MANUAL PRTICO MICROBIOLOGIA

Nuno Taveira Ausenda Oliveira Perptua Gomes Teresa Nascimento

2008

ndice Geral CAPTULO 1- Segurana biolgica em laboratrios de microbiologia 1.1. Introduo 1.2. Princpios de segurana biolgica 1.3. Nveis de segurana biolgica 1.4. A segurana biolgica em laboratrio de ensino da Microbiologia CAPTULO 2- Estudo da clula bacteriana por microscopia ptica: exame a fresco e aps colorao. 2.1. Introduo 2.2 - Protocolos experimentais 2.3. Resultados e discusso CAPTULO 3- Cultura e isolamento de bactrias 3.1 Introduo 3.2 - Protocolos experimentais 3.3 Resultados e discusso CAPTULO 4- Estudo morfolgico e bioqumico de fungos unicelulares e filamentosos 4.1 - Introduo 4.2 - Protocolos experimentais 4.3 Resultados e discusso CAPTULO 5 - Estudo da susceptibilidade bacteriana aos antibiticos e desinfectantes 5.1 - Introduo 5.2 - Protocolos experimentais 5.3 Resultados e discusso CAPTULO 6 - Estudo morfolgico e bioqumico de fungos unicelulares e filamentosos 6.1 - Introduo 6.2 - Protocolos experimentais 6.3 Resultados e discusso CAPTULO 7 - Estudo bioqumico e metablico de cocos de Gram positivo 7.1 - Introduo 7.2 - Protocolos experimentais 7.3 Resultados e discusso CAPTULO 8 - Estudo bioqumico e metablico de bacilos de Gram negativo 8.1 - Introduo 8.2 - Protocolos experimentais 8.3 Resultados e discusso CAPTULO 9 - Isolamento de bacterifagos de guas de superfcie 11.1 Introduo 11.2- Protocolo Experimental 11.3- Resultados e discusso BIBLIOGRAFIA 3 3 4 8 11 13 13 16 19 20 20 25 26 27 27 30 31 32 32 38 40 41 41 45 45 48 48 55 57 58 58 66 67 68 68 69 71 71

CAPTULO 1 Segurana biolgica em laboratrios de microbiologia

1.1. Introduo Os laboratrios de microbiologia so ambientes de trabalho especiais em que as pessoas que neles trabalham esto sujeitas a contrair doenas infecciosas que podem constituir risco de vida. So inmeros os trabalhos publicados desde o incio do sculo descrevendo casos de doenas associadas ao trabalho laboratorial, incluindo a febre tifoide (causada pela Salmonella typhi), clera (causada pelo Vibrio cholerae), brucelose (causada pela Brucella abortus), hepatite B, shigelose (causada por algumas espcies de Shigella spp.), tuberculose (causada pelo Mycobacterium tuberculosis), arboviroses, ttano (causada pelo Clostridium tetani) e SIDA (causada pelo HIV) (Tabela 1.1).

Tabela 1.1. Casos de SIDA ou infeces por HIV contradas profissionalmente at Setembro de 1992 nos Estados Unidos1 Profisso No. de transmisses profissionais (%) Tcnico de laboratrio 25 (24.8) 26 (25.7) Enfermeiro Mdico 13 (12.8) Tcnico biomdico/paramdicos 7 (6.9) Dentista/tcnico dentista 6 (5.9) Recepcionista/auxiliares 6 (5.9) Trabalhadores de limpeza/manuteno 6 (5.9) Tcnico morgue 3 (3.0) Tcnico/terapeuta 3 (3.0) Terapeuta respiratrio 2 (2.0) Tcnico cirrgico 2 (2.0) Outros trabalhadores em sade 2 (2.0) Total 101 1 Adaptado de: Sewell, D.L. 1995. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Reviews 8: 389-405.

Nalguns casos as infeces tero sido associadas simples manipulao de culturas microbianas ou amostras clnicas, ou ainda inalao de p ou aerossis contendo microrganismos patognicos. Noutros casos, as infeces foram associadas utilizao de tcnicas incorrectas e descuidadas de manuseamento de materiais infecciosos (Tabela 1.2). Neste contexto so tristemente famosas as infeces mortais adquiridas por iminentes cientistas como H.T. Ricketts, S.J.M. von Prowazek e E. Weil, durante os seus estudos das doenas provocadas por Ricktesias spp. Tabela 1.2. Tipos de acidentes associados com infeces de origem laboratorial1 Acidentes No. de infeces (%) Salpicos e aerossis 188 (26.7) Perfurao/ferida com agulha 177 (25.2) Perfurao/ferida com objectos 112 (15.9) pontiagudos Mordedura ou arranho de animal ou 95 (13.5) ectoparasita Pipetao boca 92 (13.1) Outros (desconhecidos) 39 (5.5) Total 703 1 Adaptado de: Sewell, D.L. 1995. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Reviews 8: 389-405.
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Estes estudos sugeriram que os indivduos que trabalham em laboratrios de microbiologia correm o risco efectivo de ser infectados pelos agentes que manipulam. Em contraste, estudos semelhantes demonstraram que os laboratrios que trabalham com agentes infecciosos no constituem uma ameaa para a comunidade, havendo a registar somente casos espordicos de infeces comunitrias que tero sido transmitidas por trabalhadores deste tipo de laboratrios. De forma a minorar ou eliminar a ocorrncia de doenas infecciosas associadas a actividades laboratoriais, foram elaborados alguns manuais de segurana por diversas organizaes, incluindo a Organizao Mundial de Sade e o Center for Disease Control dos Estados Unidos, que descrevem as Boas Prticas de Laboratrio e as instalaes requeridas para trabalhar em segurana com materiais infecciosos. Este captulo sistematiza e resume a informao sobre segurana microbiolgica, contida nestes manuais e em outras publicaes, que directamente relevante para minimizar ou eliminar os perigos associados ao manuseamento de culturas bacterianas e fngicas nas aulas prticas laboratoriais de Microbiologia para que estas aulas no constituam risco de segurana biolgica para os alunos, professores, pessoal de limpeza e manuteno, e restante comunidade do ISCSS. 1.2. Princpios de segurana biolgica O termo conteno do risco biolgico (ou simplesmente conteno biolgica) utiliza-se para descrever mtodos seguros de gesto de agentes infecciosos no meio ambiente laboratorial em que so produzidos, manuseados ou conservados. Os objectivos das medidas de conteno biolgica so a reduo ou eliminao da exposio a agentes potencialmente patognicos por parte de tcnicos laboratoriais e pessoal auxiliar, comunidade e meio ambiente geral extra-laboratorial. Entende-se por conteno primria, a proteco de pessoal e meio ambiente laboratorial da exposio a agentes infecciosos. A conteno primria obtm-se aplicando boas tcnicas microbiolgicas e utilizando equipamento de segurana apropriado. A utilizao de vacinas pode tambm aumentar o nvel de proteco pessoal. Entende-se por conteno secundria a proteco do meio ambiente externo ao laboratrio da exposio a materiais infecciosos. A conteno secundria obtm-se recorrendo a uma combinao de prticas operacionais especficas e desenho adequado de instalaes. Os trs elementos que permitem definir o tipo de conteno do risco biolgico incluem, portanto, a tcnica e prtica laboratorial, o equipamento de segurana, e o desenho de instalaes. A anlise de risco do trabalho a efectuar com um agente especfico determinar a apropriada combinao destes trs elementos. 1. Tcnica e prtica laboratorial O elemento mais importante da conteno biolgica a aderncia estrita a prticas e tcnicas microbiolgicas seguras e padronizadas. Os indivduos que trabalham com agentes infecciosos ou materiais potencialmente infectados devem conhecer os potenciais riscos envolvidos na sua actividade, e devem ser treinados e proficientes na execuo das tcnicas e prticas requeridas para manusear de forma segura tais materiais. O director ou pessoa a cargo do laboratrio responsvel pelo treino apropriado do pessoal. Cada laboratrio deve desenvolver ou adoptar um manual de segurana biolgica ou de operaes que identifique os perigos que podero ser encontrados e quais as prticas especficas e procedimentos a adoptar para minimizar ou eliminar riscos (Tabela 1.3). O pessoal deve ser alertado para perigos especiais e deve ser compelido a ler e a seguir as prticas e procedimentos requeridos para os evitar. O laboratrio deve ser dirigido por um cientista conhecedor das tcnicas laboratoriais apropriadas, procedimentos de segurana, e perigos associados com o manuseamento de agentes infecciosos. Quando as prticas laboratoriais padronizadas se revelem insuficientes para controlar os perigos associados com um agente particular ou procedimento laboratorial, podem ser necessrias medidas adicionais. O director de laboratrio responsvel pela seleco de prticas de segurana adicionais, que devem ser coerentes com os perigos associados com o agente ou procedimento em causa.

O pessoal de laboratrio, as medidas de segurana, e tcnicas devem ser suplementadas pelo desenho apropriado de instalaes e por caractersticas prprias de engenharia, equipamento de segurana, e prticas de gesto. Tabela 1.3. Vias de exposio a microrganismos patognicos em ambiente laboratorial1 Via Prtica microbiolgica
Pipetao boca Salpicos de material infeccioso para a boca Colocao de artigos contaminados ou dedos na boca Consumo de alimentos no laboratrio Inoculao Acidentes com agulhas Cortes Mordeduras de insecto e arranhes Contaminao da pele e membranas mucosas Derrames ou salpicos para os olhos, boca, e nariz Derrames ou salpicos em pele intacta ou pele lesada Superfcies, equipamento, e material contaminados Inalao Numerosos procedimentos que produzem aerossis 1 Adaptado de: Sewell, D.L. 1995. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Reviews 8: 389405. Ingesto

2. Equipamento de segurana_ barreiras primrias_ O equipamento de segurana inclui cmaras de segurana biolgica, recipientes fechados, e outras solues de engenharia desenhadas para eliminar ou minimizar a exposio a materiais biolgicos perigosos. As cmaras de segurana biolgica so os principais equipamentos utilizados para possibilitar a conteno de derrames infecciosos ou aerossis gerados por muitos procedimentos microbiolgicos (Tabelas 1.4 e 1.5). Tabela 1.4. Identificao de actividades laboratoriais geradoras de aerossis1 Actividades laboratoriais Prticas microbiolgicas
Inoculao de meios de cultura bacterianos Arrefecimento de ansas nos meios de cultura Chamejamento de ansas contaminadas Pipetao Agitao de suspenses bacterianas Derrames em superfcies slidas Manuseamento de agulhas e seringas Expelir ar Retirar tampa da agulha Injectar animais Retirar a agulha da a seringa Outras Centrifugao Utilizao de misturadores, agitadores, sonicadores Adio ou decantao de fludos Abertura de frascos de cultura Derrames de materiais infecciosos Liofilizao e filtrao sobre vcuo Inoculao de ovos e posterior colheita de fludos contendo vrus 1 Adaptado de: Sewell, D.L. 1995. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Reviews 8: 389405. Manipulao de ansas de inoculao

Tabela 1.5. Exemplos de aerossis infecciosos produzidos por algumas tcnicas bacteriolgicas comuns1 Procedimento laboratorial No. mdio de colnias em amostras de ar
Aglutinao em lmina 0-0.7 Injeco de animal sem desinfectar o local de 15-16 inoculao Tubo partido em rotor de centrfuga com tampa 0-20 Tubo partido em rotor de centrfuga sem tampa 80-1800 (derrame de lquido para fora da centrfuga) Uma gota de Salmonella indica depositada altura de cerca de 10 cm sobre: Ao inox 0.2-4.7 Toalha de mos seca 0-0.4 Toalha molhada com fenol (5%) 0-0.1 Insero de uma ansa quente num caldo de cultura 0.7-25 Insero de uma ansa fria em caldo de cultura 0-0.2 Quebra de ampola contendo S. indica liofilizada 1939-2040 Inoculao de agar solidificado com ansa 7-73 Utilizao de misturador mal vedado 77-1246 Abertura de garrafas com tampa de rosca 0-45 1 Adaptado de: Chatigny MA and Clinger DI. Contamination control in aerobiology. In: Dimmick, R.L:, and AB. Akers (Eds.) 1969. An introduction to experimental aerobiology, pp. 194-263. Wiley-Interscience, New-York.

Existem trs tipos de cmaras de segurana biolgica utilizadas em laboratrios de microbiologia: cmaras de classe I , II e III. As cmaras de classe I (Fig. 1.1) e classe II (Fig. 1.2) so cmaras abertas que oferecem nveis significativos de proteco ao pessoal de laboratrio e ao meio ambiente quando utilizadas em conjunto com boas tcnicas microbiolgicas. As cmaras de classe II tambm protegem contra a contaminao externa de materiais (e.g. culturas de clulas, stocks microbianos) que so manipulados dentro da cmara. As cmaras de classe III (Fig. 1.3), cmaras fechadas, so estanques a gases e constituem o mais alto nvel de proteco alcanvel actualmente para o pessoal e para o meio ambiente.

Figura 1.1. Diagrama de uma cmara de segurana biolgica de classe I. A) Abertura frontal; B) Superfcie de trabalho; C) Janela; D) Coluna de exausto; E) Filtro HEPA.

Figura 1.2. Diagrama de uma cmara de segurana biolgica de classe II, tipo A. A) Ventilador; B) Coluna de exausto; C) Filtro HEPA de entrada; D) Exaustor; E) Vidro; F) Superfcie de trabalho.

Figura 1.3. Diagrama de uma cmara de segurana biolgica de classe III. A) Mesa de apoio; B) Compartimento das luvas; C) O-ring para ligao das luvas; D) Janela de vidro; E) Filtro HEPA de sada; F) Filtro HEPA de exausto (embora sejam necessrios dois filtros HEPA consecutivos de exausto o segundo filtro no est representado na figura); G) Autoclave com duas sadas.

Outro exemplo de barreira primria a tampa dos rotores de centrfuga que impedem a libertao de aerossis formados durante a centrifugao. Para minimizar este perigo potencial, sobretudo quando se manuseiam agentes infecciosos que podem ser transmitidos por via respiratria aps exposio a aerossis, deve tambm efectuar-se o trabalho laboratorial em cmaras de segurana biolgica. O equipamento de segurana pode tambm incluir itens para proteco pessoal tais como luvas, batas, tocas, sapateiras, botas, respiradores, mscaras faciais, vidros protectores, ou culos. O equipamento de proteco pessoal muitas vezes utilizado conjuntamente com cmaras de segurana biolgica e outros

dispositivos de conteno dos agentes, animais ou materiais infecciosos que esto a ser manipulados. Em algumas situaes em que pouco prtico trabalhar em cmaras de segurana biolgica, o equipamento de proteco pessoal pode constituir a primeira barreira entre o pessoal e os materiais infecciosos (ex. actividades relacionadas com a manuteno de equipamentos). 3. Desenho de instalaes _barreiras secundrias_ O desenho das instalaes pode constituir uma importante barreira de proteco do pessoal intra- e extralaboratorial e da comunidade em geral, dos agentes infecciosos que podem ser acidentalmente libertados do laboratrio. A direco do laboratrio responsvel pela disponibilizao de instalaes adequadas funo do laboratrio e ao nvel de segurana recomendado para os agentes efectivamente manipulados. As barreiras secundrias recomendadas dependem do risco de transmisso do agente especfico. Por exemplo, os riscos de exposio para a maior parte do trabalho laboratorial em instalaes de nvel 1 e 2 de segurana biolgica so o contacto directo com os agentes, ou o contacto inadvertido atravs do meio ambiente de trabalho contaminado. As barreiras secundrias nestes laboratrios podem incluir a separao da rea de trabalho laboratorial do acesso pblico, existncia de equipamento para descontaminao (ex. autoclave) e locais para lavagem de mos. medida que o risco de transmisso dos microrganismos por aerossis aumenta, tornam-se necessrios nveis mais elevados de conteno primria e mltiplas barreiras secundrias para impedir a sada de agentes infecciosos para o meio ambiente. As caractersticas do desenho das instalaes podem ento incluir: sistemas de ventilao especializados que assegurem fluxo de ar direccionado, sistemas de tratamento do ar laboratorial para descontaminar ou remover agentes do ar contaminado (ar expelido), zonas de acesso controlado, isolamento do laboratrio em edifcios ou mdulos separados 1.3. Nveis de segurana biolgica Existem quatro nveis de segurana biolgica (NSB) que so definidos pela utilizao combinada de diferentes prticas e tcnicas laboratoriais, equipamento de segurana, e instalaes laboratoriais. Cada combinao especificamente apropriada para as operaes efectuadas, as vias de transmisso conhecidas ou suspeitadas de cada agente infeccioso, e para a funo ou actividade do laboratrio (Tabela 1.6). O director do laboratrio responsvel pela anlise de riscos associados ao trabalho laboratorial com um determinado agente microbiano e pela aplicao apropriada dos nveis de segurana biolgica recomendados para esse agente microbiano. 1. Nvel 1 de segurana biolgica (NSB 1) As prticas, o equipamento e as instalaes deste nvel de segurana so apropriadas para laboratrios de ensino (de nvel bsico introdutrio, caso da Microbiologia Geral), outras instalaes em que seja efectuado trabalho com estirpes bem definidas e caracterizadas de microrganismos viveis que sejam incuos para o adulto saudvel. O Bacillus subtilis e a Escherichia coli K12, a Naegleria gruberi, e o vrus da hepatite canina so exemplos representativos de microrganismos que satisfazem estes critrios. Muitos agentes que no esto normalmente associados a doena no homem adulto so, no entanto, patognios oportunistas e podem causar infeces no jovem, no idoso, e nos indivduos imunodeficientes ou imunosuprimidos. Este nvel de biosegurana representa um nvel bsico de conteno biolgica que assenta em prticas microbiolgicas padronizadas no sendo recomendadas barreiras primrias ou secundrias especiais, a no ser a existncia de um lavatrio para lavagem de mos. 2. Nvel 2 de segurana biolgica (NSB-2) As prticas, equipamento, e instalaes deste nvel de segurana so apropriadas para laboratrios de diagnstico, laboratrios de ensino ( onde se manipule produtos biolgicos, caso da Bacteriologia Clnica) e ainda outras instalaes em se trabalhe com uma grande variedade de microrganismos de

risco moderado naturalmente presentes na comunidade e associados com doenas humanas de maior ou menor severidade. Com a adopo de boas tcnicas microbiolgicas, estes agentes podem ser manuseados com segurana em bancadas abertas, desde que se assegure que o potencial formador de aerossis, derrames e salpicos, resultante dessas actividades baixo. O vrus da hepatite B, as Salmonella spp., e os Toxoplasma spp. so exemplos de microrganismos que devem ser trabalhados nestas condies de segurana. O nvel 2 de segurana biolgica apropriado para trabalho com fluidos e tecidos corporais e produtos derivados do sangue humano, produtos biolgicos em que a presena de um agente infeccioso pode ser desconhecida. Os perigos primrios para o pessoal que trabalha com estes agentes relacionam-se com exposies percutneas ou exposies acidentais das membranas mucosas, ou ainda com a ingesto de materiais infecciosos. Deve ter-se precaues extremas com agulhas contaminadas ou instrumentos ponteagudos. Embora os organismos manipulados em instalaes de nvel 2 de segurana biolgica (NSB-2) no se transmitam normalmente por via aerossol, todos os procedimentos que possam aumentar o risco de exposio do pessoal a aerossis devem ser efectuados em/com equipamento ou utenslios de conteno primria como so as cmaras de segurana biolgica e as tampas dos rotores de centrfugas. Outras barreiras primrias podem ser utilizadas quando tal seja apropriado: escudos contra derrames e salpicos, proteces faciais, luvas e toucas. Para reduzir a potencial contaminao ambiental devem sempre existir e estar disponveis e em funcionamento, barreiras secundrias tais como lavatrios e instalaes ou equipamento para descontaminao dos resduos infectados. 3. Nvel 3 de segurana biolgica (NSB-3) As prticas, equipamento, e instalaes deste nvel de segurana biolgica so apropriadas para laboratrios de diagnstico, de ensino, de investigao e de produo industrial em se trabalhe com uma grande variedade de microrganismos indgenas ou exticos com potencial para transmisso respiratria via aerossis, e que podem causar infeces srias e potencialmente letais. Exemplos de microrganismos que devem ser trabalhados a este nvel de segurana so: Mycobacterium tuberculosis, vrus da encefalite de St. Louis, e Coxiella burnetii. Os perigos primrios para o pessoal que trabalhe com estes agentes relacionam-se com a auto-inoculao, ingesto, e exposio a aerossis infecciosos. No nvel 3 de segurana biolgica, mais nfase colocado na utilizao de barreiras primrias e secundrias para proteco do pessoal que trabalhe em reas contguas, proteco da comunidade, e proteco do ambiente, contra a exposio a aerossis potencialmente infecciosos. Por exemplo, todas as manipulaes devem ser efectuadas numa cmara de segurana biolgica ou outro equipamento fechado. As barreiras secundrias incluem: Acesso controlado ao laboratrio Sistema de ventilao especializado que minimize a libertao de aerossis infecciosos 4. Nvel 4 de segurana biolgica (NSB-4) o nvel mais elevado de segurana biolgica. As prticas, equipamento, e instalaes deste nvel de segurana biolgica so apropriadas para o trabalho com microrganismos perigosos e exticos que constituam um elevado risco individual de contrair uma doena mortal, que podem ser transmitidos por aerossis, e para os quais no existe vacina ou terapia. Adicionalmente, agentes microbianos com um perfil antignico semelhante ou igual dos agentes deste nvel de segurana biolgica devem igualmente ser manuseados neste nvel de segurana. Exemplos de microrganismos que tm de ser manuseados neste nvel de segurana so os vrus de Marburg e da febre hemorrgica do Congo-Crimeia. Os riscos primrios para o pessoal que trabalhe neste nvel de segurana so a exposio respiratria a aerossis infecciosos, exposio das membranas mucosas a gotculas infecciosas, e auto-inoculao. Todas as manipulaes de materiais de diagnstico potencialmente infecciosos, microrganismos isolados, e animais natural ou experimentalmente infectados constituem um risco de exposio e infeco para o pessoal laboratorial, a comunidade, e o meio ambiente.

A proteco completa do trabalhador contra o material infeccioso aerossolizado obtida efectuando o trabalho em cmaras de segurana biolgica de classe III ou utilizando um fato individual com fornecimento autnomo de ar e presso positiva. As instalaes de nvel de segurana 4 so normalmente um edifcio separado ou uma zona completamente isolada equipada com complexos sistemas especializados de ventilao e de gesto de resduos para prevenir a libertao de agentes viveis para o meio ambiente.

Em todos os casos, o director do laboratrio o primeiro responsvel pela operao em segurana do laboratrio. O seu conhecimento e julgamento so crticos na anlise de riscos e aplicao apropriada destas recomendaes. Os nveis de segurana recomendados representam as condies de trabalho que, uma vez adoptadas, permitem o trabalho em segurana com os diversos microrganismos. As caractersticas particulares do agente usado, o treino e a experincia do pessoal, e a natureza ou funes do laboratrio podem tambm influenciar o director na aplicao destas recomendaes.

Tabela 1.6. Resumo dos nveis de segurana biolgica recomendados para agentes infecciosos
Nvel de segurana biolgica (NSB) NSB-1 Agentes No causam doena em adultos saudveis Associados com doenas humanas. Perigos primrios: auto inoculao, ingesto, exposio das membranas mucosas Prticas Prticas microbiolgicas padronizadas Prticas de NSB-1 mais: Acesso limitado Sinais avisadores de perigo Precaues contra objectos pontiagudos Manual de segurana biolgica definindo mtodos de descontamina o de resduos e polticas de vigilncia mdica Prticas de NSB-2 mais: Acesso controlado, Descontamina o de todos os resduos Descontamina o das vestes laboratoriais antes de as Equipamento de segurana (barreiras primrias) No requerido Utilizao de cmaras de segurana biolgica de classe I ou II para manipulaes de agentes que originem salpicos e formao de aerossis de material infeccioso. Batas, Luvas, Proteco facial quando necessria Instalaes (barreiras secundrias) Obrigatria bancada aberta com lavatrio NSB-1 mais: Autoclave disponvel

NSB-2

NSB-3

Agentes indgenas ou exgenos com potencial para transmisso por aerossis; A doena provocada pelos microrganismos pode ter

Utilizao cmaras segurana biolgica classe I ou para manipulao todos agentes Bata, Luvas,

de de de II a de os

NSB-2 mais: Separao fsica dos corredores gerais de acesso Acesso com portas duplas e que se fechem automaticament e

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consequncias srias ou mesmo mortais

lavar, Obteno de um colheita de soro para determinar nveis de base.

Proteco respiratria quando necessrio

Agentes perigosos/extic os que provocam doenas mortais, infeces transmitidas por aerossis;

Prticas de NSB-3 mais: Troca de roupa antes de entrar Duche sada Todo o material descontaminad o sada das instalaes

Todos os procedimentos efectuados em cmaras de segurana biolgica de classe III

ou NSB-4 Agentes relacionados com vias de transmisso desconhecidas

ou Todos os procedimentos efectuados em cmaras de segurana de classe I ou II em combinao com a utilizao de fatos pessoais de corpo inteiro, com fornecimento de ar e presso positiva

Ar exaurido no reciclvel Fluxo de ar com presso negativa para dentro do laboratrio NSB-3 mais: Edifcio separado ou zona isolada Sistemas dedicados de fornecimento e exausto de ar , de vcuo, e de descontamina o Outros requerimentos descritos no texto

1.4. A segurana biolgica em laboratrio de ensino da Microbiologia Para o ensino laboratorial de cursos de nvel introdutrio de Microbiologia Geral, em que se manuseia essencialmente estirpes bem definidas e caracterizadas de microrganismos viveis que so incuos para o adulto saudvel e constituem um perigo mnimo para o pessoal laboratorial e para o meio ambiente, so apropriadas prticas, equipamento e instalaes de Nvel 1 de Segurana Biolgica (NSB-1). O trabalho geralmente conduzido em bancada aberta usando prticas microbiolgicas padronizadas. Geralmente no necessrio nem utilizado equipamento de conteno especial nem edifcios especiais. Os alunos, o pessoal auxiliar e de limpeza, e o pessoal de manuteno, devem ter treino especfico nos procedimentos efectuados no laboratrio, e a sua actividade tem de ser supervisionada por um cientista ou professor com treino geral em microbiologia ou cincia relacionada. As prticas microbiolgicas padronizadas e especficas, equipamento de segurana e instalaes so as aplicadas a agentes de nvel 1 de segurana biolgica: A. Prticas Microbiolgicas Padronizadas 1. O acesso ao laboratrio limitado ou restrito discrio do director do laboratrio quando esto em curso experincias ou trabalho com culturas e amostras de microrganismos. 2. As mos devem ser lavadas: Aps lidar com materiais contendo microrganismos viveis Aps lidar com animais, Aps a remoo das luvas, Antes de deixar o laboratrio.

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3. Comer, beber, fumar, manusear lentes de contacto, e aplicar cosmticos no so permitidos nas reas de trabalho onde exista a possibilidade de exposio, mesmo que remota, a materiais infecciosos. 4. Os indivduos que utilizam lentes de contacto no laboratrio devem usar culos ou uma mscara facial. 5. Os alimentos so guardados e conservados fora da rea de trabalho em armrios e frigorficos utilizados somente com este objectivo. 6. A pipetao boca proibida; tm de ser utilizados dispositivos de pipetao automtica. 7. Todos os procedimentos so executados cuidadosamente para evitar a libertao de aerossis, salpicos ou derrames. 8. As superfcies de trabalho devero ser descontaminadas pelo menos uma vez por dia e aps qualquer derrame de material infeccioso. 9. Todas as culturas, stocks, e outros resduos infecciosos formados devero ser descontaminados antes da sua rejeio por um mtodo de descontaminao aprovado (ex. autoclavagem). 10. Os materiais a descontaminar fora da rea do laboratrio devem ser colocados num contentor durvel, prova de fugas, que dever ser fechado antes do transporte. A embalagem e transporte final dos lixos infecciosos devem obedecer s regulamentaes exigidas pelas autoridades locais. 11. Dever ser implementado um programa de controlo de insectos e roedores. B. Prticas microbiolgicas especficas No so requeridas nenhumas prticas microbiolgicas especficas. C. Equipamento de segurana (barreiras primrias) 1. No so geralmente requeridos dispositivos ou equipamentos especiais de segurana para a manipulao de agentes microbianos de NSB-1. 2. Deve ser utilizada bata ou uniforme para prevenir a contaminao das roupas. A bata deve ser vestida entrada do laboratrio e retirada sada do laboratrio. 3. Devem ser utilizadas luvas no caso de haver feridas nas mos ou quando a pele das mos est gretada ou queimada. 4. Devem ser utilizados dispositivos de proteco dos olhos (culos ou mscaras) quando se antecipa que o trabalho laboratorial poder provocar derrames, salpicos ou aerossis infecciosos. C. Instalaes laboratoriais (barreiras secundrias) 1. Cada laboratrio deve ter um lavatrio de mos. 2. O desenho laboratorial de molde a que seja facilmente limpo. No devem existir tapetes porque a sua descontaminao muito difcil. 3. Os tampos das bancadas devem ser impermeveis gua e resistentes aos cidos, bases, solventes orgnicos, e calor moderado. 4. O mobilirio laboratorial deve ser rgido e duradouro. Os espaos entre as bancadas, e entre os equipamentos deve ser acessvel para limpeza. 5. No caso do laboratrio ter janelas que abrem, estas devem estar equipadas com mosquiteiros.

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CAPTULO 2 Estudo da clula bacteriana por microscopia ptica: exame a fresco e aps colorao.
2.1. Introduo O exame microscpico a primeira etapa do estudo e identificao de um microrganismo e permite observar e analisar a forma, tamanho e organizao/agrupamento dos microrganismos. Alguns destes parmetros so mais caractersticos e mais fceis de observar quando os microrganismos esto no seu habitat natural do que quando esto em cultura in vitro longo tempo. Em materiais ou produtos que contenham uma flora microbiana mltipla e complexa o exame microscpico directo pode permitir determinar a proporo relativa das espcies microbianas presentes. Exame a fresco No exame a fresco, os microrganismos em suspenso em gua, soro fisiolgico, meio de cultura, produto biolgico, etc, so colocados entre lmina e lamela e observados ao microscpio utilizando normalmente a objectiva de 40X, o condensador em baixo e o diafragma ligeiramente fechado de modo a que no entre demasiada luz. O exame a fresco permite uma primeira observao da morfologia e modo de agrupamento dos microrganismos (Fig. 1.1). Uma vez que as clulas so observadas vivas, o exame a fresco permite ainda o estudo da eventual mobilidade bacteriana. Morfologia e tipo de agrupamento

Figura 1.1 - Formas bacterianas mais comuns e tipos de agrupamento Mobilidade bacteriana De um modo geral, a mobilidade das bactrias deve-se existncia de flagelos. Bactrias sem flagelos so normalmente imveis (ex. Klebsiella spp, Moraxella spp). A disposio dos flagelos caracterstica das diferentes espcies bacterianas e determina o tipo de mobilidade. Uma bactria montrica possui um nico flagelo; se o flagelo est disposto num dos plos da bactria a flagelao polar (ex. Pseudomonas spp) (Fig. 1.2.a). Uma bactria anftrica possui um nico flagelo em cada um dos plos. As bactrias loftricas possuem um tufo de flagelos num dos plos ou em ambos os plos bacterianos (Fig. 1.2.b). As bactrias pertricas possuem flagelos dispersos por toda a clula (ex. E. coli, Proteus spp., Salmonella spp.) (Fig. 1.2.c).

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(a)

(b)

(c)

Figura 1.2 Localizao dos flagelos. (a) flagelao polar; (b) flagelao loftrica; (c) flagelao pertrica. A bactria move-se quando o flagelo entra em rotao. A direco da rotao flagelar determina a natureza da movimentao bacteriana (Fig. 1.3). A movimentao para a frente das bactrias montricas ocorre quando o flagelo roda no sentido contrrio ao dos ponteiros do relgio; invertendo o sentido da rotao flagelar a bactria pra e roda sobre si prpria. Um mecanismo semelhante determina a mobilidade para a frente das bactrias pertricas.

Frente (a) (b) (c) (d)

Sobre si prpria Sobre si prpria

Frente

Figura 1.3 Movimentao flagelar. Relao entre rotao flagelar e mobilidade bacteriana. (a) e (b) ilustram a mobilidade de bactrias montricas, polares. (c) e (d) ilustram a mobilidade de bactrias pertricas. necessrio saber distinguir se a mobilidade bacteriana observada microscopicamente real, se provocada por correntes de convexo, caso em que todas as bactrias se movimentam numa nica direco e sentido, ou se um simples movimento Browniano em que as bactrias oscilam mas no se deslocam. Tambm se pode verificar se determinada bactria mvel ou imvel por inoculao por picada central de um meio de cultura semi-slido em tubo, por exemplo o meio de manitol-mobilidade. A bactria mvel ir multiplicar-se em todo o meio turvando completamente o meio; o crescimento das bactrias imveis ir confinar-se ao local da inoculao. Exame aps colorao Nas coloraes so usados corantes que tingem as clulas aumentando o seu contraste, o que permite melhor observao ao microscpio ptico. As tcnicas so executadas sobre esfregaos secos e fixados pelo calor ou pelo lcool. Nestes esfregaos as formas vegetativas bacterianas morrem, tornam-se permeveis aos corantes e aderem lmina devido precipitao do material proteico do citoplasma.

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O exame aps colorao permite obter uma definio mais precisa da morfologia microbiana, diferenciar algumas bactrias devido a diferentes afinidades por corantes e ainda evidenciar detalhes da estrutura bacteriana. Os corantes so compostos orgnicos e tm afinidades especficas para cada tipo de material celular. Os mais comuns so os corantes catinicos que se combinam com constituintes celulares carregados negativamente (ex. cidos nucleicos e polissacridos acdicos). Como as superfcies das clulas so geralmente carregadas negativamente estes corantes so tambm bons corantes gerais (as clulas ficam todas da mesma cor). A observao microscpica sempre feita com a objectiva de imerso (100x), usando leo de imerso, com o condensador em cima e o diafragma aberto. a) Colorao simples - usa-se um s corante que confere a mesma cor a todos os microrganismos, de execuo tcnica simples e rpida e, como no danifica muito as clulas, utilizada principalmente para estudos morfolgicos. Colorao pelo azul-de-metileno: O corante nico (catinico) combina-se com os grupos negativos do protoplasma bacteriano, especialmente com os grupos fosfato dos cidos nucleicos, e essa ligao mantm-se mesmo aps a remoo do excesso de corante por lavagem com gua. b) Colorao diferencial - como o nome indica permite diferenciar bactrias que no coram do mesmo modo, sendo utilizado mais do que um corante e, necessariamente, uma soluo de descolorao. A mais comum a colorao de Gram. Colorao de Gram: Foi descoberta pelo mdico Dinamarqus Christian Gram em 18831 (Anexo 1) e baseia-se na diferena de composio qumica e espessura das paredes bacterianas que condiciona a permeabilidade ao lcool e acetona e, em consequncia, a dissoluo mais ou menos rpida de complexos corados formados no citoplasma. Esta colorao permite dividir as bactrias em dois grandes grupos: as bactrias Gram (+) e as bactrias Gram (-). As bactrias Gram (+), quando tratadas por um corante p-rosanilina trimetilmetano como o violeta de metilo, o cristal violeta, ou o violeta de genciana (mistura dos dois primeiros) e seguidamente por uma soluo contendo iodo que genericamente se designa de mordente e que permite permite a melhor penetrao do corante (ex. lugol no caso da colorao de Gram), fixam o corante de tal modo que este no removido pela soluo de descolorao, o lcool-acetona. Exemplos: Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Bacillus sp.. As bactrias Gram (-), pelo contrrio, so descoradas pela soluo de lcool-acetona, porque o complexo violeta/iodeto formado dissolvido e extrado atravs de membrana externa. Para que depois se possam observar melhor, so novamente coradas por um corante de contraste, geralmente vermelho-rosa (fucsina diluda), que as distingue das bactrias Gram (+), corados de violeta. Exemplos: Famlias Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. A colorao de Gram depende da idade da cultura bacteriana. Assim, a positividade ao Gram enfraquece com o envelhecimento de forma que, por ex., uma cultura de bacilos Gram (+), apresenta sempre alguns elementos Gram (-). Existem ainda bactrias Gram intermedirias que se descoram facilmente, e bactrias Gram variveis em que coexistem elementos bacterianos Gram (+) e elementos Gram (-). c) Coloraes especiais - a sua aplicao permite pr em evidncia detalhes da estrutura bacteriana (flagelos, cpsulas, esporos ncleos ou incluses citoplasmticas), e ainda corar bactrias no corveis ou dificilmente corveis pelas tcnicas habituais. So geralmente mais complexas e morosas.

Gram, C. 1884. Ueber die isolirte Farbung der Schizomyceten in Schnittund Trockenpraparaten. Fortschritte der Medicin, Vol. 2: 185-189.

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Colorao de Micobactrias de Ziehl-Neelsen A superfcie bacteriana das bactrias do gnero Mycobacterium rica em cidos miclicos (lpidos complexos, ramificados, com cadeias longas). Estes lpidos tornam a membrana das Micobactrias pouco permevel aos corantes usuais e alm disso conferem-lhes a propriedade da cido-lcool resistncia. No entanto, o emprego do calor e de uma soluo corante fenolada (fucsina de Ziehl), permitem corar o protoplasma das referidas bactrias (Ziehl-Neelsen - 1885). Uma vez coradas elas resistem bastante tempo aco sucessiva de um cido mineral forte e do lcool. Todas as outras clulas, bacterianas ou no (no cido-lcool resistentes), perdem a sua colorao pela fucsina, sendo posteriormente recoradas pelo azul-de-metileno. As Micobactrias apresentam-se como finos bacilos vermelhos, ligeiramente encurvados, que se destacam nitidamente do fundo azul da lmina.

Colorao da cpsula
Muitas bactrias segregam sua superfcie substncias viscosas de composio varivel, constitudas por polissacridos, glicoprotenas, polilcoois e acares aminados que podem ser espessas ou finas, rgidas ou flexveis, dependendo da natureza qumica, e que tm funes de aderncia a superfcies, proteco bacteriana contra dessecao, contra as clulas do sistema imunolgico, e contra outras agresses exteriores. A cpsula uma secreo que adere clula sob a forma de uma camada externa, disposta de modo compacto em torno da superfcie celular. possvel visualizar a cpsula, pela colorao negativa pela tinta-da-china por via hmida, dado que a cpsula rejeita as partculas de tinta-da-china. As clulas produtoras de cpsula vem-se (com a objectiva de 40x), descoradas sobre fundo negro. Pode ainda observar-se a cpsula utilizando uma variante da colorao anterior em que se aplica fucsina diluda sobre um esfregao seco das clulas, com tinta-da-china. As clulas produtoras de cpsula vemse (com a objectiva de 100x), coradas de rosa, rodeadas por halos incolores, sobre fundo negro. Colorao de endosporos O endosporo bacteriano representa uma forma de resistncia a condies ambientais desfavorveis. Os gneros Bacillus, Clostridium e Sporosarcina so caracteristicamente esporulados. No exame a fresco os esporos so visveis atravs da sua refringncia e como so impermeveis aos corantes habituais, aparecem como zonas transparentes no interior da bactria em preparaes coradas. possvel no entanto, corar endosporos, recorrendo colorao de Mller, muito semelhante colorao de Ziehl-Neelsen, dado que tambm os esporos, so cido resistentes. Aps a colorao, visualizam-se os esporos corados de vermelho e o protoplasma, de azul. Colorao de flagelos Os flagelos bacterianos so organelos de locomoo (Fig. 1.2). So muito finos (10 - 30 nm de dimetro) e apenas podem ser vistos directamente, em microscopia electrnica. Para serem observados ao microscpio ptico, o dimetro dos flagelos tem que ser aumentado. Para isso so revestidos com mordentes, como por exemplo o almen de potssio, e posteriormente corados com fucsina (mtodo de Gray) ou nitrato de prata (mtodo de West). Estas coloraes permitem observar a disposio flagelar, o que importante na identificao de algumas espcies bacterianas. 2.2 - Protocolos experimentais Os alunos iro realizar o exame a fresco entre lmina e lamela de algumas espcies bacterianas (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas sp., Staphylococcus epidermidis) com a finalidade de fazer os respectivos estudos de mobilidade e morfologia. Aprofundaro o estudo da morfologia realizando uma colorao simples pelo azul-de-metileno e uma colorao diferencial (colorao de Gram), aprendendo tambm a classificar as bactrias como Gram (+) ou Gram (-). Os alunos iro tambm realizar a colorao da cpsula (Klebsiella pneumoniae) e a colorao de Ziehl-Neelsen para micobactrias (Mycobacterium smegmatis).

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Durante as manipulaes microbiolgicas fundamental evitar a contaminao dos instrumentos, dos meios de cultura estreis, e das prprias culturas microbianas com microrganismos do meio ambiente, de objectos no estreis, das mos, etc. Isto implica trabalhar sempre junto chama de um bico de bunsen, ou numa cmara de segurana biolgica. As caixas contendo meios de cultura no devem ser abertas seno no momento da sua inoculao, e devem ser imediatamente fechadas aps a inoculao. Quando se abre um frasco estril deve passar-se o gargalo chama do bico de bunsen para eliminar microrganismos contaminantes do ar, etc. Todas as manipulaes efectuadas no laboratrio de microbiologia devem, portanto, ser manipulaes asspticas. Exame a fresco e aps coloraes pelo azul-de-metileno e pelo mtodo de Gram 1) Escolher um tubo com meio BHI previamente inoculado com uma das bactrias a estudar e que estar supostamente, em fase exponencial de crescimento. 2) Em cada uma de trs lminas, e usando uma ansa, colocar 3 ou 4 gotas de cultura. 3) Na 1 lmina realizar o exame a fresco: Cobrir com uma lamela e observar ao microscpio ptico com a objectiva de 40x 4) Na 2 lmina realizar a colorao pelo azul-de-metileno: Espalhar com a ansa e deixar secar (esfregao) Fixar chama Deixar arrefecer Corar com azul de metileno durante 3 minutos Lavar e secar Observar ao microscpio ptico com a objectiva de imerso (100x) 5) Na 3 lmina realizar a colorao de Gram: Espalhar com a ansa e deixar secar (esfregao) Fixar chama Deixar arrefecer Lavar com gua Corar com cristal violeta durante 1 minuto Rejeitar o cristal violeta utilizando o lugol e deixar actuar durante 1 minuto Lavar a pina com que se segura a lmina, com lcool-acetona, e depois com gua Lavar o reverso da lmina com lcool-acetona, e depois com gua Lavar o esfregao com lcool-acetona durante 3 ou 4 segundos Lavar com gua Corar com fucsina diluda durante 1 minuto Lavar e secar Observar ao microscpio ptico com a objectiva de imerso (100x) Coloraes da cpsula 1) Escolher um tubo com meio BHI previamente inoculado com Klebsiella pneumoniae. 2) Usando uma ansa, colocar 2 ou 3 gotas de cultura em duas lminas. 3) Numa das lminas realizar a colorao da cpsula (colorao negativa pela tinta da china): Depositar na lmina uma gota de tinta-da-china ao lado das gotas de cultura Cobrir com uma lamela e comprimir entre folhas de papel absorvente at a camada de lquido ser to fina que fique s levemente corada, e as clulas bacterianas imobilizadas entre lmina e lamela Observar ao microscpio ptico com a objectiva de (40x) 4) Na 2 lmina realizar a colorao da cpsula pelo mtodo da tinta-da-china e fucsina diluda: Depositar na lmina uma gota de tinta-da-china ao lado das gotas de cultura

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Fazer deslizar uma lmina sobre a primeira fazendo um esfregao Secar ao ar Corar com fucsina diluda durante 2 minutos Lavar cuidadosamente com gua Secar Observar ao microscpio ptico com a objectiva de imerso (100x)

Colorao de Micobactrias pelo mtodo de Ziehl-Neelsen 1) Escolher um tubo com meio BHI previamente inoculado com Mycobacterium smegmatis. 2) Realizar a colorao de Ziehl-Neelsen: usando uma ansa, colocar 5 ou 6 gotas de cultura numa lmina espalhar com a ansa e deixar secar (esfregao) fixar chama deixar arrefecer corar com fucsina de Ziehl aquecendo at emisso de vapores mas sem deixar entrar em ebulio repetir 3 vezes totalizando cerca de 10 minutos (se necessrio adicionar mais fucsina) lavar com gua descorar com uma mistura lcool-cido durante 5 minutos (de minuto a minuto lavar e renovar o lcool-cido) lavar com gua corar com azul de metileno durante 30 segundos lavar e secar observar ao microscpio ptico com a objectiva de imerso (100x) Colorao de Micobactrias pelo mtodo de Kinyoun (a frio) 1. Preparar um esfregao homogneo, delgado e identificado numa lmina nova desengordurada, limpa e seca; 2. Deixar secar temperatura ambiente; 3. Fixar o material do esfregao passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; 4. Cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de Fucsina fenicada (fucsina de Kinyoun) previamente filtrada, deixando agir por cerca de 5 minutos, adicionando mais corante se preciso dentro deste perodo, evitando que a lmina seque; 5. Lavar em gua corrente para eliminar a fucsina. 6. Cobrir toda a superfcie do esfregao com a soluo de lcool-cido. Tomar a lmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o lcool-cido v descorando suavemente a fucsina. Se o esfregao estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregao, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operao dura, em geral, dois minutos; 7. Terminada a fase de descolorao e eliminado o lcool-cido, lavar a lmina da mesma forma como se procedeu depois da colorao com a fucsina, com cuidado para no desprender a pelcula; 8. Cobrir toda a superfcie do esfregao com soluo de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto; 9. Lavar, da mesma forma como se indicou para a fucsina, tanto o esfregao como a parte inferior da lmina; 10. Colocar a lmina com o esfregao para cima sobre papel limpo para secar temperatura ambiente ou estufa a 35 C; 11. Observar ao microscpio com objectiva de imerso (100 x). Fucsina fenolada de Kinyoun Fucsina bsica 4 gr dissolvida em 20 ml de etanol 90-95%. Juntar 100 ml de soluo aquosa de fenol a 8%.

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Observao de endosporos e flagelos bacterianos Escolher uma lmina previamente preparada com colorao de endosporos e tambm uma lmina com colorao de flagelos e observar ao microscpio ptico com a objectiva de imerso (100x).

2.3. Resultados e discusso

2.3.1 - Observe e anote a forma e o tipo de movimento (se for mvel) das bactrias que estudou no exame a fresco. 2.3.2 - Confirme a forma e observe o tipo de agrupamento das mesmas bactrias recorrendo colorao pelo azul-de-metileno. 2.3.3 - Classifique as bactrias estudadas como Gram (+) ou Gram (-). 2.3.4 - Classifique os bacilos estudados como cido-lcool resistentes ou no. 2.3.5- Classifique as bactrias estudadas em relao cpsula. 2.3.6 - Anote as suas observaes sobre o nmero e localizao dos endosporos e sobre a o nmero e localizao dos flagelos.

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CAPTULO 3- Cultura e isolamento de bactrias

3.1 - Introduo
3.1.1 - Generalidades A maior parte das tcnicas bacteriolgicas (conservao, isolamento, identificao, ou contagem de bactrias), exigem a utilizao de meios de cultura, sendo a composio dos meios de cultura funo dos conhecimentos sobre os princpios de nutrio microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizvel, os nutrientes necessrios ao crescimento das bactrias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminocidos). Para que se observe crescimento bacteriano h ainda que incubar os meios em condies adequadas de pH, tenso de oxignio e temperatura. Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactria pelos seus caracteres morfolgicos. portanto essencial obt-la em cultura em meio artificial e, na hiptese de estarem presentes diversas espcies, separ-las ou isol-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificao de natureza bioqumica. Para cultivar uma espcie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estril adequado uma pequena amostra contendo clulas vivas da espcie. A essa amostra chama-se inculo, e adio desse inculo ao meio, chama-se inoculao. O meio inoculado ento incubado em condies convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubao, as bactrias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma populao de bactrias (organismos) que se desenvolve num meio ou sua superfcie. 3.1.2 - Classificao dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em funo da sua consistncia, composio e tipo de utilizao. a) Consistncia Existem meios de cultura em trs estados fsicos: lquido semi-slido slido Os meios lquidos, como os caldos nutritivos de crescimento, podem ser utilizados para a multiplicao de microrganismos em estudos de fermentao e em vrios testes bioqumicos. Apresentam no entanto, dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas no revelam em geral quaisquer caractersticas especiais e portanto o seu valor limitado na identificao de bactrias; 2) impossvel a separao de espcies bacterianas que se encontrem em misturas. Ao contrrio dos meios lquidos, os meios slidos e semi-slidos contm um agente solidificante, normalmente o agar. O agar um polissacrido complexo extrado de uma alga marinha (agar-agar) e tem vrias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal, incluindo ficar transparente no ponto de ebulio da gua, no ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e no ser metabolizado durante o crescimento microbiano. Os meios semi-slidos (aos quais so adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentao, estudos de mobilidade bacteriana (ex.: meio manitol-mobilidade) e na promoo do crescimento de bactrias anaerbias. Os meios slidos (aos quais so adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colnias das diferentes bactrias que se desenvolvem superfcie (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes, auxiliando a sua posterior identificao. So praticamente indispensveis obteno de culturas puras. So ainda utilizados para a conservao de culturas, e permitem observar determinadas reaces bioqumicas especficas (ver meios diferenciais).

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Uma colnia um nmero elevado de clulas bacterianas em meio de cultura slido que visvel a olho n como uma entidade discreta. Assume-se que uma colnia provm de uma nica clula e portanto representa um clone de uma cultura pura. b) Composio Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. Os meios sintticos, ou quimicamente definidos que so compostos por produtos qumicos bem definidos e dissolvidos em gua destilada em propores determinadas, de modo a constituir uma soluo de nutrientes devidamente tamponada (ex. meio de citrato de Simmons), e os meios complexos, compostos por uma variedade de substncias nutricionalmente indefinidas, de origem animal, vegetal ou microbiana como por exemplo, extracto de carne, peptonas, e extracto de levedura, que so naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. Como exemplos destes meios tm-se as geloses de McConkey, Drigalsky ou Endo. c) Tipo de utilizao Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obteno de culturas puras e podem ser de vrios tipos: Meios basais - Permitem o crescimento de bactrias pouco exigentes. No existe um meio de cultura universal (ex. caldo nutritivo, gua peptonada, triptona sal, gelose nutritiva). Meios selectivos - Permitem o crescimento s de um tipo de bactrias em detrimento das outras cujo crescimento inibido. Torna-se til, no caso de uma populao plurimicrobiana, porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactrias. Meios diferenciais - So utilizados quando se pretende diferenciar entre vrios microrganismos presentes no meio de cultura. Por exemplo, no caso da gelose sangue, dado que algumas bactrias produzem enzimas (hemolisinas) que vo lisar os glbulos vermelhos enquanto outras no; dependendo do padro de hemlise pode-se distinguir entre bactrias hemolticas (Streptococcus pyogenes) e no hemolticas. Meios selectivos e diferenciais - Alguns meios de cultura so simultaneamente selectivos e diferenciais. So sobretudo utilizados em microbiologia clnica e na rea da sade pblica, como por exemplo na determinao da qualidade da gua ou num surto de intoxicaes alimentares. Temos como exemplos deste tipo de meio: a. gelose de McConkey - um meio selectivo, uma vez que contm sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactrias Gram positivas, permitindo o crescimento, apenas das bactrias Gram negativas. diferencial porque a lactose est presente neste meio e permite diferenciar entre as bactrias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que no utilizam. As bactrias Gram negativas fermentadoras de lactose, tornam o meio cido e o indicador de pH do meio de cultura (vermelho de metilo) em meio cido fica vermelho. As bactrias Gram negativas que no fermentam a lactose, no acidificam o meio, e este permanece da cor original. b. gelose de Drigalsky - um meio muito semelhante ao anterior e contm, igualmente, lactose, indicador de pH (azul de bromotimol), cristal violeta (inibidor das bactrias Gram positivas). Permite distinguir tambm entre bactrias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac - (no fermentadoras de lactose). As primeiras originam colnias de cor amarela (o pH do meio baixa devido acumulao de produtos de fermentao e o indicador vira para amarelo); as segundas originam colnias azuis (a cor original do meio). c. Meio de Chapman - um meio selectivo para os estafilococos devido elevada concentrao de cloreto de sdio (7.5 %) que somente aquelas bactrias suportam. Por conter manitol (um polilcool derivado de um acar - a manose) tambm, diferencial (por ex.) para Staphylococcus aureus, uma vez que as espcies potencialmente patognicas do gnero Staphylococcus so fermentadoras de manitol. A acumulao dos produtos de fermentao acidifica o meio, e o indicador de pH (vermelho de fenol)

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vira de vermelho (cor original do meio) para amarelo, originando colnias amarelas rodeadas de um halo tambm amarelo. As espcies de estafilococos no fermentadoras de manitol apresentam neste meio, colnias incolores (ex. S. epidermidis). Meios enriquecidos - Os ambientes naturais so geralmente habitados por populaes de vrios tipos de bactrias. Quando uma espcie com especial interesse e nutricionalmemte exigente, se encontra presente num determinado produto mas em nmero muito baixo, fundamental a utilizao de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. Estes meios enriquecidos so meios basais adicionados de produtos biolgicos ricos em nutrientes como o soro, ovo ou sangue. Exemplos: gelose sangue, gelose chocolate, brain heart infusion (BHI). Gelose Chocolate - um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80C durante 20 minutos o que promove a lise dos glbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha, responsvel pelo nome atribudo. A lise dos glbulos vermelhos liberta para o meio extracelular, protenas, cujos cofactores so importantes factores de crescimento para bactrias muito exigentes (ex. o grupo heme fundamental para o crescimento de Haemophilus influenzae, agente importante de meningites bacterianas em crianas). Meios de enriquecimento So meios lquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espcies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposio de espcies (ex. meio de enriquecimento para organismos fotoautotrficos - meio sem fonte de carbono adicionada; ex. caldo de selenito de sdio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicaes alimentares). Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biolgico a partir do qual se prope isolar um ou mais organismos. ento importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicao dos mesmos (durante um perodo de 48 a 72 horas) e tambm a sua quantidade relativa no produto biolgico para que depois a inoculao dos meios origine resultados que reflictam a proporo relativa dos microrganismos nesse produto biolgico (ex. meio de Stuart). Meios de identificao So meios que permitem pr em evidncia as caractersticas bioqumicas das bactrias e, por conseguinte, resolver os problemas de identificao postos entre espcies (ex. meio Clark-Lubs - permite distinguir entre bactrias que fazem a fermentao butanodilica da glucose e bactrias que fazem a fermentao cida mista da glucose). Meios de conservao So meios que permitem a manuteno das bactrias num estado de vida latente durante meses, anos ou dcadas. 3.1.3 - Reconstituio de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou, no caso dos meios sintticos, dos vrios compostos qumicos. b) Adio de gua destilada. c) Dissoluo completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente. d) Esterilizao (geralmente em autoclave). e) Adio da fonte de carbono esterilizada por filtrao, no caso dos meios sintticos, uma vez que solues concentradas de glcidos no devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam. f) Distribuio em tubos ou caixas de Petri aps arrefecimento a 40 - 45 C.

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3.1.4 - Tcnicas de inoculao ou sementeira de meios de cultura slidos a) Inundao utilizada uma suspenso (que pode previamente ser submetida a vrias diluies), com que se inunda a superfcie do meio slido a usar. O excesso de inculo removido por suco a vcuo aps agitao e a superfcie do meio deixada secar ao ar em atmosfera assptica. b) Espalhamento utilizada para contagem de colnias e o inculo (suspenso) , neste caso, aplicado superfcie de meio slido com um espalhador em L ou, simplesmente, com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente, ou ainda por intermdio de uma zaragatoa. c) Estrias A inoculao por estrias realizada com a finalidade de obter colnias isoladas, e realiza-se superfcie de meio slido, com uma ansa de Henle, a partir de uma suspenso ou de uma colnia isolada (Fig. 3.1).

Figura 3. 1. Esquema da inoculao de meios de cultura slidos pela tcnica das estrias. d) Incorporao A inoculao por incorporao utilizada para contagem de colnias superfcie e no interior de meio slido e realiza-se por incorporao do inculo (suspenso) no meio, enquanto quente (no mais do que 40C para no destruir o inculo) e portanto ainda liquefeito. e) Picada central Este tipo de inoculao utilizado por exemplo, no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle, ou pipeta de Pasteur fechada, num meio gelosado em tubo. 3.1.5 - Incubao dos meios de cultura inoculados Aps a inoculao e a devida identificao dos tubos ou caixas de Petri, os meios de cultura devem ser incubados, isto , colocados em estufas prprias para o efeito, em condies adequadas de temperatura, humidade e tempo (geralmente em microbiologia clnica, 37C/24h, uma vez que quase todos os agentes patognicos so organismos mesfilos). 3.1.6 - Leitura dos resultados A observao dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura, presena de pigmentos solveis, a presena de odor caracterstico e o aspecto da cultura, e nomeadamente em meio slido, a existncia de colnias isoladas e suas caractersticas particulares (ver 3.1.7). 3.1.7 - Aspecto das colnias crescidas em meio slido (Fig. 3.2) a) Tamanho Colnias pequenas - dimetro (d) < 1 mm

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 Colnias mdias - 1.5 < d < 3 mm Colnias grandes - d > 3 mm b) Forma geral Desenho dos contornos: Bordos lisos regulares Bordos irregulares Bordos dentados Bordos com prolongamento Forma de relevo: Lisas Convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparncia: Transparentes Translcidas Opacas Lactescentes d) Aspecto da superfcie: Colnias lisas Bordos regulares Superfcie lisa e brilhante por vezes Consistncia cremosa Suspenso homognea Muitas vezes semi-convexas Colnias rugosas Bordos muitas vezes dentados Superfcie rugosa, baa Consistncia pulvurulenta Suspenso heterognea Sobretudo lisas Colnias mucosas Bordos lisos e regulares Convexas Superfcie lisa e brilhante Suspenso heterognea e) Pigmentao: A elaborao de um pigmento por certas bactrias pode ser um elemento precioso de identificao. Exemplos: Serratia marcescens - colnias vermelhas Pseudomonas aeruginosa - colnias verdes azuladas (pigmentos - pioverdina e piocianina)

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Forma Forma
Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso

Elevao Elevao
Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical

Margem Margem
Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada

Figura 3. 2. Representao esquemtica da forma, elevao e margem das colnias bacterianas obtidas em meio slido.

3.2 - Protocolos experimentais Utilizando bactrias em meio lquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA), inocular por espalhamento E. coli, utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador. 2) No meio de Drigalsky, dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. e E. coli por estrias, usando a ansa de Henle. 3) No meio de Chapman, dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp. e E. coli por estrias, usando a ansa de Henle. 4) Na gelose chocolate, dividir a placa em trs partes e inocular por estrias, utilizando uma zaragatoa as seguintes bactrias: E. coli, Proteus spp. e Staphylococcus spp. 5) Nos tubos de manitol-mobilidade, com a ansa de Henle, inocular Staphylococcus spp. e Proteus spp por picada central. Utilizando bactrias isoladas em meio slido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colnias: de uma das bactrias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiolgico (SF) ou meio BHI de uma das bactrias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI

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2) Com a ansa, tirar 4 ou 5 gotas das suspenses anteriores para lminas, fazer esfregaos, e realizar para cada uma a colorao de Gram. 3.3 Resultados e discusso 3.3.1 - Classifique quanto mobilidade as bactrias que inoculou no meio manitol-mobilidade. 3.3.2 - Identifique as bactrias fermentadoras e no fermentadoras de lactose. 3.3.3 - Identifique as bactrias fermentadoras e no fermentadoras de manitol. 3.3.4 - Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactrias estudadas. 3.3.5 - Classifique as bactrias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).

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CAPTULO 4 Transformao gentica da estirpe de E. coli HB101 pelo plasmdio pGLO 4.1 - Introduo 4.1.1 - Algumas definies Genoma - Conjunto de genes Gentipo - Conjunto de genes especficos de um organismo que determina um fentipo (conjunto de caractersticas fsicas e biolgicas observveis). Recombinao Gentica - Processo pelo qual formado um novo genoma recombinante que resulta da combinao do material gentico de dois organismos. Obtm-se um novo gentipo e, por vezes um novo, um novo fentipo. A transferncia de informao gentica de uma clula dadora para uma clula receptora pode dar-se segundo trs processos: Conjugao - Transferncia de ADN entre bactrias em contacto fsico atravs de um pili sexual. Transduo - Transferncia de ADN entre bactrias mediado por bacterifagos. Transformao - Transferncia directa de um fragmento livre de ADN presente no meio ambiente. As clulas receptoras tm obrigatoriamente que estar num estado de competncia. Estado de competncia - Estado fisiolgico em que so expressos receptores envolvidos na captao do ADN e em que a clula bacteriana pode adquirir ADN exgeno e ser transformada. um estado complexo em que, por exemplo, segregada uma protena (factor de competncia) que estimula a produo de 8 a 10 novas protenas necessrias transformao. A frequncia de transformao natural pode ser muito aumentada tratando as clulas com cloreto de clcio a frio. O ADN transmitido por transformao pode ser de origem: Cromossomal - quando por exemplo clulas mortas sofrem lise nas proximidades de clulas potencialmente receptoras. Plasmdico (Fig. 4.1)

Figura 4.1 Representao esquemtica transformao de bactrias por ADN plasmdico

da

4.1.2 - Plasmdios bacterianos So molculas de ADN circular que podem existir nas bactrias ou fungos independentemente do ADN cromossomal. Os plasmdios tm as suas prprias origens de replicao e portanto exibem replicao autnoma. Tm geralmente poucos genes (< 30) e a informao que contm no , normalmente, essencial bactria hospedeira. Pode existir um elevado nmero de cpias em cada clula bacteriana (500 - 1000) ou apenas uma s cpia por clula. Os plasmdios podem ser eliminados por exposio a agentes que inibem a sua replicao (radiaes ultra violeta, radiaes ionizantes _raios e X) ou por crescimento a temperaturas acima da ptima. Este processo designa-se por cura plasmdica.

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Os plasmdios podem ser de vrios tipos: Factor F, factor de fertilidade ou plasmdio F - fundamental na conjugao bacteriana. Plasmdios Col - conferem bactria hospedeira vantagens competitivas; codificam para pequenos polipptidos (bacteriocinas) que destroem outras bactrias que no a bactria produtora. Plasmdios de virulncia - tornam os seus hospedeiros mais virulentos (ex: h estirpes de E. coli que tm plasmdios que codificam enterotoxinas que provocam diarreia). Plasmdios metablicos - tm genes que codificam para enzimas que degradam determinados substratos (lactose, tolueno, pesticidas). Plasmdios que conferem resistncias a antibiticos (factor R, plasmdio R ou factor de resistncia) tm genes que codificam enzimas que destroem ou modificam os antibiticos. O mesmo plasmdio pode possuir vrios genes de resistncia, conferindo portanto resistncia a vrios antibiticos. No laboratrio, o ADN plasmdico pode ser introduzido em bactrias pelo processo artificial de transformao, processo esse que necessariamente iniciado pela extraco e purificao do ADN plasmdico. 4.1.3 - Regulao da expresso gentica no opero arabinose O opero arabinose constitudo por trs genes designados araA, araB e araD que codificam para trs enzimas envolvidas na degradao catablica da arabinose, um acar que uma fonte de energia e carbono para as bactrias (Figura 4.2). Estes genes so transcritos a partir de um nico promotor, PBAD. A transcrio dos trs genes requer a presena simultnea da ARN polimerase, da protena araC, uma protena de ligao ao ADN produzida pelo gene araC, e da arabinose. Quando existe arabinose, a bactria internaliza a arabinose que vai interagir directamente com a protena araC. Esta interao faz com que a araC altere a sua conformao o que favorece a ligao da ARN polimerase ao promotor PBAD e, consequentemente, a transcrio dos genes araA, araB e araC. As trs enzimas hidrolticas catalizadas por estes genes so produzidas e vo degradar a arabinose. Quando a arabinose se esgota a protena araC volta sua forma original e deixa de ocorrer transcrio dos genes do opero arabinose. Figura 4.2- Composio, estrutura e regulao da expresso do opero arabinose.

4.1.4 - O plasmdio pGLO O plasmdio pGLO tem 5,4 kpb, contm a origem de replicao ori, o gene GFP que codifica para a green fluorescent protein, o gene bla que codifica para a -lactamase e o gene araC que codifica para a protena araC (Fig. 4.3).

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A GFP uma protena que quando exposta luz ultravioleta liberta energia sob a forma de luz verde visvel. O gene que codifica para a GFP provm originalmente da anmona bioluminescente da espcie Aequoria victoria. No pGLO, a expresso do gene GFP est sob o controlo do promotor PBAD. A -lactamase uma protena que confere resistncia ao antibitico ampicilina; a -lactamase produzida e secretada pelas bactrias que contm o plasmdio pGLO e inactiva a ampicilina adicionada ao meio de cultura permitindo que estas bactrias cresam na presena de ampicilina. As bactrias no transformadas, que no contm o plasmdio pGLO, no vo crescer em meio com ampicilina. Desta forma o gene bla de resistncia ampicilina permite seleccionar as bactrias transformantes. Figura 4. 3- Mapa fsico do plasmdio pGLO

O sistema de regulao da expresso da GFP no pGLO semelhante ao do opero arabinose uma vez que est sob o controlo do promotor deste opero PBAD e da protena araC. A expresso do gene GFP, e consequente produo da protena GFP, pode ser activada nas clulas transformadas pelo plasmdio pGLO por adio da arabinose ao meio de cultura (Fig. 4.4). Na presena de arabinose, a protena araC vai recrutar a ARN polimerase para o promotor PBAD e a GFP produzida. As clulas emitem tanto mais fluorescncia quanto mais GFP possurem. Na ausncia de arabinose, a araC no facilita a ligao da ARN polimerase ao promotor e no h produo de GFP. As clulas no emitem fluorescncia. Assim, no meio de cultura sem arabinose as clulas transformadas aparecero brancas (cor natural); no meio de cultura com arabinose as clulas transformadas aparecero verde fluorescente quando expostas aos raios ultravioleta.

Figura 4.4- Expresso da GFP no plasmdio pGLO.

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4.1.5- Transformao Gentica A transformao gentica envolve a insero de um novo ADN em clulas receptoras (ex. E. coli) onde o ser expresso fazendo com que as bactrias transformantes adquiram uma nova caracterstica fenotpica. O processo de transformao requer que as clulas estejam em estado de competncia. 4.2 - Protocolo experimental Pretende-se que os alunos executem uma experincia de transformao por ADN plasmdico. Para isso sero fornecidas clulas competentes de E. coli HB101 e uma soluo a 30 ng/l do plasmdio pGLO. Foram feitas algumas adaptaes tcnica usual de transformao, de acordo com as condies das aulas prticas. 1) Marque um tubo eppendorf com +pGLO e outro com pGLO e ponha os tubos fechados nos suportes de espuma ou esferovite. 2) Abra os tubos e, com uma pipeta Pasteur estril, transfira 250 l de soluo de transformao (CaCl2) para dentro de cada tubo. 3) Coloque os tubos em gelo. 4) Com a ansa descartvel estril retire uma nica colnia isolada do meio de cultura e coloque no fundo do tubo marcado +pGLO, rodando a ansa entre os dedos at que toda a colnia esteja bem dispersa no meio de transformao. Coloque de novo o tubo no gelo. Repita o procedimento com o tubo marcado pGLO utilizando uma nova ansa estril. 5) Insira uma nova ansa estril no tubo contendo soluo stock de ADN plasmdico pGLO. Retire a ansa cheia de soluo plasmdica, insira-a no tubo eppendorf rotulado +pGLO e rode lentamente a ansa no fundo do tubo de forma a misturar o plasmdio com as clulas. 6) Incube os tubos rotulados +pGLO e pGLO no gelo durante 10 min. Durante esta fase o ADN plasmdico vai ligar-se a protenas de transformao presentes na superfcie das clulas competentes com ajuda do CaCl2 que vai atenuar a natural repulso electrosttica existente entre o ADN e molculas existentes na superfcie celular contendo carga negativa (ex. LPS). 7) Marque as caixas de Petri contendo as diversas verses de meio de Luria slido (ML). Para cada experincia dever marcar: a) Uma caixa de ML com pGLO b) Uma caixa de ML com ampicilina com +pGLO e uma outra com pGLO. c) Uma caixa de ML com ampicilina e arabinose (ara) com +pGLO. 8) Transfira os suportes com os tubos do gelo para o banho de gua a 42oC e incube durante exactamente 50 segundos. Imediatamente, transfira de novo os tubos para o gelo e incube durante mais 2 minutos. Durante este perodo ocorre o choque trmico essencial para que a clula internalize o plasmdio. 9) Retire o suporte contendo os tubos do gelo e coloque-o na bancada. Adicione a cada tubo, com a ajuda de uma nova pipeta Pasteur estril, 250 l de meio L lquido. Feche os tubos e incube os tubos durante 10 min. temperatura ambiente. 10) Agite levemente os tubos com os seus dedos e, com uma nova pipeta Pasteur estril, transfira 100 l das suspenses para cada uma das placas de Petri contendo os diferentes ML slidos que previamente rotulou. Dever transferir 100 l de suspenso de -pGLO para as duas placas rotuladas com pGLO (ML e ML com ampicilina) e 100 l de suspenso de +pGLO para as duas placas rotuladas com +pGLO ((ML com ampicilina e ML com ampicilina e arabinose). 11) Espalhe as suspenses bacterianas por toda a rea do meio de cultura utilizando para o efeito uma nova ansa estril. 12) Incube as placas a 37oC at ao dia seguinte.

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Clculo da eficincia de transformao Exemplo: Concentrao do stock de ADN plasmdico Volume de soluo de plasmdio utilizado na transformao Volume de soluo de transformao Volume de meio L Volume inoculado Volume total

0.03g/l 10 l (0.3 g) 250 l 250 l 100 l 510 l

N de transformantes obtidos numa hipottica experincia 190 colnias Eficincia de transformao = n de transformantes por g ADN plasmdico = 190 (colnias) x 5 (factor de diluio) x 1/0.3 (g de ADN plasmdico) = 3166 3,2 x 103 transformantes / g de ADN plasmdico 4.3 Resultados e discusso 4.3.1- Observe as 4 caixas e anote: 1) Se houve ou no crescimento Tubo Meio Sim +pGLO LB/amp +pGLO LB/amp/ara -pGLO LB/amp -pGLO LB

No

O que deveria observar Nestas caixas devem crescer mltiplas colnias No deve haver crescimento Deve formar-se um tapete de colnias

2) Cor das bactrias Tubo Meio +pGLO LB/amp +pGLO LB/amp/ara -pGLO LB

Luz natural Luz UV

O que deveria observar Colnias brancas na luz natural Colnias verde fluorescente nos UV Colnias brancas na luz natural

3) Contar o n de colnias em cada caixa de Petri Tubo Meio Colnias O que deveria observar +pGLO LB/amp Deve haver aproximadamente +pGLO LB/amp/ara 75-300 Colnias -pGLO LB No se conseguem contar as colnias

4.3.2 - Calcule a eficincia de transformao. 4.3.3 - Discuta os resultados obtidos e apresente as suas concluses.

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CAPTULO 5 Estudo da susceptibilidade bacteriana aos antibiticos

5.1 - Introduo
5.1.1 - Algumas definies Anti-spticos Substncias qumicas com propriedades antimicrobianas com mecanismos de aco inespecficos e que podem ser utilizadas sobre os tecidos vivos (pele e membranas mucosas). Desinfectantes Substncias qumicas com propriedades antimicrobianas utilizadas sobre materiais inertes, normalmente txicas para a pele e membranas mucosas. Compostos antimicrobianos Substncias de origem natural, sinttica, ou semi-sinttica, que destroem ou inibem os microrganismos exercendo a sua aco a nvel molecular, num processo metablico ou numa estrutura celular concreta dos microrganismos. Durante muito tempo foram denominados antibiticos todos os compostos antimicrobianos produzidos por microrganismos, fungos (Penicillium, Cephalospurium) ou bactrias (Bacillus ou Streptomyces), que inibiam o crescimento ou destruiam outros microrganismos. Esta definio hoje muito restritiva e deve ser abandonada porque as molculas obtidas por sntese, ou por modificao qumica de uma molcula natural, podem originar as mesmas propriedades. Um antibitico actualmente definido como uma substncia de origem biolgica ou sinttica que actua especificamente sobre uma etapa essencial do metabolismo das bactrias (agentes antibacterianos que podem ser classificados de acordo com a sua estrutura qumica ou modo de aco sobre as bactrias) ou dos fungos (agentes antifngicos). Esta definio abrange todos os compostos antimicrobianos com excepo dos anti-spticos e desinfectantes, qualquer que seja a sua origem. Os antibiticos so utilizados na teraputica de numerosas doenas infecciosas, da serem tambm designados por agentes quimioteraputicos antimicrobianos. O espectro de aco antimicrobiano dos antibiticos o seu grau de eficcia antimicrobiana. No caso de antibiticos de largo espectro significa que so activos contra um grande nmero de bactrias Gram (+) e Gram (-). Os de baixo espectro so activos unicamente contra certas bactrias Gram (+) ou Gram (-)

5.1.2 - Mecanismos de aco dos antibiticos Os antibiticos actuam em geral (com excepo das polimixinas) sobre uma etapa essencial do metabolismo bacteriano, principalmente sobre as reaces de sntese de: Protenas (ex. tetraciclina) Peptidoglicano (ex. ampicilina) cidos nucleicos (ex. rifampicina) Folatos (ex. sulfonamidas)

5.1.3 - Estudo da actividade de um antibitico in vitro As definies de efeito bacteriosttico e de efeito bactericida de um antibitico baseiam-se em estudos experimentais. Coloca-se a bactria em contacto com o antimicrobiano e estuda-se a sua sobrevivncia em funo do tempo, fazendo variar a concentrao de antibitico (Fig. 5.1). Efeito bacteriosttico de um antibitico - Para baixas concentraes de antibitico observa-se uma diminuio do crescimento bacteriano; no entanto o nmero final de bactrias igual ou superior ao nmero inicial. Este efeito resulta de um retardamento do tempo de diviso da bactria. Existe um equilbrio entre o crescimento normal e a destruio das bactrias. Os antibiticos bacteriostticos

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induzem bloqueios reversveis da sntese proteica dos microrganismos. Este fenmeno impede a proliferao das bactrias no organismo e este depois encarrega-se de eliminar as bactrias por intermdio de mecanismos imunolgicos. Exemplos: - Tetraciclinas - Cloranfenicol - Macrlidos (ex. eritromicina) - Rifamicinas Efeito bactericida de um antibitico Verifica-se ao longo do tempo uma reduo do nmero de microrganismos que ser tanto mais marcada quanto maior for a concentrao do antibitico. Os antibiticos bactericidas podem inibir a sntese proteica dos microrganismos, ou podem destruir a membrana citoplasmtica provocando leses profundas e irreversveis nas clulas bacterianas. Exemplos: - Penicilinas e cefalosporinas - Aminoglicosidos (ex. gentamicina) - Polimixinas Por vezes a aco antimicrobiana parcial e depois de uma diminuio precoce do nmero de bactrias observa-se crescimento bacteriano. Este fenmeno pode ser devido a uma instabilidade do antibitico in vitro, a uma heterogeneidade da populao bacteriana, que pode comportar um nmero de bactrias genotipicamente mais resistentes que a maioria da populao, ou ainda, devido a uma induo da produo de enzimas que conferem resistncia ao antibitico.

Figura 5.1 Efeito de um antibitico no crescimento bacteriano.

A aco de um antimicrobiano sobre uma estirpe bacteriana pode ser caracterizada por dois parmetros: CMI (Concentrao Mnima Inibitria) A mais baixa concentrao de antibitico que inibe a multiplicao das bactrias (bacteriostase), em 18-24h. A CMI exprime-se em g/ml.

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 CMB (Concentrao Mnima Bactericida) A mais baixa concentrao de antibitico capaz de matar, aps 18 horas de contacto a 37C, uma populao bacteriana. A CMB exprime-se em g/ml. Se a CMB de um antibitico sobre uma estirpe bacteriana prxima da CMI (CMB/CMI = 1 ou 2), o antibitico considerado bactericida. Se a CMB de um antibitico muito elevada em relao CMI (CMB/CMI = 4 a 16), o antibitico considerado bacteriosttico. 5.1.4 - Mtodos de determinao da susceptibilidade bacteriana aos antibiticos o antibiograma O estudo do comportamento de uma bactria face aos antibiticos, pelo crescimento de uma populao bacteriana em presena de gradientes de concentrao de diferentes de antibiticos, permite determinar a sua sensibilidade ou resistncia a esses antibiticos. Este teste designa-se por antibiograma. Para realizar um antibiograma podem usar-se os seguintes mtodos: 1) Mtodos de diluio (em meio de cultura lquido ou slido) So mtodos quantitativos, considerados de referncia, para determinar a sensibilidade das bactrias aos antibiticos. Baseiam-se no emprego de diluies progressivas do antimicrobiano, que adicionado ao meio de cultura onde se ir inocular a bactria a estudar. Podem realizar-se em meio lquido ou slido. Estes mtodos permitem determinar a CMI e a CMB. 2) Mtodos de difuso (em meio slido) - O mtodo de difuso em agar uma prova qualitativa adequada para estudar a sensibilidade das bactrias de crescimento rpido. No adequada para as bactrias de crescimento lento e baterias anaerbias, nem para os antibiticos que difundem com dificuldade. uma tcnica sensvel e flexvel no que diz respeito s substncias que podem ser estudadas. Permite classificar o microrganismo em sensvel, intermdio ou resistente. 5.1.5 - Tcnicas de determinao da CMI de um antibitico Mtodo de diluio em meio lquido: 1) Colocar em tubos de ensaio, concentraes crescentes de antibitico. 2) Adicionar a cada um dos tubos uma cultura de bactrias em fase exponencial de crescimento diluda de forma a obter uma concentrao final de 106 cl./ml (0.5 ml de suspenso aps 18 horas de incubao). 3) Incubar durante 18 horas, ao fim das quais se verifica qual a concentrao de antibitico que inibe a multiplicao bacteriana visvel. Mtodo de diluio em meio slido (Fig. 5.2): 1) Incorporar no meio de Mueller-Hinton concentraes crescentes de antibitico. 2) Deixar secar e semear uma cultura de bactrias em fase exponencial de crescimento, diluda de forma a obter uma concentrao final de 106 cl./ml. 3) Incubar durante 18 horas, ao fim das quais se observa qual a concentrao antibitica que inibe a multiplicao bacteriana visvel. Este mtodo tem a vantagem de possibilitar o estudo de um grande nmero de espcies bacterianas em simultneo. Mtodo de difuso em gelose ou mtodo dos discos (Fig. 5.2): Nesta tcnica, discos de papel impregnados com uma quantidade definida de antibitico so dispostos superfcie de um meio gelosado de Mueller-Hinton previamente semeado por zaragatoa ou por inundao com uma suspenso de bactrias em fase exponencial de crescimento. A partir do disco, o antibitico difunde na gelose. Aps a incubao do meio de cultura 18h a 37C, verifica-se que cada disco est envolvido por uma zona de inibio.

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A sensibilidade ou a resistncia de cada estirpe bacteriana deduzida a partir de um parmetro da multiplicao bacteriana: o dimetro da zona de inibio volta dos discos de antibiticos. Um bom antibiograma dever, volta de cada disco, ter um halo bem definido, no qual se pode medir rigorosamente o dimetro.

Figura 5.2 Representao esquemtica da determinao da CMI de um antibitico por um mtodo de difuso. Para cada antibitico, mede-se o dimetro de inibio do crescimento bacteriano e deduz-se o valor (aproximado) da CMI do agente antimicrobiano em funo da espcie estudada (Fig.5.3). Com efeito, para um determinado antibitico, existe uma relao entre o valor do dimetro de inibio de crescimento e o da CMI. Este estabelecido por estudos comparativos previamente estabelecidos sobre um grande nmero de espcies bacterianas.

Figura 5.3 - Relao entre a CMI e os dimetros dos halos de de inibio.

Hoje em dia, o mtodo dos discos o mais utilizado e o mais rigoroso se forem respeitados trs parmetros:

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1) Meio de cultura O meio de cultura a utilizar deve ter de espessura 4 mm e de dimetro 9 cm. O pH deve ser igual a 7.3. Geralmente usa-se o meio de Mueller-Hinton que apresenta as seguintes vantagens: No antagonista dos principais agentes antibacterianos. No sujeito a grandes variaes de pH. aproximadamente isotnico com o sangue, podendo ser adicionado de 5% de sangue para bactrias mais exigentes. 2) Densidade do inculo O inoculo tem de ser estandardizado pois uma m estandardizao deste leva a uma grande variabilidade dos dimetros das zonas de inibio. O inoculo estandardizado com base na escala de McFarland: 0.5 para as enterobactrias 1.0 para os estafilococos A escala de McFarland (que est compreendida entre 0 e 5 unidades) efectuada com cloreto de brio e mede o grau de turvao da suspenso bacteriana. Se a concentrao do inculo for elevada a sementeira muito densa, no se destinguem as colnias - m difuso do antibitico. Se a concentrao do inculo for baixa as colnias surgem muito dispersas - o antibitico difunde-se demasiadamente bem aparecendo uma zona de actuao muito grande que falsa. Se a concentrao do inculo for ideal todas as colnias so visveis apesar de juntas - neste caso a difuso correcta e o disco fica envolvido por uma zona bem definida. 3) Concentrao de antibitico A concentrao de antibitico deve ser sempre a mesma para que possam ser usadas as tabelas de resultados. A conservao deve ser feita no frigorfico e o controlo de qualidade, realizado com estirpes padro E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. Causas de erro mais comuns: 1 -Alterao dos discos por conservao no adequada. Pode verificar-se um decrscimo das zonas de inibio para estirpes de controlo. 2 -Inoculo demasiado concentrado ou diludo, originando assim, diminuio ou aumento das zonas de inibio. 3 - Variao ou contaminao da estirpe bacteriana. 4 - Leitura incorrecta dos dimetros dos halos de inibio.
5 - Transcrio errada dos resultados.

Tcnica de Kirby-Bauer de execuo de um antibiograma (Adaptada pela FDA e aconselhada pela OMS) Meio de cultura O meio de cultura a utilizar agar Mueller-Hinton. O pH do meio deve ser entre 7.2 e 7.4, verificado sempre para cada lote do meio. Nas placas, o meio deve ter uma superfcie plana e uma altura uniforme de 4mm aproximadamente. As placas de meio devem ser conservadas no frigorfico. Quando vo ser inoculadas as placas no devem apresentar gotas de gua superfcie do meio nem na tampa, para o que so postas a secar na estufa a 35 - 37C, geralmente 15 a 30 minutos.

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Preparao do inculo A partir de uma cultura pura do microrganismo em estudo, em fase exponencial de crescimento, escolhem-se 4 ou 5 colnias isoladas, morfologicamente semelhantes com que se prepara uma suspenso em 5 ml de caldo nutritivo. Incubar 2 a 4h a 35 - 37 C at obter turvao compatvel unidade 0.5 da escala de McFarland. Diluir em seguida com soro fisiolgico do seguinte modo: Staphylococcus - 1 : 2 Enterobacteriaceae - 1 : 5 Inoculao das placas Com uma zaragatoa previamente mergulhada na suspenso bacteriana, tendo tido o cuidado de a apertar e rolar contra as paredes do tubo para expelir o lquido em excesso, semeiam-se por estrias apertadas as placas de agar Mueller-Hinton em duas direces ou mais, por toda a superfcie do meio e passando no final a zaragatoa a toda a volta da placa. Deixa-se secar o inculo durante 5 a 10 minutos. Aplicao dos discos de antibiticos Os discos devem ser conservados no frigorfico em embalagens bem fechadas. Estas devem ser retiradas do frigorfico e aguardar temperatura ambiente 1 a 2 horas, de tal modo que quando seja necessrio abri-las, os discos j tenham atingido a temperatura ambiente. Os discos so aplicados sobre a superfcie do meio inoculado com um distribuidor mecnico ou com uma pina, tendo o cuidado de exercer sobre cada um deles uma ligeira presso para assegurar um perfeito contacto com o meio. Deixar pr-difundir durante cerca de 15 minutos. Os discos devem ser colocados a mais de 15 mm do bordo da placa e distanciados uns dos outros de modo a evitar sobreposio das zonas de inibio. Colocar as placas a 37 C. Leitura dos resultados Aps 16 - 18 horas de incubao a 37 C, medem-se os dimetros das zonas de inibio, com a ajuda de uma rgua, craveira ou compasso. Deve observar-se a placa fechada invertida debaixo de luz reflectida sob um fundo negro. De acordo com a inibio de crescimento observada, a bactrias classificada como Sensvel, Intermdia ou Resistente, de acordo com tabelas publicadas.

5.1.6 - Tcnicas de determinao da CMB de um antibitico Mtodo de diluio em meio lquido (Fig. 5.4): 1) Colocar em tubos de ensaio, concentraes crescentes de antibitico. 2) Adicionar a cada um dos tubos uma cultura de bactrias em fase exponencial de crescimento diluda de forma a obter uma concentrao final de 106 cl./ml (0.5 ml de suspenso aps 18 horas de incubao). 3) Incubar durante 18 horas, ao fim das quais se verifica qual a concentrao de antibitico que inibe a multiplicao bacteriana visvel. 4) Fazer uma sementeira em gelose nutritiva do 1 tubo contendo antibitico em que no se verifica, a olho n, crescimento bacteriano. 5) Incubar 18h/37 C e verificar se h crescimento ou no. 6) Caso haja crescimento, deve-se fazer o mesmo teste no tubo de concentrao imediatamente a seguir, e assim sucessivamente, at encontrar o tubo para o qual no h crescimento em sementeira. Essa a concentrao que d a CMB.

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Figura 5.4- Representao esquemtica da determinao da CMB de um antibitico pelo mtodo de diluio em meio lquido.

5.2 - Protocolos experimentais Pretende-se que os alunos executem um antibiograma utilizando uma tcnica habitual em laboratrios de Microbiologia Clnica. Ser tambm sumariamente estudado o efeito de dois desinfectantes comuns (lixvia e desinfectante para bancadas utilizado diariamente pelos alunos) sobre duas espcies bacterianas. 1) Execuo de antibiograma segundo a tcnica de Kirby-Bauer: A partir de culturas em fase exponencial de crescimento preparar suspenses em SF ou ADE de: Escherichia coli (0.5 na escala de McFarland) Staphylococcus aureus (1 na escala de McFarland) Pseudomonas aeruginosa (1 na escala de McFarland) Embeber uma zaragatoa na suspenso de bacteriana e inocular uma placa de meio de Mueller-Hinton por estrias apertadas (em duas direces, ou mais) por toda a superfcie do meio. Deixar secar 2ou 3 minutos ao bico de Bunsen (5-10 min.)

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 Colocar em cada placa um mximo de sete discos dos antibiticos com uma pina ou um aplicador mecnico. Deixar difundir 10-15 min. Incubar as placas a 37C durante 24 horas. Medir o dimetro do halo de inibio de crescimento existente ao redor de cada antibitico utilizando uma rgua. Exemplos de antibiticos a utilizar: Escherichia coli: AMC, NET, NA,CXM, AMX, NOR, SXT, CPX,GM, FStaphylococcus aureus: P, KN, GM, E, NET, AMX, AMC, TRT, F, VNPseudomonas aeruginosa: TIC, PIP, IMI, CAZ, TBR, GM, NET, CL, CPXAcrnimos dos antibiticos: OFX - ofloxacina E - eritromicina NOR - norfloxacina CXM - cefuroxima AMX - amoxicilina P - penicilina G NA - c. nalidxico SXT - trimetroprim-sulfametoxazole CAZ - cefatazidima NET - netilmicina AM - ampicilina GM - gentamicina AMC - augmentin (amoxacilina + c. clavulnico) F- Furandantina (nitrofurantona)

2) Estudo do efeito de uma soluo de desinfectante para bancadas e do hipoclorito de sdio sobre duas espcies bacterianas Colocar 5 ml de desinfectante em dois tubos estreis Adicionar a um dos tubos 500 l de suspenso de P. aeruginosa Adicionar ao segundo tubo 500 l de suspenso de S. aureus Marcar em cada tubo o nome do desinfectante e o nome da espcie bacteriana utilizada Em intervalos de 5 minutos, aos 5, 10,e 15 minutos, transferir 100 l para placas de gelose tripticase-soja (gelose simples) e inocular por espalhamento Incubar 24h/37C. Verificar se houve ou no crescimento bacteriano nas placas contendo os desinfectantes.

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5.3 Resultados e discusso 5.3.1 - Anote o dimetro dos halos de inibio obtidos para Escherichia coli e o resultado final (Sensvel S;Intermdio I; Resistente R) AMCNET NA CXM AMX NOR SXT CPXGMF-

5.3.2 - Anote o dimetro dos halos de inibio obtidos para o Staphylococcus aureus e o resultado final (Sensvel S;Intermdio I; Resistente R) P KNGM ENET AMX AMC TRTFVN-

5.3.3 - Anote o dimetro dos halos de inibio obtidos para a Pseudomonas aeruginosa e o resultado final (Sensvel S;Intermdio I; Resistente R) TICPIPIMICAZTBRGMNETCLCPX-

40

CAPTULO 6 Estudo morfolgico e bioqumico de fungos unicelulares e filamentosos 6.1 - Introduo 6.1.1 - Generalidades As infeces causadas pelos fungos so denominadas micoses. Apenas uma pequena minoria das cerca de 100000 espcies de fungos existentes so patognicas para os seres humanos. Apesar de no serem to predominantes como as infeces bacterianas ou virais, a incidncia das micoses superficiais e sistmicas tem crescido recentemente. Factores iatrognicos, tais como tratamentos com frmacos imunosupressores em transplantados e doentes com cancro, a nutrio parental, o aumento do nmero de indivduos com SIDA, e o uso indiscriminado de antibiticos, tm sido responsabilizados por este aumento do nmero de casos. Com poucas excepes, os fungos associados com doenas em seres humanos so membros saprofticos das comunidades microbianas encontradas nos solos. Outras espcies so comensais na pele humana, intestino e mucosas que em determinadas condies (ex. imunodeficincias) assumem o carcter patognico. A clula fngica Um fungo um eucariota definido pela ausncia de organizao tecidular e de clorofila. A clula fungica frequentemente limitada por uma parede rgida de natureza celulsica ou quitinosa. A maior parte dos fungos de importncia mdica apresenta um de dois tipos de morfologia celular. As formas celulares esferoidais ou ovais so tpicas de leveduras (fungos leveduriformes) e possuem o dimetro de 5 a 25 m. As clulas tubulares ou filamentosas so caractersticas das hifas, que constituem os fungos filamentosos (ou bolores). Uma nica clula pode possuir o comprimento de 5 a 50 m por 2 a 5 m de dimetro. As leveduras aparecem isoladas ou em grupos de duas a trs clulas, com uma delas distintamente maior do que as outras. As clulas das hifas podem ou no ser compartimentadas por meio de estruturas semelhantes a paredes cruzadas denominadas septos. Um conjunto de hifas forma um miclio. Alguns fungos so dimrficos, ou seja, podem proliferar como leveduras ou como bolores. Todos os fungos dimrficos so patognicos para o homem, apresentando a forma de levedura no interior do nosso organismo e a forma filamentosa no exterior (no meio ambiente). Reproduo dos fungos Os fungos podem reproduzir-se sexuada ou assexuadamente. Reproduo assexuada: Por diviso binria (por fisso) Por diviso binria (por gemulao) Por produo de esporos assexuados. Exemplos de esporos assexuados: Artrosporos obtidos por fragmentao da hifa formando clulas que se comportam como esporos. Clamidosporos - Esporos rodeados por uma parede grossa antes da fragmentao. So esporos de resistncia. Esporangiosporos - Esporos que se desenvolvem em estruturas especficas na extremidade das hifas (esporngios). Conidiosporos - Esporos produzidos nas extremidades das hifas (conidiforos). Blastosporos - Esporos produzidos por gemulao de uma clula no vegetativa. Reproduo sexuada:

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Envolve a unio de ncleos compatveis e pode envolver tambm a formao de esporos sexuados: zigosporos, ascosporos, basidiosporos. Leveduras As leveduras so fungos unicelulares, redondos ou ovais, de parede fina ou espessa. So normalmente 5 a 10 vezes maiores do que as bactrias. Multiplicam-se normalmente por fisso binria (reproduo assexuada); quando as leveduras se multiplicam sexuadamente produzem vrios tipos de esporos que podem ser teis na sua identificao. As suas actividades metablicas tambm so utilizadas para classificao da espcie e do gnero. O isolamento de leveduras feito em meio de Sabouraud com ou sem adio de antibiticos antibacterianos (ex. cloranfenicol). A adio de antibiticos antibacterianos pode ser fundamental para o isolamento de espcies de crescimento lento. O meio de Sabouraud um meio selectivo que contm 4% de glucose (os fungos toleram presses osmticas elevadas), e um valor de pH baixo (5.2), o que vai inibir o crescimento de outros microrganismos (bactrias). As colnias de leveduras so semelhantes s colnias bacterianas. Tm uma consistncia cremosa e crescimento rpido, em 2 a 4 dias. Bolores (fungos filamentosos) Microscopicamente, os filamentos ou hifas so tubos curvados ou sinuosos, limitados por uma parede. Apresentam ramificaes e mais correntemente septos transversais. Um conjunto de filamentos denominado miclio (ou talo). O isolamento de fungos filamentosos tambm realizado em Meio de Sabouraud (ou meio anlogo), sendo o crescimento lento, de dias a semanas. As colnias filamentosas de crescimento centrfugo apresentam-se quer como bolores com filamentos areos enredados, mais ou menos longos, quer sob a forma de uma camada compacta imberbe ou recoberta com uma penugem de filamentos. As hifas podem ser rizoidais, ou seja, encontrar-se dentro de meio de cultura (ou por ex. no solo). 6.1.2 - Estudo do gnero Candida Candida albicans Candida glabrata (torulopsis glabrata) Candida tropicalis Candida guilhermondii cndida parapsilosis

a) Isolamento: meio de Sabouraud b) Taxa de crescimento: crescimento rpido (1-3 dias) c) Aspecto macroscpico: colnias cremosas, branco porcelana d) Aspecto microscpico: formas redondas ou ovais, algumas em diviso, ausncia de cpsula, algumas so filamentadas (Fig. 6.1).

Figura 6.1 - Aspecto microscpico da morfologia de Candida albicans

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Procedimentos para a identificao de leveduras: 1) Prova da blastse S a Candida albicans capaz de produzir tubos germinativos no soro humano fresco num perodo de trs horas. Os tubos germinativos so o incio de hifas verdadeiras e aparecem como filamentos que no esto constritos ao ponto de origem da clula me. Prova da blastese positiva Candida albicans Prova da blastese negativa posterior identificao Tcnica: a) Execuo de uma suspenso em tubo contendo soro humano com 3 ou 4 colnias. b) Incubao 3 horas/37C. c) Leitura por observao microscpica dos tubos germinativos (Fig. 6.2).

Figura 6.2 - Aspecto microscpico de tubos germinativos (Candida albicans)

2) Testes de assimilao de acares So testes de identificao bioqumica de leveduras que se baseiam na sua capacidade de utilizao por via aerbia ou fermentativa de acares. Auxonograma - Capacidade da levedura utilizar os acares na presena de oxignio (respirao aerbia). Zimograma - Capacidade da levedura utilizar os acares na ausncia de oxignio (fermentao). Hoje em dia a maior parte dos laboratrios usam sistemas automatizados, vendidos comercialmente, para executar os testes de assimilao dos acares e outros testes de identificao bioqumica de leveduras. Os mais correntemente usados so: API 20C (bioMrieux) e Minitek (BBL). 6.1.3 Estudo do gnero Aspergillus Aspergillus flavus Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Aspergillus versicolor Aspergillus candidum

a) Isolamento: meio de Sabouraud/malt agar/PDA

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b) Taxa de crescimento: crescimento geralmente rpido (3 dias), no entanto algumas espcies so mais lentas (semanas). c) Aspecto macroscpico: a superfcie inicialmente branca e com o tempo fica amarelada, verde, castanha ou preta, dependendo da espcie. A textura aveludada. O reverso branco, dourado ou castanho. d) Aspecto microscpico: As hifas so septadas (2.5-8.0 m de dimetro) e contm as cabeas aspergilares que so as vesculas na extremidade dos conidiforos que do origem aos esporos externos alongados (filides), que por sua vez do origem aos condios (Fig. 6.3).

Figura 6.3 - Aspecto microscpico das estruturas de frutificao de Aspergillus spp.

e) Patogenicidade: Os membros deste gnero causam um grupo de doenas conhecido como aspergiloses. A doena pode aparecer na sua forma invasiva (micose sistmica), como toxicose ou ainda como alergia. As espcies deste gnero so patognicas oportunistas, originando infeces em indivduos com baixa resistncia devido a tratamentos imunosupressores ou por serem portadores de imunodeficincia (ex. SIDA). Os fungos do gnero Aspergillus esto espalhados no meio ambiente e so frequentemente encontrados como contaminantes de culturas. 6.1.4 - Estudo do gnero Penicillium Penicillium notatum a) Isolamento: meio de Sabouraud b) Taxa de crescimento: crescimento geralmente rpido (24-48h). c) Aspecto macroscpico: As colnias apresentam cor branca ou creme com o reverso castanho. d) Aspecto microscpico: semelhante ao do Aspergillus, diferenciando-se pela observao da estrutura de frutificao em forma de pincel, formadas por artigos micelianos digitiformes denominados metulas, que do as filides (forma de garrafa) que por sua vez do origem aos condios.

Figura 6.4 - Aspecto microscpico das estruturas de frutificao de Penicillium spp.

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6.2 - Protocolos experimentais Cultura 1) Inocular o meio de Sabouraud pelo mtodo de estrias, dividindo a placa em trs partes. Em cada parcela inocular: Candida albicans Candida tropicalis Geotrichum sp. 2) Incubar 24 - 48 h/37C. Prova da blastse 1) Executar a prova da blastse, com colnias de Candida albicans e de Candida tropicalis: Em 2 tubos com soro humano fresco, suspender 3 - 4 colnias Incubar 3 h/37C Ler da prova da blastse por observao microscpica. Exame a fresco e aps colorao 1) Executar o exame a fresco com azul de lactofenol a partir de: Colnias de Candida albicans Cultura de Aspergillus spp. e/ou Penicillium spp. 2) Executar a colorao de Gram, a partir do meio de Sabouraud de Candida spp. e Geotrichum sp.

Pesquisa de C. albicans na regio posterior da lngua: Colheita por intermdio de zaragatoa Inocular a zaragatoa (por estrias) no meio de Sabouraud Incubar 24 - 48 h/37C Observao da placa de Sabouraud

Execuo demonstrativa dos testes de assimilao de acares (API 20C), para: Candida tropicalis Geotrichum sp. 6.3 Resultados e discusso 6.3.1 Leveduras (anote os resultados): a) Observao macroscpica:

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b) Observao microscpica: Exame a fresco Colorao de Gram

(obj.40x)

(obj.100x)

c) Prova da blastse: Positiva Negativa -

(Obj.40x)

d) Interpretao da pesquisa de fungos da face interna da lngua:

e) Leitura do API 20C:

6.3.2 Fungos filamentosos: a) Observao macroscpica: Aspergillus ______________ Odor_________ Extenso do crescimento_________ Pigmentao do verso__________ Pigmentao do reverso__________ Presena de hifas areas_________ Penicillium ___________ odor______________ extenso do crescimento_______ pigmentao do verso_________ pigmentao do reverso_______ presena de hifas areas_______

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b) Observao microscpica: Estruturas de frutificao do Aspergillus _________

(Obj.40x) estruturas de frutificao do Penicillium ___________

(Obj.40x)

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CAPTULO 7 Estudo bioqumico e metablico de cocos de Gram positivo

7.1 - Introduo
7.1.1 - Generalidades Os cocos Gram positivos so espcies bacterianas constitudas por clulas de forma arredondada (cocos) e imveis. A famlia Micrococcaceae constituda por vrios gneros, sendo o gnero Staphylococcus o mais importante em termos clnicos. Dele fazem parte espcies como o S. aureus, que o membro mais importante, podendo ser isolado da pele e de vrias membranas mucosas do organismo. O S. aureus pode ser responsvel por vrias infeces como, pneumonia, intoxicao alimentar, sindroma do choque txico, endocardite e abcessos. O S. epidermidis faz parte da flora normal da pele, podendo ser patognico em situaes de compromisso imunolgico do hospedeiro. O S. saprophyticus, normalmente comensal, podendo no entanto ser responsvel por infeces do tracto urinrio em mulheres jovens. A famlia Streptococaceae constituda pelo gnero Streptococcus. Os estreptococos so classificados de acordo com a sua actividade hemoltica, propriedades imunolgicas (classificao serolgica de Lancefield), e resistncia a factores fsicos e qumicos. As espcies consideradas classicamente significativas em termos clnicos, so o S. pyogenes (agente etiolgico de faringite estreptoccica, escarlatina, febre reumtica e vrios tipos de infeces de pele), o S. agalactiae (meningite, sepsis puerperal) e o S. pneumoniae (pneumonia). Os Streptococcus do grupo D segundo a classificao de Lancefield (actualmente classificados como Enterococcus) so isolados como flora normal do tracto gastrointestinal. Os S. viridans fazem parte da flora oral normal assim como da flora do tracto gastrointestinal e urogenital. 7.1.2 - Famlia Micrococcaceae Gnero Staphylococcus Staphylococcus aureus Staphyloccus epidermidis Staphyloccus saprophyticus Caractersticas gerais: So cocos Gram positivos, imveis, anaerbios facultativos. Microscopicamente, aparecem agrupados caracteristicamente em cacho de uva. (grego staphyl - cacho de uvas) Algumas estirpes podem apresentar cpsula. Os membros deste gnero bacteriano fermentam a glucose e produzem catalase. As colnias em meio slido aparecem bem definidas, redondas, convexas. 7.1.3 - Famlia Streptococaceae Gnero Streptococcus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis

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Caractersticas gerais: So cocos Gram positivos, imveis e anaerbios aerotolerantes. Microscopicamente, ocorrem isoladamente, como diplococos, ou agrupados em cadeia, dependendo do meio ambiente. Algumas estirpes podem apresentar cpsula. No produzem catalase. So culturalmente exigentes - requerem gelose de sangue. Classificao: So classificados em 21 grupos (Grupos de Lancefield: A-U), distinguidos serologicamente por pequenas diferenas especficas dos carbohidratos da parede celular. Tambm podem ser classificados de acordo com o tipo de lise enzimtica dos glbulos vermelhos (hemlise), produzida em placas de gelose sangue: Alpha () - hemolticos - caracterizam-se por uma hemlise incompleta com difuso de pigmento verde volta da colnia. Beta () - hemolticos - caracterizam-se por hemlise completa, com libertao da hemoglobina e uma zona clara volta da colnia. Gama () - hemolticos - caracterizam-se pela ausncia de hemlise. Estreptococos do grupo A de Lancefield: A espcie prototpica o Streptococcus pyogenes. Possuem o carbohidrato especfico do grupo A e vrios antignios proteicos (antignio M, T e R) na sua parede celular. So sensveis bacitracina, um polipptido antibacteriano, em contraste com os outros estreptococos. Raramente se tornam resistentes penicilina. Produzem vrias enzimas e toxinas, como a estreptoquinase, hialuronidase, nucleases e toxina eritrognica. So - hemolticos produzindo duas hemolisinas: Estreptolisina S Estvel ao oxignio. Responsvel pela - hemlise em gelose sangue. Estreptolisina O Lbil ao oxignio. Tem propriedades imunognicas, induzindo a formao de anticorpos anti-estreptolisina, o que neutraliza o seu efeito. Esta aco pode ser medida no soro e denominada de Titulao de anticorpos anti-estreptolisina O (TASO). O TASO, um teste utilizado em rotina, quando se pretende diagnosticar uma infeco recente por estreptococos e evitar a possibilidade de complicaes ps-infeco estreptoccica, como a febre reumtica ou glomerulonefrite. Aps uma infeco devida a estreptococos do grupo A, os anticorpos anti-estreptolisina O comeam a aumentar ao fim de 2-3 semanas surgindo a mxima quantidade ao fim de 5-6 semanas. O ttulo de anticorpos anti-estreptolisina O medido em unidades Todd. Um ttulo superior a 200 unidades Todd sugere uma infeco recente por estreptococos do grupo A. Estreptococos do grupo D (Enterococcus): A espcie prottipo o Enterococcus faecalis. Ocorrem como parte da flora intestinal e oral normal, em humanos e animais. Produzem hemlise varivel mas a maioria e hemoltico. So caracterizados pela reactividade com o antisoro do grupo D So resistentes bacitracina Crescem em meios de cultura com 4% de blis ou a pH 9.6.

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7.1.4 - Testes microbiolgicos para a identificao de cocos Gram positivos

Tabela 1- Algumas caractersticas fenotpicas utilizadas para distinguir o S. aureus dos Streptococcus spp. S. aureus Caracterstica Streptococcus spp. Meio de manitol Cresce e fermenta No cresce e no fermenta (em geral) Catalase Produz No produz Tipo de hemlise , , ausncia Glucose Fermenta fermenta Pesquisa de catalase: Fundamento Em aerobiose, as bactrias utilizam normalmente o oxignio como aceitador terminal de electres pela via oxidativa directa (fosforilao oxidativa). Substrato Flavoprotenas H2O2 H2O As flavoprotenas so auto-oxidveis e os tomos de hidrognio libertados fixam-se directamente sobre o oxignio molecular (O2), levando formao de perxido de hidrognio (H2O2) ou do io superxido (O2-). Estes acumulam-se nas clulas, sendo letais para as bactrias se no forem imediatamente degradados pelas enzimas superxido dismutase e/ou catalase:
+

2 O2 + 2H

superxido dismutase O2 + H2O2

catalase ou peroxidase 2 H2O2 2 H2O + O2

As bactrias aerotolerantes tm a superxido dismutase mas no tm catalase, enquanto as bactrias facultativas tm ambas. Tcnica a) Colocar 2 gotas de H2O2 fresca numa caixa de Petri. b) Com uma pipeta Pasteur fechada retirar uma colnia de uma caixa de Petri e tocar na gua oxigenada. c) Observar ou no a produo de O2 (bolhas de gs). Leitura Catalase (+)- efervescncia (libertao de O2) Catalase (-)- no h efervescncia (no h libertao de O2) Interpretao Os estafilococos so catalase positivos enquanto que os estreptococos so catalase negativos.

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7.1.5 - Estudo microbiolgico do gnero Staphylococcus Isolamento: Meio de Cultura - Chapman Composio: Peptona (1%) Extracto de carne (0.1%) NaCl (7.5%) Manitol (1%) Agar (1.5%) Vermelho de fenol (0.0025%) O meio de Chapman tem um elevado contedo em NaCl, e contm ainda manitol e vermelho de fenol. Este meio permite o isolamento selectivo de estafilococos com base na sua tolerncia a um elevado teor em NaCl e na diferenciao da espcie de S. aureus, pela fermentao do manitol e consequente viragem do indicador de pH. Outras espcies como o Streptococcus do grupo D e Bacillus sp. podem desenvolver-se neste meio. No entanto o aspecto das colnias permite distingui-las facilmente. Tcnica: Sementeira - por estrias Incubao - 24h/37C Leitura e interpretao: - Os estafilococos potencialmente patognicos fermentam o manitol e acidificam o meio cuja cor vira para amarelo; S. aureus - manitol (+) - Os estafilococos no patognicos no modificam a cor do meio que permanece vermelha ou seja, no fermentam o manitol. S. epidermidis - manitol (-) Estudo do poder patognico: Pesquisa de estafilocoagulase Fundamento A coagulase um produto extracelular que tem a caracterstica nica de coagular vrios plasmas de mamferos. A coagulase reage com um factor plasmtico, formando a estafilotrombina que converte o fibrinognio em fibrina (que insolvel) e que cobre a clula, defendendo-a das defesas do hospedeiro. A determinao da actividade da coagulase utilizada para distinguir entre espcies patognicas e no patognicas embora ainda no esteja provado que haja correlao entre a coagulase e o poder patognico. Tcnica: a) Num tubo de hemlise colocar cerca de 500 l de plasma de coelho (ou humano) diludo a 1/5. b) Adicionar 500l de uma cultura de 24h.

51

c) Incubar os tubos 37C/24h. Leitura e Interpretao (Fig. 7.1): Figura 7.1 interpretao coagulase.
+4

- Leitura e do teste da

Negativo +1 +2

Positivos +3

Negativo Positivo +1 Positivo +2 Positivo +3 Positivo +4

No se forma fibrina Cogulos pequenos desorganizados Cogulos pequenos organizados Cogulos grandes organizados Todo o contedo coagula e no se solta quando o tubo invertido

a) Os estafilococos patognicos originam a coagulao do plasma num tempo que vai dos 30 minutos s 24 horas. b) As leituras devem ser efectuadas de hora a hora durante as primeiras 5 horas. Coagulase (+) - estafilococos patognicos (ex. S. aureus) Coagulase (-) - proceder pesquisa de DNase

Pesquisa de desoxirribonuclease (DNase) Fundamento Certas bactrias so capazes de hidrolisar o cido desoxirribonucleico, graas a uma enzima por elas produzida, a DNase. Aps cultura sobre gelose nutritiva contendo cido desoxiribonucleico, pesquisa-se a presena de ADN graas a um reagente revelador, o HCl ou azul de toluidina. Meio de cultura Composio: ADN (0.2%) Peptona (0.5%) Triptona (1.5%) Cloreto de sdio (0.5%) Agar (1.5%) Tcnica: a) Semear cada estirpe por estria espessa em caixas de meio slido contendo ADN (normalmente de esperma de salmo). b) Incubar 24h/37C.

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c) No dia seguinte revelar, inundando a superfcie do meio com uma soluo 1 N de HCl ou com uma soluo a 0.1% de azul de toluidina. d) Esperar 5 a 10 minutos. Leitura e Interpretao: Reaco DNase positiva: - revelao com HCl - zona transparente ao redor da estria, o resto da caixa fica opaco por precipitao do ADN contido no meio. - revelao com o azul de toluidina - zona rsea em torno da estria e todo o resto do meio azul, dado que o azul de toluidina tem afinidade para o ADN nele contido. Pesquisa de hemolisinas Fundamento As hemolisinas so exotoxinas que provocam a destruio dos glbulos vermelhos. Pode classificar-se o tipo de hemlise consoante o tipo de ataque que a bactria faz aos glbulos vermelhos. Tcnica: a) Inocular por estrias as estirpes a estudar em meio gelosado contendo 5% de sangue de carneiro. b) Incubar 24h/37C. Leitura e interpretao Para os estafilococos patognicos, observa-se hemlise ou seja, hemlise completa em que se forma uma zona mais clara volta da colnia. Este fenmeno deve-se a uma toxina (hemolisina) libertada pelas espcies patognicas de origem humana. 7.1.6 - Estudo microbiolgico do gnero Streptococcus Isolamento: Meios de cultura: - gelose sangue - meio nutritivo para o crescimento de estreptococos do grupo A Composio: Triptona (0.3%) Peptona (1%) Cloreto de sdio (0.5%) Sangue de carneiro (5%) Extracto de carne (1%) Amido (1%) Cloreto de sdio (5%) Agar (1.3%) - D-Coccosel - meio selectivo para Enterococcus Composio: Extracto de levedura (0.5%) Tripcase (1.7%) Peptona (0.3%) Blis (1%) Azida sdica (0.025)

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Esculina (0.1%) Citrato de sdio (0.1%) Cloreto de sdio (0.5%) Citrato de ferro amoniacal (0.05%) Agar (1.3%) A blis vai seleccionar os Enterococcus, que so os nicos a tolerar grandes concentraes em cidos biliares. A azida sdica tambm funciona como inibidor. A esculina vai ser hidrolisada pelos Enterococcus em glucose e esculatina, esculatina essa que vai reagir com o citrato de ferro presente no meio originando um complexo negro. Tcnica: Sementeira - por estrias Incubao - 24h/37C Leitura: S os enterococos se multiplicam neste meio, com o aparecimento de colnias pequenas, translcidas, com um halo negro. Pesquisa de hemolisinas: Fundamento As hemolisinas so exotoxinas, que provocam a destruio dos glbulos vermelhos do sangue, podendo classificar-se o tipo de hemlise consoante o tipo de ataque que a bactria faz aos glbulos vermelhos. Tcnica: a) Inocular as estirpes a estudar em gelose de sangue, pelo mtodo de estrias. b) Incubar 24h/37C. Leitura: - Hemlise (hemlise total): halo claro e transparente volta da colnia. - Hemlise (hemlise parcial): zona verde acastanhada volta da colnia. - Hemlise (ausncia de hemlise). Testes de sensibilidade aos antibiticos 1) Teste de sensibilidade bacitracina (B): Tcnica: a) Inocular uma placa de gelose sangue com estreptococos. b) Colocar um disco impregnado com bacitracina no centro. c) Incubar 24h/37C. Leitura: O aparecimento de uma zona de inibio volta do disco de bacitracina, quer dizer que a bactria lhe sensvel, permitindo desta forma identificar os estreptococos do grupo A. Todos os outros estreptococos so resistentes bacitracina (Tabela 2). 2) Teste de sensibilidade ao trimetoprim-sulfametoxazole (SXT): Tcnica: a) Inocular uma placa de gelose sangue com estreptococos.

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b) Colocar um disco impregnado com SXT no centro. c) Incubar 24h/37C. Leitura: S se verifica o aparecimento de uma zona de inibio volta do disco quando se trata de estreptococos do grupo C ou estreptococos viridans (Tabela 2). Testes de diferenciao para as espcies de estreptococos: Tabela 2- Testes de diferenciao diagnostica de Streptococcus spp. Grupos Hemlise Bacitracina SXT S R A (S. pyogenes) R R B (S. agalactiae) R S C (S. equi) R R D (E. faecalis) ou ausncia Viridans (S. salivarius, S. R S ou ausncia mutans) 7.2 - Protocolos experimentais Pretende-se que os alunos aprendam a isolar e identificar algumas bactrias Gram (+). 1) Dividir ao meio uma placa de meio de Chapman e inocular pelo mtodo de estrias as seguintes bactrias: Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis 2) Dividir ao meio uma placa de TSA e inocular pelo mtodo de estrias com as seguintes bactrias: Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis 3) Dividir em quatro uma placa de gelose de sangue e inocular pelo mtodo de estrias as seguintes bactrias: Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Enterococcus faecalis

4) Dividir ao meio uma placa meio de D-Coccosel, e inocular pelo mtodo de estrias as seguintes bactrias: Enterococcus faecalis Streptococcus pyogenes 5) Proceder colheita por intermdio de zaragatoa (previamente embebida em soro fisiolgico estril) da pele do antebrao e inocular uma placa de gelose de sangue ou manitol. 6) Incubar todos os meios de cultura a 24h a 37oC. No dia seguinte (segundo dia): 1) Ler e interpretar o crescimento no meio de Chapman.

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2) Proceder ao teste da catalase a partir de colnias de estafilococos (meio de Chapman) e estreptococos (D-Coccosel): colocar 2 gotas de H2O2 fresca numa caixa de Petri. com uma pipeta Pasteur fechada retirar uma colnia de uma caixa de Petri e tocar na gua oxigenada. observar ou no a produo de O2 (bolhas de gs). 3) Executar uma suspenso em gua destilada estril com colnias de S. aureus e a partir dela realizar o teste da coagulase: num tubo de hemlise colocar cerca de 500 l de plasma de coelho (ou humano) diludo a 1/5. adicionar 500l da suspenso incubar os tubos 37C/24h 4) A partir da suspenso anterior realizar tambm o teste da DNase: semear por estria espessa numa caixa de meio slido contendo ADN incubar 24h/37C 5) Ler e interpretar o crescimento em gelose sangue. 6) Ler e interpretar o crescimento no meio D-Coccosel. 7) Executar duas suspenses em gua destilada estril, uma com colnias de S. pyogenes e outra com colnias de E. faecalis. 8) A partir das suspenses anteriores realizar os testes de sensibilidade aos antibiticos (B e SXT): Dividir uma placa de gelose sangue ao meio e inocular cada metade, por estrias apertadas, com as suspenses anteriormente preparadas Colocar um disco impregnado com bacitracina e tambm um disco impregnado com SXT sobre cada metade Incubar 24h/37C 9) Executar a ttulo demonstrativo um teste rpido de assimilao de acares para identificao de espcie, para S. pyogenes e E. faecalis - API Strep. 10) De acordo com as tcnicas adquiridas, identifique a espcie de estafilococos isolado a partir da pele do antebrao (obviamente se tiver obtido crescimento). No dia seguinte (terceiro dia): 1) Leitura das provas de patogenicidade do S .aureus: Coagulase leitura directa DNase revelao pelo HCl (1N) 2) Leitura e interpretao dos testes de sensibilidade aos antibiticos (B e SXT). 3) Identificao de S. pyogenes e E. faecalis, por leitura do API Strep. 4) Observao dos resultados obtidos a partir da pele do antebrao.

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7.3 Resultados e discusso

7.3.1 Anote os resultados dos testes bioqumicos para o gnero Staphylococcus:

S. aureus Teste da Catalase Fermentao do manitol - hemlise Actividade da coagulase Actividade da DNase

S. epidermidis

____________ __________________ ____________ __________________ ____________ __________________ ____________ __________________ ____________ __________________

7.3.2 Anote os resultados dos testes de identificao para o gnero Streptococcus: S. pyogenes Teste da Catalase Padro de hemlise _____________ _____________ E. faecalis __________________

__________________ __________________

Crescimento em D-Coccosel _____________ Sensibilidade bacitracina Sensibilidade ao SXT

_____________ __________________ _____________ __________________

7.3.3 Anote o nome da espcie isolada a partir da pele do antebrao.

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CAPTULO 8 Estudo bioqumico e metablico de bacilos de Gram negativo

8.1 - Introduo
8.1.1 - Bacilos Gram (-) relacionados com o tracto entrico As bactrias pertencentes famlia Enterobactereaceae (genericamente designadas por enterobactrias) formam um grande grupo de bacilos Gram (-) encontrados principalmente no clon dos seres humanos e outros animais, sendo em muitos casos constituintes da flora normal. As enterobactrias so os principais anaerbios facultativos do intestino grosso. No entanto, encontram-se em nmero relativamente baixo quando comparados com as bactrias anaerbias estritas como por exemplo os Bacteroides sp. Outra famlia importante e com significado mdico, a Pseudomonadaceae. Os membros desta famlia so bacilos Gram negativos semelhantes s enterobactrias do ponto de vista morfolgico sendo, no entanto, aerbios estritos isto , obtm a sua energia apenas por oxidao dos acares no tendo a capacidade de os fermentar. O membro mais importante desta famlia a Pseudomonas aeruginosa cujo principal habitat o solo e gua podendo ainda encontrar-se como comensal do clon em cerca de 10% da populao. Dada a semelhana entre os bacilos Gram (-) das famlias Enterobactereaceae e Pseudomonadaceae, torna-se necessrio recorrer a testes bioqumicos, aps isolamento em meios de cultura selectivos, para proceder sua identificao. 8.1.2 - Meios de cultura selectivos Gelose de Drigalsky a) Composio peptona 1.5% extracto de carne 0.3% extracto de levedura 0.3% desoxicolato de sdio 0.1% tiossulfato de sdio 0.1% lactose 1.5% cristal violeta 0.0005% azul de bromotimol 0.008% agar 1.1% b) Sementeira: por estrias, para isolamento. c) Incubao: 37C/24h. d) Aspecto das colnias: colnias de aspecto varivel, incolores para espcies no fermentadoras de lactose; ou de cor amarela para espcies fermentadoras de lactose. Gelose de McConkey a) Composio: peptona 2 % lactose 1 % mistura de sais biliares 0.15 % cloreto de sdio 0.5 % vermelho neutro 0.003 % cristal violeta 0.0001 % agar 1.3 %

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b) Sementeira: por estrias, para isolamento. c) Incubao: 37C/24h d) Aspecto das colnias: colnias de aspecto varivel, incolores para espcies no fermentadoras de lactose; ou de cor vermelha com precipitado em redor para espcies fermentadoras de lactose. 8.1.3 - Testes bioqumicos para identificao de bacilos Gram (-) 1) Provas do metabolismo glucdico Fermentao de lactose Este teste realizado pela observao directa da alterao da cor dos meios selectivos que contm lactose e um indicador de pH. Pretende verificar-se se as bactrias metabolizam a lactose por via fermentativa. Tcnica: inoculao, por ex., de uma placa de gelose de Drigalsky, por estrias incubao a 37C/24h Leitura: lactose (+) - colnias amarelas lactose (-) - colnias incolores Pesquisa de -galactosidase Para que a degradao da lactose por uma bactria seja possvel necessrio, em primeiro lugar, que aquele dissacrido penetre na clula por aco de uma permease e que no seu interior exista outra enzima, a -galactosidase, que catalize a hidrlise da lactose em dois acares simples, a glucose e a galactose. A bactria catabolizar depois ambos os monossacridos pelas vias metablicas apropriadas, com produo de energia. Tanto a -galactosidase como a permease so enzimas produzidas pelo opero lactose. Todas as bactrias capazes de metabolizar a lactose tero o opero lactose funcional. Para espcies bacterianas classificadas como lactose negativas (ou seja, que aparentemente no fermentam a lactose) deve fazer-se a pesquisa directa da -galactosidase, uma vez que essas espcies bacterianas podem ser lactose tardias, ou seja, ter dificuldade em metabolizar a lactose, no devido ausncia do opero lactose, mas devido baixa produo da enzima permease. Neste teste, as bactrias previamente induzidas pela lactose (presente no meio selectivo) so lisadas com clorofrmio ou tolueno e os lisados (contendo ou no a -galactosidase) so colocados na presena de orto-nitrofenil--D galactopiransido (ONPG), um composto que tem uma estrutura anloga lactose e que hidrolizado pela -galactosidase em orto-nitrofenol e galactose. O orto-nitrofenol apresenta cor amarela que facilmente visualizada a olho n. Tcnica: a partir de colnias multiplicadas em meio selectivo (contendo lactose) fazer uma suspenso bacteriana em soro fisiolgico estril num tubo de hemlise adicionar uma gota de tolueno ou clorofrmio agitar (para auxiliar a lise das bactrias) colocar um disco de ONPG incubar a 37/24h Leitura: ONPG (+) - colorao amarela ONPG (-) - incolor

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Teste do vermelho de metilo (VM) Este teste usado para determinar se um microrganismo crescendo num meio peptonado, glucosado e tamponado (meio de Clark e Lubs) capaz de produzir cidos em quantidade suficiente para baixar o pH para valores abaixo de 4.4, revelado pela viragem do indicador de pH, vermelho de metilo, adicionado no fim do perodo de incubao. Se tal se verificar, significa que o microrganismo em questo fermentou a glucose por fermentao cida mista cujos produtos so uma mistura de cidos (cido frmico, actico, lctico, succnico). Tcnica: inocular o meio Clark e Lubs incubar a 37C/24h revelar com soluo alcolica de vermelho de metilo Leitura: VM (+) - meio vermelho VM (-) - meio da cor original (amarelo muito claro) Teste de Voges-Proskauer (VP) As bactrias fermentadoras de glucose podem faz-lo por fermentao cida mista ou, alternativamente, por fermentao butanodilica:

glucose + O2 2 piruvato -acetolactato + CO2 acetil-metil-carbinol (acetona) + CO2 2,3-butanodiol

possvel verificar se ocorre fermentao butanodilica pelo teste de VP em que a acetona feita reagir com o -naftol em meio alcalino formando-se a creatina que tem uma cor rosa/vermelho:

KOH 40% acetona + -naftol diacetil + creatina (colorao rosa/vermelho) etanol

Tcnica: inocular o meio Clark e Lubs incubar a 37C/24h revelar com as solues VP1 (KOH a 40%) e VP2 (-naftol a 6%)

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Leitura: VP (+) - meio rosa/vermelho VP (-) - meio da cor original (amarelo muito claro) Crescimento no meio de Hajna-Kligler-Rolland O meio de Hajna-Kligler-Rolland um meio complexo que permite estudar simultaneamente vrios aspectos da metabolizao da glucose e da lactose, facilitando a identificao de enterobactrias. Composio: extracto de carne 0.3 % extracto de levedura 0.3 % peptona 1.5 % lactose 1 % glucose 0.1 % sulfato ferroso 0.02 % cloreto de sdio 0.5 % tiosulfato de sdio 0.03 % vermelho de fenol 0.0024 % agar 1.2 % Tcnica: inoculao do meio por picada central no fundo do tubo, e por estrias na rampa incubao a 37C/24h Leitura do fundo: Fermentao de glucose - cor amarela Se a bactria fermentar a glucose os produtos de fermentao (cidos) acidificam o meio fazendo o indicador de pH (vermelho de fenol) virar para amarelo. Produo de gs (CO2 ou H2) - formao de bolhas ou fissuras na gelose A fermentao acompanhada de maior ou menor produo de gs que detectada pela formao de bolhas ou mesmo fissuras na gelose. Formao de H2S - cor negra O metabolismo de aminocidos contendo enxofre (cistena) origina a formao de gs sulfdrico (H2S). O meio de Kligler contm peptonas ricas em cistena e tiossulfato de sdio como substratos. As bactrias com capacidade de utilizar estes substratos iro faz-lo com produo de H2S que, ao reagir com sulfato ferroso, origina um precipitado negro insolvel (sulfureto ferroso). Leitura da rampa: Aps algumas horas, oxidao da glucose - cor amarela Aps 24h: Glucose (+); lactose (-) - A glucose esgota e a lactose no fermentada; a bactria recorre catabolizao de aminocidos com formao de produtos que alcalinizam o meio (ex. NH3) fazendo o indicador de pH virar para vermelho. ou Glucose (+); lactose (+) - A glucose esgota e a lactose fermentada; os produtos de fermentao acidificam o meio e o indicador de pH permanece amarelo

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2) Provas do metabolismo respiratrio Teste da oxidase Como j foi referido as espcies da famlia Enterobacteriaceae so aerbias anaerbias facultativas enquanto que as espcies da famlia Pseudomonadaceae so aerbias estritas. O teste da oxidase permite destinguir as duas famlias pela pesquisa da enzima citocromo oxidase do tipo aa3 que cataliza o ltimo passo da cadeia respiratria (as bactrias aerbias estritas so oxidase positivas; as bactrias aerbias anaerbias facultativas so oxidase negativas):

citocromo oxidase aa3 2 cit c reduzido +2H + 1/2 O2 2 cit c oxidado + H2O
+

O teste da oxidase realizado recorrendo ao composto tetrametil-p-fenilenodiamina que na presena da citocromo oxidase oxidado pelo citocromo c a um composto de cor prpura designado por azul de Wurster: citocromo oxidase 2 citocromo c oxidado + tetrametil-p-fenilenodiamina 2 citocromo c reduzido + tetrametil-p-fenilenodiamina oxidada (azul de Wurster)

Tcnica: com uma pipeta Pasteur fechada, colocar uma colnia sobre um disco do teste da oxidase previamente humedecido com gua destilada estril dentro de uma caixa de Petri vazia Leitura: oxidase (+) - coloraco prpura oxidase (-) - coloraco rosa Caso o teste da oxidase seja positivo, a bactria em estudo pertence famlia Pseudomonadaceae. Uma identificao complementar deve ser feita pela observao de pigmento de cor verde em placas de gelose simples, assim como pela deteco de um cheiro caracterstico a flores. A P. aeruginosa produz dois pigmentos, a piocianina (azul) e a pioverdina (verde). A tonalidade esverdeada das colnias deve-se difuso dos dois pigmentos na gelose. 3) Provas do metabolismo proteico Teste da urease Este teste realizado no meio ureia-indol (que contm ureia, L-triptofano, tampo fosfato, glucose e vermelho de fenol) e pesquisada a enzima urease, responsvel pela hidrlise da ureia (produto do metabolismo dos aminocidos) com obteno de amnia:

urease ureia + 2 H2O CO2 + H2O + 2NH3

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Dado que a amnia alcaliniza o meio, o indicador de pH nele contido (vermelho de fenol) vira para a cor alcalina (rosa cereja). Tcnica: Inocular o meio ureia-indol Incubar a 37C/24h Leitura: urease (+) - meio rosa cerise urease (-) - meio da cor original (amarelo) Pesquisa da triptofano-desaminase (TDA) Se a bactria em estudo possuir uma triptofano-desaminase ir desaminar o L-triptofano, presente no meio ureia-indol, originando cido indol-pirvico:

TDA L-triptofano cido indol-pirvico

A presena de cido indol-pirvico ser revelada por um reagente contendo percloreto de ferro em soluo cida (HCl) que origina um composto castanho. Tcnica: Inocular o meio ureia-indol Incubar a 37C/24h Revelar com o reagente de TDA Leitura: TDA (+) - meio castanho escuro TDA (-) - meio da cor anterior adio do reagente de TDA Determinao da produo de indol Algumas bactrias desaminam e hidrolizam o L-triptofano com obteno de indol e cido pirvico:

TDA L-triptofano cido indol-pirvico

hidrlise cido indol-pirvico indol + cido pirvico + amnia

A presena de indol ser neste teste revelada por adio do reagente de Kovacs (pdimetilaminobenzaldedo em soluo de HCl e lcool isoamlico) originando um composto de cor vermelho cereja, o corante de Rosindol, que fica na fase orgnica.

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Tcnica: Inocular o meio ureia-indol Incubar a 37C/24h Revelar com o reagente de Kovacs Leitura: indol (+) - anel vermelho superfcie do meio (fase orgnica) indol (-) - anel acastanhado superfcie do meio (fase orgnica) 4) Provas de utilizao substratos especficos Teste do citrato Este teste utilizado para definir se a bactria em estudo tem capacidade (por aco das enzimas citrato permease e citrase) para usar o citrato como nica fonte de carbono e energia, e um sal de amnia como fonte de azoto, contidos no meio de Citrato-Simmons (composio: dihidrogeno fosfato de amnia, fosfato dipotssio, cloreto de sdio, citrato de sdio, sulfato de magnsio, azul de bromotimol, agar). Se a bactria possuir as enzimas referidas: citrato permease citrato de sdio cido pirvico + cido oxaloactico + CO2 citrase

O dixido de carbono produzido forma carbonato de sdio (com o excesso de sdio proveniente do citrato de sdio) que por sua vez alcaliniza o meio de cultura fazendo virar o indicador de pH para azul:

CO2 + H2O + Na+ Na2CO3 (alcalino)

Tcnica: Inocular o meio de Citrato-Simmons, por estrias Incubar a 37C/24h Leitura: citrato (+) - meio azul citrato (-) - meio da cor original (verde) 8.1.4 - Sistemas automatizveis de identificao bacteriana: o sistema API 20E O API 20E um sistema estandardizado e comercializado (bioMerieux) para a identificao de Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram negativos de crescimento no fastidioso, sendo uma verso em miniatura dos procedimentos bioqumicos convencionais. um sistema de microtubos pronto a usar, em que se realizam simultaneamente vinte e dois testes bioqumicos standardizados utilizando como inculo suspenses em soluo salina (0.85%) de culturas bacterianas puras. O sistema constitudo por uma galeria contendo vinte cmaras, cada uma das quais constituda por um microtubo e uma cpula. Os microtubos contm os substratos das reaces bioqumicas na sua forma desidratada, sendo estes rehidratados pela adio da suspenso bacteriana salina.

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De forma a criar uma atmosfera de anaerobiose, fundamental para a realizao de reaces fermentativas, adicionado a alguns microtubos (enchimento da cpula), leo mineral ou parafina lquida. As galerias so incubadas 18-24h a 35-37C. A leitura dos testes bioqumicos da galeria feita pela observao da modificao da cor, aps os vrios sistemas indicadores terem sido afectados pelos metabolitos bacterianos ou pelos reagentes adicionados. A identificao de bactrias desconhecidas ento feita recorrendo a tabelas ou sistemas automatizados, fornecidos pela casa comercial. A lista completa de bactrias que possvel identificar atravs deste sistema, encontra-se no Anexo 2. Interpretao dos testes do sistema API 20E ONPG: A -galactosidase hidroliza o ONPG com libertao do ortonitrofenol (cor amarela). ADH: A arginina dihidrolase transforma a arginina em ornitina, amnia e dixido de carbono o que provoca um aumento de pH e o indicador vira de amarelo para vermelho. LDC: A lisina descarboxilase transforma a lisina numa amina primria, a cadaverina. Esta amina provoca um aumento de pH e consequente mudana do indicador de amarelo para vermelho. ODC: A ornitina descarboxilase transforma a ornitina numa amina primria, a putrescina. Esta amina causa uma subida do pH e como tal uma mudana do indicador de amarelo para vermelho. CIT: O citrato a nica fonte de carbono. Da utilizao do citrato resulta uma subida de pH e uma mudana do indicador de verde para azul. H2S: O sulfureto de hidrognio produzido a partir do tiossulfato. O sulfureto de hidrognio reage com os sais de ferro produzindo um precipitado negro. URE: A urease liberta amnia a partir da ureia; a amnia provoca uma subida de pH e mudana do indicador de amarelo para vermelho. TDA: A triptofano desaminase forma o cido indol-pirvico a partir do triptofano. O cido indolpirvico produz uma cor castanha na presena do cloreto frrico. IND: O metabolismo do triptofano resulta na formao de indol. O reagente de Kovacs forma um complexo corado (vermelho-rosa) com o indol. VP: A acetona, um metabolito intermedirio da fermentao butanodilica da glucose produzida a partir de piruvato de sdio e evidenciada pela formao de um complexo corado. GEL: A gelatina uma mistura solvel de polipeptdeos obtida por ebulio do colagnio em gua. Algumas bactrias hidrolizam a gelatina por aco de uma enzima proteoltica, a gelatinase, sendo os aminocidos resultantes posteriormente metabolizados. Uma vez hidrolizada a gelatina liquefaz-se. A liquefaco da gelatina revelada pela difuso de um pigmento negro quando na presena do reagente de Kohn. GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA: A utilizao destes carbohidratos resulta na formao de cidos e consequente baixa de pH. O indicador muda de azul para amarelo. NO3-: Algumas bactrias (aerbias estritas) tm a capacidade de utilizar os nitratos como aceitador final de electres da cadeia respiratria reduzindo-os a nitritos, quando no existe oxignio disponvel, ou seja, em anaerobiose. Os nitritos formam um complexo vermelho com o cido sulfanlico e a N, N-dimetilalfanaftilamina, usados para revelar este teste. No caso da reaco ser positiva, confirma-se a utilizao de nitratos como aceitador de electres (ex. E. coli):

nitrato redutase nitratos nitritos

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No caso da reaco ser negativa, a adio de zinco confirma a presena de nitratos no reduzidos, reduzindo-os a nitritos (cor laranja-rosa). Se no houver alterao de cor aps a adio de zinco significa que houve uma reduo completa dos nitratos (nitratos nitritos azoto gasoso), (ex. Pseudomonas sp): nitrito redutase nitritos N2

8.2 - Protocolos experimentais Pretende-se que os alunos aprendam a identificar algumas bactrias Gram negativas. Utilizaro tcnicas de exame microscpico, de cultura bacteriana e do estudo do metabolismo atravs da realizao de alguns testes bioqumicos. 1) No meio de tripticase-soja agar inocular pelo mtodo de estrias: Pseudomonas aeruginosa 2) Em duas placas de meio de Drigalsky, inocular pelo mtodo de estrias: E. coli Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae

3) Incubar a 37C/24h. No dia seguinte (segundo dia): Identificar uma bactria de cada famlia estudada (Pseudomonadaceae e Enterobactereaceae). Para isso realizar o exame a fresco, a colorao de Gram e os seguintes testes: 1) Teste da oxidase Raspar um bastonete impregnado de tetrametil parafenilenodiamina (Oxoid) nas bactrias isoladas em meio de cultura slido. Incubar temperatura ambiente. Observar a mudana de cor ao fim de 5 minutos. oxidase (+) - coloraco prpura (Pseudomonas aeruginosa) oxidase (-) - coloraco rosa (enterobactria prosseguir os testes) 2) Pesquisa de -galactosidase A partir de colnias lactose (-), multiplicadas em meio selectivo (contendo lactose), fazer uma suspenso bacteriana em soro fisiolgico estril num tubo de hemlise Adicionar uma gota de tolueno ou clorofrmio Agitar Colocar um disco de ONPG Incubar a 37/24h

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3) Testes do VM e de VP Inocular 2 tubos com o meio Clark e Lubs Incubar a 37C/24h 4) Teste do citrato Inocular o meio de Citrato-Simmons, por estrias Incubar a 37C/24h 5) Teste da urease, TDA e indol: Inocular o meio ureia-indol Incubar a 37C/24h 6) Meio de Hajna-Kligler Inoculao do meio por picada central no fundo do tubo, e por estrias na rampa Incubao a 37C/24h 7) Inocular uma galeria Api 20E ou BBL seguindo as instrues do fabricante No dia seguinte (terceiro dia) 1) Observar e registar os resultados do teste do ONPG e do citrato 2) Revelar o teste do VM Adicionar 5 gotas de vermelho de metilo Observar a colorao obtida 3) Revelar o teste do VP Adicionar 2 ou 3 gotas de VP1 e agitar Adicionar 2 ou 3 gotas de VP2 e agitar Esperar 15-30 minutos temperatura ambiente em suporte inclinado com o tubo aberto Observar a colorao obtida

4) Observar e registar os resultados do teste da urease e do Kligler 5) Revelar o teste do TDA Adicionar 2-3 gotas de reagente de TDA e agitar Observar alterao de cor 6) Revelar o teste do indol Adicionar 5 gotas de reagente de Kovacs Agitar e deixar separar fases Observar o resultado 7) Ler a galeria API ou BBL seguindo as instrues do fabricante 8.3 Resultados e discusso Construa uma tabela com os resultados obtidos relativamente a todas as bactrias estudadas.

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CAPTULO 9 Isolamento de bacterifagos de guas de superfcie 9.1 Introduo Os bacterifagos podem ser isolados a partir de muitos ambientes diferentes. Ser de esperar encontr-los em grandes quantidades sempre que se estiver na presena de uma densa populao bacteriana, como por exemplo na gua de esgoto. Dado que a concentrao de bacterifagos especficos para um determinado hospedeiro pode ser relativamente baixa, o primeiro passo no processo de isolamento o de enriquecimento. Quando a amostra incubada com a populao bacteriana respectiva, os fagos especficos para aquela bactria vo multiplicar-se em larga escala, sendo mais fceis de isolar. Para o isolamento dos fagos, as bactrias podem ser mortas e lisadas por um tratamento com clorofrmio. Em seguida efectuada uma filtrao em membranas que serve para remover os resduos de clulas e as bactrias sobreviventes. O filtrado que contm os bacterifagos pode ser armazenado no frigorfico (2-8C) durante meses. Os fagos do filtrado podem ser isolados misturando uma pequena quantidade de filtrado com uma cultura em fase exponencial de crescimento da bactria hospedeira. A mistura ento inoculada na superfcie de uma caixa de Petri contendo agar nutritivo. A esta tcnica chama-se cultura em dupla camada. Na prtica, os vrus e as bactrias esto misturados com o meio de agar liquefeito (gelose mole)- agar da camada de cima, sendo colocados sob a forma de camada fina na superfcie do agar base (meio de Luria-Bertani). Quando o agar da camada de cima gelifica, os vrus e as bactrias so imobilizados. O fago, pelo facto de estar embebido na gelose e ter a sua mobilidade severamente restrita, infecta somente as bactrias que lhe esto adjacentes. O fago vai reproduzir-se e, eventualmente, lisar a clula hospedeira. A partcula viral ir dar origem a milhes de novos viries, aparecendo ento uma zona clara de bactrias lisadas que se ir desenvolver na camada bacteriana. Esta zona clara, observada a olho n, denominada de placa fgica (Fig. 9.1). Amostras de cada placa podem ser retiradas e posteriormente utilizadas para cultivar grandes quantidades de um nico tipo de vrus. Porque cada placa provm de uma nica partcula viral, a contagem do nmero de placas ir permitir calcular a concentrao do vrus na amostra original. Uma vez que a eficincia do plaqueamento raramente prxima dos 100%, quando se utiliza o mtodo das placas para quantificar os vrus, mais correcto exprimir a concentrao (o ttulo) da suspenso viral no como nmeros absolutos de unidades de viries mas como nmeros de unidades formadoras de placas (UFP).

Figura 9.1 - Placas de lise produzidas por dois colifagos (T1 e T2). Notar as diferenas no aspecto das duas placas lise.

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9.2- Protocolo Experimental Pretende-se que os alunos pesquisem a presena de bacterifagos em guas com elevada carga orgnica, como por exemplo a gua do esgoto, poo ou lago. No final desta aula os alunos devero saber isolar e titular fagos de E. coli e P. aeruginosa.

1) Centrifugar cerca de 10-25 ml de gua de esgoto ou de poo durante 10 minutos/ 4000 rpms. A centrifugao facilita a filtrao subsequente: evita a colmatao do filtro e acelera o processo de filtrao.

2) Filtrar o sobrenadante atravs de um filtro de 0.22 m, para remover as bactrias.

3) Adicionar o filtrado a 20 ml de meio de cultura LB (Luria-Bertani) lquido

4) Adicionar a esta mistura 1 ml de E.coli ou P. aeruginosa em fase exponencial de crescimento (109 UFC/ml).

5) Incubar a 35-37C/24 h, com agitao.

6) Num tubo contendo 10 ml de meio LB lquido adicionar 100 l da mesma cultura de E. coli ou P.aeruginosa usada anteriormente e incubar a 37C/24h (vai servir de cultura em fase exponencial de crescimento para o dia seguinte).

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No dia seguinte (segundo dia):

1) Parar a incubao da mistura (bactria e filtrado) adicionando 1 ml de clorofrmio (utilizar uma pipeta estril).

2) Filtrar a mistura por filtro de 0.45 m para um tubo de rosca estril. Este filtrado constitui a soluo stock de fagos.

3) Preparar a partir deste stock uma diluio fgica a 10-2 (Fig. 9.2)
0.1 ml

Adicionar 0.1 ml de bactria indicadora em fase exponencial de crescimento. 0.1 ml 0.1 ml

9.9 ml SF

Bactri

Stock fgico

Diluio -2 10

Banho a 48 C

0.1 ml

0.1 ml

Incubar 24h/ 37 C

Figura 9.2- Isolamento e titulao de bacterifagos. Protocolo de preparao das diluies virais e da infeco das bactrias alvo.

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No dia seguinte (terceiro dia) 1) Observar as placas de lise formadas e contar o n de placas em cada caixa. Utilizar as caixas com o n de placas mais favorvel, entre 25 e 250 colnias. 2) Determinar o n de bacterifagos por 1 ml da amostra enriquecida, tendo em conta a diluio efectuada. Frmula utilizada no clculo do ttulo fgico:

UFP/ml = n de placas x factor diluio x 2

9.3- Resultados e discusso 9.3.1- Determine o nmero de fagos de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa presentes num mililitro de gua de esgoto enriquecida. Apresente os clculos efectuados. 9.3.2- Verifique a existncia ou no de variaes no tamanho das placas lise e morfologia das mesmas, para a Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. 9.3.3- Desenhe a morfologia das placas. Procure encontrar explicao para as diferentes morfologias das placas.

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