NUTRIO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS

Microbiologia FFI 0751 Profa. Dra. Ilana Camargo

Nutrio e cultivo dos microrganismos

Crescimento microbiano Fases de crescimento Medidas do crescimento Fatores necessrios para o crescimento Fatores fsicos Fatores qumicos Relaes dos microrganismos com o oxignio

Nutrientes macronutrientes micronutrientes

Meio de cultura

Metabolismo e crescimento das bactrias

Aminocidos

Obter ou Sintetizar

Carboidratos Lipdios

Em geral, as bactrias necessitam de uma fonte de carbono e nitrognio, uma fonte de energia, gua e vrios ons para seu crescimento.
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Fatores necessrios para o crescimento

Fatores fsicos: temperatura, pH, presso osmtica

Crescimento microbiano*
* Crescimento microbiano:
em microbiologia, refere-se ao aumento do nmero de clulas.

Fatores qumicos: fontes de carbono, nitrognio, enxofre, fsforo, oligoelementos, oxignio, fatores orgnicos de crescimento (vitaminas, aminocidos, purinas, pirimidinas).

Crescimento microbiano
o aumento no nmero de clulas. Importante seu conhecimento para o desenvolvimento, por exemplo, de mtodos de controle. Fisso binria: modo mais comum de reproduo bacteriana Outros modos: brotamento (Hiphomicrobium), conidisporos (actinomicetes).

Crescimento microbiano

Fisso Binria

Tempo que demora para ocorrer = tempo de gerao

Fisso Binria
Protenas Fts: formam o divisomo, aparelho de diviso da clula (Filamento termossensvel). Divisomo: acredita-se que coordena a sntese da nova membrana citoplasmtica e da parede celular em ambas as direes clula alongada. Trmino da sntese de DNA o sinal para a formao do anel FtsZ, que fica no espao entre os nucleides duplicados.

O anel FtsZ e a diviso celular. (a) Viso em corte de um bacilo, com o anel FtsZ. (b) Ciclo celular de 8 E. coli, mostrando o surgimento e o desaparecimento do anel FtsZ. Fonte: Madigan et al., 2004.

Crescimento populacional
O aumento do nmero de clulas tambm pode ser medido pelo aumento da massa microbiana

Taxa de crescimento: variao de nmero de clulas ou da massa celular por unidade de tempo;
Gerao: intervalo em que uma clula origina duas novas; Tempo de gerao: tempo necessrio para que uma populao dobre de nmero (Tempo de duplicao);

Crescimento populacional
Coordenadas logartmicas

Coordenadas aritmticas

Converso do nmero de clulas de uma populao em uma expresso logartmica desse nmero.

Representao grfica logartmica (linha pontilhada) e aritmtica (linha contnua) da curva de crescimento de uma populao em 10 fase de crescimento exponencial.

Crescimento populacional

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Tempo de gerao
Tempo de Gerao: intervalo de tempo em que uma clula origina duas novas clulas ou tempo necessrio para uma populao dobrar de nmero. Muitas das bactrias estudadas apresentam tg de 1 a 3 h (pode variar de 10 min a >24h). Tg de E. coli = 20 min 20 geraes (~7 horas), 1 clula torna-se em > 1 milho de clulas! Tg pode ser influenciado pelas condies de cultivo (tipo de meio, temperatura, etc.).
N=No.2n log N = log N0 + n log2 n = (log N - log N0) / log 2 n= log N log No /0,301
onde N= nmero final de clulas, N o= nmero inicial de clulas, n= nmero de geraes.

n= 3,3 (logN log N0) tg = t/n

onde tg= tempo de gerao, t= tempo de crescimento e n= nmero de geraes, como determinado acima. 12

Tempo de gerao

2000 1000

UFC

2h n= 1 (uma gerao = tempo para duplicar a populao!) t=2 tg = t/n tg = 2/1 = 2 tempo de gerao = 2
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Taxa de crescimento*
o nmero de geraes formadas, por unidade de tempo, de uma cultura em crescimento exponencial ou variao no nmero ou massa por unidade de tempo.
Constante de taxa de crescimento K = ln2/tg = 0,693/tg (h-1) *Esse termo tambm descrito como a velocidade de crescimento especfico e representado por m.
No caso anterior K = 0,693/2 = 0,346
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Fases do crescimento

m=0,125

m=0,0057

m=0,0013

m ~ 0, cultura desnutrida

Curvas de crescimento de Pseudomonas fluorescens em culturas de batelada, iniciadas com inculos em diferentes fases de crescimento, indicadas pelos ms velocidade especfica de crescimento (h-1).
Fonte: Panikov, N.S. Microbial growth kinetics. UK: Chapman & Hall, 1995.

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Fases do crescimento de uma populao

Curva de crescimento tpica de uma populao bacteriana, a partir de uma cultura em batelada* (Fonte: Madigan et al., 2004). * Cultura que se desenvolve em um volume fixo de meio de cultura.

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Fases do crescimento

LAG Pouca ou ausncia de diviso celular. Sntese enzimtica e de molculas variadas. Pode ser curta ou longa, dependendo das condies fisiolgicas do inculo.

Aumento na quantidade de protenas, no peso seco e no tamanho celular

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Fases do crescimento

EXPONENCIAL OU Log

Crescimento exponencial das clulas Tempo de Gerao constante linha reta no grfico.
Fase que as clulas esto mais saudveis utilizadas para estudos enzimticos e de outros componentes celulares.

Taxa de crescimento exponencial (nmero de geraes por unidade de tempo) de uma populao pode ser influenciada pelas condies de cultivo, por exemplo.
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Fases do crescimento

ESTACIONRIA No h crescimento lquido da populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem (crescimento crptico).

Sntese de vrios metablitos secundrios (antibiticos e algumas enzimas). Tambm pode ocorrer a esporulao das bactrias.
Alteraes de fentipo por quorum sensing (processo de comunicao celular mediado pela densidade populacional).

Causas: esgotamento de nutrientes essenciais, acmulo de produtos de excreo em concentraes inibitrias, alteraes no pH.
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Fases do crescimento

MORTE OU DECLNIO Nmero de clulas mortas excede o de clulas vivas. Na maioria dos casos, a taxa de morte inferior taxa de crescimento exponencial. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viveis cai lentamente. Em alguns casos h a lise celular.
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Medidas do crescimento microbiano

contagens de viveis

Diretas
contagens de clulas totais

Medidas do crescimento microbiano

Indiretas

verificao da turbidez

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Contagem em placa

Contagem das clulas viveis Parte de trs princpios: -Cada colnia originada de uma nica bactria -Inculo original sempre homogneo -No existe agregao de clulas Desvantagem: precisa de um perodo de incubao (24h)

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Contagem de viveis Primeiro passo: diluio seriada

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Contagem de viveis Segundo passo: inoculao / semeadura Mtodo de semeadura por Profundidade (pour plate) Mtodo de semeadura por espalhamento At secar!!

Mtodos de semeadura em placa para contagem de bactrias viveis.

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Contagem em placa aps diluio seriada

Procedimento de contagem de viveis por meio de diluies em srie da amostra e o mtodo de semeadura em profundidade (pour plate).
Madigan et al., 2004.

Intervalo ideal para contagem: 30 a 300 unidades formadoras de colnias (UFC).

Dificulta contagem, Contagem errnea devido saturao que impede o crescimento de algumas colnias

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Contagem de viveis Contagem em placa

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Contagem em placa

Contagem de bactrias utilizando o mtodo de filtrao. MEV de superfcie de membrana de filtro com bactrias (esquerda). Membrana em placa de Petri, mergulhada em meio lquido Endo, seletivo para Gram negativo (direita). Fonte: Tortora et al., 2005. 27

Medidas diretas do crescimento microbiano

Contagem microscpica direta, utilizando a cmara de contagem Petroff-Hausser. Fonte: Tortora et al., 2005. 28

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Nmero mais provvel

Quanto maior o nmero de bactrias em uma amostra, maior ser o nmero de diluies necessrias para eliminar totalmente o crescimento nos tubos contendo meio de cultura Utilizado para contar microrganismos que no crescem em meios slidos

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Medidas diretas do crescimento microbiano

Mtodo do nmero mais provvel (NMP). esquerda, srie de diluies do mtodo. direita, tabela do NMP que permite calcular o nmero estatisticamente provvel de bactrias presentes na amostra. O ndice de 110 NMP/100mL indica que 95% das amostras de gua que apresentam esse resultado contm entre 40 300 CFU Fonte: Tortora et al., 2005.
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Medidas do crescimento microbiano

contagens de viveis

Diretas
contagens de clulas totais

Medidas do crescimento microbiano

Indiretas

verificao da turbidez

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Medidas indiretas do crescimento microbiano

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Medidas indiretas do crescimento microbiano

Medidas turbidimtricas do crescimento microbiano por espectrofotmetro ou fotmetro. Fonte: Madigan et al., 2004.
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Medidas indiretas do crescimento microbiano

(b) Curva de crescimento tpica, obtida em unidades Klett ou densidade ptica (DO), de dois organismos que apresentam diferentes velocidades de crescimento. Qual organismo est crescendo mais rapidamente ?(calcule o n, tg e m). (c) Relao entre o nmero de clulas, ou peso seco, e as medidas de turbidez.
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Cultura contnua: quimiostato

Sistema de fluxo ao qual um volume constante de meio fresco continuamente adicionado, sendo o mesmo volume de meio removido. Equilbrio do sistema (steadystate): quando o nmero de clulas e a quantidade de nutrientes permanece constante.
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Fatores necessrios para o crescimento

Fatores fsicos: temperatura, pH, presso osmtica

Crescimento microbiano*

Fatores qumicos: fontes de carbono, nitrognio, enxofre, fsforo, oligoelementos, oxignio, fatores orgnicos de crescimento (vitaminas, aminocidos, purinas, pirimidinas).

* Crescimento microbiano: em microbiologia, refere-se ao aumento no nmero de clulas.

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Fatores que influenciam a atividade enzimtica:

1. Temperatura: A altas temperaturas, as enzimas sofrem desnaturao e
perdem suas propriedades catalticas; A baixas temperaturas, a taxa de reao diminui;

2. pH: pH no qual a atividade enzimtica mxima conhecido como pH

timo.

3. Concentrao do substrato: Dentro de limites, a atividade enzimtica

aumenta com o aumento da concentrao do substrato.

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Efeito da temperatura na taxa de crescimento

(Fonte: Madigan et al., 2004).

Taxa de crescimento = variao do nmero de clulas ou da massa celular por unidade de tempo

Temperaturas cardeais: mnima, tima e mxima

(variveis nos diferentes microrganismos)

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Temperatura
Temperatura de crescimento pode ser mnima, tima e mxima. Maioria cresce em um intervalo de 30oC entre mnima e mxima. Psicrfilos: profundezas de oceanos e regies polares (algas clorofceas e diatomceas). Mesfilos: Temperatura tima entre 25 e 40oC. Maioria das bactrias. Termfilos Temperatura entre 45 e 80oC. Fontes termais, camadas superiores de solos que sofrem intensa radiao solar, esterco e silo em fermentao. Hipertermfilos: Temperatura tima superior 80oC. Fontes termais, como as do Parque Yellowstone. Principalmente membros de Archaea.

Relao da temperatura com as taxas de crescimento. As temperaturas timas de cada organismo esto indicadas. (Fonte: Madigan et al., 2004).

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Adaptaes moleculares psicrofilia: Enzimas ativas em baixas temperaturas apresentam maior quantidade de estruturas secundrias em alfa-hlice (estrutura mais flexvel). Contedo elevado de cidos graxos insaturados, que auxilia na manuteno do estado semi-fluido. Obs.: Adio de crioprotetores (glicerol 10%) ao meio ajuda na preservao de culturas em baixas temperaturas (-70 a 196oC). Adaptaes moleculares termofilia: Lipdeos da membrana ricos em cidos graxos saturados geram ambientes altamente hidrofbicos colaborando para estabilidade da membrana citoplasmtica. Protenas termoestveis tendem a formar ncleos altamente hidrofbicos, diminuindo a tendncia ao desdobramento. DNA girase reversa em Archaea: promove um superenovelamento positivo do DNA, mais termoestvel. Outras protenas termoestveis ajudam a manter a dupla fita do DNA unida. membrana citoplasmtica em monocamada lipdica nas Archaea (estruturalmente mais 40 resistente que a bicamada).

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pH
pH timo de crescimento refere-se ao pH do meio externo; o pH intracelular deve permanecer prximo neutralidade. Maior parte das bactrias cresce entre pH 6,5 e 7,5. Acidfilos: muitos fungos (pH timo em torno de 5 ou inferior), vrios gneros de Archaea. Alcaliflicos: muitas espcies de Bacillus e algumas arquias (que tambm so haloflicas). Adio de sais de fosfato (KH2PO4) em meios de cultura funcionam como tampo para neutralizar, por exemplo, cidos produzidos por bactrias em crescimento.
A escala de pH. (Fonte: Madigan et al., 2004).
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Presso osmtica
Os microrganismos que tem necessidades especficas de NaCl para seu crescimento timo podem ser : halfilos discretos: [ ] baixas 1 a 6% halfilos moderados: [ ] moderadas 6 a 15% halfilos extremos: [ ] altas 15 a 30%

Efeito da concentrao do on sdio no crescimento de microrganismos com diferentes tolerncias ou necessidades de sal.
(Fonte: Madigan et al., 2004).

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Presso osmtica

plasmlise

Inibio do crescimento no momento em que a membrana plasmtica se separa da parede celular. Preservao de alimentos!!!

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Relaes dos microrganismos com o oxignio

Aerbios estritos ou obrigatrios

Aerbios

Microaerfilos

Aerbios facultativos

Obrigatrios Anaerbios

Aerotolerantes
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Oxignio
Formas txicas de oxignio, todos subprodutos formados na reduo do O2 a H2O durante a respirao: nion superxido (O2-) perxido de hidrognio (H2O2) radical hidroxil (OH)

Quatro reaes de reduo de O2 a gua pela adio seqencial de eltrons. Todos os intermedirios formados so reativos e txicos clula, exceto a gua. Fonte: Madigan et al., 2004.

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Para defesa algumas bactrias produzem algumas enzimas:

-Superxido desmutase (SOD): enzima produzida em bactrias aerbias, anaerbias facultativas crescendo aerobiamente e anaerbios aerotolerantes que neutraliza os radicais superxidos livres (O2-) O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2

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-Catalase:
O perxido de hidrognio (H2O2) produzido tambm txico devido ao nion perxido (O22-)!!!! A enzima catalase neutraliza a ao deste nion, convertendo o perxido de hidrognio em gua e oxignio: 2H2O2 2H2O + O2

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-Peroxidase:
Outra enzima que neutraliza o perxido de hidrognio: H2O2 + H+ + NADH 2H2O +NAD

Organismos anaerbios obrigatrios no produzem nem catalase, nem superxido dismutase. So super sensveis ao oxignio, provavelmente devido ao acmulo de radicais livres.

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Relaes dos microrganismos com o oxignio

Microrganismos variam quanto suas necessidades ou tolerncia ao oxignio - Aerbios microrganismos capazes de utilizar o

Oxignio molecular, O2. (Ar contm 21% de O2)

-Produzem mais energia a partir do uso de nutrientes. - Aerbios estritos que ou obrigatrios: de O2 So para os sua

microrganismos sobrevivncia.

necessitam

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Relaes dos microrganismos com o oxignio

- Microaerfilos Aerbias necessitando de O 2, mas em concentraes

menores do que a encontrada no ar. So sensveis aos radicais superxidos ou perxidos,

produzidos em concentraes letais quando em condies de altas concentraes de oxignio.

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Relaes dos microrganismos com o oxignio

- Aerbios facultativos
Podem utilizar o O2 quando disponvel, mas na sua ausncia, so capazes de continuar seu crescimento atravs da respirao anaerbia ou da fermentao. A eficincia na produo de energia diminui quando o O2 no est disponvel. Exemplo: Escherichia coli Outras bactrias substituem o oxignio, durante a respirao anaerbia, por aceptores de eltrons como os ons nitrato.
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Relaes dos microrganismos com o oxignio

Alguns microrganismos no so capazes de respirar oxignio: Anaerbios Obrigatrios Aerotolerantes

- Anaerbios obrigatrios ou estritos So microrganismos que no utilizam o O2 para reaes de produo de energia. O2 pode ser um produto danoso para muitos destes. Exemplo: Gnero Clostridium = ttano e botulismo
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Relaes dos microrganismos com o oxignio

- Anaerbios aerotolerantes

Toleram a presena do oxignio, mas no podem utiliz-lo

para seu crescimento. Fermentam carboidratos produzindo cido ltico. O acmulo deste cido inibe o crescimento da microbiota competitiva aerbia estabelecendo um nicho ecolgico. Exemplo: Lactobacillus Podem tolerar o oxignio devido a produo de SOD.
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Aerbios e facultativos

Indispensvel para aerbios

Enzimas que destroem espcies txicas de oxignio. Catalases (a) e peroxidases (b) so protenas que contm porfirina. As SOD (c) contm metal como cobre e zinco, mangans ou ferro. A SOR (e) catalisa a reduo de um eltron de O 2- a H2O2 utilizando o citocromo c reduzido como doador de eltron. Adaptado de Madigan et al., 2004.

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Oxignio
Relaes dos microrganismos com o oxignio
Grupo Relao com o O2 Tipo de metabolismo Aerbios Obrigatrios Exigido No exigido, mas com melhor crescimento em O2 Exigido, mas em nveis inferiores ao atmosfrico Resp.aerbia Resp. aerbia, anaerbia, fermentao Micrococcus luteus Pele, poeira Exemplo Habitat tpico

Facultativos

Escherichia coli

Intestino grosso de humanos

Microaerofilos

Resp. aerbia

Spirillum volutans

gua de lagos

Anaerbios No exigido, sem melhor crescimento na presena de O2 Nocivo ou letal

Aerotolerantes

Fermentao

Streptococcus pyogenes

Trato respiratrio superior

Lodo de digestores de esgoto, sedimentos de lagos anxicos

Obrigatrios

Fermentao ou resp. anaerbia

Methanobacterium formicicum

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Adaptado de Madigan et al., 2004.

Oxignio

Representao dos tipos de crescimento bacteriano quanto presena de oxignio em meio caldo tioglicolato + gar (+ denso). (a) aerbios obrigatrios. (b) anaerbios obrigatrios. (c) aerbios facultativos. (d) microaerfilos. (e) anaerbios aerotolerantes. Fonte: Madigan et al., 2004.

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Cultivo de anaerbios
- necessidade de fervura da gua para eliminar o oxignio dissolvido. meio deve conter um agente redutor tioglicolato de sdio que se combina com o oxignio dissolvido residual, eliminando essa forma do meio.

Jarra para cultivo de bactrias anaerbias em placa de Petri ( esquerda): aps a adio de gua embalagem contendo o bicarbonato de sdio e boroidreto de sdio, ocorre a liberao de dixido de carbono e hidrognio. No catalisador de paldio ocorrer a reao entre o oxignio e o hidrognio, formando a gua. Cmara de anaerobiose ( direita). Fonte: Tortora et al., 2005.

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Cultivo de anaerbios

Jarra de anaerobiose. O envelope acondicionado na jarra produz uma reao qumica que gera H2 + CO2. O H2 reage com o O2 da jarra, na superfcie de um catalisador de paldio, originando H2O. A atmosfera final gerada na jarra composta por N2, H2 e CO2.

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Cultivo de anaerbios

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Nutrientes
Macronutrientes Micronutrientes

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Macronutrientes necessrios em grandes quantidades

Carbono elemento principal de todas as macromolculas biolgicas: corresponde a 50% do peso seco da clula bacteriana tpica. fontes orgnicas de C protenas, carboidratos e lipdeos (quimiorganotrficos). fonte inorgnica de C CO2 (quimioautotrficos e fotoautotrficos). Nitrognio importante constituinte de protenas, cidos nuclicos: corresponde a 12-14% do peso seco da clula bacteriana tpica. encontrado na natureza principalmente na forma de compostos inorgnicos: amnia (NH3), nitrato (NO3-) ou N2. fontes orgnicas: aminocidos, bases nitrogenadas. Fsforo e Enxofre juntos, correspondem a 4% do peso seco da clula bacteriana tpica: Fsforo necessrio para a sntese de cidos nuclicos e fosfolipdeos. Forma usual encontrada na natureza on fosfato PO43- . Enxofre constituinte dos aa cistena e metionina e tb de vitaminas (tiamina, biotina). Maior parte do enxofre utilizado nos processos celulares vem de fontes inorgnicas: on sulfato (SO42-) e sulfeto (HS-).
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Macronutrientes

Fonte: Madigan et al., 2004.

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Micronutrientes (elementos-trao)

Fonte: Madigan et al., 2004.

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Fatores orgnicos de crescimento

Algumas bactrias necessitam de fontes extracelulares de vitaminas, que atuam como coenzimas. Ex. bactrias lcticas (Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc)

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Fonte: Madigan et al., 2004.

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Microrganismos em meio de cultura

Fatores orgnicos de crescimento

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Microrganismos em meio de cultura

Crescimento e multiplicao Meio de cultura satisfatrio

Sntese de seus prprios monmeros

Dever conter:

Fonte de carbono Nitrognio Sais inorgnicos Vitaminas

(tiamina, biotina, cobalamina...)

Em certos casos:

Outros fatores de crescimento (Aminocidos, purinas, pirimidinas)

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Microrganismos em meio de cultura

Exigente Nutricionalmente No Exigente

Meio especfico/ Ricos Meio mnimo Pseudomonas

Solues aquosas de glicose, amnia, fosfato, sulfato e outros minerais

Parasitas intracelulares obrigatrios

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Meios de Cultura
Solues nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos em laboratrio. Inculo: microrganismos que so colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento. Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura.

Quimicamente definidos: Quantidades precisas de compostos qumicos inorgnicos ou orgnicos altamente purificados, adicionados a gua destilada.

Meios

Complexos (ou indefinidos): No se conhece a composio precisa de alguns componentes. Empregam produtos de digesto da casena (protena do leite), de carne, de soja, de leveduras, extratos de plantas, entre outros.
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Meios de cultura
Utilizados para o cultivo dos microrganismos; Quimicamente definidos Definio exata
Retirando ou adicionando um constituinte ao meio definido, pode-se saber se aquele constituinte essencial para o crescimento do microrganismo.

Em laboratrio Rotina heterotrficos meios cultura complexos Produtos naturais.

de

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Meios comerciais
J contm todos os componentes desejados; Adiciona-se gua Esteriliza-se 121C durante 20 minutos. Distribui-se em placas de Petri tambm esterilizadas. Armazena-se em geladeira embaladas em sacos plsticos para diminuir a desidratao.

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Microrganismos em meio de cultura

Composio: Peptona (Fonte de nitrognio) Triptose (reaes de fermentaes) Extrato de carne (carboidratos, constituintes minerais, vitaminas) Extrato de leveduras (Fonte de vitaminas) gua (destilada / deionizada)

Sangue (Fator de crescimento, rico em nitrognio,

carboidratos e vitaminas)

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gar: polissacardeo complexo solidificante obtido de

algas marinhas.
Poucos microrganismos degradam o gar. Temperatura de fuso inferior temperatura da gua. Permanece lquido at 40C. Na tcnica de Pour plate o gar mantido a 50C e adicionado sobre o inculo sem afetar, ou causar danos a bactria.

Dependendo de sua concentrao os meios podem ser classificados quanto a consistncia:

- Lquido menos de 1g de gar por litro de gua - Semi-slido 4 g/L - Slido 15 a 18 g/L
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Classificao quanto funo:

-Seletivo -Diferencial

-Enriquecedor
-Transporte

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Meios Seletivos
Favorece o crescimento da bactria de interesse impedindo o crescimento de outras bactrias. Inibidores: substncias capazes de inibir algumas bactrias que no so de interesse. 1) Corantes: verde brilhante, eosina, cristal violeta... 2) Metais pesados: Bismuto; 3) Substncias qumicas: azida, citrato, desoxicolato, selenito e lcool feniletlico... 4) Agentes antimicrobianos: vancomicina, cloranfenicol 5) Meio hipertnico: alta concentrao de sal (7,5%)
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Meio Diferencial
Utilizado para fcil deteco da colnia da bactria de interesse quando existem outras bactrias crescendo na mesma placa do meio
Substncias utilizadas como indicadores de atividade enzimticas que auxiliam na identificao

-Indicadores de pH: fucsina, azul de metileno, vermelho neutro,

vermelho de fenol e prpura de bromocresol. Medem as variaes de pH que resultam do metabolismo bacteriano de certos substratos.

- Indicadores diversos: detectam produtos bacterianos

especficos. Ex.: ons ferro e ferroso para a deteco de sulfato de hidrognio
75

Indicadores de pH comumente usados em microbiologia Indicador

Andrade Prpura de bromocresol Azul de bromotimol Vermelho de ortocresol Vermelho de metila Vermelho neutro Vermelho de fenol

pH cido
rseo amarelo amarelo amarelo vermelho vermelho amarelo

pH bsico
amarelo prpura azul vermelho amarelo amarelo vermelho

76

38

C.L.E.D. Cistina Lactose Eletrlitos - Deficiente

Peptona ..........................................................7
Extrato de levedura........................................2 Extrato de carne.............................................2 Cistina......................................................0,128 Lactose..........................................................10 Azul de Bromotimol..................................0,03 gar...............................................................12

Nitrognio e carbono

Acar Indicador de pH

77

CLED (Cistina Lactose- Eletrlitos-Deficientes)

Com indicador azul de bromotimol

Lactose + (Amarelo)

Meio diferencial

78

39

CLED (Cistina Lactose- Eletrlitos-Deficientes)

Com indicador de Andrade!!

Lactose + (Rosa)

Meio diferencial

79

gar MacConkey Peptona de carne...................................................3 Peptona de casena..............................................17 NaCl.........................................................................5 Lactose..................................................................10 Sais biliares.........................................................1,5 Vermelho neutro................................................0,03 Cristal violeta...................................................0,001 gar....................................................................13,5
Acar Inibidor de Gram+ Nitrognio e carbono

Indicador de pH
Inibidor de Gram+

80

40

Meio Seletivo e Diferencial

Muito utilizado na rotina laboratorial

gar MacConkey Seletivo e Diferencial

Seletivo: Cristal violeta e sais biliares inibem bactrias Grampositivo; Diferencial: Este meio possui indicador de pH vermelho neutro: quando o meio fica cido a cor fica rosa. Possui lactose que a bactria pode degradar (fermenta) produzindo cido que diminui o pH do meio.

81

Lactose Lactose +

MacConkey Cultura mista!!!!!! Seletivo para enterobactrias (Gram-negativo) a partir de fezes, urina, alimentos, gua...
82

41

MacConkey
Cultura mista!!!!!!

1. Lactose 2. Lactose +

Sais biliares e cristal violeta inibem Gram-positivas

Meio seletivo e diferencial

83

gar Manitol Hipertnico

Nitrognio e carbono

Peptona...............................................................10

Extrato de carne..................................................1
Inibidor NaCl.....................................................................75 Gram+ ede algumasdas Gram

Manitol................................................................10 Vermelho de fenol .......................................0,025

carboidrato Indicador de pH

gar....................................................................12

Meio Seletivo e Diferencial

84

42

gar Manitol Hipertnico Manitol -

Indicador Vermelho de fenol!!!

Manitol +

A degradao do manitol est relacionada com a patogenicidade, indicativo da presena de Staphylococcus aureus.
85 Crescem apenas bactrias que suportam grande concentrao de sal!

E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactrias (Gramnegativo) Corantes inibem Gram-positivo

Brilho verde metlico Escherichia coli

Meio seletivo e diferencial

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43

E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactrias (Gramnegativo) Corantes inibem Gram-positivo Colnias pardo rsea Enterobacter sp

Meio seletivo e diferencial

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X.L.D. Xilose Lisina Descarboxicolato Xilose lactose e sacarose + Amarelo! Xilose, lactose e sacarose Vermelho!!! Produo de H2S Negro!!! Cultura mista!!!!!!!!!!! Seletivo e diferencial para enterobactrias patognicas, especialmente Shigella e Salmonella.
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44

Meios de Cultura
Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: gar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes.

Meios

Diferencial: Permite a fcil identificao da colnia da bactria de interesse, dentre as colnias de outras bactrias crescidas no meio. Ex.: Meio gar sangue para detectar a presena de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colnia pela lise das hemceas)
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Meio de enriquecimento
Incrementa o crescimento de certas espcies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de microrganismos que no sejam de interesse.

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45

Caldo selenito e Caldo GN

Partem do princpio de que a E. coli e outros Gram-negativos da flora normal so mantidos em fase de latncia (Lag) prolongada pelas substncias qumicas inibidoras.

As espcies de Salmonella e Shigella so menos inibidas, entram em uma fase de crescimento exponencial (Log) e so isoladas com mais facilidade de amostras fecais.

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Caldo GN Triptose..............................................................20 Glicose.................................................................1 Manitol.................................................................2 Hidrogenofosfato potssico..............................4 NaCl......................................................................5

Base nutritiva!! carboidrato carboidrato Tampo

Citrato de sdio..................................................5
Desoxicolato de sdio....................................0,5

Inibidores de Gram+

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Caldo selenito e Caldo GN

Incubao de no mximo 8 horas

Meio seletivo X.L.D. ou Hektoen ou SS

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gar SS (Salmonella/Shigella) Peptonas.........................................................10 Lactose...........................................................10

Nitrognio e carbono carboidrato algumas Gram -

Bile de boi dessecada................................. 8,5 Inibidores de Gram+ e

Citrato de sdio.............................................10 Tiossulfato de sdio.....................................8,5
Indicador de H2S

Citrato de amnio e ferro III............................1 Verde brilhante........................................0,0003 Vermelho neutro.......................................0,025 gar.................................................................12

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Indicador de pH

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gar SS (Salmonella/Shigella) Salmonella sp Lactose (Transparente) Produo de H2S (Com centro negro)

Meio Seletivo e diferencial: verde brilhante, bile e alta concentrao de tiossulfato e citrato inibem a microbiota acompanhante de fezes, alimentos e outros materiais.
Lactose + E. coli - cor rosa
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Rico X Enriquecimento Rico: o meio que suplementado com sangue, soro,

suplementos vitamnicos e extrato de levedura para isolar

microrganismos exigentes.
Ex: gar Mueller Hinton suplementado com 5% de sangue de carneiro e gar chocolate

Meio de enriquecimento: Incrementa o crescimento de certas

espcies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de microrganismos que no sejam de interesse. Ex.: Caldo GN e Caldo selenito.
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gar Mueller Hinton suplementado com sangue de carneiro a 5%.

Meio rico Permite o crescimento da maioria das bactrias

Colnia

Hemlise

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Meios de Cultura
Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: gar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes. Diferencial: Permite a fcil identificao da colnia da bactria de interesse, dentre as colnias de outras bactrias crescidas no meio. Ex.: Meio gar sangue para detectar a presena de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colnia pela lise das hemceas)

Meios

de Enriquecimento: Semelhante ao seletivo, mas suplementado por nutrientes especiais, com a caracterstica de aumentar o nmero da bactria de interesse tornando-a detectvel.
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Meio de transporte
Stuart
Mantem o microrganismo vivel, mas impede o crescimento e multiplicao at o subcultivo em meio

adequado.

Glicerol fosfato de sdio .......................................10 Tioglicolato de sdio................................................1 Cloreto de clcio....................................................0,1 Azul de metileno................................................0,002 gar............................................................................8
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Mtodo de esgotamento em placa

Por estriamento

100

50