UEZO Centro Universitrio Estadual da Zona Oeste Biotecnologia Rio, 28/11/11

Anlises Clnicas
Trabalho de Microbiologia Aplicada

Grupo 3 Nomes: Victor David Ivson Cassiano Aurea Virginia Caio Filipe

Microbiologia aplica em analises clinicas

Neste trabalho ser relatado casos de surtos de infeco hospitalar, mtodos de identificao da bactria bem como sua multirresistncia, principais bactrias envolvidas em infeco de origem hospitalar, leis que regem essa rea segundo a ANVISA e mtodos de preveno. Ao final deste trabalho ser colocada uma situao hipottica com a utilizao de todos os itens anteriores. Assim o objetivo deste trabalho alertar para leis e tcnicas de identificao e preveno de infeco hospitalar, bem como mostrar essas leis e tcnicas na pratica.

Introduo
As Anlises Clnicas constituem uma das reas fundamentais dentro das cincias da sade. A Sade Pblica hoje um sector incontornvel nas polticas do Ambiente e da Sade. As anlises clnicas contribuem para o diagnstico, prognstico, teraputica e preveno da doena, no mbito da patologia clnica, da imunohemoterapia e da sade pblica. Por isso deve-se a esta uma grande importncia, principalmente na identificao de novas cepas bacterianas e sua multirresistncia. Diante da diversidade bacteriana, de sua capacidade de adaptao ao meio e de sua fcil ocorrncia, pois so microrganismos, fica a importncia de se determinar o tipo de bactria e/ou a cepa. Trataremos neste trabalho de surtos de infeco hospitalar e sua identificao. Aproximadamente 10% dos pacientes hospitalizados infectam-se frequentemente em consequncia de procedimentos invasivos ou de terapia imunossupressora. O ambiente hospitalar inevitavelmente um grande reservatrio de patgenos virulentos e oportunistas, de modo que as infeces hospitalares podem ser adquiridas no apenas por pacientes, que apresentam maior susceptibilidade, mas tambm, embora menos freqentemente, por visitantes e funcionrios do prprio hospital. Os patgenos implicados nas infeces hospitalares so transmitidos ao indivduo tanto via endgena, ou seja, pela prpria flora do paciente quanto pela via exgena. Esta ltima inclui veculos como mos, secreo salivar, fluidos corpreos, ar e materiais contaminados, como por exemplo, equipamentos e instrumentos utilizados em procedimentos mdicos. Muitos destes procedimentos so invasivos, isto , penetram as barreiras de proteo do corpo humano, de modo a elevar o risco de infeco.

Os principais fatores que influenciam a aquisio de uma infeco so: status imunolgico idade (recm-nascidos e idosos so mais vunerveis) uso abusivo de antibiticos procedimentos mdicos, em particular, os invasivos immunosupresso falhas nos procedimentos de controle de infeco

Atividades Bsicas do Laboratrio de Microbiologia de Analises Clinicas

As atividades bsicas de um Laboratrio de Microbiologia consistem em: Elaborar e viabilizar normas para colheita, conservao e transporte de material de interesse clnico; Estabelecer e executar rotinas microbiolgicas, dentro dos padres tcnico cientficos vigentes, que permitam o isolamento e identificao dos principais agentes infecciosos de importncia clnica, por gnero e, se possvel, por espcie; Determinar a sensibilidade s drogas antimicrobianas; Efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilizao; Divulgar e pr em prtica normas de biossegurana; Participar junto com a Comisso de Controle de Infeco Hospitalar do rastreamento epidemiolgico dos surtos de infeco hospitalar; Fornecer periodicamente dados relacionados com a etiologia das infeces hospitalares e da resistncia s drogas; Executar outras atividades afins de natureza no rotineira e de relevncia em determinadas situaes como, por exemplo, estudos microbiolgicos de materiais inanimados, portadores, desinfetantes, etc.

Biossegurana
No Laboratrio de Anlises Clnicas, a segurana de responsabilidade da direo, no sentido de evitar, ao mximo, riscos aos seus empregados, assim como de responsabilidade de cada trabalhador a execuo de suas tarefas dentro dos parmetros de segurana, pelo que sero estabelecidas regras genricas e normas especficas pertinentes. A rotina do Laboratrio de Microbiologia envolve riscos relacionados exposio, tanto com material clnico e reagentes qumicos, como com potenciais agentes patognicos concentrados em meio de cultura. A adoo e prtica de normas de segurana e uso de equipamentos afins so considerados imprescindveis. Medidas gerais de preveno como adoo de manuais de procedimentos adequados e de primeiros socorros, acompanhados de treinamento e orientao verbal, devem ser tomadas sempre que possvel. Outros cuidados importantes so o uso de EPI, cuidados ao lidar com substancias qumicas, cuidado aos riscos de contaminao, esterilizao do local, alm de todos os equipamentos adequados necessrios para manipulao da amostra.

Requisio de Exames Microbiolgicos e Identificao de Amostras Clnicas

Fatores que podem comprometer o exame microbiolgico: hiptese diagnstica mal elaborada, informaes mal colhidas, incompletas, ou no, devidamente interpretadas, etc.; requisio inadequada da anlise laboratorial; coleta, conservao e transporte inadequados; falhas tcnicas no processamento da anlise; demora na liberao de resultado; m interpretao dos resultados.

Deve-se lembrar que o envolvimento do mdico com o laboratrio de microbiologia pode, com freqncia, ser muito til para ambos, propiciando melhor orientao tcnica, mais objetividade, facilitando a interpretao de resultados, etc. A importncia do relacionamento mdico com o laboratrio deve-se ao fato de que a microbiologia envolve etapas interpretativas para muitos exames, como aqueles que envolvem flora (mucosas), ou no caso de agentes especficos em que so fundamentais a escolha de meios seletivos, uso de meios enriquecedores, a uso de suplementos, ampliao do tempo de cultivo, a variao na temperatura de incubao, a adio de novos testes, etc.

Passos fundamentais para a investigao 1. Identificao clara do paciente: nome e sobrenome; registro no hospital ou servio; data de nascimento (evitar confuso com homnimos e informaes importantes relacionadas faixa etria); sexo (por exemplo, a interpretao de bacteriria pode ser diferente para a mulher); clnica, leito ou ambulatrio; espao para identificao do exame (nmero da anlise microbiolgica e seo do laboratrio).

2. Informaes Relevantes para o Diagnstico do Processo Infeccioso: hiptese diagnstica; dados clnicos dados epidemiolgicos relevantes dados laboratoriais que evidenciem o stio do processo infeccioso provvel origem do processo infeccioso comunitrio ou hospitalar.

uso de antbiticos nos ltimos dez dias (por qu e quais?); paciente com comprometimento imunolgico ou com algum fator predisponente infeco oportunista paciente transferido ou de alta nos ltimos 30 dias de outro hospital? colonizado ou infectado ou portador de bactrias multirresistentes? data do pedido mdico, nome legvel do mdico, carimbo e/ou ramal de contato data e hora da coleta e nome de quem colheu o material (permite reavaliao de procedimentos e reciclagem, por exemplo, quando se detecta excesso de contaminao em uroculturas, etc); comentrios, quando necessrios, sobre o procedimento de coleta. Por exemplo, acidentes ou dificuldades para obteno do material, condies do paciente, quantidade, etc; no caso de suspeita de infeco urinria, informar se o paciente sintomtico ou no.

Identificao da Amostra
O profissional responsvel pela coleta ser tambm responsvel por identificar de forma legvel e correta o material a ser encaminhado ao laboratrio de microbiologia. Na amostra devem estar identificados: nome e registro do paciente; leito ou ambulatrio e especialidade; material colhido; data, hora e quem realizou a coleta.

Quem colhe o material deve ser devidamente treinado e periodicamente reciclado nesta atividade. Deve saber que o material dever ser destinado, o mais brevemente possvel, ao laboratrio. Deve conhecer ou obter instrues sobre conservao e/ou transporte do material caso este no possa ser realizado imediatamente.

Natureza do Teste Solicitado Exame microscpico: a fresco, campo escuro; com colorao Gram, Ziehl, Giemsa, ou outra; pesquisa de Pneumocistis carinii; pesquisa de Cryptosporidium e Isospora belli.

Cultura: rotina bacteriolgica;

rotina para fungos; rotina para micobactrias.

Especficos: anaerbios, micoplasma, Legionella spp, Helicobacter spp, exames especiais de interesse da CCIH (controle de medicamentos, frascos de soros, bolsas de sangue, portadores, equipamentos, etc.); rotina para vrus (quando disponvel); outros.

Testes especiais: aglutinao com ltex para meningite; testes imunolgicos diretamente no material clnico: Chlamydia trachomatis (genital), Streptococcus pyogenes (orofaringe); pesquisa de toxinas (S. aureus, Limulus teste para endotoxinas de Gram (-) Clostridium difficile etc); tipagem para fins epidemiolgicos em investigao de surtos ou fontes de infeco hospitalar; PCR para micobactrias, etc; exames quantitativos (exceto os de rotina, como urina, cateter vascular e lavado broncoalveolar). Por exemplo, hemocultura de sangue perifrico ou de cateter, bipsia de tecidos, lquido de dilise peritoneal, etc.

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos: rotina( Kirby Baner) antibiograma com drogas no padronizadas; outros testes de sensibilidade aos antimicrobianos (Concentrao Inibitria Mnima/CIM, E test); pesquisa de antimicrobianos no sangue, LCR, etc., poder bactericida do soro; teste de sensibilidade de fungos a drogas, etc.

Coleta Microbiolgica
Todo resultado liberado pelo laboratrio de microbiologia conseqncia da qualidade da amostra recebida. O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor stio da leso, evitando contaminao com as reas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiolgico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um tratamento no apropriado. Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados

para evitar o isolamento de um falso agente etiolgico, resultando numa orientao teraputica inadequada.

Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possvel. Instruir claramente o paciente sobre o procedimento. Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clnicos. Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado. Considerar o estgio da doena na escolha do material. Patgenos entricos, causadores de diarria, esto presentes em maior quantidade e so mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarrica do processo infeccioso intestinal. Na suspeita de febre tifide, a fase da doena ir determinar o melhor local da coleta (sangue/fezes). Quantidade suficiente de material deve ser coletado para permitir uma completa anlise microbiolgica. Caso a quantidade seja pequena, priorizar os exames. O pedido do exame deve conter, alm da identificao do paciente, dados como idade, doena de base e indicao do uso de antibiticos.

Consideraes de Segurana Utilizar as barreiras de proteo necessrias a cada procedimento. Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patognica. Usar frascos e meios de transporte apropriados. No manusear a amostra em trnsito: paciente e laboratrio. No contaminar a superfcie externa do frasco de coleta e verificar se ele est firmemente vedado. Caso ocorram respingos ou contaminao na parte externa do frasco, fazer descontaminao com lcool 70% ou outra soluo descontaminante disponvel. No contaminar a requisio mdica que acompanha o material. As amostras devero ser transportadas em sacos plsticos fechados. Identificar claramente a amostra coletada, com todos os dados necessrios. Colocar a identificao no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rtulos. Encaminhar os materiais imediatamente ao laboratrio.

O recebimento criterioso das amostras clnicas pelo laboratrio de microbiologia garante uma melhor correlao clnico/laboratorial.

Principais Erros de Identificao Discrepncia entre a identificao da amostra e o pedido mdico. Falta de identificao da amostra. Origem da amostra ou tipo de amostra no identificada. Teste a ser realizado no especificado.

Amostras Inadequadas Material clnico recebido em soluo de fixao (formalina). Ponta de cateter de Foley. Material conservado inadequadamente com relao a temperatura (urinas colhidas h mais de 24 horas, que ficaram guardadas em geladeira, ou colhidas h mais de duas horas, sem refrigerao). Frascos no estreis. Presena de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminao na superfcie externa. Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida colhida no mesmo dia e da mesma origem. Swab nico com mltiplas requisies de testes microbiolgicos. Swab seco. Culturas para anaerbios recebidas em condies no apropriadas.

Amostras com as caractersticas acima descritas so inadequadas e demandam um contato prvio com o mdico solicitante para melhores esclarecimentos.

Transporte das Amostras

Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao laboratrio para: assegurar a sobrevivncia e isolamento do microrganismo, pois o laboratrio de microbiologia trabalha basicamente em funo da viabilidade dos microrganismos; evitar o contato prolongado dos microrganismos com anestsicos utilizados durante a coleta, pois eles podero exercer atividade bactericida; evitar erros de interpretao nas culturas quantitativas, principalmente urina e lavado broncoalveolar.

Tcnicas de Coleta Colher antes da administrao de antibiticos. Lavar as mos e sec-las. Remover os selos da tampa dos frascos de hemocultura e fazer assepsia prvia nas tampas com lcool 70%. Garrotear o brao do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta rea no dever mais ser tocada com os dedos. Fazer a anti-sepsia com lcool 70% de forma circular e de dentro para fora. Aplicar soluo de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%) tambm com movimentos circulares e de dentro para fora. Para ao adequada do iodo, deixar secar por um a dois minutos antes de efetuar a coleta. Coletar a quantidade de sangue e o nmero de amostras recomendados de acordo com as orientaes descritas ou se discriminadas no pedido mdico.

Remover o iodo do brao do paciente com lcool 70% para evitar reao alrgica. Identificar cada frasco com todas as informaes padronizadas e enviar ao laboratrio, juntamente com a solicitao mdica devidamente preenchida.

As amostras podem ser coletadas de vrios locais, rgos e tecidos, tais como ponta de cateter, secreo traqueal, aspirado transtraquial, lavado bronco-alveolar, secreo de orofaringe, liquor, feridas, abscessos, exsudatos, tecido subcutneo, amostras de pele, bipsia da pele, tecido sseo, secreo de ouvido, secreo ocular, material genital, fezes, urina, etc.

IDENTIFICAO DE BACTRIAS

Salina Material: salina (soro fisiolgico - 0,85% de cloreto de sdio), lmina e lamnula. Indicao: permite observar a morfologia bacteriana e avaliar a existncia de motilidade. Usada para pesquisa a fresco de Trichomonas em secrees, fungos (leveduri-formes ou filamentosos) e em diferentes materiais, etc. Tcnica: gotejar a salina (uma gota) no centro de uma lmina de microscopia e nela suspender uma colnia ou uma alada do material a ser investigado. Cobrir com uma lamnula e examinar ao microscpio, com objetiva de 40X ou 100X (leo de imerso).

Exame em Campo Escuro Material: microscpio com condensador de campo escuro e, quando possvel, objetiva de 100X com ris, lmina, lamnula, salina e leo de imerso. Indicao: empregado para observar a motilidade de bactrias dificilmente observadas em microscopia direta com salina, como o caso do Treponema pallidum e da Leptospira sp., podendo ser usada tambm para observar a motilidade do Campylobacter sp. e outras bactrias. Tcnicas: Para a pesquisa do Treponema pallidum devem-se atritar as bordas da leso suspeita com um swab ou ala bacteriolgica. Colher o exsudato com a prpria ala ou fazer um imprint com a lmina e cobrir com a lamnula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapidamente. Para a pesquisa de Leptospira um dos materiais mais utilizados a urina recm-emitida, centrifugada e examinado o sedimento. A microscopia em campo escuro realizada colocando-se leo de imerso entre o condensador e a parte inferior da lmina (deve-se encostar o condensador na lmina). Inicialmente, observa-se com objetiva de 40X para obter o

foco e avaliar as condies do material, fazendo-se, a seguir, a bacterioscopia por imerso, com objetiva de 100X.

Colorao de GRAM A colorao de Gram usada para classificar bactrias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratrio de microbiologia clnica um teste adicional rpido para o diagnstico de agentes infecciosos, sendo tambm utilizado para avaliar a qualidade da amostra clnica analisada. As interpretaes dos esfregaos corados pelo Gram envolvem consideraes relacionadas com as caractersticas da colorao, tamanho, forma e agrupamento das clulas. Estas caractersticas podem ser influenciadas por vrios fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubao e a presena de substncias inibidoras. A confirmao do diagnstico uma fundamental para o se obter resultados confiveis. Muito antes de iniciar a busca de dados junto ao paciente e junto aos registros dos profissionais de sade (pronturio: evoluo clnica, anotaes de enfermagem e outros) faz-se mister ter claramente o que (a) clnica e (b) resultado laboratorial compatveis, conforme a definio de casos. Quais so esses sinais e sintomas de processo infeccioso? A definio preconizada aquela descrita no utilizada pelo NNISS. Estes devero estar contidos na ferramenta de coleta de dados para possibilita a incluso, excluso e anlise dos casos (ver formulrio de investigao). Utilidade da colorao de Gram: rapidez na informao e orientao na terapia emprica, avaliao da qualidade do material colhido, sugerindo o tipo de cultura - rotina ou especial. Procedimento: Confeccionar o esfregao; Corar com violeta de cristal por 60 segundos; Lavar com esguicho de gua destilada; Cubrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos; Lavar com esguicho de gua destilada; Descorar com lcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos; Lavar com esguicho de gua destilada; Corar com safranina por 60 segundos Lavar com gua destilada, secar e observar ao microscpio.

Controle de Qualidade Verificar diariamente a aparncia dos reagentes. Se a soluo de cristal-violeta precipitar, refiltre antes de usar. A evaporao pode afetar a eficcia dos reagentes. Recomenda-se que as solues de trabalho sejam trocadas regularmente, dependen-do da demanda. Diariamente e quando novos reagentes forem preparados, corar, juntamente com os esfregaos da rotina, lminas controles. Esfregaos de Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) ou Staphylococcus aureus (ATCC 25922) so preparados e fixados. Resultados esperados:

a) bacilos Gram-negativos, colorao rsea. b) cocos Gram-positivos, colorao violeta. Sistema de reviso dos resultados do Gram: c) a reviso diria de lminas de Gram, selecionadas pelo supervisor, pode ajudar a determinar a necessidade de treinamento e adicionar informaes de relevncia clnica. d) comparar resultados da cultura com a leitura do Gram. Fazer manuteno preventiva e limpeza dos microscpios.

Outras Coloraes Albert Layborn (Corinebactrias) Colorao de Flagelos

Procedimentos para observar expresses fenotpicas:

Meio lquido: observar o aspecto das culturas antes de utilizar nas demais inoculaes. Preparar lmina a fresco: observar motilidade. Preparar lmina corada: observar reao de Gram, forma, arranjos e estruturas. Inocular placas com gar-nutriente em estrias cruzadas: observar morfologia das colnias Inocular meio com gar-amido: observar a hidrlise do amido com algumas gotas de soluo de iodo Inocular meio inclinado em linha reta: observar formas de crescimento Inocular meio com gelatina: verificar atividade proteoltica

Caractersticas fisiolgicas Provas bioqumicas Os microrganismos realizam variadas atividades bioqumicas utilizando nutrientes do ambiente que os rodeia Essas reaes que ocorrem dentro ou fora das clulas so catalisadas por enzimas. Geralmente, o metabolismo origina produtos finais cuja deteco pode auxiliar na identificao.

Utilizao de fontes de carbono Provas fermentativas (Glicose, lactose, sacarose, manose, xilose, sorbitol etc.)

Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que depende do microrganismo envolvido. Isso pode gerar gs (que pode ser detectado pela presena de bolhas no tubo de Durham) e cidos orgnicos (que pode ser detectado pela mudana de cor do indicador). Mesmo com uma reao negativa, o microrganismo pode ter utilizado outros nutrientes do meio de cultura do teste, como a peptona. As leituras devem ser feitas em no mximo 24 h, pois podem ocorrer reaes alcalinas sobre outros substratos. Utilizam-se meios bsicos (pH 7,2) e o indicador Andrade para cidos.

VM (Vermelho de Metila) Teste que avalia se as bactrias fermentam a glicose pela via cida mista, com a produo de vrios cidos (cido frmico, ltico, actico), o que prova o abaixamento do pH a menos 4,4, que o limite de viragem do indicador de pH. Embora todas as enterobactrias fermentem glicose, alguns microrganismos, durante a fase final de incubao, convertem esses cidos a produtos no cidos como o etanol e a acetona, resultando num pH mais elevado (pH 6). O indicador de pH o vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 vermelho e acima de 6 amarelo. Adicionar 4 gotas e rolar gentilmente entre a palma das mos.

VP (Voges Proskauer) H bactrias que utilizam a fermentao butilenogliclica. Fermentam a glicose produzindo acetil-metil-carbinol (acetona), butilenoglicol e pequenas quantidades de cidos. Quando KOH (4 gotas do Barrit II) adicionado, e na presena de O2 atmosfrico, a acetona oxidada a diacetil. A adio de alfa-naftol (10 gotas do Barrit I) nesta reao catalisa a produo de um anel vermelho tijolo, aps 10-15 minutos. Adicionar primeiro o Barrit I, depois o Barrit II e agitar o tubo para expor ao oxignio. Hidrlise do amido O amido um polissacardeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da clula e ser utilizado, necessrio, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores. A habilidade para hidrolisar esse polmero depende da produo e secreo de vrias amilases. A quebra do amido detectada utilizando-se culturas em gar amido que so cobertas com uma soluo de iodo (3 a 4 mL por placa). O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro. As colnias que podem hidrolisar o amido apresentaro uma zona clara a seu redor.

Citrato Este teste determina se a bactria capaz de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono para o metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sdio, fosfato de amnia e azul de bromotimol. Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease h a sua utilizao pela citrase, com produo de

hidrxido de amnia que eleva o pH, fazendo com que a reao se torne azul. Nesse teste, utilizam-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxignio, que necessrio para utilizao do citrato. O CO2 produzido reage com o sdio do citrato formando carbonatos de reao alcalina.

Malonato (teste FM) Essa prova determina a capacidade de uma bactria de utilizar malonato como nica fonte de carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente desidrogenase succnica, impedindo sua ao cataltica sobre o cido succnico com interrupo do Ciclo de Krebs, tirando da bactria sua principal fonte de energia e impedindo a formao de outros intermedirios necessrios ao metabolismo. Incuba-se a 35-37OC durante 24-48 horas. Indicador azul de bromotimol.

Utilizao de fontes de nitrognio

Fenilalanina - desaminao (teste FM) H bactrias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio, originando o cido fenilpirvico, que reage com o cloreto frrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde. Obs: Como se utiliza o mesmo ensaio para o malonato, necessrio acidificar o meio com HCl, que passa para amarelo, antes de adicionar o cloreto frrico.

Lisina - descarboxilao Algumas bactrias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a poro carboxila dos aminocidos, com formao de aminas, de reao alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. A reao ocorre preferencialmente em condies anaerbias e ligeiramente cidas, mas inicialmente ocorre a utilizao da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificao do meio. O meio contm o indicador bromocresol prpura. Nas etapas iniciais de incubao, o tubo torna-se amarelo devido fermentao da glicose. Se o aminocido descarboxilado o meio retorna cor prpura. A reao se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com leo mineral para agilizar o processo.

Indol

O indol produzido pela ao da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura, ocorrendo, tambm, a produo de cido pirvico e amnia. O indol pode ser detectado pela formao de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, aps a adio de pdimetilaminobenzaldedo (reativo de Erlich).

Produo de H2S (meio SIM) Algumas bactrias so capazes de degradar compostos contendo enxofre (como o tiossulfato de sdio e a cistena das peptonas), atravs da tiossulfato redutase, produzindo H2S que incolor. Este reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). Para que esta reao ocorra necessrio que o meio esteja cido.

Uria H bactrias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uria presente no meio liberando amnia, CO2 e H2O. A amnia reage formando carbonato de amnia que alcaliniza o meio. O indicador de pH o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a colorao magenta. Uma colorao meio rosa suficiente para considerar a reao positiva.

Reduo de Nitratos Muitas bactrias so capazes de reduzir nitratos a nitritos, ocorrendo mais rapidamente em condies anaerbias (condio em que o nitrato substitui o oxignio como aceptor final de eltrons). Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito evidenciado atravs da formao de um composto avermelhado.

Motilidade A motilidade observada atravs do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-slido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. Se a motilidade positiva o aspecto do meio ser turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento s ser observado na zona da picada. Fica mais fcil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas atravs do tubo motilidade negativa. Provas IMViC (Indol, Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato) Esta srie de quatro provas j vistas anteriormente permite diferenciar os principais grupos de Enterobacteriaceae: Grupo I: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella Grupo II: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia

Grupo III: Proteus Grupo IV: Yersinia

Teste de sensibilidade aos antibiticos So testes realizados para determinar a resistncia de um bactria, tem se tornado extremamente importantes para identificao de novas cepas resistentes. Essa resistncia muda todo o tratamento em um individuo e estimula a novas pesquisas de antibiticos eficazes. No abordaremos essas tcnicas pois o objetivo principal a identificao, porm, deixamos clara a importncia destes testes em laboratrios de analises clinicas.

Comparao das colnias de bactrias Culture Reaction Descriptio Culture n Esta bactria forma colnias de Klebsiella tamanho pneumoniae mdio com margens regulares e elevao convexa Colnias so vermelhar e Pseudomona circulares s fluorescens coom margem inteira Reaction Descriptio n Esta bactria forma colnias ligeirament e midas e viscosas, circulares. convexas, com margens lisas.

Escherichia coli

Serratia marcescens

Colnias circulares, convexas e com margens lisas.

Chromobacteri um violaceum

Colnias circulares, convexas com margem Micrococcus inteira, e luteus apresenta m-se roxas na maioria dos meios Colnias puntiforme s, convexas, com margens lisas. O tamanho muito reduzido devido ao Lactobacillus metabolis plantarum mo ineficiente dessa bactria. Ela pode levar 3-4 dias para alcanar um tamanho aprecivel. Colnias so largas, porm menos que as de Bacillus B. cereus. cereus As margens so onduladas, com forma

Colnias puntiforme s, convexas com margens lisas, com cor amarelada na maioria dos meios.

Enterococcus faecalis

Colnias puntiforme s, convexas, com margens lisas. . O tamanho reduzido devido ao metabolis mo ineficiente, que pode levar 3-4 dias para atingir um tamanho aprecivel.

Bacillus subtilis

Colnias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.

circular e uma elevao achatada. Colnias largas, irregulares Staphyloccoc e us achatadas epidermidis com margens onduladas. Colnias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.

Bacillus polymyxa

Situao Hipottica
Interpretao clnica
Voc foi chamado na enfermaria de urologia para avaliar uma paciente com diarria h dois dias, uma jovem de 20 anos, aps ter feito tratamento com penicilina e estar sendo alimentado por sonda nasogstrica h 1 semana. A pesquisa nas fezes para enteropatgenos foi negativo, mas positiva para toxina B e C do Clostridium difficile. Este paciente tem colite associada antibiticoterapia. A colite que surge aps o uso de antibiticos, geralmente peloClostridium difficile (20% dos casos), esta mesma infeco pode ocorrer durante a alimentao por sonda em pacientes hospitalizados. O Clostridium difficile (CD) um bacilo Gram-positivo anaerbico formador de esporos, que foi descrito pela primeira vez em 1935, mas sua associao com algum tipo de doena s foi reconhecido em 1978. Atualmente, o mais importante patgeno causador de diarria em ambiente hospitalar ou em casas de repouso, causando alta morbidade e mortalidade. A flora bacteriana de uma pessoa adulta normal resistente colonizao pelo CD entretanto, se essa flora alterada, por exemplo pela antibiticoterapia de amplo espectro (penicilinas, cefalosporinas e clindamicina), essa resistncia desaparece ficando suceptvel a infeco. Alm dos antibiticos, quimioterpicos e imunossupressores, em menor incidncia, tambm podem causar a diarria. Outros fatores so: idade avanada e gravidade da doena que causou a internao, cirurgiasgastrointestinais, uso de sonda nasogstrica, amaciantes fecais, medicamentos antiperistlticas, anticidos e enemas. A maioria das bacilos CD ingeridos eliminado pela acidez gstrica,e somente 1% alcana o intestino delgado, j os esporos so bem mais resistentes ao pH do estmago e comeam a germinar quando entram em contato com os sais biliares. Durante a passagem pelo intestino delgado, as bactrias vo se proliferando, adquirindo flagelos e produzindo enzimas proteoliticas que indicaro a virulncia da cepa. No clon, as bactrias aderem mucosa e produzem suas principais toxinas, A e B.

A gama de sintomas dos pacientes contaminados com CD vai desde quadros frustos a disenterias importantes com repercusso hemodinmica, colite pseudomembranosa e formao de megaclon txico. Diagnstico O diagnstico confirmado pelo contexto clnico e pela deteco de tanto da toxina A (citotoxina) quanto da toxina B (enterotoxina) nas fezes. Ambas as toxinas esto presentes em apenas 35% dos casos. A toxina A a que desempenha o maior papel citotxico levando extensa destruio tecidual e reteno lquida intra-epitelial, a toxina B tem sua ao mais nociva somente aps a barreira mucosa estar lesada. feito a identificao por meios de cultura. Outro mtodo diagnstico a colonoscopia Tratamento - A primeira linha de tratamento com metronidazol por ser barato e eficaz. Nos pacientes que no tem boa resposta a esse tratamento deve receber um novo tratamento com metronidazol oral (1g/dia, durante 10 a 14 dias), antes da vancomicina (125 mg/dia durante 7 dias), que muito cara. Recorrncia Apesar do sucesso teraputico do episdio inicial, a recorrncia da infeco de 15% a 25% dos casos, entre trs a 21 dias aps o final do tratamento. Esses quadros podem ser explicados pela persistncia dos esporos a nvel intestinal ou reinfeco, com cepas diferentes de CD. A conduta refazer o mesmo esquema teraputico, com taxa de resposta de 95%. O uso de probiticos ( Saccharomyces boulardi e Lactobacillu GG) demonstram ao benfica contra as recidivas da doena.

Referncias Bibliogrficas
Manual de Procedimentos Bsicos em MICROBIOLOGIA CLNICA para o Controle de Infeco Hospitalar ANVISA, Gerncia Geral de Servios de Sade, Gerncia de Controle de Riscos Sade, Ministrio da sade. Manual de Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco em Servios de Sade. ANVISA. INVESTIGAO E CONTROLE DE BACTRIAS MULTIRRESISTENTES. ANVISA.