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12/08/2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA Campus Florestal

Introduo

O que so Enzimas ?

Enzimas e suas aplicaes industriais


Pollyanna Amaral Viana

Conceito: so protenas catalisadoras que aumentam a velocidade das reaes, sem sofrerem alteraes no processo global.

Introduo

O que so Enzimas ?

Introduo Caractersticas das Enzimas


1. So fundamentais para qualquer processo bioqumico; 2. Direcionam todos os eventos metablicos; 3. Tm grande poder cataltico maior que aquele dos catalisadores inorgnicos ou sintticos; 4. Possuem alto grau de especificidade para seus substratos; 5. Atuam em solues aquosas, tendo atividade afetada por pH e temperatura;
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Introduo
Meados do sculo XX: com avanos tecnolgicos e cientficos em reas como a bioqumica, as enzimas passaram a ser extradas de clulas produtoras:

Introduo O que so Enzimas ?


Macromolculas catalisadoras das reaes qumicas, presentes em todos os seres vivos, dos quais podem ser extradas e aplicadas, livres ou imobilizadas, em sistemas diferentes daqueles que as originou. As enzimas so importantes ferramentas prticas na medicina, agricultura, indstria qumica e indstria de alimentos.
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Passaram a ocupar um papel importante em produtos e processos industriais.

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Introduo

Enzimas e suas aplicaes industriais


PECTINASES INULINASES LIPASES

GALACTOSIDASES PROTEASES AMILASES CELULASES QUERATINASES

ENZIMAS

XILANASES FOSFATASES

INVERTASES

OXIDORREDUTASES

Lipases e suas aplicaes industriais LIPASES


As lipases so produzidas por muitos microrganismos e eucariontes superiores, como mamferos, plantas, fungos e bactrias. A maioria das lipases comerciais de origem microbiana.
Resduos industriais, indstrias de leos vegetais, laticnios, solo contaminado com leo, sementes oleaginosas, alimentos em decomposio...
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Lipases e suas aplicaes industriais LIPASES


Indstria de detergentes: remoo de manchas de leo de tecidos. Indstria de alimentos: desenvolvimento de sabor em leite, manteiga, queijo e carnes; melhoria do sabor de produtos de panificao; melhoria do aroma de bebidas; leos e gorduras. Indstria de polpa e papel: remoo de triglicerdeos e ceras do alcatro para melhoria da qualidade do papel.
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Oxidorredutases e suas aplicaes industriais OXIDORREDUTASES


Enzimas envolvidas em reaes de oxido-reduo;

Oxidorredutases e suas aplicaes industriais OXIDORREDUTASES


Indstria de alimentos Catalases (peroxidases): remoo de perxidos adicionados aos alimentos como conservantes: leite e soro; melhoria da qualidade do queijo. Glicose oxidase: deglicosilao ovo (gema e claras para evitar a reao de Maillard durante a secagem) e eliminao de O2 (antioxidantes) evita alteraes de sabor e cor dos alimentos (sucos, cervejas e vinhos).

Desidrogenases, oxidases, oxigenases e peroxidases

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Oxidorredutases e suas aplicaes industriais OXIDORREDUTASES


Indstria de papel: degradao da lignina. Diagnstico clnico: quantificao de glicose, colesterol e cido rico (glicose oxidase). Indstria txtil: remoo de corante aplicado no tingimento do jeans (lacase). Processos de biorremediao: recuperao de reas contaminadas.
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Invertases e suas aplicaes industriais INVERTASES


Invertases (sacarases): enzimas que catalisam a hidrlise da sacarose em frutose e glicose em quantidades iguais (xarope - acar invertido).

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Invertases e suas aplicaes industriais INVERTASES


Principal fonte: leveduras (Saccharomyces cerevisiae).

Amilases e suas aplicaes industriais AMILASES


Amilases: enzimas que catalisam a hidrlise do amido (polissacardeo de reserva dos vegetais trigo, milho, arroz, mandioca, batata).

Vantagens do xarope (acar invertido): possui poder edulcorante 20% superior ao da sacarose; no cristaliza em concentraes elevadas. Indstria de alimentos: confeitarias; panificao; formulao de cremes para recheios e gelias.

Sua presena na cerveja pasteurizada uma clara indicao de que o tratamento trmico no foi efetuado corretamente.
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Amilases e suas aplicaes industriais AMILASES


Indstria de alimentos Panificao: aumentam o volume do po e melhora a textura do produto final antienvelhecedor. Bebidas alcolicas: hidrlise do amido (cevada) em glicose para ser fermentada pelas leveduras. Produo de lcool combustvel: fermentao alcolica da sacarose (cana-de-acar).
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Pectinases e suas aplicaes industriais PECTINASES


Pectinases: enzimas que catalisam a hidrlise da pectina (polissacardeo da parede celular de plantas). Indstria de alimentos: processamento de frutos e legumes (extrao, clarificao e despectinao de sucos de frutas);extrao de leos vegetais. Indstria de celulose e papel: branqueamento da polpa. Indstria txtil: desengomagem da fibra txtil.
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Proteases e suas aplicaes industriais PROTEASES


Proteases: enzimas degradativas que hidrolisam protenas a peptdeos e aminocidos. A maioria das proteases comerciais de origem microbiana (90%). Indstria de detergentes: remoo de manchas e resduos de origem protica. Indstria de couros: processamento melhoramento da qualidade do couro remoo de albuminas e globulinas. e 19

Proteases e suas aplicaes industriais PROTEASES


Indstria de alimentos Produo de queijos: coagular o leite (casena). Panificao: protelise da glutenina (protena insolvel) da farinha de trigo melhora a qualidade da massa. Preparo de produtos de soja: melhoria do valor nutricional.
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Proteases e suas aplicaes industriais PROTEASES


Processamento de sub-produtos industriais e lixos: converso da queratina em biomassa utilizvel, concentrados proticos de valor nutricional para animais. Indstria farmacutica: agentes teraputicos ex. proteases de A. oryzae eliminam asparagina da corrente sangunea de pacientes portadores de cncer;
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Inulinases e suas aplicaes industriais INULINASES


Inulinases: enzimas que catalisam a hidrlise da inulina (frutano polissacardeo de frutose com uma glicose terminal - da parede celular de plantas).
Inulina

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Inulinases e suas aplicaes industriais INULINASES


Indstria de alimentos: produo de xaropes com alto teor de frutose (adoante natural)

Galactosidases e suas aplicaes industriais GALACTOSIDASES


Galactosidases: enzimas que pertencem classe das hidrolases; so glicosidases que hidrolisam compostos contendo O- e S-glicosil.

utilizado para a fabricao de produtos para diabticos.

-Galactosidases e -Galactosidases Produo de etanol: sacarificao e fermentao.


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Catalisam a clivagem hidroltica de resduos de D-galactose em ligao e , respectivamente.


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Galactosidases e suas aplicaes industriais GALACTOSIDASES


-Galactosidases ( lactases): hidrolisam a lactose em glicose e galactose.

Galactosidases e suas aplicaes industriais GALACTOSIDASES


-Galactosidases: hidrolisam oligossacardeos de galactose (GO) no digerveis em acares digerveis ligaes (1-6).

Rafinose
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Estaquiose

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Galactosidases e suas aplicaes industriais


Soja Alto valor econmico Alta produtividade Produo mundial total/m2: 255 milhes de toneladas (USDA, 2011)
Excelente valor nutricional

Galactosidases e suas aplicaes industriais


Fatores antinutricionais

Oligossacardeos de Galactose (GO)

35 % carboidratos solveis
Fonte abundante e de baixo custo de protenas

e carboidratos.
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Galactosidases e suas aplicaes industriais


Ausncia de -galactosidase intestinal

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES

Flatulncia, clicas , diarria.

Bactrias fermentativas (CO2,H2,CH4)

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Galactosidases e suas aplicaes industriais


Debaryomyces hansenii UFV-1

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES


Purificao
EXTRATO LIOFILIZADO

Espcie de levedura capaz de utilizar pentoses e hexoses como fonte de carbono

Enzima extracelular
7 6

FILTRAO EM GEL SEPHADEX G-150


0,03 0,025 0,02

' Atividade ) Protena

'

Atividade (U/mL)

-Galactosidases

5 4 3 2 1

)
0,015 0,01 0,005

TROCA -INICA DEAE-SEPHAROSE

Protena (mg/mL)

Extracelulares

Intracelulares
31

' 0) 1

) '

) '

) '

32

) '

) '

) '

) '

64

) '

) '

) '

'

92

'

' )

' )

112

' )

' )0

ENZIMA PURIFICADA
32

Fraes

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES


Purificao
EXTRATO BRUTO

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES


kDa 1 2 3 4

66.0

CRIOPRECIPITAO

Enzima intracelular
0,6 0,06

45.0 36.0

' Atividade ) Protena


Atividade (U/mL)
0,4

FILTRAO EM GEL SEPHADEX G-150


' '
0,04 A280 0,02

29.0 24.0 20.1

0,2

TROCA -INICA DEAE-SEPHAROSE

14.2

) '

)) ' )' ) ' ' ) ) ' ) ' ) ) ' ) ' ) ' ) ' ) ' ) ' ))) ) ))))))) ) 0 ) ' ' ) ' ' ' ' ''
20 40 60 80 100 120 140 Fraes

ENZIMA PURIFICADA
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Figure 1 - SDS-PAGE (12.5%) das etapas de purificao da -galactosidase extracelular de D. hansenii UFV-1. (1) padres; (2) liofilizado; (3) Filtrao em gel; (4) Troca-inica.
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Galactosidases e suas aplicaes industriais


Tabela 1: Resumo do protocolo de purificao da -galactosidase extracelular de Debaryomyces hansenii UFV-1.
Etapas de purificao Protena total (mg) 7,45 0,57 Atividade total (U) 88,33 58,52 Atividade especfica (U/mg) 11,86 102,67 Fator de Rendimento (%) purificao (X) 1,00 8,66 100,00 66,25

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES


Caracterizao enzimtica pH timo
120 pH vs Enz.intra pH vs Enz.extra

100

Atividade relativa (%)

Extrato liofilizado Filtrao em gel

80

60

40

Troca-inica

0,26

51,60

202,33

17,06

58,42

20

1 U: 1 mol de -NP formado por minuto


0 0 2 4 6 8 10

pH
35 36

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Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES


Caracterizao enzimtica T tima
120 T vs Enz.extra T vs Enz.intra

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES


Caracterizao enzimtica Especificidade (-Galactosidase extracelular)
Substrato -NPGal -NPGal -NPGlc -NPXil -NPMan -NPAra -NPGal -NPGlc Concentrao (mM) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Atividade (U/mL) SD 3,39 0,15 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
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100

Atividade relativa (%)

80

60

40

20

0 0 20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

37

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES


Caracterizao enzimtica Especificidade (-Galactosidase extracelular)
Substrato Sacarose Estaquiose Rafinose Melibiose Gentiobiose Maltose Lactose Concentrao (mM) 10 10 15 2 10 10 10 Atividade (U/mL) SD 0,0 3,84 0,02 2,78 0,05 0,011 0,001 0,001 0,0
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Seqenciamento automtico da poro N-terminal da galactosidase extracelular. Protena presente no Gel de Poliacrilamida Western blotting

Recorte da banda

Picotada

Membrana de PVDF

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PPSQ-21/23

Galactosidases e suas aplicaes industriais


Tabela comparativa de N-terminal de -galactosidases MICRORGANISMO
Debaryomyces hansenii UFV-1 Debaryomyces hansenii CBS767 Magnaporthe grisea Torulaspora delbrueckii Zygosaccharomyces mrakii Zygosaccharomyces cidri Saccharomyces cerevisiae

N-TERMINAL
YENGLNLVPQMGWN YENGLGLTPQMGWN NGLNLVPQMGWN NGLGLTPQMGWN NGLGLTPQMGWN NGLGLTPQMGWD NGLGLTPQMGWD NGLGLTPQMGWD NGLGLTPQMGWD NGLAITPQMGWN NGLAITPQMGWN
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Seqenciamento do N-terminal Tyr-Glu-Asn-Gly-Leu-Asn-Leu-Val-Pro-Gln-Met-Gly-Trp-Asn (YENGLNLVPQMGWN).


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Saccharomyces carlsbergensis Saccharomyces mikatae Phanerochaete chrysosporium Mortierella vinacea

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Galactosidases e suas aplicaes industriais


Imobilizao enzimtica
Enzimas imobilizadas: enzimas ou sistemas enzimticos fisicamente confinados ou localizados em uma certa regio definida do espao com reteno de suas atividades catalticas.
Reutilizao

Galactosidases e suas aplicaes industriais


Imobilizao enzimtica
Mtodos de Imobilizao

Economia e praticidade

Vantagens

Aumento da estabilidade

No contaminao do produto
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Galactosidases e suas aplicaes industriais


Imobilizao da -galactosidase extracelular sobre slica modificada
80C

Galactosidases e suas aplicaes industriais

-galactosidase

Slica

Glutaraldedo

3-aminopropiltrietoxisilano
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Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES

Galactosidases e suas aplicaes industriais

-Galactosidase (10,5U)

Indstria de alimentos: hidrlise de oligossacardeos de galactose (GO) em produtos derivados da soja

Liofilizao 6 horas, 60 oC
5 mL Leite de soja

Leite de soja; melao de soja; suco contendo soja.


HPLC
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Extrao alcolica dos GO


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Galactosidases e suas aplicaes industriais


Rafinose A Estaquiose

Galactosidases e suas aplicaes industriais


-Galactosidase imobilizada (40U) 10 horas, 60 oC
25mL leite soja

Liofilizao

Figura 3 - Cromatograma comparativo da hidrlise do leite de soja pela enzima -galactosidase extracelular de D. hansenii. Controle - 0 h (A) 2 h (B) e 4 h (C). 49

HPLC

Extrao alcolica dos GO


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Rafinose

Estaquiose

Galactosidases e suas aplicaes industriais -GALACTOSIDASES

- Usina aucareira- remoo de GO;


C

Outras aplicaes:
D

- Indstria de papel: branqueamento; - Indstria alimentcia: > digestibilidade; - Converso de sangue B em O.

Figura 4 - Cromatograma comparativo da hidrlise do leite de soja pela enzima -galactosidase extracelular imobilizada de D. hansenii. Controle-0 h (A), 2 h (B,) 4 h (C) e 10 h (D). 51

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