PCR La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una

tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Fundamento e importancia Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la dcada de 1980. Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).

Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional.

Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin (ver ms abajo). Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi

todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores ms antiguos que carecan de este sistema, solucionaban el problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas.

Reactivos Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 100 L. Para realizar la tcnica se necesitan: 2 Los 4 desoxirribonuclesidostrifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa. Iones monovalentes, como el potasio. Una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq). ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un c

Temperaturas y tiempos de los ciclos Como hemos explicado anteriormente la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un nmero determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el nmero de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificndolos podemos optimizar la reaccin. Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los tubos de un bao Mara a otro de diferente temperatura (la T de desnaturalizacin, la de hibridacin y la de elongacin). El proceso resultaba demasiado tedioso y era difcil alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos, por lo que se desarroll el termociclador que lo haca de manera automtica. A continuacin describiremos de forma ms detallada el tiempo y la temperatura de cada una de las etapas de un ciclo.

1.- Desnaturalizacin

Se trata de una etapa crtica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94C durante 30 segundos a 1 minuto Tiene alto contenido de G + C puede aumentar el tiempo o la temperatura. Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rpida a partir de los 95C, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubacin. En la prctica se suele aadir un perodo de desnaturalizacin antes de comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta etapa suele ser de 5a 94C.

2.- Hibridacin En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los oligonucletidos: la composicin de bases, el tamao y la concentracin.

En la prctica, la temperatura de hibridacin puede oscilar entre 45C y 65C, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde.

3.- Elongacin En la mayora de las reacciones, la etapa de extensin se realiza a 72C. Tericamente esta temperatura puede variar entre 70-72C. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb En la prctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una ltima elongacin de 5a 72C.

Nmero de ciclos Tambin adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el nmero de ciclos que se utilizan. Este nmero depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera emprica). Es importante no realizar un nmero alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificacin de productos no deseados originados por hibridaciones no especficas. Hay que tener en cuenta que la reaccin est producida por una enzima que sufre el efecto meseta que describe la atenuacin en la tasa de la acumulacin del producto. Despus de un nmero determinado de ciclos la amplificacin deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilizacin.

Contaminacin en la PCR La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una tcnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequea) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la tcnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989). Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al mximo: Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR Uso de instrumental exclusivo para la PCR Utilizacin de reactivos y tubos estriles

Uso de guantes por el manipulador Realizacin de controles de blanco (se aade agua en lugar de ADN, no debe existir amplificacin).

Optimizacin de la PCR En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas: La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima cantidad de ADN para obtener un gran nmero de copias, as que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminacin con ADN extraos puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realizacin de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en laboratorios de deteccin gentica, se suele hacer una divisin para la preparacin de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR. Disponen tambin de cabinas de seguridad biolgica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades, y la leja, las lmparas de UV y psoralenos son tambin muy recurridos para esta limpieza extensiva Las tcnicas de diseo de cebadores son importantes en la mejora de la obtencin de productos de PCR y en evitar la formacin de productos falsos. Algunas consideraciones al disear estos cebadores son: o Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy especfica, y los que se excedan en longitud harn que perdamos rendimiento en la reaccin. o La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 2 bases pricas. o Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre s, o se formarn dmeros entre ellos. Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que ms se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma ms eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Los componentes del tampn de reaccin debern ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas. El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecern termocicladores elaborados con materiales que hagan ms eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, adems de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicacin ser clave.

Tipos de PCR PCR anidada Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de PCR es de alta sensibilidad y especificidad, aunque no nos permite cuantificar la muestra. La especificidad aumenta porque como es amplificacin de un amplicn obtenido previamente, los cebadores slo van a hibridar en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica banda. As, evitamos posibles hibridaciones inespecficas de los cebadores. PCR in situ La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin. PCR mltiplex PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de base de datos.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera: 1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN. 2 paso: aplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR) Artculo principal: PCR en tiempo real

Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature). Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas en sondas especficas. En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin del ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.

Variaciones de la PCR bsica

PCR especfica de alelo: esta tcnica de diagnstico o clonacin es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs). PCR "assembly": consiste en la sntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucletidos largos con secuencias solapantes cortas. PCR asimtrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra. PCR de colonia: mediante esta tcnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rpidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN. Amplificacin dependiente de helicasa: esta tcnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de desnaturalizacin-extensin. PCR hot-start: esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica durante las etapas iniciales de la PCR: mientras que la mquina alcanza la temperatura de la primera etapa (unos 95) puede que ocurra la unin de los cebadores y se produzca amplificacin, ya que en el camino para alcanzar estos 95 se pasa por la temperatura de anillamiento (que es ms baja). Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reaccin comience cuando la mquina ya est a 95, debido a que antes no se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir mediante varias tcnicas: - Aadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento - Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reaccin. La cera se funde al alcanzar los 95 y es entonces cuando los componentes entran en contacto - Anticuerpos anti-polimerasa que estn bloqueando a la polimerasa. Al alcanzar los 95 estos anticuerpos se inactivan debido a que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar

PCR especfica de intersecuencia (ISSR): se trata de un mtodo de PCR para su uso en huella gentica, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella gentica nica de longitudes de fragmento amplificadas. PCR inversa: es un mtodo usado para poder realizar la PCR cuando slo es conocida una secuencia interna. Muy til en la identificacin de secuencias que flanquean insertos genmicos. PCR mediada por ligacin: este mtodo usa pequeos linkers de ADN ligados al ADN de inters y mltiples cebadores hibridando estos linkers. PCR especfica de metilacin (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genmico.

Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un nico par de cebadores, evitando as las limitaciones de resolucin de la PCR multiplex. PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo real). PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico bajando gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso de la PCR. PAN-AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificacin, y puede ser usado en clulas vivas.

Aplicaciones La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como herramienta de deteccin y/o generacin de acervos de fragmentos de ADN de inters; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo en diagnstico clnico. Investigacin La PCR convencional se emplea como base para multitud de tcnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de inters.

Clonacin de un segmento de ADN mediante amplificacin con cebadores que contienen una secuencia apta para la recombinacin dirigida con un plsmido.

Una aplicacin de la PCR de extrema importancia es la clonacin de secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plsmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interaccin posterior con otra complementaria situada en el vector de clonacin a emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restriccin en dichos cebadores, de modo que, y si sta no exista previamente en el fragmento y es nica en el vector, pueda efectuarse una ligacin mediante la ligasa de T4 tras la digestin con la enzima de restriccin apropiada de ambos elementos. Otro mtodo asimilable a esta va es el empleo de la recombinacin dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la recombinacin dirigida con un vector dado.4 Medicina En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006): Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas caractersticas de tamao o temperatura de fusin que permitan identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales que implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el de la infeccin por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad. 5 La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante. El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.