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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE TLAXCALA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD LICENCIATURA EN NUTRICIN

MANUAL DE PRCTICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA I

QFB. EVA ENRIQUEZ OLIVARES Zacatelco, Tlax. A 20 de Agosto del 2011.

PRESENTACION En este Manual se muestra la ubicacin de la asignatura terico- prctica de BIOQUIMICA I dentro del plan de estudio de LIC. EN NUTRICION.. Las asignaturas terico-prcticas, incluyen horas de teora y prctica. Las horas de prctica tienen duracin de dos horas semana/mes se imparte durante el primer semestre de LN. La asignatura guarda coherencia con disciplinas subsecuentes, vinculacin vertical y reas consecuentes. Esta rea del conocimiento contribuye con el perfil del egresado en la adquisicin de habilidades, destrezas, actitudes de trabajo en equipo y consolidacin de los conceptos tericos que permiten formar nutrilogos con calidad. El presente Manual tiene por objeto apoyar a los alumnos en su formacin , para adquirir conocimientos, aptitudes y actitudes, en especial en aspectos de tcnicas analticas qumicas que le permitan la formacin de un criterio respecto al contenido de nutrientes que poseen los alimentos. Un objetivo ms del presente trabajo, fue reunir y analizar las tcnicas qumicas ms comnmente utilizadas para evidenciar las diferentes presentacin, asociacin y actividad de las biomolculas.

El egresado de la licenciatura en Nutricin ser capaz de evaluar y diagnosticar el estado nutricio de la poblacin, a nivel comunitario e individual, a travs del conocimiento de la composicin bioqumica del ser humano, as como, los procesos metablicos que ocurren en el organismo, para en su caso, diagnosticar los casos patolgicos que se generan por carencias de nutrientes.

Utilizando como una herramienta el conocimiento de las diversas vas metablicas de las biomolculas, los diferentes procesos enzimticos involucrados, para el estudio de diferentes enfermedades o eventos relacionados con el proceso salud-enfermedad. Permitiendo al Licenciado en Nutricin el reconocimiento de su origen y trascendencia definiendo los campos de intervencin con la finalidad de resolver problemas nutricionales a nivel poblacional e individual, basado en aspectos metodolgicos, como un eje necesario para el desarrollo y avance del conocimiento en esta rea.

Slida capacitacin para investigar tanto el diagnstico nutricional de las comunidades, adems de realizar investigaciones sobre el valor nutritivo y caractersticas de nuevos alimentos.

Planificar Programas de Nutricin congruentes con la realidad, basados en el diagnstico de un problema metablico, tomando en cuenta los indicadores de poblacin, recursos e instrumentos.

Dar asesoras sobre la nutricin basados en procesos bioqumico-metablicos en los diferentes niveles que se le solicite.

Capacitacin bsica para participar en el proceso Enseanza-Aprendizaje en el campo de la nutricin a nivel tcnico, medio superior y superior.

Fundamento Legal de la Evaluacin


REGLAMENTO DE EVALUACIN ACADEMICA.

Ttulo Primero. Capitulo Unico. Disposiciones Generales. Artculo 1,2,3,4,5,6 y 7. Titulo Segundo. Captulo II. De las Evaluaciones de Asignaturas. Artculos 12, 13, 15, 16, 17, 28, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y 33. Titulo Segundo. Captulo III. De las Evaluacin para Titulacin. Artculos 34, 35, 36, 37 y 38. Titulo Tercero. Capitulo I. Del Procedimiento. Artculos 44, 45, 46, 51, 52 y 53.

Elementos de evaluacin
Parcial 1
Criterio LABORATORIO Reporte de prcticas, tareas y participacin Examen escrito 50% Reporte de prcticas, tareas y participacin Examen escrito 50% Reporte de prcticas, tareas y participacin Examen escrito 50% LABORATORIO 30% Valor

Parcial 2
Criterio Valor Criterio

Parcial 3
Valor

Ordinario
Criterio Valor

50%

50%

50%

Para un mejor desarrollo de este curso, deber cumplirse rigurosamente el REGLAMENTO DEL LABORATORIO. Ser requisito que el alumno elabore de manera clara y concisa los reportes de las prcticas de laboratorio (procedimiento, resultados y conclusiones) que se realicen durante el semestre. Se aplicarn 3 exmenes parciales y en cada examen se evaluarn 4 prcticas de laboratorio. Se evaluar la calidad de la participacin en el laboratorio y el desempeo del alumno al explicar una pregunta determinada que surja en las sesiones de laboratorio, o bien, su participacin espontnea. As mismo se evaluar la disciplina en el laboratorio y la destreza de los alumnos al realizar las prcticas. La calificacin final del laboratorio ser el promedio de los tres exmenes parciales lo cual equivale al 30% de la calificacin final a la que se sumar el 70% obtenido en Teora.

El laboratorio de Bioqumica I constituye un 30% de la calificacin de la materia (el otro 70% corresponde a la teora) y su evaluacin se har independientemente en base a lo siguiente: Se evaluar la disciplina en el laboratorio, la destreza de los alumnos para realizar las prcticas y la capacidad para comprender el fundamento de cada una de las prcticas por medio de tres exmenes, el primero se aplicar al final de la realizacin de la cuarta prctica y el segundo al final de la octava prctica y el tercero al final de la dcima prctica. a) Exmenes tericos del laboratorio b) Reporte de las prcticas de laboratorio e investigacin bibliogrfica. c) Participacin REGLAS GENERALES DEL LABORATORIO 1. Uso obligatorio de la bata. 2. No ingerir agua, ni alimentos. 3. No fumar, ni llevarse objetos a la boca. 4. No dejar objetos personales sobre su lugar de trabajo. 5. El alumno es responsable de la limpieza de su mesa al iniciar y al concluir la prctica. 6. Es indispensable lavarse las manos con un jabn adecuado al inicio y al finalizar la prctica correspondiente.

Recomendaciones importantes para la seguridad del usuario del laboratorio : a) Al calentar un recipiente con alguna sustancia, asegurarse que el tapn este un poco flojo, de otra manera la botella puede estallar. b) En caso de que se derrame un cultivo vivo, conserve la calma y siga estas indicaciones: Informe al profesor de lo ocurrido inmediatamente. Coloque toallas de papel sobre el material derramado. Vierta abundante desinfectante sobre las toallas. Despus de transcurridos 15 minutos, quite y tire las toallas en el recipiente destinado a la eliminacin de material contaminado.

La utilizacin de guantes desechables en esta operacin es necesaria.

c) En caso de incendio, quemadura en al piel o herida personal, informe al momento a su instructor, todas las personas en el laboratorio deben conocer la ubicacin del extinguidor y del botiqun de primeros auxilios.

d) Ya que la lista de accidentes es muy larga, en caso de que esto ocurra, lo mejor que se debe hacer es NO tomar la iniciativa, sino notificar inmediatamente al profesor, las recomendaciones de cada prctica en particular se darn al inicio de cada una de ellas.

CONTENIDO TEMTICO DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA I


PRIMER SEMESTRE

Encuadre e Introduccin al Laboratorio.

Practica 1: Mezclas y concentraciones Practica 2: Separacin de mezclas Practica 3:Agua. Cantidad relativa de agua en alimentos Practica 4:pH:equilibrio acido-base

PRIMER EXAMEN PARCIAL Practica 5: Grupos funcionales: CARBOHIDRATOS.- Deteccin de glucosa en Practica 6: LIPIDOS.- Deteccin de Colesterol y Triglicridos en alimentos Practica 7: PROTEINAS.-Deteccin de Protenas y Albmina en alimentos. Prctica 8:AMINOACIDOS.- Identificacin de Aminocidos por cromatografa

SEGUNDO EXAMEN PARCIAL Practica 9: ENZIMAS.- Cintica enzimtica Practica 10: Minerales: Deteccin de calcio en alimentos. TERCER EXAMEN PARCIAL

ENCUADRE Tema Actividad de aprendizaje Tcnica didctica Material de apoyo y referencia bibliogrfica Reglamento, lista de material bsico, carta descriptiva y medidas de seguridad. Tiempo

Introduccin al laboratorio de Bioqumica y organizacin para realizar las prcticas

Que el alumno conozca : El reglamento, forma de evaluar, carta descriptiva y las principales medidas de seguridad en el laboratorio. Revisin de la NOM-087 SSA-1 ECOL. Entrega de contenido temtico de prcticas.

Taller y lectura comentada.

2 hrs.

PRACTICA No. 1 MEZCLAS Y PREPARACIN DE MEZCLAS INTRODUCCION.- En toda la naturaleza existe una determinada cantidad de sustancia, ya sea diluida o pura, pero generalmente en el medio existe como, la solucin o disolucin a una determinada cantidad (soluto) Interaccionando en el solvente. Solucin: Es la mezcla de dos o ms sustancias. Se las clasifica de acuerdo a: Su tamao: soluciones coloidales, soluciones verdaderas, dispersiones macroscpicas, dispersiones finas, suspensiones, emulsiones. Su tonicidad: soluciones isotnicas, soluciones hipotnicas, soluciones hipertnicas. Su concentracin: en criterios cualitativos: soluciones diluidas, soluciones concentradas, soluciones saturadas, soluciones sobresaturadas. y en criterios cuantitativos: soluciones porcentuales, soluciones peso/volumen, soluciones volumen/volumen, soluciones peso/peso. Disolucin: Es la dispersin molecular o inica de un slido en un determinado liquido. En los cuales tenemos. V V: Cantidad en mL en 100 ml de solucin final. P V: Cantidad en g en 100 g de solucin final P P: Cantidad en g en 100 ml de solucin final. Expresiones de concentracin: molaridad, molalidad, normalidad, parte por milln y concentracin porcentual.

I.OBJETIVOS.-

Adquirir destreza en los clculos y preparacin de los diversos tipos de soluciones. Preparar soluciones de importancia bioqumica. Diferenciar los diferentes tipos de mezclas de inters bioqumico.

II. MATERIALES Y REACTIVOS. Balanza analtica Sal comn Pipetas graduadas Sulfato de cobre pentahidratado Glucosa anhidra Alcohol medicinal Calculadora (personal) azcar de mesa Tabla peridica

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


Ensayo n 01. preparacin de soluciones porcentuales. Solucin azucarada al 2% (identifique tipo de solucin) 100 ml. 250 mL de solucin isotnica de NaCl (tipo de solucin) Solucin hidroalcoholica 4:6 (determinar el porcentaje)100 ml Ensayo n 02. preparacin de soluciones molares. Preparar 1 dL de una solucin de CuSO4 0.2 M. Preparar 100 ml. De una solucin 0.1M de glucosa. Se tiene 100 ml de solucin de 0,5 N de acido sulfrico. Se desea saber: cuantos moles tiene .

IV. RESULTADOS

V. CONCLUSIONES Preguntas de investigacin

Cul es la clasificacin de las mezclas Definir mezcla homognea y heterognea 2 ejemplos de cada una. Qu es Normalidad, Molaridad, Molalidad y concentracin porcentual. Describa y explique los fenmenos: Difusin, Dilisis, Equilibrio Donnan, Osmosis, presin osmtica.

Ejercicios propuestos:
1.-Una solucin de acido sulfrico tiene una densidad de 1,84 g/ml y contiene 98 % en peso de acido. Que volumen de la solucin ocuparan 360 g de acido qumicamente puro? 2.- Cuantos gramos de KOH se necesitan para preparar una solucin 0.25M disueltos en cantidad de agua suficiente, hasta realizar 500 ml de solucin? .Cuantos gramos de sulfato de sodio se necesitan para preparar 30 ml una solucin 7,1M?

VI. BIBLIOGRAFIA: 1. Roskoski R. Bioqumica. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Mxico 1998. 2. Herrera E. Bioqumica, Biologa molecular y biologa fisiolgica. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Espaa 1996 Volumen I y II 3. Robert K. Murray, Mayes Peter A. Bioquimicq de Harper.-Dcima quinta edicin. Editorial Manual Moderno. Mxico.2001

PRACTICA No. 2

SEPARACION DE MEZCLAS INTRODUCCION.-En un estado natural de las sustancias generalmente forman mezclas. Existen mtodos para separar los componente que las forman por lo cual se debe tomar en cuenta el estado natural de la mezcla y de sus componentes. Existe gran cantidad de sustancias qumicas que, para identificarlas, se separan en sistemas homogneos sencillos para conocer su utilizacin y composicin, utilizan procesos que reciben el nombre de Anlisis Qumicos. Hay varios mtodos para separar los componentes de una mezcla. En el laboratorio son comunes los siguientes: Decantacin. Filtracin. Destilacin. Cristalizacin. Magnetismo. Cromatografa. LA DECANTACION Se usa para separar mezclas formadas por slidos y lquidos o por ms de dos o ms lquidos no miscibles (no solubles). Consiste en dejar reposar el lquido que contiene partculas slidas en suspensin. Luego se transvasa con cuidado el lquido (menos denso) a otro recipiente, puede utilizarse una varilla de vidrio a fin de retenerse alguna partcula slida que trate de pasar. Esta tcnica se utiliza tambin con lquidos no miscibles, como el agua y el aceite. Se emplea con frecuencia el embudo de separacin o de decantacin. Se coloca en el embudo la mezcla y cuando se hallan diferenciado las dos partes, abre la llave y se separan los lquidos. La capa superior pertenece al lquido menos denso y queda dentro del embudo. LA FILTRACIN Se usa para separas slidos no solubles en lquidos. La separacin se hace por medios porosos que retienen las partculas slidas y dejan pasar el lquido; algunos son:

I.OBJETIVO: Ensayar algunos mtodos de separacin Identificar los mtodos para separar los componentes de una mezcla y adquirir habilidad en la aplicacin de diferentes mtodos a travs de la experiencia en el laboratorio. Identificar los tipos de mezclas para poder seleccionar el mtodo de separacin ms adecuado para su separacin.

II. MATERIAL Y REACTIVOS Cloruro de sodio

Azcar Sulfato de zinc Maicena Leche lquida Limones Papel filtro Centrfuga Vasos de precipitados Embudos Agua destilada Mechero Tripi Tela de alambre con asbesto Probetas Pipetas Pasteur Aceite comestible III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Se preparan las siguientes mezclas: Solucin de azcar al 10% de azcar en alchol, 100 ml Sol. De cloruro de sodio al 10% en alcohol, 100 ml Sol. De maicena en agua 10%, 100 ml Sol . de maicena en alcohol al 10%, 100 ml Sol. De aceite al 30% en agua, 100 ml Sol. Al 30% de aceite en alcohol, 100 ml Sol. De sulfato de zinc al 10% en agua, 10 ml Sol. De sulfato de zinc en alcohol, 10 ml Sol. Al 10% de leche en jugo de limn, 50 ml Dependiendo del tipo de mezcla se proceder a utilizar los mtodos de separacin de: decantacin, filtracin, evaporacin y centrifugacin.

IV. RESULTADOS

V. CONCLUSIONES

CUESTIONARIO Cuales de las siguientes sustancias son sustancias puras? agua de mar

Cmo podra separa cada una de stas mezclas? VI. BIBLIOGRAFIA: Roskoski R. Bioqumica. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Mxico 1998. Herrera E. Bioqumica, Biologa molecular y biologa fisiolgica. Editorial McGraw-Hill Interamericana.Espaa 1996 Volumen I y II Robert K. Murray, Mayes Peter A. Bioquimicq de Harper.-Dcima quinta edicin. Editorial Manual Moderno. Mxico.2001

PRACTICA No. 3 AGUA. Cantidad relativa de agua en alimentos INTRODUCCION.-El agua en los alimentos se encuentra en tres formas: Agua en forma libre- se encuentra en los espacios intergranulares dentro de los poros del material Agua adsorbida- asociada a las macromolculas por fuerzas de Van der Wals o puentes de hidrogeno) Agua enlazada- en combinacin con diversas sustancias (agua de hidratacin) Porcentaje de agua en los diferentes grupos de alimentos: Grupos de alimentos : Porcentaje de agua contenida -Vegetales 17% ; Frutas 73 % - 80% -Verduras 90%- 96% -Leche y lcticos 10% ; Leche 90% -Quesos 39%- 59% -Cereales 8% ; Pan 39% -Galletas 5% -Carnes y pescados 2% ; Carnes 73%- 84% ;Pescado 50%- 70% -La miel contiene agua en un 20% y el huevo en un 74%. El agua es un lquido inodoro o inspido. A la presin atmosfrica (760 mm de Hg), el punto de fusin del agua pura es de 0C y el punto de ebullicin es de 100C; se expande al congelarse, es decir aumenta de volumen, de ah que la densidad del hielo sea menor que la del agua y por ello el hielo flota en el agua lquida. Mtodos gravimtricos, por volatilizacin, para cuantificar la humedad en los sistemas alimenticios. Mtodo Indirecto. Fundamento: Se basan en la volatilizacin del agua libre del sistema al exponerla a la temperatura de ebullicin del agua hasta obtener el peso constante de la materia seca. Se cuantifica el porcentaje de humedad del sistema alimenticio admitiendo que la diferencia aritmtica entre el peso inicial de la muestra, expuesto a la temperatura de ebullicin del agua, y el peso constante obtenido de materia seca, se debe al agua libre evaporada bajo las condiciones experimentales establecidas y que es el nico compuesto que bajo esas condiciones se volatiliza (Skoog y West, 1983).

I. OBJETIVOS: 1.-Conocer y ensayar el mtodo Gravimtrico, por volatilizacin , para cuantificar la humedad

en los sistemas alimenticios 2.- Medir la cantidad relativa de agua existente en algunos alimentos.

II. MATERIALES Y REACTIVOS Balanza granataria Vidrio de reloj o caja Petri Mechero Tripi Tela de alambre con asbesto Parrilla elctrica Pinzas para cpsulas y esptulas Estufa de secado

MUESTRAS Tortillas de harina de trigo Tortillas de maz Galletas de soda.

III PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Deshidratacin de la muestra Pesar exactamente de 20 a 30 g de muestra en el momento de colocar la muestra en la estufa. Exponer la muestra por un periodo de tiempo adecuado para cada caso (segn contenido de humedad). Pesarla tan pronto alcance la temperatura ambiente. Llevar a peso constante, para lo cual debe colocarla nuevamente en la estufa durante el tiempo necesario, dejar enfriar y pesar. Repetir esta operacin hasta que dos pesadas consecutivas varen slo 1 gramo. IV. CALCULOS Y RESULTADOS Clculos: Calcular el porcentaje de humedad en el producto evaluado. Nota: Realizar las determinaciones por duplicado. Para harinas y productos derivados el calentamiento se realiza a 130 1 C por una hora exacta, comenzando a contar el tiempo cuando el interior de la estufa haya alcanzado la temperatura indicada. El contenido de humedad en alimentos como malta, cacao, queso, vegetales con bajo contenido de azcar puede determinarse en este mismo tipo de estufa a presin atmosfrica, a la temperatura y tiempo de secado apropiadas.

Calcular el porcentaje de agua en estos alimentos tomando en cuenta el peso antes y despus de De la deshidratacin.

V . CONCLUSIONES:

Informacin que debe conocer el estudiante: 1) Defina el punto de ebullicin 2) A qu temperatura hierve el agua al nivel del mar? 3) A qu temperatura hierve el agua en la ciudad de Tlaxcala? 4) Por qu el agua se volatiliza a Temp. < 100 C? 5) Cules son los constituyentes de los sistemas alimenticios que se pueden volatilizar a temperaturas cercanas a 100 C? 6) D ejemplos de sistemas alimenticios en los cual aplicara esta metodologa y por qu?

VI. BIBLIOGRAFIA MURRAY,Robert k.- Bioqumica de Harper.- 15. Ed.- Manual Moderno. Mxico D.F. 2001 LAGUNA, Jos; PIA, Enrique.- Bioqumica de Laguna.- 5 ed.- Manual Moderno.-

Mxico D.F.- 2002.


ROSKOSKI, R. Bioqumica. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Mxico 1998. HERRERA, E. Bioqumica, Biologa molecular y biologa fisiolgica. Editorial McGraw-Hill Interamericana.Espaa 1996 Volumen I y II.

PRACTICA No. 4

Ph:equilibrio acido-base

INTRODUCCION Entender la qumica acido-base es fundamental para comprender las propiedades de las molculas biolgicas. Una gran cantidad de los metabolitos de bajo peso molecular y de los componentes macromoleculares de las clulas vivientes, son cidos y bases, por lo que son capaces de ionizarse. Un electrolito es una especie que en disolucin acuosa conduce la corriente elctrica. La disociacin es el proceso por el cual un compuesto inico se separa en sus iones en disolucin, por ejemplo NaCl. La ionizacin es el proceso por el cual un compuesto molecular se separa formando iones en disolucin, por ejemplo HCl. Los cidos y bases De acuerdo con la teora clsica de la ionizacin electroltica desarrollada por Arrenhius, los electrolitos disueltos en agua, se disocian directamente en partculas cargadas (positivas y negativas) llamadas iones. Para Qumica Analtica, son de gran inters aquellos electrolitos cuyos iones provocan que la disolucin sea acida o bsica. De acuerdo con la misma teora, los iones que dan origen al comportamiento acido son los protones y los iones hidrxido provocan el comportamiento alcalino. Por lo tanto, cidos son los electrolitos que en disolucin acuosa liberan iones hidrogeno, y bases son los que liberan iones hidrxido. El equilibrio acido - base se puede representar por medio de las ecuaciones siguientes: Acido anin + H+ Base catin + OH
I. OBJETIVO

Interpretar los conceptos de acido base y pH para que explique el comportamiento de los principales sistemas amortiguadores en el organismo. Observar y diferenciar el comportamiento de un acido fuerte y un acido dbil frente a una base fuerte. Determinar el pH de NaOH y HCl en soluciones diluidas y de las diferentes muestra biolgicas presentes. II. MATERIAL Y REACTIVOS Materiales Reactivos

Agua destilada Hidrxido de sodio cido clorhdrico Matraz Erlenmeyer de 100 ml Probeta de 100 ml Vaso de precipitados de 50 y 100 ml. Gradilla y tubos de ensayo Pipetas de 5 y 10 ml

Tiras reactivas para medir pH

Muestras Biolgicas: Orina, zumo de frutas, vinagre, leja, caf, leche, clara de huevo, saliva, etc.

III. PROCEDIMIENTO En la primera parte de la prctica se determinara la acidez total de dos disoluciones. La primera es una disolucin de acido fuerte (HCl) en agua y la segunda es un acido dbil (acido vinagre) Colocar una alcuota de cada muestra en los tubos de ensayo y una alcuota de HCl 0,1 N y de NaOH 0,1N y medir el pH con las tiras para medir pH. IV. RESULTADOS ALIMENTO pH

V. CONCLUSIONES

PREGUNTAS:

Definicin de cido y base de Arrenhius, Brondsted-Lowry y Lewis Qu es un cido y base dbil y fuerte. Cual es la Ecuacin y que significa la Ecuacin de Henderson-Hasselbalch Qu es una solucin amortiguadora o buffer.

VI. BIBLIOGRAFIA:

DEVLIN, Thomas M.- Bioquimica.- 3 ed.- reverte, S.A. de C.V.-Mxico, D.F.- 2000.
MURRAY,Robert k.- Bioqumica de Harper.- 15. Ed.- Manual Moderno. Mxico D.F. 2001 HERRERA, E. Bioqumica, Biologa molecular y biologa fisiolgica. Editorial McGraw-Hill Interamericana.Espaa 1996 Volumen I y II. NELSON, David L.- Qumica Orgnica.- 2 ed.- Pearson educacin.- Mxico, D.F..2000.

PRACTICA No. 5
GRUPOS FUNCIONALES :CARBOHIDRATOS.- Deteccin de glucosa en alimentos

INTRODUCCION
La Qumica Orgnica es el estudio de los compuestos que contienen carbono, llamada tambin Qumica del carbono. Los compuestos orgnicos son esenciales para nuestra existencia. Los hidrocarburos (compuestos constituidos nicamente por carbono e hidrgeno) intervienen en la elaboracin de muchos productos indispensables de la vida moderna: anestsicos, telas, anticongelantes, combustibles, plsticos, drogas, alimentos, etc. Se entiende por grupo funcional, un conjunto de tomos presente en la cadena de carbono de un compuesto y que por sus caractersticas de reactividad define el comportamiento qumico de la molcula. Cada grupo funcional definir, por tanto, un tipo distinto de compuesto orgnico. Los carbohidratos tambin llamados azucares, osas o sacridos, son polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas o compuestos polimricos que por hidrlisis producen polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas. Segn el nmero de unidades de azucares sencillos que posean se clasifican en: MONOSACARIDOS o azucares sencillos, que a su vez pueden ser ALDOSAS cuando contienen el grupo aldehdo o CETOSAS cuando contienen el grupo cetona. Los monosacridos naturales pertenecen a la serie D de los azcares y pueden tener entre tres y hasta siete tomos de carbono. DISACARIDOS que estn formados por dos monosacridos unidos entre s por enlaces glucosidicos. OLIGOSACARIDOS que tienen entre tres y diez monosacridos unidos tambin por enlaces glucosidicos. POLISACARIDOS que son polmeros naturales con varios miles de unidades de azcar sencillo ligadas entre s. La glucosa es el monosacrido que proporciona .la mayor fuente de energa del cuerpo humano
PRINCIPIO (4-5)

La determinacin enzimtica de glucosa de acuerdo a las siguientes reacciones: Glucosa oxidasa

Glucosa + O2-------------------------cido Glucnico + H2O2 Peroxidasa 2 H2O2 + Fenol + 4-AAP-------------------------Quinoneimina + 4 H20 4-AAP = Amino-4-antipirina

I.OBJETIVO

Identificar los alimentos que contiene glucosa Diferenciar los alimentos dulces que contienen glucosa y los que no la contienen.

II.MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensaye Gradillas para tubos Micropipetas automticas de 1000 ul y 500 ul. Bao mara Termmetro Reactivo para determinacin de glucosa por el mtodo de glucosa-oxidasa Leche Atole de maicena blanco Jugo de naranja natural Jugo de naranja comercial Refresco incoloro Miel de abeja Miel de maz azcar

Muestras:

III.PROCEDIMIENO

Tipo de muestra

Volumen de muestra 500 ul

Volumen de reactivo 1000 ul

Mezclar e incubar a 37C durante 10 minutos y leer

Desarrollo de color rosa resultado positivo Sin cambio de color: resultado negativo

IV.RESULTADOS Tipo de muestra Resultado

V.CONCLUSIONES

CUESTIONARIO: A. Dibujar la molcula de la glucosa, lactosa, galactosa, fructosa y sacarosa. B. Porqu la sacarosa no reacciona con el reactivo de glucosa oxidasa? C .A que se refiere la isomera de los azucares y cuales son los tipos de isomera? D. A que tipo de carbohidrato pertenece la glucosa E. Nombre de 2 monosacridos, 2 disacridos y 2 polisacridos.

VI.BIBLIOGRAFIA MURRAY,Robert k.- Bioqumica de Harper.- 15. Ed.- Manual Moderno. Mxico D.F. 2001 HERRERA, E. Bioqumica, Biologa molecular y biologa fisiolgica. Editorial McGraw-Hill Interamericana.Espaa 1996 Volumen I y II. FOX,Mary Ann .- Qumica Orgnica.- 2 ed.- Pearson educacin.- Mxico, D.F..2000.

HENRY, John Bernard.-Clinical diagnosis and management by laboratory methods. Pennsylvania USA. 20 th ed.2007 NELSON,David L .- Lehninger Principios de Bioqumica.- 2 ed.- Omega .Mxico, D.F..- 2000.

PRACTICA No. 6 LIPIDOS.- deteccin de colesterol y triglicridos en alimentos.

INTRODUCCION Los lpidos son sustancias constituidas fundamentalmente por C, H, O. El 95% de las grasas contenidas en los alimentos y en el cuerpo humano son triglicridos, tambin veremos los fosfolpidos y el colesterol, que aunque estn en pequeas cantidades son muy importantes. Los lpidos son un grupo heterogneo de compuestos que tienen la propiedad comn de ser insolubles en agua pero solubles en solventes orgnicos tales como la propiedad comn de ser insolubles en agua pero solubles en solventes orgnicos tales como la acetona, alcohol, cloroformo o benceno. Desde el punto de vista qumico los lpidos pueden dividirse en lpidos simples (que por hidrolisis dan cidos grasos y alcoholes) y los lpidos complejos (que pueden contener fosfato, diversos carbohidratos y a sustancias nitrogenadas, como esfingosina, etanolamina, y hexosaminas) Los cidos grasos son elementos constituyentes esenciales de las grasas, sean estas de origen animal o vegetal, pudiendo ser saturadas o insaturados, los que con mayor frecuencia se encuentran son: A) Saturados: palmtico y esterico. B) Insaturados: palmitolico, olico y el araquidnico. Mtodo Enzimtico-colorimtrico.-Trinder. Punto final. La determinacin enzimtica de colesterol total de acuerdo a las siguientes reacciones: Colesterol estearasa Colesterol ester + H2O ------------------------------- Colesterol + cidos grasos Colesterol oxidasa Colesterol + O2 ------------------------------------ ColesM-en-3-eno + H2O2 Peroxidasa 2H202+4-AAP +Fenol -------------------- Quinoneimina + 4H20 4-AAP = Amino-4-antipirina Determinacin enzimtica de los triglicridos de acuerdo a las siguientes reacciones. Lipoproteinlipasa Triglicridos + H2O------------------------- Glicerol + cidos Grasos Glicerol Kinasa Glicerol + ATP ------------------------------- Glicerol-3-Fosfato + ATP Glicerol-3-Fosfato Oxidasa Glicerol-3-Fosfato + O2 ------------------------------------ Dihidroxiacetona-P+H2O2 Peroxidasa H202 + 4-AAP + p-Clorofenol------------------------- Quimioneimina 4-AAP = Amino-4-antipirina

I.OBJETIVO Identificar la presencia de Colesterol y Trigliceridos en algunos alimentos por mtodos enzimtico-colorimtricos. Identificar qu alimentos contienen Colestrol y/o Triglicridos

II.MATERIAL Y REACTIVOS

Tubos de ensaye Gradillas para tubos Micropipetas automticas de 1000 ul y 500 ul. Bao mara Termmetro Reactivo para determinacin de Colesterol por mtodo enzimticocolorimtrico. Reactivo para determinacin de Triglicridos por mtodo enzimticocolorimtrico.

Muestras:

Leche Consom de pollo natural Consom de pollo comercial Consom de res natural Consom de res comercial 1Huevo mantequilla margarina aceite comestible. Crema comestible.

III.PROCEDIMIENO Tipo de muestra Volumen de muestra 500 ul Volumen de reactivo para Colesterol 1000 ul Vol. De reactivo para Triglicridos 1000 ul

Mezclar e incubar a 37C durante 5 minutos y leer Desarrollo de color rosa resultado positivo Sin cambio de color: resultado negativo

IV.RESULTADOS Tipo de muestra Resultado para Colesterol Resultado para Triglicridos

V.CONCLUSIONES

CUESTIONARIO: A. Cual es la clasificacin general de los lpidos. B. A que grupo de esta clasificacin pertenecen los triglicridos?. C .A que grupo pertenece el colesterol?. D. Escriba la estructura qumica de los triglicridos E. Escriba la estructura qumica del Colestrol F. Cuales son las funciones biolgicas del Colesterol G. Cuales son las funciones biolgicas de los Triglicridos H. Mencione 2 alimentos ricos en Colesterol I. Mencione 2 alimentos ricos en Triglicridos.

VI.BIBLIOGRAFIA

HENRY, John Bernard.-Clinical diagnosis and management by laboratory methods. Pennsylvania USA. 20 th ed.2007 NELSON,David L .- Lehninger Principios de Bioqumica.- 2 ed.- Omega .Mxico, D.F..- 2000.

DEVLIN, Thomas M.- Bioquimica.- 3 ed.- reverte, S.A. de C.V.-Mxico, D.F.- 2000.
MURRAY,Robert k.- Bioqumica de Harper.- 15. Ed.- Manual Moderno. Mxico D.F. 2001

PRACTICA No. 7 PROTEINAS.- Deteccin de Protenas y albmina en alimentos.

INTRODUCCION.

La palabra tiene su origen en el trmino griego proteios, que quiere decir lo principal o lo ms importante. Son macromolculas, formadas por cadenas de aminocidos unidos por enlaces peptdicos - Se trata de las biomolculas ms importantes, que fueron descubiertas por Berzelier en 1838 y posteriormente descritas por Mulder. - Pueden desempear muchas funciones que dependen sobre todo de la cadena de aminocidos que las compone. - Existen diferentes clasificaciones de las protenas: I. COMPOSICIN - Simples: despus de realizar una hidrlisis de la protena nicamente podemos encontrar aminocidos. - Conjugadas: al realizar la hidrlisis encontramos junto a los aminocidos diversas sustancias que son los conocidos como los grupos prostticos. II. ESTRUCTURA - Protenas globulares: - Estn compuestas por 1 o ms cadenas proteicas que confieren a la protena su forma caractersticamente redondeada o esfrica. - Suelen tener un carcter relativamente dinmico. - Suelen ser solubles en medios acuosos. - Ejemplos: Anticuerpos (Ig), Albmina, Hb, enzimas.... - Protenas fibrosas: - Se trata de 1 o ms cadenas polipeptdicas unidas de lo largo de un eje, presentando una estructura relativamente rgida, con elevada resistencia y no solubles. Las protenas forman un complejo coloreado en presencia de sales de cobre en un medio alcalino. Protenas + Cu2+---------------- Complejo coloreado(morado)

Determinacin colorimtrica de la albmina utilizando verde de bromocresol a pH 4,20. pH= 4,20 Albmina + BCG -------------------------------- Albmina- BCG complejo(verde bandera)

I.OBJETIVO Detectar la presencia de protenas en algunos alimentos por el mtodo de Biuret Detectar la presencia de Albmina en algunos alimentos Identificar los alimentos que contienen protenas y los que no las tienen.

II.MATERIAL Y REACTIVOS

Tubos de ensaye Gradillas para tubos Micropipetas automticas de 1000 ul y 500 ul. Bao mara Reactivo para determinacin de Protenas totales por mtodo colorimtrico de Biuret. Reactivo para determinacin de Albmina por mtodo colorimtrico de Verde de Bromocresol.

Muestras:

Leche Consom de pollo natural Consom de pollo comercial Consom de res natural Consom de res comercial 1Huevo Yogourth Leche blgara Sopa instantnea comercial

III.PROCEDIMIENO

Tipo de muestra

Volumen de muestra

Volumen de reactivo de Biuret

500 ul

1000 ul

Volumen de reactivo de Verde e Bromocresol 1000 ul

Mezclar e incubar a temperatura ambiente(TA) durante 15 minutos y leer PROTEINAS: Morado + ; sin cambio de color ALBUMINA: Verde + ; sin cambio de color -

IV.RESULTADOS Tipo de muestra Resultado para Protenas Resultado para Albmina

V.CONCLUSIONES

CUESTIONARIO: A. Describa las estructuras de las Protenas . B. A qu grupo de su clasificacin pertenecen las Albminas?. C .Menciones 2 propiedades fsicas de las protenas D. Mencione 2 propiedades qumicas de las protenas E. mencione 2 caractersticas de las Albminas F. Funciones biolgicas de las Protenas G. Funciones biolgicas de las Albminas H. Mencione 2 alimentos ricos en protenas.

VI.BIBLIOGRAFIA

HENRY, John Bernard.-Clinical diagnosis and management by laboratory methods. Pennsylvania USA. 20 th ed.2007 NELSON,David L .- Lehninger Principios de Bioqumica.- 2 ed.- Omega .Mxico, D.F..- 2000.

DEVLIN, Thomas M.- Bioquimica.- 3 ed.- reverte, S.A. de C.V.-Mxico, D.F.- 2000.
MURRAY,Robert k.- Bioqumica de Harper.- 15. Ed.- Manual Moderno. Mxico D.F. 2001

PRACTICA No. 8 IDENTIFICACION CROMATOGRAFICA DE AMINOACIDOS INTRIDUCCION En la presente prctica llevaremos a cabo una cromatografa de reparto, en capa fina, para la separacin de aminocidos. En la cromatografa de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribucin diferente entre la fase mvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las molculas a lo largo del sistema cromatogrfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisin o arrastre ejercido por la fase mvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorcin. En la cromatografa de reparto tenemos un soporte inerte al que est unida la fase estacionaria lquida. La mezcla a separar junto con la fase mvil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase mvil arrastrar consigo un porcentaje de molculas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra depender de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si stos son diferentes aqulla tambin lo ser, siendo posible la separacin si se utiliza el volumen de eluyente apropiado. En su desplazamiento, las molculas de soluto se distribuirn no puntualmente, sino formando un rea debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fenmenos tales como la difusin. Cromatografa en capa fina En la cromatografa en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminologa inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partculas finas y distribuirse uniformemente en forma de lminas. Esto incluye sustancias inorgnicas (gel de slice, xido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgnicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). Reacciones coloridas para aminocidos De todos los mtodos reseados, el ms general y utilizado es el de la reaccin con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azul-prpura, con la excepcin de la prolina que da una coloracin amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino est sustituido).

I.OBJETIVO Ensayar la tcnica de Cromatografa de Placa Fina Identificar que alimentos contienen el aminocido GLICINA Comprobar las reacciones coloridas que desarrollan los aminocidos con la Ninhidrina.

II.MATERIALES Y REACTIVOS

Secador de pelo. Placa de silicagel para cromatografa en capa fina. Gradillas con tubos de ensayo. micropipetas automticas de 10,20,50 y 100 ul Probetas (100 y 250 ml). Vasos de precipitado (100 y 500 ml). Frasco lavador con agua destilada. Recipientes de muestras biolgicas de 50 ml. Papel de filtro. Rotulador de vidrio. Glicina en sol alc. Etanol. Hidrxido amnico. Ninhidrina en solucin Muestras:

Consom de pollo natural Consom de pollo comercial Consom de res natural Consom de res comercial Sopa instantnea comercial

III.PROCEDEMIENTO 1.- Se coloca a una altura de 2 cm del inicio de la placa 50 ul de sol. de glicina y con una separacin de 1cm se colocar 50 ul se muestra. Sin tocar la silica. 2.- Secar con aire las gotas de muestra. 3.- Se aade al tanque cromatogrfico eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que ste alcance la zona de aplicacin de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se deja desarrollar la cromatografa hasta que el eluyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (20-30 min aproximadamente). 4.- Terminada la cromatografa se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se roca con un pulverizador que contiene la solucin reveladora (en la campana de gases). La placa se secar hacindole llegar aire caliente con el secador.

IV.CALCULOS Y RESULTADOS

Muestra GLICINA

Distancia recorrida en cm.

Rf

Resultado

V.CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

Qu propiedades de los aminocidos debemos tomar en cuenta para su separacin cromatogrfica? Qu tipo de aminocidos reaccionan desarrollando color con la Ninhidrina?. Cuales son los aminocidos esenciales y los no esenciales y por que se les clasifica as.

VI.BIBLIOGRAFIA

Luisot P (1982). Bioqumica Estructural, 2 Ed. Editorial AC. Excelente libro de bioqumica estructural. En el captulo de aminocidos se describen con detalle sus propiedades fsicas y qumicas. Smith I, Feinberg JG (1965) Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd. Desarrollo histrico de la tcnica y aplicaciones.

PRACTICA No. 9 ENZIMAS.- Cintica enzimtica

INTRODUCCION Las enzimas son los biocatalizadores de la gran mayora de las reacciones bioqumicas, de naturaleza orgnica y estado coloidal, elaboradas por las clulas vivas, pero actan independientemente de estas. Son altamente especficas y poseen gran poder cataltico. La velocidad de la reaccin enzimtica se define como la variacin en el tiempo de la concentracin del sustrato, siendo proporcional a dicha concentracin. Los factores que pueden influir en la actividad enzimtica son la temperatura, el pH, la concentracin del sustrato y los activadores e inhibidores. EFECTOS DE LA TEMPERATURA: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta una temperatura, en la cual llamamos temperatura optima, ya que despus de esta a mayor temperatura se desnaturaliza EFECTOS DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO Cuando en el medio existe una pequea cantidad de sustrato la conversin a producto es de alta velocidad, a medida que aumentamos el sustrato la velocidad tiende a disminuir la relacin es inversa, hasta llegar a un punto donde la enzima es completamente saturada, cuando la concentracin de sustrato se mantiene constante se dice que la enzima a alcanzado su velocidad mxima. EFECTOS DEL pH: La concentracin de los hidrogeniones en el medio es de suma importancia para que se lleve a cabo una reaccin de catlisis, recordemos que las enzimas son protenas, y se desnaturalizan a altas concentraciones de H3O+ de OH-. Toda enzima trabaja a un pH ptimo en su velocidad mxima, por debajo o ms de ello se inactiva momentneamente. ACTIVADORES Son la presencia de iones necesarios para la unin de enzima sustrato y hacer ms rpida la reaccin. Como el caso de la glucosa 6P para que se transforme a fructosa 6-P es necesario la enzima fosfoglucoisomerasa que es dependiente de iones magnesio e iones manganeso. INHIBIDORES Se habla de inhibicin cuando disminuye la actividad o eficacia del la enzima y las sustancias que producen este efecto reciben el nombre de inhibidores. Entre otros factores que afectan podemos hablar de la concentracin de la enzima, el tiempo y temperatura de incubacion,el pH, etc.

I.OBJETIVOS Demostrar la influencia del pH en una reaccin enzimtica. Demostrar la influencia de la concentracin de sustrato en una reaccin enzimtica. Demostrar la influencia de la temperatura en una reaccin enzimtica Demostrar la influencia del tiempo de incubacin en una reaccin enzimtica.

II.MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos
Tubos de prueba Micropipepetas automticas de 10ul, 20ul, 50ul y 1000 ul. Bao mara Espectrofotmetro HCl 0,1 NaOH 0,1 N Reactivo con enzima Glucosa-Oxidasa Termmetro

III.PROCEDIMIENTO Ensayo 1: Efecto del pH


TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 Sol. De Glucosa 100 mg/dl 10 ul 10 ul 10 ul Agua destilada 10 ul NaOH 0.1N HCl 0.1N Reactivo de Glucosa-oxidasa 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul

10 ul 10 ul 20 ul

Incubar los tubos a 37C durante 10 min. Y leer. Ensayo 2: Efecto de la temperatura
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 Sol. De Glucosa 100 mg/dl 10 ul 10 ul 10 ul Agua destilada 10 ul Reactivo de Glucosa-Oxidasa 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul Temperatura de incubacin 4C 37C 50C 37C

20 ul

Incubar los tubos a 37C durante 10 min. Y leer. Ensayo 3: Efecto de la concentracin del sustrato.
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 Sol. De Glucosa 100 mg/dl 10 ul 20 ul 50 ul Agua destilada 10 ul Reactivo de Glucosa-Oxidasa 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul

20 ul

Incubar los tubos a 37C durante 10 min. Y leer. Cada una de las reacciones se leern en un Espectrofotmetro en unidades de Absorbancia. IV.RESULTADOS A ensayo 1
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4

A ensayo 2

A ensayo 3

V.CONCLUSIONES

CUESTIONARIO: Explique el mecanismo de accin de la Glucosa-Oxidasa. Que efecto tiene la sol. De HCl y NaOH en la reaccin ensayada. Clasificacin de las Enzimas

A qu grupo de esta clasificacin pertenece la Glucosa-Oxidasa Como se compone un sistema enzimtico Qu es una Holoenzima, apoenzima, grupo prosttico y coenzima.

VI.BIBLIOGRAFIA

HENRY, John Bernard.-Clinical diagnosis and management by laboratory methods. Pennsylvania USA. 20 th ed.2007 NELSON,David L .- Lehninger Principios de Bioqumica.- 2 ed.- Omega .Mxico, D.F..- 2000.

DEVLIN, Thomas M.- Bioquimica.- 3 ed.- reverte, S.A. de C.V.-Mxico, D.F.- 2000.
MURRAY,Robert k.- Bioqumica de Harper.- 15. Ed.- Manual Moderno. Mxico D.F. 2001

PRACTICA No 10 MINERALES.-Deteccin de calcio en alimentos. INTRODUCCION

Por su naturaleza los minerales siempre tienen carga elctrica y se unen a otros elementos, a pesar de que se encuentran en pequeas cantidades (mg, g, ) son esenciales para muchos fenmenos vitales (como en las enzimas), Nuestro organismo requiere principalmente: Ca, K, Na,P, S, Cl, Mg; y otros en mnimas cantidades (g, ppm. ppb) las cuales son denominadas oligoelementos, tales como: Cu, Co, Zn, Fe, Mn. Mo, I.
Prueba complejomtrica directa colorimtrica. (Arsenazo III) para la deteccin de Calcio. El arsenazo III (cido 1,8-dihidroxi-3,6-disulfo-2,7-naftalenen-bis(azo)-dibenzenarsnico). Forma en medio neutro un complejo azul con el calcio. La intensidad del color azul es directamente proporcional a la concentracin de calcio total.

I.OBJETIVOS

Detectar calcio en los alimentos por el mtodo complejomtrico Identificar que alimentos contienen calcio. Correlacionar los resultados obtenidos con los de la literatura.

II.MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensaye Gradillas para tubos Micropipetas automticas de 1000 ul y 500 ul. Reactivo para determinacin de Calcio por el mtodo complejomtrico. Leche Crema Huevo Refresco incoloro Yogourth Leche blgara Sopa instantnea comercial

Muestras:

III.PROCEDIMIENO

Tipo de muestra

Volumen de muestra 500 ul

Volumen de reactivo 1000 ul

Mezclar e incubar a T.A. durante 10 minutos y leer Desarrollo de color azul resultado positivo Sin cambio de color: resultado negativo

IV.RESULTADOS Tipo de muestra Resultado

V.CONCLUSIONES

CUESTIONARIO: A. Importancia biolgica del Calcio B. Qu son los macro y microminerales. C .Mencione 2 macrominerales D. Mencione 2 microminerales VI.BIBLIOGRAFIA

HENRY, John Bernard.-Clinical diagnosis and management by laboratory methods. Pennsylvania USA. 20 th ed.2007 NELSON,David L .- Lehninger Principios de Bioqumica.- 2 ed.- Omega .Mxico, D.F..- 2000.

DEVLIN, Thomas M.- Bioquimica.- 3 ed.- reverte, S.A. de C.V.-Mxico, D.F.- 2000.
MURRAY,Robert k.- Bioqumica de Harper.- 15. Ed.- Manual Moderno. Mxico D.F. 2001 .