UNIVERSIDAD NACIONAL SANTIAGO ANTUNEZ DE MAYOLO

FACULTA CIENCIAS DEL AMBIENTE

ESCUELA: CURSO: TEMA: DOCENTE: INTEGRANTES:

INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA AISLAMIENTO Y CULTIVO DE BACTERIA PRESENTES EN EL BIODIGESTOR BLGA. POLO SALAZAR ROSARIO ADRIANA CAMILLO MORALES MILTON EDU MAYHUAY GUERRERO ROCIO SALAS CUEVA RUBY MISHELL VERDE VILLON DENNIS

HUARAZ - 2011

SUMARIO

INTRODUCCION 1. OBJETIVOS 2. MARCO TEORICO 2.1. BIOGS 2.1.1. Etapas de la Digestin Anaerobia 2.1.2. Etapa Acidognica o Fermentativa 2.1.2.1. Las bacterias Homoacetognicas 2.1.2.2. Las bacterias Heteroacetognicas 2.1.2.3. Las bacterias sulfato reductoras 2.1.3. Factores Influyentes en la Digestin Anaerobia 2.1.3.1. 2.1.3.2. 2.1.3.3. 2.1.3.4. La temperatura Relacin carbono/ nitrgeno Control PH Bacterias adecuadas:

2.1.4. Bacterias Que Intervienen En La Produccin Metanoica 2.1.4.1. Actividad Bacteriana En El Biodigestor

2.1.5. Desechos Agrcolas Y Animales Con Potencial Para Producir Metano 3. MATERIALES Y METODOS 3.1. MATERIALES 3.2. EQUIPOS 3.3. MATERIAL BIOLOGICO 3.4. COLORANTES Y REACTIVOS 3.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMETAL 3.5.1. Preparacin del biodigestor 3.5.1.1. 3.5.1.2. 3.5.1.3. 3.5.1.4. Recoleccin de muestra Aislamiento de los microorganismos Identificacin de los microorganismos Determinacin de Coliformes

4. RESULTADOS E INTERPRETACION 4.1. DETERMINACION DE COLIFORMES 4.2. SIEMBRA POR DILUCIONES 4.3. COLORACIONECOLORACION SIMPLE 4.4. COLORACION GRAM 4.5. CLASIFICACION DE LAS POSIBLES BACTERIAS OBTENIDAS 4.5.1. Metanobacteriaceae 4.5.2. Metanotermaceae 4.5.3. Metanococcaceae 4.5.4. Metanomicrobiaceae 4.5.5. Metanocorpusculaceae 4.5.6. Metanosarcinaceae 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES

1. OBJETIVOS: 1.1.1. Recoleccin y reproduccin de cepas nativas de microorganismos del biogs. 1.1.2. Obtencin de metano 1.1.3. Identificar bacterias metanognicas

2. MARCO TEORICO:

2.1. BIOGS: El biogs es una mezcla de gases cuyos principales componentes son el metano y el bixido de carbono, producidos como resultado de la fermentacin de materia orgnica en ausencia del aire y la accin de un grupo de microorganismos. En la naturaleza se encuentra gran variedad de residuos orgnicos de los cuales se puede obtener biogs, como por ejemplo: estircol de animales domsticos como vacas, cerdos y aves, residuos vegetales como pajas, pastos, hojas secas y domsticos como restos de comida, yerba, frutas, verduras, etc.

2.1.1. Etapas de la Digestin Anaerobia La materia orgnica no puede ser utilizada directamente por los microorganismos a menos que se hidrolicen en compuestos solubles que puedan atravesar la membrana celular, la hidrlisis es, por tanto, el primer paso necesario para la degradacin anaerobia. Las bacterias que participan en esta etapa son las Hidrolticas, que producen cido actico, compuestos monocarbonados, cidos grasos orgnicos y otros compuestos policarbonados, ejemplos de las bacterias hidrolticas son las enterobacterias, bacterias aerotolerantes como las bacterias del cido lctico, y bacterias anaerobias estrictas como Clostridium, Bacteroides, Propionibacterium y Selenomonas. Las Enterobacterias como la E. Coli tienen una enzima formiato liasa responsable de la generacin de hidrgeno a partir de formiato. Las bacterias del cido lctico producen a partir del azcar cido lctico y etanol dependiendo si son homo o heterofermentativas. En esta etapa las bacterias, actan sobre los componentes orgnicos del sustrato, tales como celulosa, almidones, protenas y grasas entre otras, transformndolos por hidrlisis en compuestos orgnicos solubles, de esta forma

los carbohidratos se convierten en azcares simples; las grasas, en cidos grasos y glicerol y las protenas se desdoblan en polipptidos y aminocidos, liberando tambin CO e H . Posteriormente, esos productos son convertidos a cidos
2 2

orgnicos, fundamentalmente butrico, propinico y actico (Angelidaki, 1997). La hidrlisis depende de variables como pH, temperatura, concentracin de biomasa hidroltica, tipo de materia orgnica y tamao de partcula. En general la tasa de hidrlisis aumenta con la temperatura independiente del sustrato utilizado, y disminuye cuando existe en la composicin del sustrato una alta cantidad de lignina, este compuesto es altamente refractario a la degradacin anaerobia, afectando la biodegradabilidad del sustrato.

2.1.2. Etapa Acidognica o Fermentativa, las molculas orgnicas solubles son fermentadas, formando compuestos que pueden ser utilizados directamente por las bacterias metanognicas productos finales de la etapa anterior son transformados en acetato, hidrgeno y CO por un grupo de bacterias que
2

aportan aproximadamente el 54% del hidrgeno que se utilizar en la formacin de metano. La funcin de estos microorganismos en el proceso de la digestin anaerobia es ser donantes de hidrgeno, CO y acetato para las bacterias
2

metanognicas. Existen dos tipos de microorganismos que producen acetato, las bacterias Homoacetognicas las cuales fermentan el acetato como nico metabolito y las bacterias Acetognicas las que metabolizan los productos terminales de la etapa acetognica y necesitan asociarse estrechamente a microorganismos consumidores de hidrgeno. Por otra parte existen las bacterias sulfato reductoras, este tipo de microorganismos se da por oxidacin de compuestos orgnicos, y reduccin de sulfato a sulfuro. Se subdividen en dos grupos: oxidadores completos que producen CO , H O y sulfuro, y oxidadores
2 2

incompletos cuyos productos son acetato, CO y sulfuro. La metanognesis es el

2

punto final del proceso, donde actan las bacterias metanognicas, degradando estos cidos y alcoholes, obtenindose como productos finales del proceso metablico, gas metano (CH ), CO , y trazas de H O, NH y biomasa, esta etapa
4 2 2 3

constituye el paso limitante del proceso de degradacin anaerobia. Las bacterias metanognicas, pertenecen al Reino de las Arquebacterias, y de acuerdo a los sustratos que pueden degradar, se dividen en:

 Hidrogenotrficos: Estas bacterias son capaces de producir metano a partir de hidrgeno como dador de electrones y anhdrido carbnico como fuente de materia orgnica. Metiltrofos: metilsulfuros. Acetoclsticos: Producen metano y anhdrido carbnico a partir de acetato. El mayor nmero de especies de bacterias metanognicas pertenecen al primer grupo. Los gneros de metanobacterias hidrogenoflicas mesfilas mas frecuentes en reactores anaerobios son: Methanobacterium, Metabolizan compuestos como metilaminas y

Methanospirilum, Methanobrevibacter.

2.1.3. Factores Influyentes en la Digestin Anaerobia Como todo proceso biolgico, la digestin anaerobia debe ser controlada, pues existen diversos factores que influyen considerablemente en el xito o no de la misma. Un desbalance en alguno de estos factores puede provocar la ruptura del equilibrio entre las comunidades microbianas y por consiguiente el no funcionamiento del sistema, la no produccin de biogs y fertilizante. A continuacin se relacionan los factores de mayor importancia que influyen en este proceso fermentativo.

2.1.3.1.

La temperatura Es una variable muy importante ya que a medida que

aumenta la temperatura tambin aumenta la actividad metablica de las bacterias, requirindose menor tiempo de retencin para que se complete el proceso de fermentacin.

Tabla 1. Relacin entre el periodo de fermentacin y la temperatura.

Temperatura C Tiempo (das)

8 120

10 90

15 60

20 45

27 38

37 30

A mayor temperatura se obtiene mayor agilidad en el desarrollo del proceso, permitindose la posibilidad de emplear dimensiones menores en el reactor, no obstante lo anterior, cuando se trabaja a temperaturas muy elevadas el proceso puede dejar de ser rentable, por lo cual es comn que los digestores operen en un rango mesoflico. La Tabla 2, muestra los valores maximos, minimos y ptimos a los cuales puede operar una fermentacin anaerobia.

Tabla 2. Rangos de temperatura para la fermentacin anaerbica.

Rangos, C Fermentacin Sicrofilica Mesofilica Termofilico Mnimo 4 - 10 15 - 20 25 - 45 Optimo 15 - 18 28 - 33 50 - 60 Mximo 25 - 30 35 - 45 75 - 80

2.1.3.2.

Relacin carbono/ nitrgeno

Los materiales de fermentacin estn compuestos en su mayor parte por carbono (C) y nitrgeno (N). Si el contenido de este ltimo es muy alto, la reproduccin de las bacterias se inhibe debido a la alta alcalinidad. Lo ideal es una relacin C/N de 20:1 a 30:1; relaciones C/N menores; por ejemplo, inhiben la actividad bacteriana por excesivo contenido de amonio. La concentracin de amonaco en el material de fermentacin debe ser menor de 2000 mg/L.

2.1.3.3.

Control PH Es de vital importancia para el sistema, ya que una

disminucin del pH puede traer como resultado la inhibicin del crecimiento de las bacterias metanognicas, ello hace que disminuya la produccin de metano y aumente el contenido de dixido de carbono y se produzcan olores desagradables por el aumento del contenido de sulfuro de hidrgeno.

De manera general, el pH se mantiene bastante estable a pesar de la produccin de cidos por las bacterias, ya que en el medio fermentativo se generan sustancias tampones que garantizan un rango de pH adecuado. Adems, la velocidad de formacin de cido depende de la velocidad de la conversin a biogs. Se acepta generalmente que los valores ptimos del pH oscilen entre 5.5 y 8.0, sin embargo en el sistema de dos etapas el pH recomendado depende de la fase anaerobia.

Tabla 3. pH ptimo en la produccin de biogs. Valor de pH Valor tpico Valor ptimo Etapa hidroltica 5.0 - 6.0 5.5 - 5.7 Etapa metanognica 6.5 - 7.5 6.8 - 7.2

2.1.3.4.

Bacterias adecuadas: Debe existir una proporcin ptima de ambas poblaciones

bacterianas, metanognicas y no metanognicas, lo cual se garantiza con un previo inculo, el cual desarrolla suficientes sustancias amortiguadoras para mantener los valores deseados de pH y que cubren casi totalmente las altas demandas de condiciones anaerbicas por las bacterias metanognicas. 2.1.4. BACTERIAS QUE INTERVIENEN EN LA PRODUCCION METANOICA Estas bacterias (Arqueas productoras de metano) estn ampliamente distribuidas en la naturaleza en ambientes anoxignicos; con mayor frecuencia se encuentran en ambientes terrestres como microambientes de poro medio en suelos, en bosques y praderas, aguas continentales, en especial en pantanos y zonas encharcadas y, en alguna proporcin, en el mar (1,2). Este ltimo ambiente les genera competencia con microorganismos reductores de sulfatos por el acetato y el hidrgeno disponibles para su supervivencia, sustratos que pueden ser reemplazados por las metilaminas, excretadas por algunos animales marinos . En el suelo, agua y otros ambientes como el rumen, la disponibilidad de los sustratos depende de la accin metablica de otros

microorganismos que degradan compuestos orgnicos a acetato, formiato, metilamina, metanol y metilmercaptano entre otros. Estos son utilizados por las bacterias metanognicas en la produccin de metano. 2.1.4.1. ACTIVIDAD BACTERIANA EN EL BIODIGESTOR

Las bacterias actan en el biodigestor bsicamente a partir de un proceso de fermentacin. Este proceso se lleva a cabo en la cmara de digestin por la accin de dos tipos de bacterias: Bacterias acidgenas: actan sobre la materia orgnica

desgradndola a cidos voltiles y son poco sensibles a los cambios que se operan en el medio en que actan. Bacterias metanognicas: actan sobre los cidos voltiles provenientes de la accin de las anteriores y las degradan hasta obtener Biogs. 2.1.5. DESECHOS AGRICOLAS Y ANIMALES CON POTENCIAL PARA PRODUCIR METANO Desechos Animales: Estircoles, cama, desechos alimenticios, orina, etc. Residuos Agrcolas: Semillas, pajas, corteza de caa, etc. Desechos de Rastros: Sangre, carne, desechos de pescado, etc. Residuos Agroindustriales: Aserrn, desechos de tabaco, cascarilla de arroz, desechos de frutas y vegetales. Residuos Forestales: Ramas, hojas, cortezas, etc.

3. MATERIALES Y METODOS :

3.1. -MATERIALES:

Balde de 18 L Manguera 1m. Globo Frascos Asa de siembra Marcador de vidrio Placas estriles Matraz Mechero Laminas porta y cubre objetos Pipetas esterilizadas

3.2. EQUIPOS: Autoclave Bao mara Microscopio

3.3. MATERIAL BIOLOGICO: Agar nutritivo Cultivo de bacterias anaerobias Frascos con agua de dilucin Tubos con caldo Lauril Agua destilada Desechos de animales: estircol Desechos orgnicos: verduras, frutas, etc.

3.4. COLORANTES Y REACTIVOS: Azul de metileno Cristal violeta Lugol Alcohol cetona Safranina

3.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMETAL 3.5.1. Preparacin del biodigestor.- primero lavamos el balde a usar y luego de un secado en el vertemos hasta los tres octavos del volumen del recipiente estircol, encima le colocamos una capa de residuos orgnicos y al final agua, procurando que se encuentre en una proporcin de diez por ciento dejando al final casi la mitad del volumen para la coleccin del gas. Previo a este proceso preparamos la tapa que debe estar conectada a la manguera y esta al globo asegurndonos de que no se produzca fuga de gas. Una vez terminada la colocamos en la boca del balde cerrndola hermticamente para evitar el ingreso del oxgeno atmosfrico ya que las bacterias productoras de biogs son estrictamente anaerbicas. Todo esto lo dejamos reposar por un espacio de 3 a 4 semanas tratando de mantenerlo a una temperatura constante para una mayor reproduccin de las metano bacterias. 3.5.1.1. Recoleccin de muestra.- una vez que el globo est inflado y

transcurrido el tiempo necesario procedemos a destapar el balde y en un frasco cogemos una laboratorio. 3.5.1.2. Aislamiento de los microorganismos.-en el laboratorio vamos a cantidad considerable para llevarlo a

realizar la siembra por diluciones sucesivas debido a que nos encontramos frente a una mezcla bacteriana por lo que es preciso aislar los grmenes y as poder cuantificarlos y observar sus caractersticas. 3.5.1.3. Identificacin de los microorganismos.- una vez que hemos

encontrado la dilucin ms favorable que nos permita un crecimiento sobre el medio entre 30-300 colonias vamos a proceder a escoger a

los microorganismos para colorearlos de acuerdo a sus caractersticas y obtener un mejor resultado. Aplicamos la coloracin simple para los hongos y la coloracin GRAM para las bacterias. Anotamos los resultados.

3.5.1.4.

Determinacin de coliformes.- para determinar la presencia de

coliformes en nuestra muestra realizamos diluciones sucesivas hasta diez a la menos cinco, luego cogemos 1 ml de cada dilucin y la sembramos en caldo lauril. Para cada dilucin se tiene tres tubos en los que observaremos las reacciones y comprobaremos la presencia de coliformes

4. RESULTADOS E INTERPRETACION:

4.1. DETERMINACION DE COLIFORMES:

Numero de dilucin Numero de tubos positivos

-1

-2

-3

-4

-5

La lectura se realiza para las tres ltimas diluciones ejecutndose de atrs para adelante siendo 3-3-2 para un valor de la tabla de 1100 x coliformes /100ml. NMP

Interpretacin: Entendemos que en nuestra muestra aun hay presencia de coliformes en una proporcin de 1100 x NMP coliformes /100ml

esto debido a que para la elaboracin del biogs utilizamos estircol. Estos microorganismos sirven de alimento para las bacterias formadoras de metano.

1.1. SIEMBRA POR DILUCIONES: MUESTRA (primera siembra) (segunda siembra) RESULTADO 360 X0 368 X0 ufc ufc

1.2. COLORACIONECOLORACION SIMPLE

Montaje: Hmedo Observacin: Penicillium 1.3. COLORACION GRAM

Montaje: Hmedo Observacin: Trichodermo

Montaje: Seco Observacin: Sarcinas - Gram + (cuatro) Sthapylos - Gram + (racimos de uva) Sthapylos - Gram + (cadenas) Cocos - Gram

Montaje: Seco Observacin: Bacilos - Gram + (Metano bacilos)

Montaje: Seco Observacin: Bacilos - Gram +

Montaje: Seco Observacin: Bacilos - Gram + Cocos - Gram +

Montaje: Seco Observacin: Cocos - Gram +

Montaje: Seco Observacin: Bacilos - Gram + Cocos - Gram +

Montaje: Seco Observacin: Bacilos - Gram + (Methanobacterium)

CLASIFICACION DE LAS POSIBLES BACTERIAS OBTENIDAS Metanobacteriaceae Bacilos largos o cortos; utilizan H2 y CO2 y algunas formato o alcoholes como substratos para metanognesis; cocos que utilizan slo H2 o metanol, la mayora son Gram positivos; contienen pseudomurena; no mtiles; contenido de GC, 23-61% Metanotermaceae Bacilos; los substratos para metanognesis son H2 y CO2; Gram positivos; contienen pseudomurena; no mtiles; termoflicos extremos; contenido de GC, 33-34% Metanococcaceae Cocos irregulares; los substratos para metanognesis son H2 + CO2 y formato; Gram negativos; mtiles; contenido de GC, 29-34% Metanomicrobiaceae Bacilos, espirilos, placas o cocos irregulares; utilizan H2 y CO2 algunas formato o alcoholes como substratos para metanognesis; Gram negativos; mtiles y no mtiles; contenido de GC, 39-61% Metanocorpusculaceae Pequeos, cocos irregulares; utilizan H2 y CO2 y algunas formato o alcoholes como substratos para metanognesis; Gram negativos; mtiles y no mtiles; contenido de GC, 48- 52% Metanosarcinaceae Pseudosarcina, cocos irregulares; utilizan H2 y CO2, acetato, compuestos metlicos como substratos para metanognesis, nunca formato; cocos que utilizan slo H2 o metanol; la mayora son Gram positivos o negativos; frecuentemente no mtiles; contenido de GC, 36-52%

5. CONCLUSIONES 5.1. Al obtenerse metano comprobamos que se desarrollaron colonias de bacterias metanognicas 5.2. Comprobamos que al ser aislada la muestra se obtuvieron bacterias metano gnicas Gram + 5.3. Se obtuvieron coliformes ya que estas son eliminadas completamente en un
tiempo mas prolongado

6. RECOMENDACIONES 6.1. Se puede utilizar limaduras de fierro para mejorar la descomposicin 6.2. Se puede utilizar un medio de cultivo como el medio de tioglicolato enriquecido que se utiliza para el cultivo y aislamiento de bacteria anaerbicas obligadas o de crecimiento lento 6.3. El estircol es secado al medio ambiente, se pierde alrededor de un 50% del nitrgeno es recomendable utilizar el estircol fresco

7. REFERECIAS BIBLIOGRAFICAS

BIODIGESTOR CONSERVACIONISTA, ing. M.E. Chvez, 2000 BROK. Biologa de los microorganismos. 10ma edicin Fermentaciones y metanognesis, facultad de ciencias agrarias UNAM http://www.uprm.edu/biology/profs/.../p4-metanogenesis.pdf Puerto Rico Documento obtenido del Portal del Ingeniero Ambiental http://www.ingenieroambiental.com