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INMUNOFISIOPATOLOGA Y DIAGNSTICO DE LA ASPERGILOSIS BRONCOPULMONAR ALRGICA

CARLOS FRANCISCO HERRERA HOYOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA BOGOT, NOVIEMBRE DE 2005

INMUNOFISIOPATOLOGIA Y DIAGNOSTICO DE LA ASPERGILOSIS BRONCOPULMONAR ALRGICA

CARLOS FRANCISCO HERRERA HOYOS

MONOGRAFA Presentado como requisito parcial Para optar el ttulo de ESPECIALISTA EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA

DIRECTOR Dra. CLAUDIA MARCELA PARRA GIRALDO Bacteriloga, Magster en Microbiologa con nfasis en Inmunologia Profesora Asistente del Departamento de Microbiologa

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA BOGOT, NOVIEMBRE DE 2005

INMUNOFISIOPATOLOGA Y DIAGNSTICO DE LA ASPERGILOSIS BRONCOPULMONAR ALRGICA

CARLOS FRANCISCO HERRERA HOYOS

Dra. CLAUDIA MARCELA PARRA GIRALDO DIRECTORA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA BOGOT, NOVIEMBRE DE 2005

INMUNOFISIOPATOLOGA Y DIAGNSTICO DE LA ASPERGILOSIS BRONCOPULMONAR ALRGICA

CARLOS FRANCISCO HERRERA HOYOS

Dra. Diana Patio C. M.Sc. COORDINADORA ESPECIALIZACIN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGA CLNICA BOGOT, NOVIEMBRE DE 2005

Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones anotadas, son de responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la Pontificia Universidad Javeriana (Artculo 9.18 del reglamento de trabajos de grado y de investigacin. Agosto de 1989)

TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIN JUSTIFICACIN OBJETIVOS 1. QUE ES LA HIPERSENSIBILIDAD? ..............................................................14 1.1. Hipersensibilidad tipo I ....................................................................................14 1.2.. Hipersensibilidad de tipo III ............................................................................16 1.3. La hipersensibilidad de tipo IV o hipersensibilidad retardada .........................17 2. CARACTERSTICAS DE LOS ALERGENOS ....................................................18 3. HONGOS Y ALERGIA .......................................................................................19 3.1. Proceso de sensibilizacin a aero-alergenos fngicos ...................................22 4. ASPERGILLUS FUMIGATUS ............................................................................23 4.1. Alergenos de A. fumigatus ..............................................................................26 5. PROCESO DE SENSIBILIZACIN EN LA ABPA..............................................28 5.1. Patogenia y epidemiologa de la ABPA ..........................................................29 5.2. Criterios diagnsticos del ABPA .....................................................................29 6. PAPEL DE CLULAS DEL SISTEMA INMUNE INNATO, EN LA RESPUESTA INMUNE FRENTE A CONIDIAS DE A. FUMIGATUS ..........................................30 7. PAPEL DE LOS LINFOCITOS T, EN EL PROCESO DE SENSIBILIZACIN FRENTE A ALERGENOS DE A. FUMIGATUS .....................................................31 8. IMPLICACIN GENTICA DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LA ABPA .................32 9. EL DIAGNSTICO DE LA ALERGIA.................................................................33 9.1. Para estudiar los alergenos es importante el proceso de caracterizacin de estos el cual comprende varias etapas:.................................................................35 9.2. Pruebas en el diagnstico de alergia ..............................................................37 9.3 Experiencia en la obtencin de antgenos de A. fumigatus .............................39 para el diagnostico de ABPA .................................................................................39 9.4. Antgenos descritos en A. fumigatus...............................................................41 9.5. Serodiagnostico en pacientes con sospecha de ABPA ..................................44 9.6. Serodiagnostico en pacientes con aspergilosis invasora................................45

CONCLUSIONES ..................................................................................................49 BIBLIOGRAFA ......................................................................................................52

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Reaccin de hipersensibilidad Tipo I. ........................................................... 15 Figura 2. Respuesta alrgica........................................................................................... 16 Figura 3. Reaccin Intradrmica (Aplicacin del alergeno en la superficie cutnea) ...................................................................................................................................... 38 Figura 4. Reaccin Intradrmica (Puncin (Prick) de la piel a travs de la gota de alergeno previamen - ................................................................................................ 38 Figura 5. Reaccin Intradrmica (Visualizacin de una prueba cutnea realizada con histamina (con -trol positivo), en la parte inferior de la imagen, y con suero fisiolgico (control negativo) en la parte superior.) .............................................. 38

INTRODUCCIN Aspergillus sp es un hongo de amplia distribucin nivel mundial. De las aproximadamente 180 especies reconocidas de Aspergillus sp un numero relativamente pequeo causa enfermedades en humanos. A. fumigatus, A. flavus, A. niguer entre otros, son los patgenos humanos mas comunes, sin embargo por las caractersticas de termotolerancia de A. fumigatus, es el que mayor capacidad posee para adaptarse a la temperatura corporal y colonizar el tejido, este hongo es un saprobio cosmopolita que se ha aislado prcticamente en cualquier tipo de sustrato, en el mundo es uno de los mas ubicuos y sus conidias son trasportadas por el aire. Los hongos en la naturaleza cumplen su ciclo de vida en nichos ecolgicos que no comprometen a los organismos superiores, es por este motivo que su clasificacin como patgeno ha sido controversial, dentro de las patologas en las cuales se han visto comprometidos los hongos podemos mencionar, las micotoxicosis en las cuales hay envenenamiento alimentario por causa de las micotoxinas, el micetismo, entidad atribuida al consumo de hongos alucingenos, las micosis, en donde los hongos son capaces de proliferar e invadir tejidos las cuales, se clasifican segn el sitio de colonizacin en micosis superficiales, subcutneas, sistmicas, las que ocurren en pacientes inmunocompetentes, y las llamadas micosis oportunistas, que ocurren en pacientes inmunocomprometidos. Finalmente diferentes componentes de las conidias de los hongos actan como alergenos, en donde en pacientes susceptibles, atpicos generan respuestas de hipersensibilidad principalmente de tipo 1. Dentro de los Aspergillus involucrados mas frecuentemente en procesos alrgicos se encuentra A. fumigatus, principalmente en pacientes inmunocompetentes, en estos hospederos tambin puede presentarse como

aspergiloma o bola de hongo; Adicionalmente como una entidad clinica diferente en individuos inmunicomprometidos puede producir a nivel sistmico enfermedades graves, como la aspergillosis invasora. Entre las enfermedades de componente alrgico que involucran al rbol respiratorio, tenemos entre otras asma, laringitis, sinusitis y rinitis, las cuales al parecer se desarrollan luego de la exposicin a diferentes alergenos, lo que se traduce en la obstruccin bronquial, acompaada de un proceso inflamatorio e hiperreactividad bronquial que puede conducir a alteraciones titulares peri bronquiales; dentro de los alergenos que producen estos cuadros clnicos se incluyen las conidias del gnero Aspergillus. En el asma, se han descrito complicaciones con la aparicin de la Aspergillosis broncopulmonar alrgica (ABPA), la cual tambin puede ser una complicacin de la fibrosis cistica donde el hongo principalmente acta como un colonizador bronquial y no como invasor tisular. La ABPA se considera una hipersensibilidad pulmonar causada principalmente por colonizacin bronquial por A. fumigatus, se encuentra asociada con una respuesta inmune por linfocitos antgeno especficos Th2 con secrecin el IL4 e IL5 entre otras citocinas. La reaccin de hipersensibilidad esta caracterizada por varias caractersticas, entre ellas la presencia de IgG e IgE especificas contra eptopes de A. fumigatus, eosinofilia, aumento en IgE total, reactividad cutnea inmediata, bronquiectasias proximales, y fibrosis pulmonar. Es importante tener en cuenta que estos hallazgos pueden ser similares a los causados por infecciones bacterianas en pacientes con fibrosis cistica o por atopia, menos la presencia de anticuerpos (Ac) especficos contra A. fumigatus. En cuanto a la frecuencia de la ABPA no se conoce con exactitud, pero se estima que tiene una prevalencia del 6 al 20% en pacientes con asma y del 8.5% entre los pacientes con fibrosis cistica. Segn estudios epidemiolgicos multicentricos

realizados en EE.UU. y Canad, otro en Europa, se observaron datos de prevalencia de ABPA en 2% y 7.8% respectivamente. En la revisin de literatura realizada, no se encontr un reporte epidemiolgico de la situacin de los pacientes asmticos y con fibrosis cistica, en Colombia. Para el diagnostico de ABPA, existen exmenes paraclinicos que ayudan con la confirmacin de esta entidad clnica. Entre los cuales se cuentan con pruebas serolgicas para determinar la sensibilizacin de los individuos a los alergenos de los diferentes Aspergillus, mtodos de ELISA para deteccin de anticuerpos contra antgenos de A. fumigatus, ensayo para cuantificacin de antigenemia como ELISA tipo sndwich y aglutinacin por ltex adems tcnicas moleculares como PCR para deteccin de ADN de A. fumigatus. En esta revisin se har un exploracin de la literatura que hace referencia a la inmunofisipatologia de la ABPA, a las investigaciones que relacionan tipos de HLA con la susceptibilidad a esta enfermedad y sobre las tcnicas con las cuales se cuenta para el diagnostico de esta entidad clnica.

JUSTIFICACIN El elevado numero de conidios presentes en el aire y la baja incidencia de las micosis en hospederos inmunocompetentes nos demuestra que a pesar de que la mayor parte de personas estn expuestas a un gran nmero de hongos estos microorganismos son habitualmente eliminados por los mecanismos defensivos del hospedero. El desarrollo de una infeccin fngica depende del estado de los mecanismos de defensa del hospedador, los factores de virulencia del hongo y la dosis infectante o tamao del inoculo fngico (Bial Aristegui 2002). La posibilidad de que una persona inhale esporas fngicas, tanto en ambientes abiertos como cerrados, es elevada. Las respuestas alrgicas a los hongos se relacionan de una manera ms directa con las esporas fngicas que con la presencia de restos miceliares u otras clulas fngicas. La respuesta a cada tipo de espora difiere segn la persona, y los alergenos fngicos presentan una gran variabilidad en la severidad de la respuesta alrgica que provocan.

OBJETIVOS Objetivo General Realizar (ABPA) Objetivos Especficos 1. Determinar, con que profundidad se conoce sobre la inmunofisiopatologa de una bsqueda y anlisis de la literatura referente a la

inmunofisiopatologa y diagnstico de la Aspergilosis Broncopulmonar Alrgica.

la Aspergilosis Bronco Pulmonar Alrgica. 2. Indagar sobre datos epidemiolgicos de esta enfermedad publicados a nivel

mundial. 3. Saber si se conoce, sobre la asociacin de molculas del HLA, la resistencia

y /o susceptibilidad frente a la ABPA 4. Conocer las tcnicas a nivel de laboratorio su sensibilidad y .especificidad

con las que en la actualidad se cuentan para el diagnostico. de ABPA.

1. QUE ES LA HIPERSENSIBILIDAD? La hipersensibilidad se define en forma genrica como la respuesta inmunolgica excesiva, resultado de una susceptibilidad antignica individual, probablemente debido a un trastorno del complejo sistema de inmunoregulacin. Los mecanismos ntimos siguen 4 patrones definidos con los trminos, de reacciones de hipersensibilidad el tipo I, II, III, IV. De acuerdo con la clasificacin de Coombs y Gell. En una respuesta alrgica se pueden dar las respuestas de hipersensibilidad de tipo I, III y IV, en la respuestas originadas por alergenos fngicos, predominan la respuesta tipo I, seguida de la III, y en una menor proporcin por la IV. (MONTOYA ROJAS, M., 2004). 1.1. Hipersensibilidad tipo I El desarrollo de una hipersensibilidad de tipo I implica en la mayora de los enfermos una predisposicin gentica. Estos pacientes producen una respuesta de anticuerpos IgE en concentraciones ms elevadas que las personas no atpicas. Esta produccin de IgE se da despus de una primera exposicin al alergeno, cuando el individuo se vuelve a exponer a este, los anticuerpos IgE se unen a receptores Fc, presentes en los mastocitos y basfilos. Cuando se produce un entrecruzamiento entre el antgeno y estos anticuerpos asociados a clulas, las clulas son activadas para liberar rpidamente diversos mediadores, estas citocinas en conjunto producen un aumento de la permeabilidad vascular, vasodilatacin contraccin del msculo liso bronquial y visceral e inflamacin local, esta reaccin se conoce tambin como hipersensibilidad inmediata, porque comienza rpidamente a los pocos minutos de la estimulacin por el alergeno, y en la clnica a esto se le denomina una respuesta alrgica. (figura 1 y 2). Esta respuesta parece ser un comn denominador en las respuestas originadas por aeroalergenos fngicos, la cual puede estar acompaada, en una menor 14

proporcin, por respuestas de hipersensibilidad tipo III o IV. (MONTOYA ROJAS, W., 2004; Bial Aristegui, 2002).

Figura 1. Reaccin de hipersensibilidad Tipo I.

Fuente: www.zonamedica.com.ar/.../alergia/fenomeno.htm

1. Alergeno. 2. Mecanismo inductor. 3. Determinante antignico. 4. Linfocito B. 5. Proliferacin y diferenciacin celular. 6. Linfocito T helper. 7. Inhibicin. 8. Inhibicin. 9. Linfocito T supresor. 10. Liberacin de IgE y unin a la superficie de mastocitos y basofilos. 11. Clula plasmtica (capacitada para la produccin de IgE especfica). 12. IgE especifica. 13. Leucocito basofilo.14. Mastocito.

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Figura 2. Respuesta alrgica

Fuente: www.icarito.latercera.cl/.../respuesta_alergica.htm

1.2.. Hipersensibilidad de tipo III Se caracteriza por una respuesta inmune exageradamente anmala que est producida por la interaccin entre alrgenos fijos o circulantes con anticuerpos IgG (o IgM). Ello da lugar a la formacin de inmunocomplejos que actan como iniciadores de reacciones bioqumicas inflamatorias en cascada, como la 16

activacin del complemento, liberacin de mediadores qumicos, presentes en los grnulos de mastocitos y basfilos, y agregacin plaquetaria. La alveolitis extrnseca alrgica y algunos tipos de asma estn asociados a reacciones de tipo III. Habitualmente se asocian a enfermedades profesionales que afectan a granjeros y agricultores que manipulan heno u otros forrajes (pulmn de granjero), cuidadores de palomas (pulmn de cuidador de palomas y otras aves), trabajadores de destileras de whisky (enfermedad del trabajador de la malta), empresas lecheras dedicadas a la fabricacin de quesos (pulmn de lavador de quesos) o en personas dedicadas a la obtencin de lea (pulmn de leador). Los alrgenos ms importantes suelen ser de procedencia bacteriana (Actinomyces) y, entre los fngicos, destacan fundamentalmente Mucor y Alternaria. (Bial Aristegui, 2002). 1.3. La hipersensibilidad de tipo IV o hipersensibilidad retardada Est mediada por linfocitos T sensibilizados que reaccionan con un alrgeno que ha penetrado o ha sido inmovilizado en un tejido mucosa respiratoria, vasos sanguneos, entre otros. Durante la respuesta se generan linfocinas y una respuesta inflamatoria tisular acompaante. Este mecanismo es probablemente el responsable de la alveolitis alrgica inducida por hongos en pacientes expuestos de forma crnica a los alrgenos fngicos. Suele aparecer al menos 24 h despus del contacto con el antgeno. (Bial Aristegui, 2002).

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2. CARACTERSTICAS DE LOS ALERGENOS Son antgenos que son inocuos para la mayora de la poblacin pueden causar enfermedad alrgica e nun individuo atpico expuesto a ellos por inhalacin, inyeccin o ingestin, el trmino alergeno se aplica especficamente a aquellos antgenos que pueden causar sntomas alrgicos. No obstante los individuos atpicos con frecuencia no son sensible s a algunos antgenos, an cuando estn expuestos intensamente a elles, asunto los mismos alrgenos pueden causar problemas severos en otras personas atpicas, se han aislado y caracterizado alergenos de diversas fuentes como plenes, caspa de animales, leche, huevos y venenos de insectos. Los alergenos conocidos suelen ser protenas, los estudios qumicos de alergeno proteicos no proporcionan evidencia de caractersticas peculiares estructurales que podran explicar su capacidad para causar enfermedad en individuos atpicos, los polisacridos como el dextrn y el polisacrido neumococcico pueden ser alergenos, pero con menor frecuencia. Los compuestos qumicos simples que reaccionan con las protenas tisulares tambin pueden causa problemas alrgicos. Existen muy pocos datos que demuestren que existe un factor hereditario para una respuesta alrgica a un determinado alergeno. (ROJAS MONTOYA, W. 2004) Es ms probable que las condiciones de exposicin y la cantidad de alergeno con la cual el paciente entra en contacto durante un determinado perodo de la vida, este asociada a condiciones especiales, tales como infecciones virales, contaminantes atmosfricos etc., sean esenciales para el desarrollo de la enfermedad. Actualmente no se sabe cuantos alergenos existen porque aparentemente cualquier producto biolgico tiene potencial alergenico. Se han logrado purificar mas de 200 alergenos y la lista crece rpidamente debido a el aumento en las enfermedades alrgicas .

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Los alrgenos respiratorios fngicos suelen ser protenas hidrosolubles presentes en las conidias o esporas fngicas y que son extradas de las mismas por los fluidos mucosos de las vas respiratorias. (Bial Aristegui., 2002). 3. HONGOS Y ALERGIA Existe una amplia evidencia histrica que relaciona determinados tipos de alergias con los hongos y aunque los mdicos hipocrticos ya describieron enfermedades compatibles con la alergia a los hongos, la primera descripcin conocida que relaciona a hongos y cuadros alrgicos data de 1726, cuando Floyer observ sntomas asmticos en pacientes que haban visitado unas bodegas. Blackley describi, en 1873, uncatarro bronquial con roncus pulmonar severo (Catarrhus Aestivus, fiebre del heno o asma del heno) despus de la inhalacin de esporas de Chaetomium y Penicillium. En 1924, Van Leeuwen, en Holanda, relacion la aparicin de sntomas de asma con la presencia de esporas fngicas en el ambiente y con el clima, y, en el mismo ao, Cadman describi el primer caso documentado de asma asociado al polvo de trigo. En los aos siguientes se demostr que la prevalencia de conidios fngicos en el ambiente se relacionaba con una mayor presencia de reaccin cutnea positiva a los antgenos fngicos. Prince y colaboradores y Feinberg describieron que el aire de espacios abiertos era un reservorio importante de conidios y demostraron que muchos de sus pacientes presentaban reacciones cutneas frente a extractos de hongos. La inhalacin de esporas de Alternaria o de Penicillium en concentraciones comparables a las de una exposicin natural puede inducir asma en individuos sensibilizados. (Bial Aristegui., 2002). La exposicin a los alrgenos fngicos se produce tanto en espacios abiertos como interiores. Muchos de los alrgenos de interior son los mismos que se encuentran en el exterior de los edificios, penetrando por ventanas y puertas, sistemas de ventilacin, o por grietas u otras aberturas en las paredes. Los 19

hongos pueden tambin ser introducidos en los edificios a travs de la tierra arrastrada por los zapatos. Algunas especies de hongos, como Penicillium y Aspergillus, se encuentran en mayores concentraciones en el interior de los edificios que en el espacio abierto. La especie de Aspergillus implicada ms comunmente en procesos patognicos y en induccin a respuestas alrgicas es el A. fumigatus donde la entidad clnica alrgica mas frecuente es la Aspergilosis Bronco Pulmonar Alrgica (ABPA), la cual se ha descrito principalmente como una complicacin del Asma y de la fibrosis cistica. (KURUP, 2000). El nmero total de esporas fngicas en el aire puede variar de menos de 200 a ms de un milln por metro cbico. No es infrecuente que el recuento de esporas fngicas supere las 4000 por metro cbico, siendo de stas ms de 2000 de Cladosporium y ms de 1000 de Alternaria. Cladosporium y, sobre todo, Cladosporium herbarum, contribuye con un mayor nmero de esporas en los ambientes abiertos y se le considera una causa importante de alergia respiratoriaUn estudio realizado en Cdiz durante el ao 1989 detect un total de 340,60 esporas de Alternaria por metro cbico, con un pico mximo en la semana 43 en el que se alcanzaron 82,10 esporas por metro cbico. La posibilidad de que una persona inhale esporas fngicas, tanto en ambientes abiertos como cerrados, es elevada. (Bial Aristegui., 2002). Las respuestas alrgicas a los hongos se relacionan de una manera ms directa con las esporas fngicas que con la presencia de restos miceliares u otras clulas fngicas. Las respuestas a cada tipo de espora difieren segn las personas y los alrgenos fngicos presentan una gran variabilidad en la severidad de la respuesta alrgica que provocan. Aunque la concentracin en el aire de Cladosporium es mayor, hay ms personas alrgicas a Alternaria que a Cladosporium y las respuestas son ms severas contra Alternaria. De hecho, la sensibilizacin a alrgenos fngicos y la exposicin a esporas de hongos aerovagantes se han asociado con episodios severos de asma y parece existir 20

una mayor mortalidad en aquellos pacientes con sensibilizacin a Alternaria alternata. No siempre es posible establecer una relacin directa entre los recuentos de esporas fngicas en la atmsfera y la presencia de sintomatologa alrgica. (Bial Aristegui., 2002). Esto puede deberse a diferentes factores, principalmente ambientales donde la humedad es el factor que contribuye con mayor eficiencia al crecimiento de los hongos donde estos crecen y sus conidias son transportadas libremente por el viento en das secos y ventosos. Este polvo orgnico puede sedimentarse en diferentes superficies o puede ser inhalado por el ser humano u otros animales y depositarse los conidios en superficies mucosas respiratorias o en la conjuntiva. La exposicin repetida a estos propgulos fngicos aumentan el riesgo de que se desarrollen reacciones alrgicas especficas contra antgenos fngicos. (Bial Aristegui., 2002). La sensibilizacin a los alrgenos de los hongos es bastante comn y particularmente entre personas con asma. En EE.UU. se considera que alrededor del 4% de la poblacin est sensibilizada con alrgenos de Alternaria alternata y se ha observado que el 80% de los pacientes asmticos muestran reactividad cutnea frente a antgenos de uno o ms hongos. (Bial Aristegui., 2002). Los estudios realizados por DAmato y colaboradores en 1997 en Europa, con pruebas cutneas usando extractos de Alternaria y Cladosporium, mostraron valores muy variables, desde el 3-4% de Portugal y los pases escandinavos al 20% en Espaa. El nmero de asmticos con sensibilizacin a alrgenos fngicos parece estar aumentando. En Hungra, por ejemplo, ha aumentado de 10,6% en 1977 a 38,5% en 1988, aunque esto puede asociarse al aumento de la potencia de los extractos fngicos empleados en las pruebas intradrmicas y a la mejora de los estudios realizados. (Bial Aristegui., 2002).

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La alergia de tipo I a los hongos no es tan frecuente e importante como la desarrollada frente a otros alrgenos inhalados. Se estima que alrededor del 8% de los adultos y entre el 20 y el 25% de los nios con alergia respiratoria son hipersensibles a antgenos de hongos. (Bial Aristegui., 2002).

3.1. Proceso de sensibilizacin a aero-alergenos fngicos Los alrgenos respiratorios fngicos despus de ser inhalados van a atravesar las barreras mucosas y van a ser fagocitados por los macrfagos y otras clulas presentadoras profesionales de antgenos (APC) que degradan a los alrgenos. Durante la degradacin del alrgeno, las APC procesan a estos componentes proteicos para presentrselos posteriormente, bajo restriccin de las molculas del complejo principal de histocompatibilidad de tipo II (MHCII), a los receptores (TCR) de los linfocitos T cooperadores (CD4+). Los linfocitos B, a travs de su receptor especfico (BCR), tambin van a reconocer a los alrgenos. El intercambio de seales qumicas por mediadores como las citocinas entre linfocitos T cooperadores y linfocitos B va a posibilitar que las clulas B se transformen en clulas plasmticas y produzcan anticuerpos de la clase IgE. Esta activacin que en personas sin alergia produce una respuesta de defensa contra los diferentes agentes infecciosos: bacterias, virus, protozoos, hongos, en las personas atpicas conlleva una sobreproduccin de IgE que produce numerosos efectos indeseables. En las reacciones de hipersensibilidad de tipo I, como en la fiebre del heno o el asma, tras una primera exposicin al alrgeno la persona se sensibiliza, produciendo anticuerpos especficos contra el antgeno generalmente IgE, que quedan expuestos sobre la superficie de mastocitos y basfilos. (Bial Aristegui., 2002). Despus de una segunda exposicin al alrgeno, la reaccin se produce muy rpidamente, en pocos minutos. Una sustancia de gran importancia que se libera 22

durante la reaccin alrgica es la histamina. Tambin son liberados otros mediadores qumicos, como leucotrienos (LTC4, LTD4, LTE4), factor de agregacin plaquetaria (PAF) y prostaglandinas (como la PGD2). La histamina es un potente mediador de la inflamacin y su liberacin por mastocitos y basfilos da lugar a una disminucin de la tensin sangunea, una contraccin del msculo liso (broncoconstriccin, vasoconstriccin) y aumento de la secrecin de las glndulas mucosas. Los mastocitos y los basfilos son dos tipos celulares relacionados con la liberacin de histamina. Los anticuerpos IgE producidos por las clulas plasmticas se unen a los receptores presentes en la superficie de mastocitos presentes en piel, mucosas y tejidos y basfilos torrente sanguneo. Ambos tipos celulares contienen grnulos con histamina y otros mediadores qumicos y una reaccin entre los alrgenos y los anticuerpos IgE sobre las superficies celulares, entrecruzamiento de las inmunoglobulinas provoca el comienzo de la desgranulacin celular y la liberacin subsecuente de mediadores qumicos. La histamina produce la contraccin del msculo liso de los bronquiolos (broncoconstriccin) que se observa en el asma, la secrecin de mayor cantidad de moco en las paredes bronquiales y alveolares, la secrecin de fluido nasal y de lgrimas, con congestin nasal y prurito nasal y conjuntival, y finalmente, la alteracin de la permeabilidad vascular con una disminucin de la presin sangunea que en raras ocasiones puede conducir a un choque alrgico o anafilctico. No es infrecuente que exista una fase tarda del proceso. A travs de este proceso se producen algunas formas de asma extrnseca, rinitis alrgica estacional, urticaria, angioedema, choque anafilctico y alergia digestiva Frecuentemente se utiliza el trmino genrico de alergia como sinnimo de este tipo de hipersensibilidad. (Bial Aristegui., 2002). 4. ASPERGILLUS FUMIGATUS Es un hongo filamentoso con conidioforos cortos, de pared lisa, incoloros o ligeramente verdosos, sin tabicar y sin ramificaciones. Nacen de una clula base 23

del micelio, ensanchando al final en una vescula amplia, coronada de esterigmas en forma de redoma (Figura 3). Su posicin taxonmica : Phylum: Ascomycota, Clase: Euascomycetes, Orden: Eurotiales, Familia: Trichocomaceae Sinnimos: Aspergillus bronchialis, Aspergillus phialoseptus, Aspergillus septatus. (Bial Aristegui., 2002) En su aspecto macroscpico sus colonias son de crecimiento rpido, planas, vellosas, compactas, blancas al comienzo, toman rpidamente un color verde grisceo, de aspecto aterciopelado y consistente. La superficie muestra algunos pliegues y mechones vellosos blancos. Dorso incoloro que, al envejecer, toma tintes amarillos o pardos. Su crecimiento es ms rpido a 37C. (Bial Aristegui, 2002) (Figura 3). (Bial Aristegui., 2002) Figura 3. A B

A. Microscopia de conidias-conidioforos y fialides de A. fumigatus. B. Colonias de A. fumigatus, anverso Tomado de: Rev Iberoam Micol 2002.

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A. fumigatus es un hongo cosmopolita, saprofitico que juega un papel importante en el reciclamiento del nitrgeno y el carbono ambiental. Su nicho ecolgico natural es el suelo o la tierra, donde sobrevive y crece en el detrito orgnico. Aunque esta especie de hongo no es la mas prevalente en el mundo, es uno de los mas ubicuos de aquellos con conidias transportadas en el aire. A. fumigatus lleva a cabo un proceso abundante de esporulacin produciendo miles de conidias. Las conidias liberadas a la atmsfera tienen un dimetro suficiente (2 a 3 micras) para alcanzar los alvolos pulmonares. A. fumigatus no tiene un mecanismo elaborado para liberacin de conidias al aire; la diseminacin o su liberacin simplemente se da por disturbios en el ambiente o por fuertes corrientes de aire. Una vez las conidias estn en el aire, debido a su pequeo tamao quedan vagando en el. Revisiones ambientales indican que todos los humanos inhalan miles de conidias de A. fumigatus por da. Para muchos de los pacientes, por lo tanto, la enfermedad ocurre predominantemente en los pulmones, aunque puede haber diseminacin en pacientes mas severamente predispuestos. (Latge, 1999). La inhalacin de las conidias por individuos inmunocompetentes raramente tiene un efecto adverso, desde que son eliminadas de una forma relativamente eficaz por mecanismos innatos del sistema inmune. As, durante los ltimos aos A. fumigatus haba sido visto como un patgeno dbil responsable de las formas alrgicas de la enfermedad, como Pulmn de granjero, Aspergilloma. (Latge 1999). La predominancia del A. fumigatus sobre las dems, se debe a: La adaptabilidad de este a la temperatura del cuerpo humano, a una comparativa resistencia a la muerte oxidativa y a esporas de pequeo tamao capaz de alcanzar los alvolos en las vas respiratorias. Aspergillus fumigatus es responsable de muchos casos de aspergilosis broncopulmonar alrgica (ABPA) y aspergiloma, dos condiciones clnicas en las que dicho hongo acta como colonizador bronquial y no un invasor tisular. 25

En la ABPA desencadena una hipersensibilidad de tipo I y adems cuenta con la accin ocupante de espacio del crecimiento fngico. El aspergiloma, se define como un crecimiento fngico miceliar en forma de

pelota en una caverna preformada dentro del parnquima pulmonar (muchas veces posttuberculosa). Ambas entidades clnicas pueden presentar signos radiolgicos que ayudan en el diagnstico. En la mayora de los pacientes (> 81%) con estas presentaciones alrgicas se detectan anticuerpos IgE que contribuyen al diagnstico. Otras especies de Aspergillus de inters en patologa humana Aspergillus flavus, Aspergillus Nger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor. En esta revisin haremos especial nfasis en la Aspergillosis Broncopulmonar Alrgica (ABPA) la cual se define como una reaccin de hipersensibilidad en los pulmones que ocurre en pacientes que tienen como base un proceso asmtico y/o de fibrosis cistica. Los criterios diagnsticos de ABPA incluyen: asma, infiltrado pulmonar, reacciones el hipersensibilidad inmediata a pruebas dermicas frente a antigenos de Aspergillus sp, IgE total elevada en suero, eosinofilia en sangre perifrica, presencia de anticuerpos IgE-IgG especficos de Aspergillus sp, bronquiectasias central y anticuerpos precipitantes contra A. fumigatus. Todos estos criterios pueden no estar siempre presentes en todos los pacientes. Aunque la presencia de IgE especifica contra A. fumigatus en suero es considerado un criterio muy significativo para el diagnostico. (Latg 1999). 4.1. Alergenos de A. fumigatus Los alergenos descritos hasta el momento de Aspergillus fumigatus pueden ser categorizados funcionalmente como protenas citoplasmticas y secretadas, la 26

propiedad de estos ha unirse a molculas de IgE, ha sido crucial para clasificarlos como alergenos, y esta caracteristica ha sido una herramienta para su aislamiento y posterior produccin por tcnicas de recombinacin. Estos son los antgenos utilizados en la pruebas diferentes pruebas diagnosticas (Banerjee et al, 2000). Algunos de los alrgenos descritos son Asp f 1 (mitogilina), Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5 Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16 (protena de 43 kDa), Asp f 17, Asp f 18 y Asp f 22 (enolasa, 47 kDa). (Kurup, 2005). De los cuales directamente se han relacionado como eptopes que son reconocidos por anticuerpos IgE producidas en ABPA a: Asp f2, f3, y f6. (Rementera, et al 2005). Se conoce que hay variedad de alergenos en otras entidades alrgicas, entre ellas, La alveolitis alrgica (pulmn de granjero), el asma o la larinitis alrgica pueden desarrollarse despus de la exposicin a conidios de Aspergillus, como ocurre cuando se trabaja con heno mohoso o como en los casos de estipatosis por inhalar el polvo de las fibras de esparto -Stipa tenacissima- que contienen Aspergillus fumigatus y actinomicetos termfilos. Finalmente el conocer la diversidad y la estructura molecular de los alergenos juega un papel importante en el entendimiento del tipo de respuesta alrgica que desarrollan los pacientes, , adems que pueden modificarsen los obtenidos por metodos quimicos o por ingenieria gentica, para promover o no la unin a IgE y como cada antgeno quizs juegue un papel mas o menos especfico podran disearsen inmunomoduladores.que favorezcan las terapias para estos pacientes (Kurup, 2005)

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5. PROCESO DE SENSIBILIZACIN EN LA ABPA En la Aspergillosis Broncopulmonar Alrgica (ABPA) las esporas son inhaladas hacia las vas bronquiales donde son atrapadas por el moco luminal y germinan. Las esporas germinantes liberan antgenos que son procesados por clulas presentadoras de antgenos, como los macrfagos residentes, clulas B y clulas dendrtica, y presentados a los linfocitos T. La respuesta por parte de estos es inicialmente de tipo TH2 seal que despierta principalmente una respuesta de tipo humoral, con la produccin de interleucinas como: IL3, IL5, IL4, IL10, IL13. Para que se de la liberacin de IgE se da el reconocimiento de una segunda seal por interaccin de la clula T y B va CD23 y CD21, CD40-CD40 ligando. Se han identificado otros caminos de sealamiento de la clula B donde CD58 (LFA-3) tambin promueve el cambio de isotipo a inmunoglobulina E y adems la sntesis de esta inmunoglobulina. Consecuente con la respuesta Th2 producida, adems se producen IgA e IgG especficos. Luego de la interaccin de la clula T, B y la clula presentadora de antgeno, la respuesta inmune resultante se da inicialmente en el tejido linfoide broncoalveolar (BALT). (VISWANATH Y KURUP, 2000). Las mucosas del rbol respiratorio poseen una serie el factores con capacidad bactericida importante, los cuales refuerzan el poder protector el la mucosa. La lisozima, por ejemplo, es una enzima con capacidad el destruir la membrana celular el muchos grmenes Gram positivos, al atacar el lazo el unin entre el acido muramico y la acetil glucosamida, presente en la membrana celular de estos grmenes. Por su parte un grupo de macrfago especializados traspasan la pared el los alvolos y patrullan la luz el los mismos para fagocitar grmenes o partculas extraas que entran por va area. Igualmente Acs producidos por clulas plasmticas de la submucosa son secretados a la luz bronquial en donde actan sobre los agentes agresores para antagonizarlos y facilitar que sean fagocitados. (MONTOYA ROJAS, W. 2004).

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5.1. Patogenia y epidemiologa de la ABPA Como se mencion anteriormente, es una complicacin del asma bronquial o de la fibrosis cistica como resultado de la inhalacin de alergenos de A. fumigatus. (BENERJEE et.al. 1998; VISWANATH Y KURUP, 2000). La ABPA es actualmente la complicacin pulmonar alrgica ms severa causada por especies de Aspergillus. ABPA ocurre en aproximadamente en 1 a 2% de los pacientes asmticos (15% de los pacientes asmticos estn sensibilizados contra A. fumigatus) y del 7 al 35% de pacientes con fibrosis cistica, presentndose una respuesta inmune celular nica y hallazgos fisiopatologicos causados por productos de la respuesta de clulas T. (KRASNICK et.al. 1995) 5.2. Criterios diagnsticos del ABPA Clnicamente ABPA se manifiesta como un asma bronquial con infiltrados pulmonares transitorios que pueden evolucionar a bronquiectasias proximales y fibrosis pulmonar. Es un sndrome muy difcil de diagnosticar. Los criterios clnicamente listados para el diagnostico definitivo de la ABPA son lo siguientes: asma, eosinofilia en sangre perifrica (>1.000mm3), reactividad en piel inmediata hacia extractos antignicos de A. fumigatus entre15 +/- 5 min., presencia de anticuerpos IgE contra A. fumigatus, niveles elevados de IgE total en suero (>1 microgramos/ml), una historia de infiltrado pulmonar y bronquiectasis central. Aspectos menos importantes como: aislamiento de A. fumigatus a partir de esputo, placas de color caf con eosinofilos, cristales de Charcot-Leyden y una reaccin en piel a las 6+/-2h luego de la aplicacin del antigeno son adems usados como diagnostico. (SLAVIN et.al. 1986; SLAVIN et.al. 1988).

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6. PAPEL DE CLULAS DEL SISTEMA INMUNE INNATO, EN LA RESPUESTA INMUNE FRENTE A CONIDIAS DE A. FUMIGATUS Los Aspergillus son patgenos respiratorios y las infecciones pulmonares son usualmente adquiridas a travs de inhalacin de conidias, que poseen un dimetro aproximadamente entre 2.5 3.5 micras, las conidias son capaces de alcanzar los pequeos espacios alveolares en las vas respiratorias, donde la germinacin de la conidia y la subsecuente invasin del tejido ocurre en individuos inmunosuprimidos. Aunque clulas epiteliales y endoteliales pueden internalizar conidias, los mecanismos efectores de la respuesta innata han sido reconocidos como la mayor defensa del hospedero para la aspergillosis pulmonar invasiva (API). Los macrfagos alveolares residentes fagocitan y eliminan las conidias, principalmente por mecanismos no oxidativos, mientras que los neutrofilos usan mecanismos dependientes de oxgeno para atacar las hifas germinantes de las conidias que escapan a los macrfagos. Estudios mas recientes en ratones y humanos han mostrado que la disregulacin en la respuesta Th1/Th2 y el cambio a respuesta inmune Th2 puede contribuir en el desarrollo de un resultado desfavorable para (API). (BOZZA et.al., 2002) Las clulas dendrticas tienen un rol primario en el control de los patgenos en la superficie de la mucosa y son reconocidas como los iniciadores de la respuesta inmune contra ellos. Una densa red de clulas dendrticas ha sido descrita en el tracto respiratorio. En su estado de reposo, las clulas dendrticas del tracto respiratorio estn especializadas para tomar y procesar, pero no para presentar antigenos. Hay evidencia de que las clulas dendrticas pulmonares producen IL10, lo cual indica que la produccin local de citocinas inmunoreguladoras que puede afectar la habilidad de estas clulas para llevar a cabo una adecuada respuesta contra los patgenos invasores. Esto es particularmente relevante en el caso de la respuesta contra hongos, donde la clulas dendrticas parecen ser 30

capaces de diferenciar entre diferentes formas de estos patgenos invasores, a travs del uso de distintos receptores de patrones de reconocimiento (PRRs), receptores para un numero de componentes del sistema de complemento (CR), y FcR (Fc gammaR). (BOZZA et.al., 2000). 7. PAPEL DE LOS LINFOCITOS T, EN EL PROCESO DE SENSIBILIZACIN FRENTE A ALERGENOS DE A. FUMIGATUS . Los linfocitos T CD4 activados son como clulas ejecutivas, cuya funcin es influir en otras clulas a travs de secrecin de citocinas. En lneas generales, los linfocitos T CD4 pueden dividirse en clulas Th1, que secretan citocinas asociadas principalmente con la inmunidad celular (p. ej., IL2, interfern gamma, IL12, IL18), y clulas Th2, cuyos productos favorecen sobre todo la inmunidad humoral y la alergia (p. ej., Il4, IL5, IL10, IL13). (LAHITA, et.al. 2000). La IL3 y IL5 promueven la maduracin de eosinofilos en medula sea y su activacin. Adems, IL4 induce la expresin de VCAM-1, que son molculas de adhesin celular al endotelio vascular y su ligando VLA-4 en la clula T y eosinofilos. Recientes estudios han demostrado que IL4 induce la produccin de eotaxina (tetrapeptido acido) la cual induce el reclutamiento de eosinofilos hacia las vas areas pulmonares, adems de la expresin selectiva de receptor para citocina 3 (CCR3) y receptor para eotaxin en eosinofilos, basofilos y clulas CD4 +Th2. (VISWANATH Y KURUP, 2000) En ABPA grandes cantidades de IgE especfica contra A. fumigatus son

producidas en BALT. (VISWANATH Y KURUP, 2000). Ambos IgE-IgA anti Af 7 unidos por la porcin Fc a los receptores de los eosinofilos disparan la liberacin de mediadores cuando se unen a los alergenos. (VISWANATH Y KURUP, 2000).

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8. IMPLICACIN GENTICA DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LA ABPA Desde 1978, Flaherty y colaboradores, sospecharon sobre la relacin existente, entre los genes del HLA, el Asma y la ABPA, sin embargo no se contaba con la tecnologa necesaria, y su resultados no fueron concluyentes, en 1979 Graves y colaboradores, reportaron un caso de una familia donde la mayora de sus integrantes presentaba sintomatologa clnica de ABPA. Estos hallazgos sugeran un compromiso gentico en la susceptibilidad a la enfermedad. Teniendo en cuenta que factores como el ASMA y la fibrosis cistica, son enfermedades que se complican con ABPA, y que tienen un componente hereditario claro, hacia que esta hiptesis tuviera mas peso. Ya en 1996, con tecnologa mas avanzada, y el reconocimiento a A. fumigatus, como principal agente etiolgico del ABPA la obtencin del alergeno como el Asp f 1, se reconoci como primera instancia, Ac IgE e IgG especficos contra este antgeno, y el rol del los linfocitos en la patognesis de esta enfermedad. Asp f 1 induce un fenotipo de clulas T CD4+ Th2, productoras principalmente IL-4, las cuales presentaban HLA-DR, y principalmente los alelos HLA DR2 o HLA-DR5. (Chauhan et al, 1996). En 1997, el mismo grupo de investigacin, por serotipificacin obtuvieron que las celulas CD4+, perfil th2, estimuladas por Asp f1, presentaban los subtipos de HLA-DR2, DRB1*1501,*1503 y *1601, y para HLA DR-5 DRB1*1101,*1104 y *1202 estudios posteriores con poblacin sana, con la misma metodologa encontraron que estos pacientes significantemente en una alta frecuencia presentaban HLA-DQ2, lo que sugera que este haplotipo, podra conferir resistencia a la ABPA (Chauhan, et al 2000). Otro receptor crucial en la respuesta adaptativa, es el TCR, al estudiar, que rearreglos genticos tenan los clones de clulas T especficas a Asp f 1, encontraron que los segmento de genes utilizados en los TCR Vbeta13 , mientras 32

que los TCR de los linfocito de poblacin sana, presentaban un rearreglo Vbeta 1. lo que indicara que este factor tambin puede jugar un rol en la susceptibilidad a esta enfermedad.(Chauhan et al 2002). En estudios posteriores, encontraron que posiblemente HLA DR4 o DR7, podran estar implicados tambin en la susceptibilidad y que HA-DQ2 podria estar vinculado a la resistencia y que una combinacin de estos factores genticos determinaran el camino de ABPA en paciente con fibrosis cistica o asma (Chauhan et al,2003; Knutsen, 2003). En conclusin estos estudios y sus hallazgos, han demostrado esencialmente la relacin gentica que tiene el ABPA, en pacientes susceptibles, con la presencia de los haplotipos de CMH clase II, HLA DR 2, y DR-5, y que los individuos que presentan HLA-DQ, podran presentar resistencia a la enfermedad. 9. EL DIAGNSTICO DE LA ALERGIA Se basa en la historia clnica del paciente. Las pruebas cutneas son la mejor forma de confirmar la sensibilidad a un alrgeno especfico. Son selectivas y se realizan a partir de la informacin que proporciona el historial clnico desarrollado por el alerglogo. Las soluciones empleadas en los diferentes estudios alergolgicos se realizan a partir de extractos de materiales inhalados, ingeridos o inyectados. En la prueba intradrmica o prick test se inyecta una pequea cantidad del extracto estril estandarizado. Se considera positiva si en 15 min se produce una reaccin de ppula al menos 5 mm mayor que el control. Sin embargo, la historia clnica y la exposicin a los hongos solamente tienen validez cuando se conocen adecuadamente los patrones de crecimiento de los hongos potencialmente responsables. Cuando es imposible hacer pruebas cutneas directas, se utiliza la denominada prueba radioalergoabsorbente (RAST), 33

que detecta la presencia de IgE srica especfica frente al alrgeno correspondiente. La cantidad de IgE especfica se determina aadiendo anticuerpos anti-IgE marcados con 125I y midiendo la cantidad de radiactividad que capta el conjugado. Adems, si no hay una correlacin adecuada entre las pruebas de RAST e intradrmicas, pueden ser necesarias pruebas adicionales de provocacin alrgica. Esta prueba actualmente se realiza en sistemas automatizados, bajo la tecnologa ImmunoCAP, en sus versiones fluorimtricas o isotpicas. Tambin se utilizan, en menor medida, variantes cromognicas de esta tcnica, denominadas EAST (prueba enzimoalergoabsorbente). Uno de los mayores problemas que existen en el estudio de las alergias a los hongos es la estandarizacin de los antgenos. Hay variaciones antignicas importantes relacionadas con las condiciones externas de crecimiento como el tiempo y la temperatura de incubacin, el pH o las concentraciones de nitrgeno y carbohidratos en los medios de cultivo empleados. Se aade a esta problemtica que los extractos alergnicos empleados en el diagnstico clnico de la sensibilidad a los hongos se caracterizan por su variabilidad y a menudo son poco predecibles en su actividad biolgica. Los alrgenos fngicos pueden ser recuperados del micelio, de las esporas del hongo o del medio donde se produce su cultivo. Muchos de estos componentes alergnicos son glicoprotenas y se est desarrollando una importante labor investigadora para conocer y purificar los principales alrgenos fngicos y comprender la importancia de los componentes glucdicos y proteicos en la alergia.

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9.1. Para estudiar los alergenos es importante el proceso de caracterizacin de estos el cual comprende varias etapas: Demostracin de la unin a la IgE: La capacidad de una molcula para inducir la respuesta IgE en personas o animales debera hacerse experimentalmente. Sin embargo lo que se hace habitualmente es asumir que dicha molcula es capaz de inducir dicha respuesta y as evaluar su capacidad de unin a la IgE en pacientes alrgicos. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999). Importancia clnica y epidemiolgica: El papel que juega un alergeno como productor de enfermedades alrgicas se demuestra mediante dos enfoques: El mas directo emplea pruebas de provocacin y una manera indirecta es hacer estudios epidemiolgicos rigurosos investigando una relacin causa-efecto a nivel de poblacin. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) Purificacin: Actualmente el procedimiento ms utilizado es clonar el gen del alergeno en un vector y hacer que la protena recombinante sea producida por bacterias, levaduras u otras clulas eucariotas, para esto se necesita de libreras genticas. Otra forma de purificaron de los alergenos, es separando los componentes del extracto natural por tcnicas como la cromatografa e inmunoquimica. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) Secuencia de aminocidos: Se emplean metodos quimicos convencionales automatizados que dan buenos resultados si la proteina esta bien purificada y su tamao. Cuando se clona el gen del alergeno, se puede predecir la secuencia de aminoacidos de la protena, empleando el cdigo gentico. Determinar la secuencia de aminocidos permite nos permite conocer propiedades fisicoquimicas del alergeno y poder compararla con otras proteinas. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999)

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Reactividad cruzada: Es la propiedad de una molcula alergenica para inducir produccin de IgE capaz de reaccionar contra otras molculas. Para determinar las caractersticas y numero de reacciones alrgicas, se debe conocer muy bien las reacciones cruzadas entre los alergenos. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) Identificacin de epitopes: los epitopes son las unidades mnimas reconocidas por los anticuerpos o los receptores de los linfocitos T. para identificar y localizar epitopes es necesario conocer la secuencia de aminocidos, a partir de la cual se sintetizan pequeos pptidos que, superponindose parcialmente en sus extremos, equivalen a toda la secuencia del alergeno. Cuando los anticuerpos que se unen al epitope son del isotipo IgE, se denominan epitopes alergnicos. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) Utilidad diagnostica: La utilidad diagnstica de una molcula alergnica se mide por su potencial para reemplazar al extracto total, ya sea por si solo o en compaa de otros alergenos purificados del extracto. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) Potencial terapeutico: Desde el punto de vista mdico, el objetivo principal de la caracterizacin de los alergenos es su aplicacin para el control de las enfermedades alrgicas. La inmunoterapia con estractos alergenicos es una opcion terapeutica capaz de modificar el curso de la enfermedad alergica. Tambin se contempla la posibilidad de profilaxis con vacunacin temprana de la poblacin genticamente susceptible. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) Determinacin de la funcin biolgica: Las pruebas empleadas para establecer la funcin biolgica de un alergeno dependen del tipo de protena y su homologa con las ya existentes. Actualmente la determinacin de la funcin biolgica de los alergenos es ms que todo de inters cientfico y est muy relacionado con el 36

estudio de la estructura de dichas molculas. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) Estructuras secundaria y terciaria: La estructura tridimensional de un alergeno puede predecirse mediante programas de modelaje molecular que aprovechan su homologa con molculas estudiadas experimentalmente con anterioridad. Sin embargo, para establecer con certeza la estructura nativa son necesarios los estudios de espectroscopa (con resonancia magntica nuclear o dicroicismo circular) y cristalografa mediante difraccin de rayos x. (MARTINEZ, B. Y CARABALLO, L. 1999) 9.2. Pruebas en el diagnstico de alergia Prueba de escarificacin (scratch- test): consiste en practicar una ligera escarificacin y aplicar en el sitio una gota de alergeno. Reaccin intradrmica: consiste en colocar una pequea cantidad del alergeno va intradrmica. Estas pruebas son mediadas por IgE, se leen a los 15 minutos y se observa la formacin de papula, eritema y prurito. Sirve para el diagnostico de asma, rinitis, alergia a alimentos y alergia a insecticidas. Prueba de parche (patch test): se usa para verificar la inmunidad celular o la hipersensibilidad tipo IV mediada por linfocito T y macrfago. Consiste en depositar sobre la piel sana el producto que se va a probar, bajo la oclusin de un sello adhesivo. La lectura se realiza a las 48 y 96 horas y sirve para diagnosticar problemas de dermatitis eczematosa y alergia a los alimentos e inhalantes como plenes y caros, en nios. (Platts, et. al., 1987; Janson, et. al., 1996)

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Figura 3. Reaccin Intradrmica (Aplicacin del alergeno en la superficie cutnea)

Fuente: El diagnostico Alergologico paso paso. Alergia respiratoria. Figura 4. Reaccin Intradrmica (Puncin (Prick) de la piel a travs de la gota de alergeno previamen te depositada )

Fuente: El diagnostico Alergologico paso paso. Alergia respiratoria. Figura 5. Reaccin Intradrmica (Visualizacin de una prueba cutnea realizada con histamina (con -trol positivo), en la parte inferior de la imagen, y con suero fisiolgico (control negativo) en la parte superior.)

Fuente: El diagnostico Alergologico paso paso. Alergia respiratoria. 38

Los hallazgos inmunolgicos caractersticos de las alveolitos alrgicas extrnsecas son los anticuerpos precipitantes sricos especficos contra los antgenos presentes en el material inhalado. Se detecta IgG por inmunoelectroforesis o por tcnicas de difusin en gel, aunque en el suero del paciente tambin se pueden detectar IgA e IgM especficas. La sintomatologa se presenta de seis a ocho horas despus de la exposicin e incluye malestar general, sntomas seudogripales, fiebre, mialgias y artralgias, disnea, prdida de peso y, posteriormente, sintomatologa asmtica. Los rasgos ms importantes de la alveolitis alrgica o neumonitis por hipersensibilidad son la afectacin bilateral y difusa de bronquiolos terminales, alvolos e intersticio pulmonar; inflamacin constituida por un infiltrado celular mononuclear que frecuentemente deriva en la formacin de granulomas y fibrosis. 9.3 Experiencia en la obtencin de antgenos de A. fumigatus para el diagnostico de ABPA Las propiedades antignicas de los extractos de A. fumigatus han sido reconocidas por un largo tiempo y han servido como base para el desarrollo temprano de ensayos inmunolgicos usados en el diagnostico serolgico de aspergillosis en pacientes inmunocompetentes. Desafortunadamente hay diferencias cualitativas y cuantitativas en los extractos antignicos preparados en varios laboratorios. Variabilidad en los extractos de A. fumigatus parece no estar relacionada con la tensin o la temperatura de crecimiento, desde que el mismo patrn antignico a sido observado con mltiples tensiones a temperaturas de 25 y 37C, pero una gran fuente de variabilidad claramente envuelve otras condiciones de cultivo. En particular el periodo de incubacin; periodos de incubacin publicados han establecido un rango a partir de 1 o 2 das a 25C en agitacin hasta 5 semanas a 37C bajo condiciones estacionarias. Diferentes patrones antignicos son producidos cuando el organismo es cultivado en un medio definido 39

como Czapek-Dox y cuando es cultivado en un medio con protena hidrolizada como el medio de Sabouraud. Mas aun la presencia de altas concentraciones de exosa en ambos medios, induce un pH acido durante el crecimiento y puede influenciar enormemente el patrn antignico producido. Las mejores preparaciones de complejos antignicos son obtenidas durante crecimiento activo fngico (1 da a 37C) en un medio sin azcar pero con un sustrato proteico o una protena hidrolizada. La composicin de estos medios parece estar muy cerca del ambiente nutricional encontrado por el hongo en los pulmones rico en colgeno y elastina principalmente con un pH cerca de 7.4. (Latge, et. al., 1994; Latge, 1995) Otros factores que afectan la composicin antignica incluyen la forma del hongo a partir de la cual es extrada la mezcla antignica. Aunque extractos de conidias y micelios contienen un largo numero de molculas reactivas inmunologicamente, mltiples cualitativas y cuantitativas diferencias en su composicin pueden ser demostradas. Procedimientos de extraccin suave como cortos periodos de incubacin de micelios intactos en buffer salino en presencia o ausencia de detergentes, resulta en la extraccin de componentes de la pared celular. En contraste, tcnicas de rompimiento de pared celular permiten la recuperacin de todas las glicoproteinas, protenas y polisacridos del micelio. Tambin se pueden obtener patrones antignicos a partir de filtrados de cultivos dependiendo de cmo los componentes antignicos son concentrados. (Latg, et. al., 1994) Adems de todas las complicaciones de extraccin de antigenos a partir de

cultivos in vitro bajo diferentes condiciones, existen algunas evidencias de que los antigenos expresados in vivo durante la colonizacin del tejido del hospedero son diferentes de aquellos expresados in vitro. Desde que la cuantificacin de anticuerpos dirigidos especficamente contra antigenos producidos en la matriz del pulmn podran aumentar los valores predictivos de exmenes inmunolgicos, se debera hacer mucho mas trabajo en esta rea. (De repentigni et. al. 1991; Sarfati, et. al., 1995) 40

Cerca de 100 protenas o glicoproteinas de A. fumigatus pueden unirse a Ig humana demostrado por tcnicas como Western Blotting realizadas luego de una electroforesis dimensional. Inicialmente se crea que el Western Blotting era la respuesta para el serodiagnstico en aspergillosis. Desafortunadamente las molculas antignicas en muchos de los estudios han sido caracterizadas sobre la base de la masa molecular, lo cual es insuficiente para identificar un antigeno. La identificacin debe ser realizada a partir de anlisis de secuencias de protenas. Dos estrategias han sido usadas para la caracterizacin molecular de antigenos de A. fumigatus. La estrategia predominante que muestra ser reactiva por Inmunoblotting ha sido la purificacin bioqumica seguida por Secuenciacin y clonacin del gen estructural. Una segunda estrategia envuelve el uso de libreras de expresin para aislar clones que expresen antigenos reconocidos en el suero del paciente. (Arruda, et. al.,1995; Benerjee, et. al. 1996) 9.4. Antgenos descritos en A. fumigatus La catalasa de A. fumigatus que a sido caracterizada ampliamente es una protena tetramerica con una subunidad monomerica de 90 kDa. (Calera et.al., 1997; Hearn et.al., 1992; Lopez et.al., 1996). La protena es muy estable siendo insensible a altas temperaturas, al igual que agentes denaturantes y reductores. El gen estructural para la protena, CATI, ha sido clonado y secuenciado. El anlisis de la secuencia de amino cido muestra que CATI tiene una seal peptdica de 15 aminocidos y un propptido de 12 amino cidos, con un par de aminocidos bsicos Arg26-Arg27 actuando como seal de clivage para la endopeptidasa KEX2. En comparacin de secuencias de CATI con otros genes de catalasas se observa un tripeptido conservado His102, Ser141, Asn175, que esta envuelto en la unin de la protena a su grupo prosttico heme. (Calera et.al., 1997)

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La dipeptidylpeptidasa V tambin ha sido caracterizada recientemente.(Beauvals et.al., 1997). Tiene una masa molecular de 79kDa y un pptido seal de 18 aminocidos. Sus propiedades bioqumicas, as como su localizacin extracelular indica que es una enzima perteneciente a la nueva clase de las Dipeptidylpeptidasa (DPPV). Comparando secuencias de DPPV de A. fumigatus con otra DPPs muestra la presencia de Gly558-x-Ser560-x-Gly562. (Harvey et.al., 1987) La RNasa de A. fumigatus esta compuesta de 149 aminocidos, con una secuencia lder de 27 aminocidos y un sitio activo de 6 aminocidos His49Glu95-Phe96-Pro98-Arg120 y His136. (Yang y Moffat, 1996). Galactomanan (GM) aislado de la pared celular o de filtrado de cultivos a sido analizado por una variedad de diferentes mtodos de purificacin. (Latge et.al., 1994; Mischnick y Rulter, 1994).Es el nico antigeno polisacrido caracterizado de A. fumigatus. Galactomanan fue el primer antigeno detectado en animales infectados experimentalmente y en pacientes con aspergillosis invasora. Aunque el A. fumigatus libera grandes cantidades de Galactomanan en medios de cultivos, no hay pruebas de que el GM analizado in vitro sea idntico al GM circulante en los fluidos corporales. In vivo la presencia de GM solo ha sido demostrada indirectamente a travs de anticuerpos especficos anti-GM, y su anlisis qumico a sido obstaculizado por la presencia de pequeas cantidades de antigeno difciles de recuperar por medio del anlisis. (Latg et.al., 1991) B1-3 glucano, que es otro de los componentes de la pared celular del Aspergillus sp, (Latg et.al., 1991) puede tambin ser usado para el diagnstico an cuando no es una molcula inmunognica. En este caso el sistema de deteccin es basado en la activacin de la cascada proteoltica de la coagulacin. Se a establecido un ensayo colorimtrico, (Miyazaki et.al., 1995) para la deteccin de B1-3 glucano cuyos componentes incluyen factor G y un tripeptido Gly-Arg-pNA 42

cromognico, que es clivado por el ltimo componente de la cascada proteoltica. El ensayo puede medir picogramos de la B1-3 glucano y a sido usado para demostrar la presencia de este polisacrido durante infecciones fngicas sistmicas. (Mitsutake et.al, 1995; Miyazaki et.al., 1995; Yuasa et.al., 1996) Las pequeas cantidades de B1-3 glucano encontradas en el suero pueden explicarse por el hecho de que es un componente integral del esqueleto de la pared celular y en comparacin con la GM, no es liberado normalmente de la pared fngica. (Latg et.al., 1991). Recientemente antgenos usados en diagnostico in vivo e in vitro, son extractos no caracterizados de micelios fngicos o del material antignico secretado presentes en medios de cultivos. (KURUP, 2000) El objetivo de este estudio, es evaluar 5 diferentes alergenos recombinates de A. fumigatus nombrados as: Asp 1, 2, 3, 4, 6 por el mtodo de ELISA usando sueros de pacientes con ABPA y controles individuales de laboratorios en Estados Unidos y Suiza. (KURUP, 2000) Los resultados demostraron que los alergenos recombinante Asp f2, Asp f4, Asp f6 de A. fumigatus usados en el presente estudios se unieron especficamente a IgE en el suero de pacientes con ABPA. De todas maneras la reactividad de estas protenas recombinates varia con diferentes pacientes. (KURUP, 2000). De los 24 pacientes estudiados, 22 mostraron unin significante a IgE con Asp f4 y 21de los pacientes con Asp f2. Asp f6 fue mas especifica pero la unin era mas dbil. (KURUP, 2000) El resultado obtenido en dos laboratorio uno en Estados unidos y otro en Suiza mostraron reactividad diferente frente la prueba cutnea en pacientes con asma. No se sabe si esta diferencia esta dada por diferencias en los procedimientos. Se observ que cuando se usan conjuntamente Asp f1, 2, 3, 4, 6, la sensibilidad 43

alcanza el 100% para ambos laboratorios en el diagnstico de ABPA, mientras que para asmticos a pesar que de la especificidad era del 100%, la sensibilidad fue entre 6 y 45%.(KURUP, 2000) Los resultados obtenidos confirman la especificidad de los alergenos 2, 4, 6 en la deteccin de IgE para diagnostico clnico en ABPA, estos alergenos pueden ser desarrollados como estndar para diagnostico de ABPA. (KURUP, 2000) 9.5. Serodiagnostico en pacientes con sospecha de ABPA Exmenes serolgicos para deteccin de anticuerpos contra antigenos de Aspergillus sp puede ser de mucha ayuda en el diagnostico de aspergilloma o ABPA, las dos formas de aspergillosis observadas en individuos inmunocompetentes. Aunque el crecimiento del hongo en relacin con los tejidos es limitado en ambos sndromes, una fuerte respuesta humoral contra el organismo frecuentemente ocurre. (Repentigny y Reiss 1984; Kurup y Kumar 1991; Latg 1995) De 20 procedimientos diagnsticos que han sido desarrollados para detectar anticuerpos anti-Aspergillus, la Doble Inmunodifucion y la inmunoelectroforesis son los ms comnmente usados en el laboratorio clnico. Estos dos mtodos son simples, baratos, fciles de desarrollar y capaz de eliminar los resultados falsos positivos lo que ocurre como resultado de los bajos niveles de anticuerpos anti-Aspergillus presentes en la mayora de los individuos sanos. (Latg 1995) La desventaja principal de estos mtodos esta en la inhabilidad para cuantificar la respuesta inmunolgica y la falta de estandarizacin debido al uso de extractos crudos de Aspergillus sp (Hearn 1992). Inmunoensayos con antigenos purificados de A. fumigatus por procedimientos bioqumicos han sido reportados recientemente. (Kobayashi et.al., 1993; Latge et.al., 1994) Adems de la dificultad en la produccin de grandes cantidades de antigenos puros a partir de cultivos in Vitro, una mnima contaminacin aun del 1% 44

del antigeno de inters con otro antigeno de mayor reactividad puede llevar a resultados errneos (Moser et.al., 1992). Para evitar estos problemas, ahora es posible el uso de tcnicas de biologa molecular para producir antigenos puros recombinantes. Por ejemplo, protenas de A. fumigatus han sido producidas en Escherichia coli o en Pichia pastoris. (Beauvals et.al., 1997; Calera et.al., 1998; Moser et.al., 1994; Strakova et.al., 1994) El sistema de expresin de P. pastoris puede llevar a la produccin de grandes cantidades de protena de A. fumigatus. Antigenos recombinantes de A. fumigatus sirven como base para el desarrollo de mtodos de Elisa los cuales permiten la cuantificacin de la respuesta inmune. (Kobayashi et.al., 1993; Latg et.al., 1991) Cuantificacin de isotipos de inmunoglobulina como el entendimiento de la cintica de los anticuerpos en la respuesta a travs del curso de la enfermedad ser muy til, considerando que la mayora de los individuos sanos ya tienen anticuerpos anti A. fumigatus como resultado de la continua exposicin al ambiente. (Igea et.al., 1993; Knutsen et.al., 1994; Kurup et.al., 1990; Trompelt et.al., 1994; Van rens et.al., 1998) Desde que los ttulos en individuos normales estn normalmente bajos, la infeccin puede ser correlacionada con un aumento en los anticuerpos especficos. (Cramerl 1998; Hemmann et.al., 1998). 9.6. Serodiagnostico en pacientes con aspergilosis invasora Las infecciones fngicas sistmicas son una causa frecuente de muerte en pacientes inmunocomprometidos, con una alta incidencia y altos rango de mortalidad. Los organismos causantes mas frecuentes de las infecciones fngicas con mas del 90% en los pacientes inmunosuprimidos, son Candida sp y Aspergillus sp. Las infecciones por Aspergillus sp son especialmente difciles de diagnosticar; el diagnostico esta basado en pruebas de deteccin citolgica o histopatolgica de hifas o resultados de cultivos positivos de sitios normalmente estriles. Aunque biopsia de sitios infectados como procedimientos invasivos no 45

son por lo general posibles por que los pacientes estn crticamente afectados y tienen un riesgo aumentado de complicaciones como sangrado debido a la trombocitopenia. Aspergillus sp son raramente detectados en cultivos de sangre y no se encuentran signos patognomnicos de aspergillosis invasiva en las imgenes radiogrficas. Por estas razones la prueba de Aspergillosis invasora (AI) es difcil de alcanzar. (HUMMEL et.al., 2004) Durante la ltima dcada se han logrado progresos sustanciales en el desarrollo de nuevas aproximaciones y mtodos para el diagnstico serolgico de las micosis. Antigenos clnicamente relevantes han sido adaptados para el uso de inmunoensayos, y mtodos para deteccin de antgenos fngicos en fluidos corporales. El serodiagnstico se confa en la deteccin de antigenos circulantes producidos por A. fumigatus y otras especies de Aspergillus sp. Galactomannan es uno de aquellos antigenos que puede ser medido en el suero de pacientes con aspergillosis. (KAWAMURA et.al., 1998) Para la deteccin de angenos en fluidos corporales es importante la disociacin de los complejos inmunes; (Rogers et.al., 1990; Stynen et.al., 1995; Westney et.al., 1996) estos resultan de la presencia de anticuerpos anti-Aspergillus debido a la contnua exposicin ambiental en la mayora de los individuos. Actualmente mtodos usados para disociar complejos inmunes han sido seleccionados empricamente. Se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales (MAb) para la deteccin. De todas maneras el desarrollo de un kit comercial requiere el uso de MAbs por las desventajas inherentes en los antisueros policlonales, como las cantidades limitadas de antisueros. MAbs han sido producidos contra una gran variedad de molculas de A. fumigatus, (Kurup et.al., 1991; Arruda et.al., 1992; Frosco et.al., 1994; Kumar et.al., 1993; Reljula et.al., 1992; Ste Marle et.al., 1990; Stynen et.al., 1992) antigenos circulantes: entre las cuales solo dos han sido identificadas como Galactommannan (GM) y antigeno de Aspergillus

fumigatus (Asp f 1). (Arruda et.al., 1992). 46

Los test serolgicos en su mayora usan Aglutinacin por latex, pero su sensibilidad parece no ser suficiente. Para mejorar esta sensibilidad, se diseo un ELISA tipo sndwich doble directo. (KAWAMURA et.al., 1998) La prueba de Elisa tipo sndwich descrita para deteccin de Galacto Manano (GM), epitope de A. fumigatu,s es el mtodo actual mas sensible desarrollado. (Stynen 1995) Varios estudios realizados en Europa han mostrado que el Elisa tipo sndwich contribuye al diagnostico temprano de la Aspergillosis Invasora, y que la reproducibilidad entre-intra laboratorios es razonablemente buena. (Bretagne et.al., 1997; Manso et.al., 1994; Stynen et.al., 1995; Sulahlan et.al., 1996; Tabone et.al., 1997; Verweij et.al., 1996) Se conoce que las ms altas concentraciones de GM siempre son liberadas en la fase terminal de la enfermedad. Dependiendo de los pacientes, la antigenemia puede durar entre 1 semana y dos meses. (Bretagne et.al., 1997; Rohrlich et.al., 1996; Tabone et.al., 1997; Verwelj et.al., 1997) GM es detectado en concentraciones mas bajas en orina, (0.5 ng de GM/ml) que en suero (1 ng de GM/ml). (Stynen et.al., 1995) A pesar del bajo umbral detectado en orina y en comparacin con estudios reportados previamente, (Ansorg et.al., 1994; Rogers et.al., 1990) la presencia de antgeno en orina a demostrado ser inconsistente o inconsecuente, y cuando esta presente no ocurre antes de poder ser detectado en suero. Por lo tanto, suero parece ser la muestra ms apropiada para la deteccin de GM en Aspergillosis invasora. (Latg et.al., 1995; Stynen et.al., 1995). Otro de los avances de la prueba de ELISA es la posibilidad de monitorear las concentraciones de antigeno en suero durante el tratamiento. Una disminucin en la concentracin de galactomannan en suero, es indicativa de la eficacia del tratamiento. (Bretagne et.al. 1997; Patterson et.al., 1998; Rohrlich et.al., 1996; Van cutsem et.al., 1993). Ademas de la ELISA, se han desarrollado otros metodos para deteccion de GM y otros antigenos como la poligalactosamina, presente en la pared celular en concentraciones mas altas que el GM, a traves de metodos de especificidad y 47

sensibilidad muy razonable como la inmuno PCR. (Latg et.al., 1991). El uso de la PCR demanda un extremo cuidado para evitar resultados falsos positivos o falsos negativos. (KAWAMURA et.al., 1998). La tcnica de PCR sirve para detectar ADN de Aspergillus sp en muestras de lavado broncoalveolar en pacientes con aspergillosis pulmonar invasiva o tambin podemos detectar el DNA de Aspergillus sp en muestras de suero de estos pacientes a partir de una PCR anidada. (KAWAMURA et.al., 1998) En investigaciones mas recientes, se ha evaluado el estudio de la Real Time PCR en sangre y fluidos broncoalveolares, los cuales muestran ser muy utiles, aunque no se ha utilizado una plataforma estandarizada. (MUSHER et.al., 2004)

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CONCLUSIONES

Paciente que de enfermedad primaria tenga asma o fibrosis cistica,

La ABPA es

una reaccin de hipersensibilidad que se da luego de la inhalacin de conidias de Aspergillus fumigatus, seguida de su presentacin por las clulas presentadoras de antigeno residentes en la mucosa bronquial, las cuales desencadenan una activacin de clulas linfocitarias Th2, con la consecuente liberacin de sustancias que van a dirigir el cuadro clnico caracterstico de la ABPA.. Todo lo anterior se presenta luego de un proceso de sensibilizacin al entrar en contacto por segunda vez con las conidias de A. fumigatus. Las manifestaciones de la reaccin de hipersensibilidad tipo 1 presentes en ABPA son producto de la accin de citocinas que estimulan a un grupo de clulas como mastocitos y eosinofilos, los cuales a su vez van a liberar sustancias como histamina y leocotrienos, son capaces de ejercer diferentes funciones dentro del proceso inflamatorio y la respuesta alrgica como la aparicin de infiltrados pulmonares que pueden evolucionar a bronquiectasias proximales y fibrosis pulmonar. Las molculas de HLA juegan un papel muy importante en la activacin de clulas CD4+ Th2 capaces de responder al antigeno que desencadena la ABPA. Estas molculas van a determinar susceptibilidad o resistencia dependiendo la presencia de los correspondientes alelos, como la presencia de molculas HLA-DR que contribuyen a la susceptibilidad, mientras que la resistencia esta conferida a molculas HLA-DQ. Las molculas DR2 o DR5 en pacientes con ABPA son las principales molculas de restriccin para la presentacin de antigenos como Asp f 1. Existe una significante asociacin entre estos serotipos en pacientes con ABPA.

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Estas molculas son capaces de activar clulas Th2 especificas contra antigeno Asp f 1 en pacientes con ABPA. Dentro de las clulas implicadas en la respuesta alrgica los macrfagos alveolares juegan un papel muy importante dentro de la respuesta innata, son capaces de destruir las conidias por mecanismos no oxidativos principalmente, a diferencia de los neutrofilos que usan mecanismos dependientes de oxigeno para atacar a las hifas germinantes. Las clulas dendrticas tambin cumplen una funcines importantes como transportadoras de hifas y como celulas presentadoras. El diagnostico de la ABPA es complicado especialmente en pacientes con fibrosis cistica, debido a la dificultad para reconocer esta enfermedad por la similitud clnico radiolgica de estos procesos, y la elevada frecuencia de respuestas humorales frente a A. fumigatus en los pacientes con fibrosis cistica sin ABPA y por la variacin espontnea de la respuesta inmune frente a A. fumigatus en los pacientes con fibrosis cistica con el tiempo. El diagnostico de ABPA se basa en una combinacin de criterios: episodios de obstruccin bronquial, eosinofilia perifrica, reactividad cutnea inmediata frente a A. fumigatus, elevacin de IgE total serica, elevaciones significativas de las IgE IgG especificas frente a A. fumigatus, infiltrados pulmonares y bronquiectasias centrales, precipitinas sericas frente a A. fumigatus. El diagnostico puede establecerse con siete de los ocho criterios propuestos y as se han descrito casos en pacientes asintomtico sin bronquiectasias y con ttulos bajos de IgG frente a A. fumigatus y de IgE total. Tecnicas como la ELISa para deteteccion de antigenos fungicos como galactomannan demostro ser una de los ensayos mas sensibles de gran ayuda para diagnostico de aspergillosis invasora y ademas para monitorear las concentraciones de antigeno durante tratamiento. Tambien tenemos la PCR que

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presenta una sensibilidad y especificidad muy razonable para la deteccion de ADN de Aspergillus en muestras como lavado broncoalveolar o muestras de suero.

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