Introduccin al cultivo de tejidos

Versin 1.11

1. Introduccin histrica 2. Qu entendemos por cultivo de tejidos? 2.1 Tipos de cultivos de tejidos 2.2 Tipos de clulas 3. Ventajas y limitaciones 4. Aplicaciones 5. Establecimiento de un cultivo celular 6. Bancos y colecciones de lneas celulares 7. Almacenamiento de clulas 8. El laboratorio 8.1. Cabina de flujo laminar 8.2. Incubador de CO2 8.3. Microscopios 8.4. Congeladores y equipo de criogenia 8.5. Equipo de esterilizacin y filtracin 8.6. Otros instrumentos 9. El substrato y el medio de cultivo Apndices Apndice A: Trminos Apndice B: Bibliografa Apndice C: Historial Apndice D: Mejoras pendientes de realizar

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1. Introduccin histrica En el siguiente cuadro se muestran algunos de los hechos histricos ms relevantes en el desarrollo de las tcnicas y mtodos de cultivo de tejidos
1885 1907 1910 1913 1916 1948 1952 1954 Roux Harrison Burrows Carrel Rous y Jones Sanford y cols. Gey y cols. Levi-Montalcini y cols. Abercrombie y cols. Eagle Temin y Rubin Hayflick y Moorehead Buonassisi Littlefield Ham Harris y Watkins Yaffe Augusti-Tocco y Sato Khler y Milstein Sato y cols. Wigler y Axel Martn y Evans Thomson y Gearhart Consigui mantener durante das clulas de embrin de pollo en una solucin salina Utiliz tcnicas de estudio in vitro para el estudio de fenmenos in vivo, y demostr el crecimiento de fibras nerviosas en cultivo Emple plasma de pollo para nutrir los cultivos embrionarios de pollo Demostr la posibilidad de mantener en cultivo clulas de embrin de pollo, en condiciones de asepsia, durante un tiempo superior a la vida del animal Utilizaron por primera vez extractos enriquecidos en tripsina para disociar clulas de los tejidos Demuestran la formacin de clones celulares Establecen la primera lnea celular humana contnua, las clulas HeLa Determinan que el factor de crecimiento nervioso (NGF) estimula el crecimiento de axones en cultivo Observan la inhibicin de crecimiento por contacto en fibroblastos Desarrolla medios definidos y describe factores de adhesin Desarrollan un ensayo cuantitativo para la infeccin de clulas de pollo en cultivo por el virus del sarcoma de Rous Describen la vida finita de las clulas humanas diploides Publica los mtodos para mantener clulas diferenciadas Introdice el medio HAT para el crecimiento selectivo de clulas hbridas, y desarrolla las tcnicas de fusin celular Utiliza el primer medio definido libre de suero Producen el primer heterocarion de clulas de mamfero por la fusin inducida por virus de clulas humanas y de ratn Estudia la diferenciacin de mioblastos normales in vitro Establecen la primera lnea celular estable de neuroblastoma, lnea de celulas diferenciada Establecen la primera lnea celular productora de anticuerpos monoclonales Publican una serie de trabajos que demuestran las distintas necesidades de hormonas y factores de crecimiento que precisan diferentes lneas celulares Desarrollan un mtodo eficiente para introducir una copia simple de genes de mamfero en clulas en cultivo Aslan y cultivan clulas madre embrionarias pluripotenciales del ratn Aslan clulas madre embrionarias humanas

1955 1958 1961 1962 1964 1965 1968 1969 1975 1976 1977 1986 1998

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2. Qu entendemos por cultivo de tejidos? Podemos decir que es el conjunto de tcnicas que nos permiten mantener clulas in vitro con una gran aproximacin a sus propiedades y funciones in vivo. Dependiendo del grado de preservacin de la estructura del tejido u rgano de origen y del tiempo de su duracin distinguimos diferentes tipos de cultivos: de rganos, explantes, primarios, secundarios, etc. El trmino cultivo de tejidos suele ser usado como un trmino genrico que incluye el de cultivo de rganos y el de cultivo de clulas.

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2.1 Tipos de cultivos de tejidos Cultivo de rganos: En este tipo de cultivo la organizacin tridimensional del rgano in vivo se mantiene, aunque slo sea parcialmente, y mantiene todas o algunas de las caractersticas histolgicas del tejido original. El rgano o porcin del mismo se mantiene en un medio lquido del que extrae los nutrientes y al que elimina los desechos metablicos. Los diferentes tipos de clulas se mantienen en su forma diferenciada y constituye una buena rplica del rgano original. Pero, sin embargo, generalmente no permite la propagacin, ya que el crecimiento de clulas se produce nicamente en la periferia. Normalmente este tipo de cultivo es difcil de mantener durante un tiempo prolongado debido a las diferencias potenciales de crecimiento de los distintos tipos celulares que constituyen el rgano. La falta de propagacin tiene como consecuencia que para repetir el experimento se necesite nuevo material, por lo que se produce cierta heterogeneidad de muestras. Explantes primarios: Constituidos por fragmentos pequeos de tejidos u rganos que se adhieren a una superficie en la que generalmente crecen las clulas ms perifricas del explante. Un cultivo se denomina cultivo primario cuando las clulas o tejidos procedentes de un ser vivo crecen sin haber pasado previamente por una fase de crecimiento in vitro. Un cultivo se denomina cultivo secundario cuando procede de una fase previa de crecimiento in vitro. Cultivo de clulas: Este tipo de cultivo est formado por clulas dispersas disgregadas de un tejido vivo, de un cultivo primario, o de una lnea celular, mediante distintos sistemas mecnicos, qumicos o enzimticos. Las clulas crecen en suspensin o adheridas a una superficie. Generalmente son cultivos que contienen un nico tipo de clula y stas suelen ser homogneas genticamente. Es el tipo de cultivo ms utilizado en la actualidad debido a su capacidad de propagacin, es decir de crecimiento mantenido.

Hablamos de cultivos histotpicos cuando las clulas son reagrupadas para recrear una estructura tridimensional parecida al tejido original
Cultivos de alta densidad sobre un pocillo filtro Perfusin y sobrecrecimiento de una monocapaen frasco o en disco Reagregacin en suspensin sobre agar o en gravedad cero real o simulada Infiltracin de una matriz tridimensional como el gel de colgeno

Un cultivo organotpico implica los mismos procedimientos anteriores pero combinando clulas de diferentes linajes que constituyen un rgano

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2.2 Tipos de clulas Las clulas que se suelen utilizar en cultivos pertenecen generalmente a uno de estos grupos:

TIPO CELULAR Epiteliales Tejido conjuntivo Tejido muscular Tejido nervioso Sangre y tejidos linfoides Clulas madre embrionarias

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3. Ventajas y limitaciones Las principales ventajas de la utilizacin de las tcnicas de cultivo de tejidos son: Control del medio extracelular. Podemos controlar en un cultivo distintos factores como: pH, temperatura, humedad, presin osmtica, tensiones de O2 y de CO2, concentracin de nutrientes, etc. Homogeneidad de la muestra. Las clulas de un cultivo son bastante homogneas en comparacin con la variabilidad existente entre animales de experimentacin. Disminucin del gasto. Si se experimenta con frmacos, al utilizarse cultivos de clulas se utilizan concentraciones muy bajas de dichos productos. Recientemente la utilizacin de sistemas robotizados que utilizan pequeos volmenes, permite la realizacin de determinados trabajos que necesitan un gran nmero de determinaciones repetitivas en diferentes tiempos o con diferentes concentraciones de productos. Disminucin de la necesidad de realizar ensayos in vivo. Evitndose, aunque no completamente, el sacrificio de animales de experimentacin. Desarrollo de cultivos histotpicos y organotpicos que incrementan la fiabilidad de los modelos experimentales Categora
Fisicoqumica ambiental Condiciones fisiolgicas Micromedioambiente Homogeneidad de la lnea celular Caracterizacin Preservacin Validacin y acreditacin Replicacin y variabilidad Ahorro de reactivos Control de concentracin y tiempo Mecanizacin Reduccin del uso de animales

Ventaja
Control del pH, temperatura, osmolaridad, gases disueltos Control de la concentracin de hormonas y nutrientes Regulacin de la matriz extracelular, de la interaccin clula-clula, de la difusin de gases Existencia de medios selectivos, clonacin Citologa, inmunomarcaje Almacenamiento en nitrgeno lquido Se puede monitorizar el origen, la historia, la pureza Fcil cuantificacin Uso de volmenes reducidos, acceso directo , bajos costes Posibilidad de definir dosis, concentraciones y tiempos Posible con robtica y microtitulacin Estudios de citotoxicidad, screening de frmacos, cosmticos ,...

Pero tambin existen limitaciones como: Excesiva sensibilidad. El crecimiento de las clulas es relativamente lento y es dependiente en muchos casos de factores no del todo conocidos. Adems, existen contaminantes como hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas y virus que suelen tener un crecimiento ms rpido y pueden llegar a matar las clulas en cultivo. Lmite de produccin. Generalmente el lmite de produccin de un laboratorio normal es menor a 10g de clulas. Inestabilidad. Muchas lneas celulares contnuas son inestables por ser aneuploides. Validacin del modelo. Cuando realizamos un modelo en cultivo celular, estamos utilizando un conjunto de clulas disgregadas cuyo origen fue de un tejido, pero que se diferencia de ste por que:
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o Se ha perdido la organizacin tridimensional espacial propia del tejido original o Se han perdido las interacciones heterotpicas, entre los distintos tipos celulares y entre las clulas y la matriz extracelular o Carece de los sistemas de regulacin in vivo y especialmente de los constituyentes del sistema nervioso y del sistema endocrino Por lo tanto deberemos de confirmar el modelo en cultivo respecto de los resultados en modelos in vivo.

Categora
Necesidad de experiencia

Ejemplos
Manejo Contaminacin qumica Contaminacin microbiana Contaminacin cruzada Lugar de trabajo Incubacin, control del pH Contenedores y deshecho de contaminantes biolgicos Equipamientos Fungibles Medio, suero, plsticos Heterogeneidad, variabilidad Desdiferenciacin Adaptacin Seleccin Expresin de marcadores Histologa, citologa Geometra y micromedioambiente

Control ambiental Cantidad y costo Inestabilidad gentica Inestabilidad fenotpica Identificacin del tipo celular

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4. Aplicaciones Con las tcnicas de cultivo de tejidos se pueden abordar distintas aproximaciones al estudio de la clula desde diferentes puntos de vista. Destacamos los estudios y procesos relacionados con:

Actividad intracelular

Movimiento intracelular de molculas

Interaccin clula-clula

Interaccin con el medio extracelular

Gentica

Productos celulares y tisulares

Replicacin y transcripcin de ADN Sntesis proteica Metabolismo energtico Metabolismo de drogas Ciclo celular Diferenciacin Apoptosis ARN Traslocacin de receptores hormonales Metabolitos Calcio Transduccin de seales Trfico de membranas Morfognesis Control paracrino Cintica de proliferacin celular Cooperacin metablica Adhesin celular y desplazamiento celular Interaccin con la matriz extracelular Invasin Modelos organotpicos de prtesis mdicas Nutricin Infeccin Accin de drogas Interacciones ligado-receptor Citotoxicidad Mutagnesis Carcinognesis Anlisis gentico Manipulacin gentica Transfeccin Infeccin Transformacin Inmortalizacin Senescencia Secrecin Biotecnologa Diseo de biorreactores Recoleccion de productos Tejidos artificiales

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5. Establecimiento de un cultivo celular El cultivo primario consistir probablemente en un mayor o menor nmero de clulas de diferentes tipos con diferentes capacidades de crecimiento. Para la mayor parte de los experimentos es necesario utilizar un nico tipo celular. Por lo tanto se deber de seleccionar el tipo celular necesario. Para ello podremos: Dejar las clulas crecer. Las clulas de crecimiento ms rpido tomarn la dominancia del cultivo Controlar la composicin del medio de crecimiento. La adicin de factores de crecimiento o de inhibidores del crecimiento podr seleccionar ciertos tipos celulares Separar las clulas mediante gradientes de densidad

Una vez seleccionado eltipo celular podemos mantener el cultivo durante un perodo de tiempo variable que depende del tipo y del origen de las clulas. Hayflick y Moorehead estudiaron el potencial de crecimiento de clulas embrionarias humanas y comprobaron que las clulas podan crecer, mediante subcultivos repetidos, durante unas 50 generaciones. Pasado este tiempo, las clulas entran en senescencia y pierden la capacidad de dividirse. Por lo tanto las clulas tienen una capacidad finita de divisiones mitticas y este nmero se llama lmite de Hayflick. Este nmero de divisiones permanece fijo incluso si se criopreservan las clulas durante largo tiempo. La capacidad de crecimiento est relacionada con el origen de las clulas, as, las clulas derivadas de tejidos embrionarios tienen un lmite de crecimiento mayor que las procedentes de tejidos adultos. Una clula normal, necesaria en determinadas experiencias, podemos decir que es aquella que: Posee un nmero diploide de cromosomas (46 en la especie humana) Generalmente es dependiente del anclaje a un substrato para su crecimiento. Las clulas crecen hasta que se confluyen en una monocapa de clulas que ocupa todo el substrato. Generalmente las clulas linfoides y hematopoyticas crecen en suspensin o en medios semislidos Tienen una vida finita No son cancerosas En este proceso de establecimiento de un cultivo celular se procede a la seleccin de un tipo celular determinado que: ha debido de superar los procesos de disgregacin enzimtica y/o mecnica posee la capacidad de crecer adherido a un substrato o de crecer en suspensin es capaz de responder a factores estimulantes o inhibitorios del crecimiento aadidos al medio tiene una tasa de crecimiento alta
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Por lo tanto, cambiando estos factores variarn tambin las clulas seleccionadas. A veces las clulas normales, tras la confluencia, pueden diferenciarse y adquirir caractersticas morfolgicas y funcionales parecidas a las clulas de origen. El crecimiento de las clulas se detiene tambin tras la confluencia y es necesario dividir, propagar o subcultivar las clulas. Generalmente en cultivos primarios la dilucin es aproximadamente de a . Para ello se despegan las clulas del substrato, se cuentan, se ajusta la concentracin y se depositan sobre el nuevo substrato con la cantidad de medio ajustada a la concentracin de clulas. Tras un nmero de pases determinado, segn el lmite de Hayflick, el cultivo entra en una fase de senescencia, con crecimiento lento, con acumulacin de anomalas, perdidas de funciones, etc..., que conducen a la muerte del cultivo. Ocasionalmente el cultivo primario se puede mantener durante ms tiempo del esperado y esto se debe a la aparicin de clulas inmortales en el cultivo, es decir, clulas que adquieren la capacidad de crecimiento infinito y a esa poblacin se le llama lnea celular establecida o lnea celular contnua. Esto requiere que las clulas pasen por un proceso llamado transformacin que hace perder a las clulas su sensibilidad al estmulo asociado con el control del crecimiento. Existe una correlacin positiva entre la aparicin de aneuploidas y la transformacin de las clulas. Tambin se puede establecer como regla que una lnea celular es ms fcil de establecer o cultivar cuanto ms indiferenciada sea, a excepcin de las lneas tumorales de clulas diferenciadas. Las clulas de un cultivo primario pueden transformarse o inmortalizarse, adems, por el tratamiento con mutgenos, virus u oncogenes.

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6. Bancos y colecciones de lneas celulares Para muchos experimentos pueden obtenerse diferentes tipos de lneas celulares de colecciones o bancos que poseen centenares de lneas perfectamente caracterizadas. Generalmente es ms fcil adquirir una determinada lnea celular que establecerla experimentalmente. En la tabla siguiente se muestran algunas de las lneas celulares ms frecuentemente utilizadas. TIPO CELULAR Epiteliales Tejido conjuntivo Tejido muscular Tejido nervioso Sangre y tejidos linfoides Clulas madre embrionarias Lneas celulares
A-253, CHO, HeLa, MDCK, PtK1 3T3, BHK, COSD, L, MRC-5, Vero, WI-38 L6 NB41A3 K562, Namalwa, MPC-11, U937 E14.1, H1, H9, R1

Las dos colecciones o bancos de lneas celulares ms importantes son: American Type Culture Collection (ATCC) European Collection of Cell Cultures (ECACC)

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7. Almacenamiento de clulas Las clulas procedentes de cultivos primarios o de lneas celulares establecidas pueden almacenarse durante largos perodos de tiempo en temperaturas bajo cero. Para ello se utilizan sistemas criognicos como veremos en el apartado siguiente. Con la criopreservacin se favorece: El mantenimiento de clulas sin tener que utilizar tejidos animales primarios Evitar la prdida de la lnea por contaminacin Evitar la prdida de la lnea por cambios genticos

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8. El laboratorio Lo ms caracterstico de un laboratorio de cultivo de tejidos es el mantenimiento de la asepsia. El rea de trabajo para realizar cultivos debera de estar en una habitacin aislada, aunque la aparicin de las cmaras de flujo laminar ha reducido estas necesidades de aislamiento. La estructura y condiciones ambientales de un laboratorio de cultivo celular vara notablemente entre aquel que trabaja con agentes patgenos bacterias, virus, etc- y aquel que no los utiliza. En el primer caso las condiciones son ms estrictas e incluso se debe de filtrar el aire que sale de la habitacin de cultivos. A continuacin mostramos algunos de los instrumentos o equipos ms usados en un laboratorio de cultivo de tejidos

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8.1. Cabina de flujo laminar La funcin de estas cabinas es mantener el rea de trabajo donde manipulamos las clulas libres de contaminantes. Para ello un motor fuerza el paso del aire por un filtro de gran superficie (filtro HEPA) que est situado en el techo, flujo vertical, o en la pared frontal, flujo horizontal. Con ello se consigue una retencin de partculas del 99.999% por debajo generalmente de un grosor de 0.2m. El flujo del aire es laminar, es decir, sin turbulencias donde puedan quedar retenidas partculas contaminantes. Existen diferentes tipos de cabinas de flujo laminar que tienen como fines generales: Proteger al operario de agentes patgenos o contaminantes del interior de la cabina Proteger el cultivo de patgenos o contaminantes externos o internos de la cabina Proteger el medioambiente de patgenos o contaminantes del interior de la cabina Segn importancia de la proteccin de estos tres elementos se distinguen cabinas de clase I, II y III: Clase I: Protege al operario y al medioambiente (campanas de gases) Clase II: Protegen al operario, el cultivo y el medioambiente Clase III: Cabina de seguridad estanca para trabajo con agentes biolgicos de alto riesgo Para ms informacin sobre seguridad biolgica y cabinas de flujo laminar (Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets, CDC y NIH. 1995)

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8.2. Incubador de CO2 Adems de otros sistemas incubadores de temperatura controlada como estufas y baos termostatados, los incubadores ms caractersticos del laboratorio de cultivo de tejidos son los incubadores de CO2. Esto son equipos que mantienen la temperatura, adems poseen un sistema de inyeccin de CO2 generalmente entre 4-7%, y finalmente controlan la humedad ambiente. Es muy importante la estabilidad de la temperatura ya que las clulas suelen resistir bajadas de la temperatura, pero son muy sensibles a aumentos por encima de la temperatura del animal de origen. Para homogeneizar la temperatura interna, algunos incubadores poseen un dispositivo de recirculacin de aire que garantiza la homogeneidad de la temperatura en el interior de la cmara. El nivel de CO2 se ajusta para mantener equilibrio carbonato-bicarbonato del medio de cultivo. Ms informacin sobre incubadores de CO2: Revco Termo Forma

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8.3. Microscopios El control microscpico del cultivo se realiza con un microscopio en el cual la fuente de iluminacin y los objetivos se encuentran en posicin invertida respecto de los microscopios pticos convencionales. Por ello se suelen llamar microscopios invertidos. El motivo de la localizacin de los objetivos y de la fuente de iluminacin se basa en que los frascos de cultivo suelen tener un grosor de centmetros y por lo tanto los microscopios convencionales no tienen una distancia focal en sus objetivos que permita la observacin. Al estar localizados en los microscopios invertidos los objetivos en la parte inferior, la distancia focal se reduce al grosor del substrato de cultivo. Generalmente no se realizan coloraciones de las clulas en cultivo, por lo tanto, son muestras vivas sin color y con poco contraste por lo que se utilizan condensadores y objetivos de contraste de fases y prismas de contraste de interferencia diferencial de Nomarski.

Leica Nikon Olympus Zeiss

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8.4. Congeladores y equipo de criogenia Es recomendable disponer de distintos equipos que mantienen temperaturas bajas. Entre ellos podemos distinguir: Frigorficos de 4C: para mantener almacenados medios o tampones Congeladores de -20C: para mantener suero, aditivos y enzimas Congeladores de -80C: para mantener a largo plazo aditivos del medio de cultivo y para substancias muy sensibles como enzimas, mitgenos, inductores, factores de crecimiento, ... Unidad de almacenamiento en nitrgeno lquido (-196C): para el almacenamiento de lneas celulares El proceso de almacenamiento por congelacin de clulas en cultivo requiere un medio especial de congelacin que contiene un agente criopreservante (glicerina, DMSO, ...). Para proceder a la congelacin se realizan pases por temperaturas cada vez ms bajas hasta finalmente utilizar los depsitos con nitrgeno lquido. Existen sistemas automticos para la reduccin progresiva y controlada de la temperatura. Ms informacin sobre sistemas criognicos: Carburos Metlicos Revco Termo Forma

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8.5. Equipo de esterilizacin y filtracin Para garantizar la asepsia del cultivo no slo el medio debe de ser esteril y el rea de trabajo lo ms asptica posible (cabina de flujo), tambin todos los recipientes e instrumentos que entren en contacto con el cultivo deben de ser estriles. A veces podemos utilizar tubos o pipetas que se adquieren estriles, pero en otras ocasiones debemos de proceder a su esterilizacin. El mtodo ms utilizado es el autoclave (aproximadamente 121C, 1.0 bar, 15 min). Otros sistemas son la eserilizacin por irradiacin con rayos gamma o rayos X, la esterilizacin por gas (oxido de etileno o formaldehdo), luz ultravioleta, calor seco, ... Estos sistemas se utilizan generalmente para elementos de cristal o de plstico como frascos, tubos, pipetas, etc... Para esterilizar soluciones lquidas se suelen utilizar sistemas de filtros de 0.22m de poro (Millipore) que no dejan pasar ni bacterias ni hongos mayores de dicho tamao, realizndose por lo tanto una esterilizacin por filtracin.

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8.6. Otros instrumentos Otros instrumentos frecuentes en el laboratorio de cultivo de tejidos, al igual que en otros laboratorios, son:

Balanzas

Bao termostatado

Centrfugas refrigeradas y no refrigeradas

Equipos de purificacin de agua

Micropipetas de volumen variable o de volumen fijo

pHmetro

Pipeteadores automticos

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9. El substrato y el medio de cultivo Para poder realizar un cultivo de tejidos es preciso: Un recipiente, donde se realiza el cultivo o Placa de Petri de tamaos 3.5, 6.0 y 10 cm o Multiplacas, con varios pocillos de 6 a 96 son las ms frecuentes o Frascos de Roux de diferentes formas y tamaos o Especiales, como las roller bottles o los que llevan incorporados un portaobjetos

Un substrato, donde las clulas se adhieren y crecen o Recipientes de vidrio, de los indicados en el apartado anterior o Recipientes de plstico, de los indicados en el apartado anterior o Microsoportes, pequeas esferas de distinta naturaleza, que se mantienen en suspensin, sobre las que crecen las clulas o Substratos metlicos o Superficies tratadas con componentes de la matriz extracelular como colgeno, fibronectina, vitronectina, etc... o Feeder layers, que son restos de celulas que creciereon en monocapa y que se esterilizan y se inhibe su crecimiento con radiacin gamma o X. o Matrices tridimensionales como geles de colgeno, celulosa, fosfato clcico, etc ... o Substratos no adherentes como agar o agarosa que permiten cierta separacin entre las clulas para formar colonias Una fase gaseosa donde es de gran importancia el oxgeno y el dixido de carbono. El primero de ellos, imprescindible para la vida de las clulas. El segundo, fundamental para la regulacin del pH del medio de cultivo. Un medio lquido que recubre o en el que estn suspendidas las clulas y que las nutre. Este es el medio de cultivo que presenta una serie de caractersticas como: o Propiedades fsicas pH, generalmente alrededor de 7.4 y controlado por el CO2 del incubador y por substancias amortiguadoras incluidas en la formulacin del medio como el HEPES. El medio de cultivo suele incluir rojo fenol que es un indicador del pH, as el

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medio es de color rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5, azul-rojizo a ph 7.6 y de color prpura a pH 7.8 Osmolaridad, que suele estar comprendida generalmente entre 260-320 mOsm/kg. Temperatura, es fundamental para el correcto crecimiento de las clulas e influye asimismo en el pH Viscosidad, relacionada con la concentracin de suero Tensin superficial, que debe de mantenerse lo suficientemente baja para evitar la formacin de espumas

o Composicin qumica Solucin salina equilibrada (BSS): mezcla de sales inorgnicas suplementada con glucosa Aminocidos, es necesario suplementar con aminocidos esenciales, generalmente se aade glutamina a una concentracin 2mM antes de la utilizacin del medio Vitaminas Glucosa Otras molculas, como lpidos, piruvato, etc... Suero, que aporta hormonas y factores de crecimiento. Los ms utilizados son el suero de ternera (CF), el suero bovino fetal (FCS), el suero de caballo (HS) y el suero de origen humano (HuS). El suero es un elemento determinante en el correcto crecimiento de un cultivo. Existen lneas que sin suero no crecen y existen otras lneas que no crecen en la presencia de suero. Esto se debe a la presencia de diferentes molculas en el suero, generalmente en concentraciones mnimas, que pueden estimular o inhibir el crecimiento celular. Adems, los distintos lotes de suero suelen ser diferentes en las concentraciones de estos elementos, con lo a veces la repeticin de un experimento no es posible al desconocer exactamente las concentraciones de estas molculas en los distintos sueros utilizados. Antibiticos y antifngicos, para evitar el crecimiento de bacterias y hongos. Los ms utilizados son penicilina, estreptomicina, gentamicina, fungizona y anfotericina-B Actualmente se pueden utilizar ciertos medios con frmulas definidas que incluyen factores de adhesin, inhibidores de proteasas, hormonas, factores de crecimiento, oligoelementos como Cu, Se y Fe, y protenas

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BME MEM RPMI 1640 DMEM GMEM IMDM McCoy 5a L-15 F-10 F-12 199 M16 CS-C

Medio basal de Eagle Medio mnimo esencial de Eagle Medio MEM modificado por Dulbecco Medio MEM de Glasgow Medio DMEM modificado por Iscove Medio L-15 de Leibovitz Medio F-10 de Ham Medio F-12 de Ham Medio 199

Existen un gran nmero de medios de cultivo diferentes que se diferencian en la calidad y cantidad de sus componentes. Algunos son de uso general y otros son muy especficos para el crecimiento de ciertas clulas. En la tabla adjunta se indican algunos de ellos

El medio de cultivo puede fabricarse en el laboratorio siguiendo la formulacin del mismo, pero es ms frecuente adquirirlo ya sea en forma de polvo cristalino para reconstituirse con agua, y generalmente aadirle glutamina y suero; o como un medio lquido al que se le aade slo glutamina y suero.

Para ms informacin sobre substratos y medios de cultivo: Amersham Biosciences BD Biosciences Bellco Glass Inc. Cellgro Corning Invitrogen LifeTecnologies Nunc Roche Sigma-Aldrich

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Apndices
Apndice A
Trminos:
Aneuploida Asepsia Clon Fusin celular Heterocarion Hbridos In vitro In vivo Micoplasmas Mutgenos Oncogenes Tripsina

Apndice B
Bibliografa: Butler M (1996) Animal Cell Culture and Technology. The Basics. IRL Press at Oxford University Press, Nueva York, USA. Davis JM (2002) Basic Cell Culture. Second Edition. Oxford University Press, Oxford, UK Freshney RI (1986) Animal cell culture. A practical approach. IRL Press, Oxford Freshney RI (2000) Culture of animal Cells: A manual of basic technique. 4th Edition. John Wiley & Sons.

Apndice C
Historial 1.11 07/08/2002 Archivo pdf Se aaden nuevos contenidos 1.10 26/06/2002 Archivo pdf Correcciones ortogrficas Cambio parcial de la organizacin ndice paginado
JM Garca Pgina 31 de 32 Versin 1.11 http://histolii.ugr.es/jmgarcia/cultivos/cultivos.pdf 8/7/2002

Separacin por pginas Inclusin de ms enlaces Inclusin de bibliografa Trminos 1.00 21/06/2002 Archivo pdf

Apndice D
Mejoras pendientes de realizar: Incluir un historial del fichero Incluir trminos Incluir bibliografa Incluir protocolos Ordenar figuras y poner pies 26/06/2002 26/06/2002 26/06/2002

JM Garca

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