Celular Movilidad Esporulacin Condiciones de Vida Categora Nutricional Fuente C, N, S, y Energa 1 Bacterias / Firmicutes / Bacilos / Bacillales / Bacillaceae / Bacillus spp. Degradador de Queratina Queratinasa Aerobio Estricto o Anaerobio Facultativo Bastn Tincin Gram (+) Positiva - Flagelacin pertrica Positiva Temperatura: 4 55C ptima: 50C pH ptimo: 4,3 9,3 ptimo: 7-7,5 Quimioauttrofo Queratina
(6)

4.2.3 Metabolismo de las Bacterias Queratinolticas El proceso de Degradacin de la Queratina se basa en el proceso de Sulfitlisis el cual provoca la ruptura del enlace disulfuro presente en la cistena, dando lugar al cido cisteinsulfnico y a otro de cisteina. A pH cido puede tener lugar la reformacin de un nuevo enlace disulfuro. 4.2.4 Pares Oxido Reduccin
Donador : NAD + / NADH E0 (- 0 .32 ) 2 e Aceptor : NO3- / NO2- E0 (+ 0.42 ) 2 e
-

4.2.5 Reaccin de Degradacin de la Queratina

3C 6 H 8 O4 N 2 S 2 + 3O2 2C 6 H 8 O7 + 6CO2 + 6 NO3 + 6 SO4 + 4 H 2 O

4.2.6. Diagrama de Obtencin de Harina de Plumas sin Aplicaciones Biotecnolgicas

INICIO

Lavado de plumas

Desecacin al ambiente

Coccin con vapor hmedo Presin: 2-3 atm Tiempo 1-2horas HCl

Coccin en seco

Hidrlisis Acida

Enfriamiento

Desecacin

Trituracin

Control de calidad

FIN
(13)

4.2.7. Diagrama de Obtencin de Harina de Plumas con Aplicaciones Biotecnolgicas

INICIO

Lavado de plumas

CONDICIONES DEL BIORREACTOR -Aerobiosis -pH: 7.5-8 -Medio de cultivo: Medio Minimal con 20g/l de plumas. -Microorganismo: Bacillus spp. -Temperatura 35-37C -Tiempo 26 horas

Desecacin al ambiente Alimentacin de sustrato cada 12 horas/58 horas Temperatura 150C Tiempo 1-3 seg Temperatura: 60C Tiempo: 24 horas

Degradacin

Secado por Aspersin

Secado en estufa

Molienda

Control de calidad

FIN

5. MARCO METODOLOGICO 5.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS 5.1.1 Muestreo El muestreo es no probabilstico intencionado; es decir que las plumas y suelo sern recogidos de distintas plantas avcolas. Los criterios para obtener la muestra fueron: } Las plumas seleccionadas deban presentar caractersticas similares (blancas, tamao). } Lugares: Las muestras se tomaron de tres avcolas ubicadas en la Provincia de Pichincha. } El suelo tuvo que ser tomado de los mismos galpones de donde se tomaron las plumas. 5.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS 5.2.1 Diseo del Medio de Cultivo para Aislamiento y Seleccin de Cepas Queratinolticas FUENTE Carbono y Energa Nitrgeno y Azufre COMPONENTE Queratina (Pluma de Pollo) K2HPO4 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O CaCl2 MnSO4.4H2O Mn, Mo, Cu, Co, Zn 0.02 CANTIDAD (g)/L agua 20 1 200mg 10mg 10mg 20mg 0.5 mg/cada uno
(2)

Nutrientes Inorgnicos (base mineral)

Elementos Traza

5.2.3 Aislamiento y Enriquecimiento de Cepas Degradadoras de Plumas Se toman muestras de suelo de diferentes reas de los galpones de cra de pollos de engorde y se inoculan en tubos de ensayo que contienen caldo nutritivo como medio de transporte. Despus de 24 horas de incubacin, se someten a un proceso de pasteurizacin a 80C/15min a fin de seleccionar los microorganismos esporulados. Para el enriquecimiento de los microorganismos queratinolticos y los ensayos cinticos, se utiliza el medio minimal ms 20 g/l plumas esteriles. La presentacin de las plumas vara dependiendo del tipo de ensayo a ser realizado (polvo o troceadas con tijeras). 5.2.4 Seleccin de Cepas Queratinoliticas Se realizan aislamientos en Agar Nutritivo y se seleccionan colonias morfolgicamente diferentes. Cada una de ellas se inocular en tubos que contienen el medio diseado fresco aplicados los criterios de seleccin segn los parmetros de determinacin para evaluar su capacidad queratinoltica.

5.2.4.1 Criterios de Seleccin 5.2.4.1.1 pH El proceso de degradacin de protenas genera productos del metabolismo como gas amoniaco, el cual eleva el pH desde 7 hasta 9 aproximadamente. Para la determinacin de este suceso, se utiliz una tira de papel indicador con el fin de comprobar la basicidad generada. Las bacterias degradadoras de queratina crecen a un pH comprendido entre 4.3 9.3. Con motivo de determinar el pH ptimo al que la bacteria tiene una mayor velocidad de crecimiento, se someti a los microorganismos a pH de 7.5, 8 y 9. Cabe mencionar que el medio diseado presenta un pH de 8 y para lograr variaciones de 7.5 y 9 se utiliz Acido Ntrico al 5% e Hidrxido de Sodio al 10% respectivamente. 5.2.4.1.2 Temperatura El bioproceso en mencin emplea altas temperaturas con el fin de lograr la degradacin completa de la queratina de la pluma. Por otro lado, las bacterias degradadoras se desarrollan a una temperatura comprendida entre 4 y 55C. Es por esto que se emplearon valores de 30, 35 y 37C, para as establecer la temperatura a la que las cepas son capaces de resistir y generar altas velocidades de crecimiento. 5.2.4.1.3 Concentracin de Nutrientes El sustrato sujeto a degradacin tiene un porcentaje de 54.5 en la pluma de pollo, lo que corresponde a una buena cantidad con respecto a fuente de carbono, nitrgeno y energa para las cepas degradadoras. Es por esto que se pretendi variar el contenido de nutrientes, de 45%, 54% y 65%, para determinar si se presenta represin frente a diferentes concentraciones de sustrato. 5.2.5 Produccin de Biomasa 5.2.5.1 Propagacin y Cultivo de las cepas Queratinoliticas Inocular un medio precultivo en fiolas Erlenmeyer con 30ml de medio minimal con plumas (20g/L) e incubar a 37C/48h en el shaker orbital, con una velocidad de agitacin de 150 rpm. Para los ensayos cinticos, los cultivos se realizaran durante 48h con una concentracin de plumas de 20g/L y una agitacin de 150 rpm, que sern las condiciones ptimas para lograr una mejor homogeneidad y baja viscosidad del medio. 5.2.5.2 Determinacin de la Medida de Biomasa Microbiana El contenido de un cultivo en Erlenmeyer con medio minimal con plumas, se filtra a travs de un micropore. El sobrenadante obtenido se descarta y el sedimento celular se lleva ala estufa a 115C 20 min aproximadamente, posteriormente se coloca en el desecador y finalmente se pesa. Realizar esta medicin hasta obtener peso constante. 5.2.6 Preservacin de los Microorganismos La conservacin de las cepas aisladas se realiza a 37C en estras (cuas) de medio slido previamente diseado para cepas con actividad queratinoltica y suplementado con 20 g/L de harina de plumas, previamente inoculadas e incubadas a 37C. Aadir 10% de glicerol y mantener a -80C

6. RESULTADOS

6.1 Tabla de Caractersticas de las Cepas Degradadoras de Queratina

CDIGO DE LA CEPA

FORM A

COLOR

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23

Irregular Redonda grande Redonda pequea Redonda grande Redonda grande Irregular Redonda grande Redonda pequea Redonda pequea Redonda grande Redonda Pequea Redonda pequea Irregular Redonda pequea Redonda pequea Ovalada Redonda grande Redonda pequea Redonda pequea Redonda grande Redonda pequea Ovalada Redonda grande

Blanco Amarillo - Anaranjado Blanco Blanco Blanco Blanco Blanco Crema Blanco Blanco Crema Blanco Crema Blanco Crema Blanco Blanco Crema Crema Blanco Blanco Blanco Crema

6.2 Tabla de Variacin de pH de las Cepas Degradadoras de Queratina

pH CDIGO DE LA CEPA 7,5 8,0 9,0

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23

+/+/+ + +/+ + + + + + +/-

+ + +/+/+ + + +/+/+/+/+ +/+/+/+/+/+/+/+ +/+/-

+ + +/+/+/+/+ + +/+/+/+/+ +/+/+/+/+/+/+/+/+/+/-

6.3 Tabla de Variacin de Temperatura de las Cepas Degradadoras de Queratina

Temperatura CDIGO DE LA CEPA 30C 35C 37C

C1 C2 C6 C7 C8 C9 C10 C13 C15 C18 C21 C23

+/+/+/+/+/+/+/+/+/+/-

+ + +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/-

+ + +/+/+ +/+ + +/-

6.4 Tabla de Variacin de Concentracin de Sustrato de las Cepas Degradadoras de Queratina

Concentracin de Sustrato CDIGO DE LA CEPA 45% 55% 65%

C1 C2 C8 C13 C21

+/+/+ +/-

+ + + + +

+ + + + +

6.5 Grfica de la Eficiencia de Degradacin Queratinoltica con respecto a los Criterios de Seleccin

Eficiencia de Degradacin Queratinoltica 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0
C1 C2 C3 C4 C5

Pruebas Bioqumicas Tincin Gram Catalasa Oxidasa Manitol

C6 C7 C8 C9 C1 0

Resultado Bacilo (+) + +

C11 C1 C13 C1 C15 C1 C17 C1 C19 C20 C21 C22 C23 2 4 6 8

Cepas

6.6 Tabla de Resultados de las Pruebas Bioqumicas realizadas a la Cepa Seleccionada

PRUEBAS BIOQUIMICAS Tincin Gram Catalasa Oxidasa Manitol

RESULTADO Bacilo (+) + +

6.7 Curva de Crecimiento para el Bacillus spp. (Terica) 0.27

Tiempo de 5 horas Generacin

X vs t
6,000 5,000 4,000 3,000 2,000 1,000 0,000 0,000

X g/L

2,000

4,000

6,000
t, h

8,000

10,000

12,000

14,000

7. DISCUSIONES

7.1 Discusin sobre los Resultados

La mayora de cepas aisladas presentaban una misma morfologa y coloracin, probablemente debido a que se trataba de un mismo microorganismo, razn por la cual tuvieron que ser exoneradas en los siguientes procesos de seleccin. De acuerdo a la seleccin por variacin de pHs se obtuvieron doce cepas, las cuales se adaptaban de mejor manera a las nuevas condiciones, teniendo un mejor crecimiento a pH 7.5 y 8, lo que indica que las cepas pueden resistir las condiciones que demanda el bioproceso. De las doce cepas anteriormente seleccionadas por pH, se escogieron 5 cepas, las mismas que crecieron adecuadamente a la temperatura de 37C, temperatura a la que se ajusta el birreactor para el proceso de degradacin. De las cinco cepas, se seleccion la cepa C13, la misma que se adapt muy favorablemente tanto a las condiciones de pH, temperatura y sustrato. Posteriormente a esta cepa se le someti a pruebas bioqumicas, cuyo resultado indica que se trata de una cepa de Bacillus y que gracias a la prueba positiva de manitol puede mencionarse que se trata de Bacillus Licheniformis. Sin embargo hace falta una serie de reacciones tanto microbiolgicas como bioqumicas para asegurar este dato. Debido a la falta de tiempo la produccin de biomasa de la cepa seleccionada, no pudo realizarse por lo cual se ha credo conveniente aadir referencias tericas sobre este proceso.

7.2 Discusin sobre la Industrializacin del Bioproceso El mtodo de obtencin por el que tradicionalmente se obtiene harina de plumas, reduce el porcentaje de protena y por ende el valor nutritivo del alimento, as como ya se ha explicado anteriormente y por lo tanto se cree que es inadecuado. Por esta razn se plante una nueva alternativa que genere harina con un mayor valor proteico por adicin de la protena microbiana. Para esto se somete a la pluma a mtodos menos rigurosos en cuanto a temperatura y pH, adems de que se realizan adiciones semi-continuas de sustrato con el fin de que la bacteria no pierda viabilidad y productividad.

7.3 Discusin sobre las Modificaciones de Anteriores Investigaciones Este trabajo de investigacin esta fundamentado en un proyecto ya ejecutado en el exterior, sin embargo se a realizado modificaciones que se describen a continuacin: El medio de cultivo descrito en dicha investigacin fue el MBS, el cual sirvi como referencia para el diseo del nuevo medio de cultivo fundamentado en Stainer y suplementado con la adicin del 20% de pluma de pollo por ser la queratina el sustrato primordial. Con respecto a la metodologa empleada se variaron los criterios de seleccin ya que la propuesta indicaba colocar una pluma entera con medio e inoculo para vizualizar la degradacion, mientras que lo realizado fue variaciones de pH, temperatura y concentracin del sustrato y de esta manera determinar que cepa se adapta favorablemente a todos estos cambios.

8. CONCLUSIONES Se obtuvieron muestras de plumas blancas y muestras de suelo sometidas ambas a esterilizacin para eliminar la flora patgena y asegurar el aislamiento de microorganismos esporulados queratinoliticos. El medio diseado para el aislamiento de cepas queratinoliticas gener una alta productividad microbiana ya que contribuy con todos los requerimientos nutritivos para el crecimiento de la cepa. Mediante los criterios de seleccin se obtuvo la cepa de Bacillus spp. la cual demostr alta productividad y una mayor velocidad de crecimiento en comparacin con las 4 cepas queratinoliticas tambin seleccionadas. A la cepa C13 de Bacillus spp. se le someti a diferentes pruebas bioqumicas cuyos resultados indican que puede tratarse de la especie Licheniformis al ser una de las pocas cepas que da positivo la prueba de manitol, sin embargo es necesario realizar mas pruebas de confirmacin. Al no ejecutarse en el laboratorio la produccin de biomasa, la cepa seleccionada unicamente fue purificada y finalmente preservada para mantener sus caractersticas biotecnolgicas. El mtodo de obtencin de harina de pluma propuesto se basa en un proceso semicontinuo en donde se aade medio de cultivo para evitar el agotamiento del sustrato, reducir la viscosidad y la acumulacin de sustancias toxicas.

9. RECOMENDACIONES Esta investigacin esta dirigida a la mayora de las avcolas en donde generalmente no le dan un uso adecuado a los subproductos de las aves de corral como es el caso de las plumas, de las cuales se obtiene harina como suplemento alimenticio para animales. Con este motivo se pretende que la industria ecuatoriana d aplicacin a esta propuesta que hace uso de la biotecnologa para obtener un producto de calidad, competitivo y a menor costo que el ya existente. Para medir la degradacin de las plumas se recomienda determinar grupos amino libres en el producto del bioproceso, segn el mtodo de la ninhidrina. Una forma de determinar si la cantidad de protena ha aumentado en la harina, es realizar una cuantificacin de L-lisina por ser el aminocido que se encuentra en mayor cantidad en la queratina. Del mismo modo para determinar el mayor grado de digestibilidad de la harina puede realizarse un estudio con animales de abasto.

10. ANEXOS

10.1 Aislamiento, Enriquecimiento y Seleccin de Cepas Queratinolticas Inocular < 0.5 g de muestra de suelo diferentes reas de galpones de criadero de pollos

10 ml de caldo nutritivo

Incubar por 24 horas

Pasteurizar a 15 min. Por 80 C

Seleccin de Microorganismos esporulados

Inoculacin Enriquecimiento:Medio minimal con 20g/L de plumas

10.2 Seleccin de Cepas Queratinoliticas

Enriquecimiento:Medio minimal con 20g/L de plumas

Aislamiento en Agar nutritivo Seleccin de colonias morfolgicamente diferentes

Pluma troceada y Medio Diseado fresco (5 ml) Incubadas a 40 C Cepa que produce la mayor degradacin en el tiempo ms corto.

10.3 Produccin de Biomasa 10.3.1 Propagacin y Cultivo de las cepas Queratinoliticas Medio Precultivo

30 ml de medio minimal y 20g/L de plumas troceadas, 37 C/ 48h Shaker orbital, con una velocidad de agitacin de 150 rpm Ensayos Cinticos, 48 horas con 20g/L de medio de plumas y una agitacin de 150 rpm Condiciones ptimas para lograr para lograr homogeneidad y baja viscosidad del medio

10.3.2 Determinacin de la Medida de Biomasa Microbiana

Medio Minimal con plumas troceadas

Filtrar (micropore) Sedimento celular a 115C en la estufa por 20 minutos Colocar en el desecador y finalmente se pesa Se realiza hasta peso constante

10.2.3 Preservacin de los Microorganismos

CEPAS SELECCIONADAS

Cepas a 37C por estriado en Medio Diseado con harina de plumas (20g/L). Previamente aadido 10% de glicerol y mantener a 80C

11. REFERENCI AS BIBLIOGRAFICAS 1. COLLINS AND LYNE S. Microbiologycal Methods . Sptima Edicin. Gran Bretaa. 1995. Pgs. 391-395. 2. STAINER, Roger. Microbiologa . Pgs. 20-49. 3. BROOK. Microbiologa de los Microorganismos . Dcima Edicin. Pgs.103-165. 4. http://74.125.47.132/search?q=cache:d2ANzFzz1KkJ:www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/2 7333/2/articulo7.pdf+aislamiento+bacillus+pluma+ave+corral&cd=2&hl=es&ct=clnk&gl=ec 5. http://www.sica.gov.ec/cadenas/maiz/docs/produc_avicolamod.html 6. http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx 7. http://es.wikipedia.org/wiki/Bacillus 8. http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/27333/2/articulo7.pdf 9. http://www.bioone.org/doi/abs/10.1642/00048038(2004)121%5B0656:BDOBAW%5D2.0.CO%3B2 10. http://es.wikipedia.org/wiki/Pluma 11. http://turnkey.taiwantrade.com.tw/showpage.asp?subid=137&fdname=MISCELLANEOUS&pa gename=Planta+procesadora+de+plumas+de+aves+de+corral 12. http://www.zoetecnocampo.com/foro/Forum35/HTML/000018.html 13. http://www2.uah.es/mapa/seminarios/activos/Seminarios%20biologia/aa10.pdf 14. http://www.rpp.com.pe/2009-03-28-peru-exporto-mas-de-1329-tm-de-harina-de-plumas-el2008-noticia_172583.html