ALEXANDRE NASCIMENTO ROCHA FILHO

SUPEROVULAO EM GUAS

BOTUCATU 2003

ALEXANDRE NASCIMENTO ROCHA FILHO

SUPEROVULAO EM GUAS

Monografia apresentada Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Botucatu, como requisito da disciplina em Seminrios em Reproduo rea de Animal I do programa de Ps-graduao Medicina Veterinria, concentrao em Reproduo Animal.

Responsveis pela disciplina: Prof. Adj. Dra. Maria Denise Lopes Prof. Ass. Dr. Sony Dimas Bicudo

BOTUCATU 2003

SUMRIO LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUO 2. DINMICA FOLICULAR 3. INDUO DE OVULAES MLTIPLAS EM GUAS 3.1 Hormnio Liberador de Gonadotrofinas (GnRH) 3.2 Imunizao Contra a Inibina 3.3 Hormnio Folculo Estimulante (FSH) 3.4 Extrato de Pituitria Eqina (EPE) 3.4.1 Taxas de ovulao 3.4.2 Induo e sincronizao das ovulaes 3.4.3 Momento de incio do tratamento X resposta superovulatria 3.4.4 Recuperao embrionria 3.4.5 Taxas de prenhez 3.4.6 Efeito de tratamentos sucessivos 4. CONSIDERAES FINAIS 5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 3 4 4 5 6 6 8 9 9 10 11 12 13 13 14 15

LISTA DE ABREVIATURAS b.i.d. = duas vezes ao dia eCG = gonadotrofina corinica eqina eFSH = hormnio folculo estimulante eqino purificado EPE = extrato de pituitria eqina FIV = fertilizao in vitro FSH = hormnio folculo estimulante FSH-P = hormnio folculo estimulante suno GIFT = transferncia intrafalpio de gametas GnRH = hormnio liberador de gonadotrofinas hCG = gonadotrofina corinica humana ICSI = injeo intracitoplasmtica de espermatozide LH = hormnio luteinizante mg = miligrama ml = mililitro mm = milmetro OT = transferncia de ocito s.i.d.= uma vez ao dia TE = transferncia de embrio

1. INTRODUO O desenvolvimento de protocolos comprovadamente eficazes e consistentes na induo de superovulao em guas tema de grande relevncia para a indstria eqina. Conforme mencionado por McCue (1996), alguns dos benefcios decorrentes da superestimulao ovariana em guas so a maior disponibilidade de ocitos para a aplicao de diferentes tecnologias de reproduo assistida fertilizao in vitro (FIV), transferncia intrafalpio de gametas (GIFT), transferncia de ocito (OT) e injeo intracitoplasmtica de espermatozide (ICSI) , alm da melhoria da eficincia em programas de transferncia de embries (TE) e no manejo de guas subfrteis. A induo de mltiplas ovulaes na espcie bovina por meio da administrao de gonadotrofinas como a gonadotrofina corinica eqina (eCG) e o hormnio folculo estimulante (FSH) um mtodo eficiente e bem sedimentado. Entretanto, os ovrios de guas so substancialmente menos sensveis estimulao com eCG em comparao com outras espcies (GINTHER, 1992), e a estimulao ovariana com FSH de origem suna (FSH-P) requer doses muito elevadas e tem baixa eficincia quando comparada sua utilizao em vacas (IRVINE, 1981; SQUIRES et al., 1986). Dessa forma, a busca de melhores resultados na induo de superovulao em guas tem sido pautada na utilizao de outros preparados hormonais, como o extrato de pituitria eqina (EPE) e o FSH eqino purificado, bem como na imunizao ativa ou passiva contra a inibina. O presente trabalho tem como objetivo revisar os principais aspectos relacionados induo de superovulao em guas, tais quais a dinmica folicular, os mtodos de superestimulao ovariana disponveis e seus resultados. Maior nfase ser dada ao uso do EPE, por meio de uma abordagem mais detalhada de algumas das peculiaridades inerentes a esse tratamento. 2. DINMICA FOLICULAR Em guas o desenvolvimento folicular segue um padro de ondas (GINTHER, 1992), tendo sido descritas ondas maiores e ondas menores (GINTHER, 1993). Ondas maiores caracterizam-se por apresentar um folculo dominante com dimetro 30 mm, 4

enquanto

em

ondas

menores

no

se

desenvolve

folculo

dominante.

desenvolvimento folicular durante o ciclo estral em guas geralmente ocorre na forma de uma onda folicular maior, a qual se inicia na metade de um intervalo interovulatrio de 22-24 dias (GINTHER, 1992). Um pulso de FSH estimula a emergncia da onda folicular, atinge um pico em mdia trs dias mais tarde e ento as concentraes de FSH passam a declinar durante vrios dias at atingirem nveis basais. Enquanto isso, os folculos crescem em paralelo at que o maior folculo atinja cerca de 21-23 mm. A partir de ento, o maior folculo geralmente torna-se dominante e continua a crescer enquanto os demais tornam-se subordinados e apresentam uma interrupo ou reduo do crescimento, caracterizando o fenmeno da divergncia folicular (GASTAL et al., 1997). Aparentemente, o maior folculo torna-se dominante antes que o segundo maior folculo possa atingir um dimetro similar. Baseado em um estudo realizado com vacas, foi postulado que a essncia do mecanismo de seleo folicular encontra-se em uma associao funcional de modupla entre as concentraes de FSH e os folculos. O futuro folculo dominante e os subordinados contribuem para a reduo das concentraes de FSH da emergncia at a divergncia, apesar de continuarem sendo estimulados por essas concentraes decrescentes. No incio da divergncia, o futuro folculo dominante o principal responsvel pelo efeito depressor sobre as concentraes de FSH e continua a crescer sob estmulo dessas reduzidas concentraes, enquanto os folculos subordinados no mais respondem reduzida quantidade de FSH e regridem (GINTHER et al., 2000). O principal desafio a ser vencido pelo tratamento superovulatrio estimular e manter o desenvolvimento de folculos que durante um ciclo normal teriam o crescimento inibido e sofreriam atresia (PIERSON & GINTHER, 1990). Dessa forma, os tratamentos superovulatrios baseiam-se na disponibilizao de quantidades suficientes de FSH para o crescimento folicular, quer pela administrao direta dessa gonadotrofina contida nos preparados, quer por meio da imunizao contra a inibina ou administrao de hormnio liberador de gonadotrofinas (GnRH). 3. INDUO DE OVULAES MLTIPLAS EM GUAS

3.1 Hormnio Liberador de Gonadotrofinas (GnRH) O uso de GnRH e anlogos com o intuito de induzir mltiplas ovulaes uma prtica pouco empregada atualmente por possuir algumas limitaes. Os mtodos descritos na literatura como sendo capazes de aumentar a incidncia de ovulaes mltiplas em guas envolvem utilizao de doses elevadas de GnRH e numerosas aplicaes ou sistemas de liberao contnua por meio de bombas, restringindo seu uso na prtica (JOHNSON, 1986, 1987; GINTHER & BERGFELT, 1990). Alm disso, a eficcia do tratamento com GnRH durante a estao ovulatria reduzida, sendo seu uso mais efetivo durante o anestro (SQUIRES & SEIDEL, 1995; MCCUE, 1996). 3.2 Imunizao Contra a Inibina A inibina um hormnio protico que tem um efeito especfico sobre a secreo de FSH e pouca, ou nenhuma ao, sobre a secreo de LH (GINTHER, 1992). Nas fmeas produzida pelas clulas da granulosa e exerce efeito inibitrio sobre a secreo de FSH pela hipfise (GINTHER, 1992). A principal fonte de inibina o folculo dominante, e seu efeito depressor sobre as concentraes de FSH parece ser determinante para a inibio do crescimento e atresia dos folculos subordinados durante a onda folicular (SQUIRES & SEIDEL, 1995; MCCUE, 1996). Com base nesse conhecimento foi suposto que a neutralizao da inibina permitiria que as concentraes de FSH se mantivessem elevadas durante as fases de crescimento e seleo folicular, prevenindo a regresso de alguns folculos e aumentando o nmero de ovulaes. McKinnon et al. (1992) imunizaram cinco guas com uma subunidade alfa recombinante de inibina bovina, realizando duas aplicaes com 35 dias de intervalo, e obtiveram uma mdia aproximada de 2,3 ovulaes aps a segunda imunizao, que foi superior (P<0,02) das guas controle (1,2 ovulaes; n=21). Em um outro estudo, seis guas foram imunizadas cinco vezes em intervalos de trs semanas com um fragmento sinttico da subunidade alfa de inibina suna. Esse tratamento resultou em uma taxa de ovulao mdia por ciclo estral superior (P<0,01) das guas no tratadas (2,8 1,1 vs 1,1 0,1) e num incremento na taxa de recuperao embrionria por gua (1,6 0,5 vs 0,7 0,2), embora no significativo 6

(MCCUE et al., 1992).

Embora a imunizao ativa contra a inibina fornea bons

resultados no que diz respeito ao nmero de ovulaes e embries recuperados, a necessidade de se realizar sucessivas imunizaes bem como os efeitos adversos decorrentes dessas (edema e formao de abscesso no local de aplicao) tornam o referido mtodo inapropriado em algumas situaes. Induo de mltiplas ovulaes em guas por meio de imunizao passiva contra a inibina tambm tem sido relatada. A administrao de dois litros de plasma de gua ovariectomizada (n=5) ou dois litros de plasma anti-inibina (n=10), no dia 10 psovulao, resultou em 100% de ovulaes simples nas guas tratadas com plasma de gua ovariectomizada e 50% de ovulaes mltiplas entre os animais tratados com plasma anti-inibina (1,6 0,2 ovulaes/gua; MCCUE et al, 1993). Um resultado superior foi relatado por Nambo et al. (1998), que obtiveram em mdia mais (P<0,05) ovulaes aps aplicarem em guas 100 (n=4) ou 200 ml (n=4) de soro anti-inibina (3,75 0,63 e 4,5 0,65, respectivamente) do que mediante administrao de 100 ml de soro oriundo de bode orquiectomizado (1,25 0,25, n=4). Os soros foram administrados por via endovenosa no dia 12 ps-ovulao, tendo as guas recebido previamente uma injeo intramuscular de prostaglandina F2 no dia 8. Os principais resultados obtidos na superovulao de guas com a imunizao ativa ou passiva contra a inibina encontram-se na Tabela 1. Tabela 1. Taxas de ovulao e percentual de guas com mltiplas ovulaes aps imunizao ativa ou passiva contra a inibina. % de animais No de Tipo de Taxa de c/ mltiplas Referncia animais imunizao ovulao ovulaes tratados
5 6 10 8* Ativa Ativa Passiva Passiva 2,3 2,8 1,6 4,1 100 67 50 100 McKinnon et al., 1992 McCue et al., 1992 McCue et al., 1993 Nambo et al, 1998

*Dados combinados de dois tratamentos.

Adaptado de McCue (1996)

3.3 Hormnio Folculo Estimulante (FSH) Os primeiros relatos da utilizao de hormnio folculo estimulante (FSH) para induo de mltiplas ovulaes em guas se referem ao uso de FSH-P, devido sua ampla disponibilidade. Em sntese, a administrao dessa gonadotrofina em guas duas vezes ao dia, da metade ou final do diestro at o incio do estro, forneceu resultados apenas medianos no que diz respeito taxa de ovulao e nmero de guas manifestando mais que uma ovulao por ciclo estral (Tabela 2). Alm de produzir uma resposta bem inferior obtida na espcie bovina, trata-se de um mtodo oneroso por requerer administrao de elevadas doses hormonais sendo, portanto, de aplicao restrita (SQUIRES et al, 1986). Em estudos subseqentes, avaliou-se a eficcia de preparados contendo fraes enriquecidas de FSH de origem eqina (eFSH) na superovulao de guas. Os trabalhos que forneceram os melhores resultados basearam-se na administrao de uma dose diria aproximada de 25 mg de eFSH, em uma nica aplicao (Rosas et al., 1998) ou fracionada em duas aplicaes (Machado et al., 2003), iniciando-se o tratamento entre os dias seis e sete ps-ovulao e encerrando-o quando da deteco de folculos 35 mm em dimetro. Os resultados desses e de outros estudos em que se utilizou eFSH encontram-se resumidos na Tabela 2. Tabela 2. Taxas de ovulao e percentual de guas com mltiplas ovulaes aps tratamento com FSH de origem suna (FSH-P) ou eqina (eFSH). % de animais c/ No de Taxa de mltiplas Referncia animais Tipo de FSH ovulao ovulaes tratados
4 9 17* 9 15 5 6 FSH-P FSH-P FSH-P eFSH eFSH eFSH eFSH 1,7 1,6 1,6 1,9 2,8 4,6 4,2 N/A 44 65 N/A N/A 80 N/A Irvine, 1981 Squires et al., 1986 Sirois et al., 1992 Hofferer et al., 1993 Palmer et al., 1993 Rosas et al., 1998 Machado et al., 2003

*Dados combinados dos grupos

8 mg e 16 mg de FSH-P. N/A = no pde ser calculado a partir dos dados fornecidos.

Adaptado de McCue (1996).

3.4 Extrato de Pituitria Eqina (EPE) O extrato de pituitria eqina (EPE) tem sido o preparado mais utilizado em estudos sobre induo de mltiplas ovulaes em guas (SQUIRES & SEIDEL, 1995). Atualmente, o extrato utilizado pela grande maioria dos pesquisadores obtido atravs da homogeneizao de pituitrias eqinas e extrao das gonadotrofinas em uma soluo com 40% de etanol e 6% de acetato de amnia. As gonadotrofinas so precipitadas a -20C elevando-se a concentrao de etanol para 80%, sendo ento dissolvidas em tampo fosfato, dializadas e liofilizadas. A relao LH:FSH no extrato de aproximadamente 4:1 (GUILLOU & COMBARNOUS,1983). 3.4.1 Taxas de ovulao Os primeiros relatos de sucesso na superestimulao ovariana em guas referem-se administrao de EPE, tanto durante o anestro sazonal (DOUGLAS et al, 1974 apud DOUGLAS, 1979) quanto em plena estao ovulatria (LAPIN & GINTHER, 1977). Posteriormente, diversos pesquisadores obtiveram bons resultados com a Em utilizao do EPE em uma ou duas aplicaes dirias. Conforme revisado por McCue (1996), taxas de ovulao entre 1,7 e 3,8 tinham sido reportadas at ento. uso de EPE (Tabela 3). Tabela 3. Taxas de ovulao e percentual de guas com mltiplas ovulaes aps tratamento com EPE uma (s.i.d.) ou duas (b.i.d.) vezes ao dia. % de animais No de Taxa de c/ mltiplas Referncia animais Dose ovulao ovulaes tratados
5 8 8 10 10 10 10 6 25 mg/s.i.d. 25 mg/s.i.d. 25 mg/b.i.d. 25 mg/s.i.d. 12,5 mg/b.i.d. 25 mg/b.i.d. 50 mg/s.i.d. 25 mg/b.i.d. 3,6 2,4 7,1 3,4 3,4 4,7 4,4 3,4 80 62,5 100 80 60 90 100 N/A Rosas et al., 1998 Alvarenga et al., 2001 Alvarenga et al., 2001 Scoggin et al., 2002 Scoggin et al., 2002 Scoggin et al., 2002 Scoggin et al., 2002 Machado et al., 2003

trabalhos mais recentes, taxas de ovulao entre 2,4 e 7,1 foram obtidas por meio do

N/A = no pde ser calculado a partir dos dados fornecidos.

A taxa de ovulao obtida por Alvarenga et al. (2001) quando da aplicao de 25 mg de EPE duas vezes ao dia foi significativamente maior (P<0,05) do que a obtida com uma nica aplicao de 25 mg (7,1 5,1 vs 2,4 1,8). Embora esse trabalho no tenha esclarecido se a melhor resposta superovulatria estava relacionada a uma maior dose ou freqncia na administrao do EPE, Scoggin et al. (2002) concluiram, aps experimento delineado para esse fim especfico, que a melhor resposta resultado de uma maior dose diria e no de uma maior freqncia nas aplicaes. Atualmente tm sido testados protocolos de superovulao em guas com doses decrescentes de EPE, com base nas evidncias de que em vacas a incorporao de hormnio luteinizante (LH) ao tratamento superovulatrio com FSH-P purificado prejudica os resultados (DONALDSON et al., 1986) e de que um atraso na exposio dos folculos em crescimento ao pico pr-ovulatrio de LH melhora a resposta superovulatria (DOCCHIO et al., 1999). Scoggin et al. (2002) trataram nove guas a partir dos dias 6 a11 do diestro com doses decrescentes de EPE duas vzes ao dia, aps administrao de prostaglandina F2. Aps a induo das ovulaes com gonadotrofina corinica humana (hCG) e suspenso do tratamento com EPE, foram obtidas em mdia 3,3 ovulaes por gua e 88,9% (8/9) de animais apresentando duas ou mais ovulaes. Em estudo que comparou o tratamento superovulatrio a base de doses constantes com o de doses decrescentes de EPE (n=6 animais/grupo), Carmo (2003) no encontrou diferena significativa nas taxas de ovulao (3,5 1,9 e 5,0 2,2, respectivamente; P=0,26) e de recuperao embrionria (1,2 1,3 e 1,8 1,3, respectivamente; P=0,24) entre os tratamentos. 3.4.2 Induo e sincronizao das ovulaes Lapin & Ginther (1977) reportaram que o uso de hCG no final do tratamento com EPE reduziu (P<0,05) o intervalo do incio do tratamento ovulao em aproximadamente dois dias. Posteriormente, Woods & Ginther (1983a) verificaram que o intervalo entre a primeira e a ltima ovulao em guas superovuladas com EPE e que receberam hCG era substancialmente menor (P<0,01) do que nos animais superovulados que no receberam essa gonadotrofina (0,0 0,0 vs 1,6 0,4). Os

10

mesmos autores observaram ainda uma maior (P<0,05) taxa de ovulao nas guas superovuladas que haviam recebido hCG em relao s que no receberam. Desde ento, a utilizao de hCG para estimular e sincronizar as ovulaes em guas superovuladas passou a ser uma prtica comum, fornecendo bons resultados (SQUIRES et al., 1986; DIPPERT et al., 1992, 1994). Um outro mtodo bastante utilizado com a finalidade de apressar e sincronizar as ovulaes ao final dos tratamentos superovulatrios em guas e que fornece resultados satisfatrios a administrao intravenosa do prprio EPE na dose de 25 mg (HOFFERER et al., 1993; PALMER et al., 1993; ROSAS et al., 1998). 3.4.3 Momento de incio do tratamento X resposta superovulatria Alguns trabalhos foram realizados com o intuito de verificar qual o melhor momento para se iniciar o tratamento com EPE. Em estudo conduzido por Woods & Ginther (1983a), 85,7% (6/7) das guas tratadas com EPE entre os dias 15 e 19 (dia 0 = dia da ovulao) apresentaram mltiplas ovulaes, comparado a 28,6% (2/7) das tratadas entre os dias 19 e 23. A taxa de ovulao foi maior (P<0,01) no grupo tratado nos dias 15-19 (2,9 0,5 vs 1,3 0,2). Dippert et al. (1992) compararam as respostas superovulatrias entre guas tratadas com EPE a partir do dia 5 ou 12 ps-ovulao e concluiram que iniciando-se o tratamento mais precocemene no diestro obtem-se uma melhor resposta no desenvolvimento folicular e no nmero de ovulaes. Iniciando o tratamento superovulatrio com EPE em guas em diferentes estdios do desenvolvimento folicular, Pierson & Ginther (1990) verificaram superestimulao ovariana em resposta aos tratamentos iniciados quando o maior folculo atingiu 15, 20, ou 25 mm em dimetro. Entretanto, quando o tratamento com EPE foi iniciado aps o maior folculo ter atingido o dimetro de 30 mm no houve respota superestimulatria, tendo sido isso creditado ao estabelecimento da dominncia folicular por parte do maior folculo e comprometimento dos demais folculos com o processo de atresia. Esses achados esto de acordo com a constatao de que na espcie bovina os tratamentos superovulatrios evocam melhores respostas ovarianas quando iniciados na ausncia de um folculo dominante (BUNGARTZ & NIEMANN, 1994). 11

3.4.4 Recuperao embrionria Woods & Ginther (1983b,1984) divulgaram os primeiros relatos referentes colheita de mltiplos embries de guas superovuladas. Verificaram que o tratamento superovulatrio com EPE resultou em um maior (P<0,01) nmero de embries recuperados por gua, em comparao com os animais no tratados (2,9 vs 0,7). No entanto, a taxa de recuperao embrionria por ovulao foi similar (P>0,1) entre as guas superovuladas e as controle. Desde ento, essa uma realidade que tem sido constatada na maioria dos trabalhos, exceo do desenvolvido por Palmer et al. (1993), em que se relatou a recuperao de apenas 0,6 embries por gua superovulada (Tabela 4). Tabela 4. Taxas de ovulao e de recuperao embrionria de guas tratadas com EPE. No de Taxa de No de embries No de embries animais Referncia ovulao por gua por ovulao tratados
14 16 5 8a 8b 10 8
c a

4,6 2,8* 3,6 2,4 7,1 3,4 4,4 3,4 4,7 3,4

2,9 0,6* 2,0 1,6 3,5 1,2 1,5 2,6 2,1 1,0

0,6 0,2* 0,53 0,68 0,49 0,35 0,36 0,67 0,43 0,26

Woods & Ginther, 1984 Palmer et al., 1993 Rosas et al., 1998 Alvarenga et al., 2001 Alvarenga et al., 2001 Scoggin et al., 2002 Scoggin et al., 2002 Scoggin et al., 2002 Scoggin et al., 2002 Machado et al., 2003

9d 9b 6

*Mdia de 60 ciclos tratados. a, b, c, d Tratamento com 25 mg s.i.d. (a), 25 mg b.i.d. (b), 50 mg s.i.d. (c) e 12,5 mg b.i.d. (d). O reduzido nmero de embries recuperados em relao ao nmero de ovulaes pode ser encarado como uma conseqncia da ocorrncia de mltiplas ovulaes, sejam elas naturais ou induzidas. Squires et al. (1987b) constataram que os percentuais de recuperao de dois embries de guas que apresentaram duplas ovulaes espontneas, uni ou bilaterais, eram somente 23,2 e 41,7, respectivamente. 12

Palmer et al. (1993) especularam que em guas superovuladas poderiam haver falhas na liberao do ocito por parte dos folculos durante a ovulao, que os ocitos seriam de m qualidade ou que haveria fecundidade normal seguida de perda embrionria precoce. Porm, Dippert et al. (1994), coletando ovrios e ovidutos de guas superovuladas e no superovuladas dois dias aps a ltima ovulao, no encontraram diferenas significativas entre os dois grupos de animais no que diz respeito ao nmero de ovulaes que resultaram em embries e no posterior desenvolvimento embrionrio in vitro. folicular Posteriormente, Bzard et al. (1995) verificaram que embora o ambiente seja diferente em guas superovuladas, em comparao s no

superovuladas, a maturao ovocitria alcanada em ambos os grupos de animais. 3.4.5 Taxas de prenhez Em alguns estudos, procurou-se avaliar o efeito exercido pelo tratamento superovulatrio com EPE em guas sobre a fertilidade. Inicialmente, menores taxas de prenhez foram verificadas em guas tratadas com o extrato do que nas no tratadas (WOODS & GINTHER, 1982; WOODS et al.,1982), assim como em receptoras de embries oriundos de guas tratadas com EPE em comparao quelas que haviam recebido embries de guas no tratadas (WOODS & GINTHER, 1983b, 1984). Em contrapartida, Squires et al. (1987a) demonstraram que no h difrenas entre as taxas de prenhez de receptoras de embries oriundos de guas com mltiplas ovulaes naturais ou induzidas ou com uma nica ovulao. Os achados desses ltimos autores foram reforados posteriormente com os resultados dos trabalhos de Dippert et al. (1994) e Bzard et al. (1995), os quais, respectivamente, no encontraram diferenas significativas nas taxas de fertilizao in vivo e desenvolvimento embrionrio in vitro ou na maturao ovocitria entre guas superovuladas e no superovuladas. 3.4.6 Efeito de tratamentos sucessivos Estudos especficos sobre os efeitos da administrao de EPE em ciclos subseqentes so escassos e, predominantemente, referem-se utilizao de dois ciclos estrais apenas. A esse respeito, na maioria dos relatos no houve diferena na 13

resposta superovulatria de guas entre os tratamentos realizados no primeiro e segundo ciclo estral (WOODS & GINTHER, 1985; PALMER et al., 1993; CARMO, 2003). Hofferer et al. (1991) verificaram apenas uma tendncia a uma melhor resposta no segundo ciclo tratado (3,2 vs 2,2 ovulaes/gua; P=0,07). No mesmo estudo, observaram tambm que a administrao contnua de EPE a guas por 94 dias no impediu a ocorrncia de crescimento folicular e ovulaes, mas peturbou o padro de ondas normalmente verificado do desenvolvimento folicular. Adicionalmente, encontra-se descrito na literatura que repetidas estimulaes ovarianas com EPE por at seis ciclos estrais consecutivos no resultaram em alterao das taxas de ovulao (PALMER, 1985 apud MCCUE, 1996). 4. CONSIDERAES FINAIS Mecanismos que regulam o desenvolvimento folicular e garantem a ocorrcia de apenas uma ovulao na grande maioria dos ciclos estrais conferem espcie eqina, assim como bovina, a designao de monovular. Lamentavelmente, driblar esses mecanismos no tem sido uma tarefa to bem sucedida em guas, diferente do que ocorre em vacas. Embora muitos mtodos de induo de ovulaes mltiplas em guas tenham sido descritos at o presente momento, a utilizao do extrato de pituitria eqina tem fornecido resultados mais satisfatrios. inerentes ao processo superovulatrio. Por isso, tem recebido maior destaque e No entanto, a variabilidade verificada nos gerado uma gama maior de informaes a respeito de algumas particularidades resultados e a grande discrepncia entre o nmero de ovulaes e embries obtidos revelam a necessidade de se continuarem os estudos. Mais recentemente, a utilizao do FSH eqino purificado tem produzido resultados comparveis aos obtidos com EPE. Infelizmente, ambos os preparados no so disponveis comercialmente, o que tem restringido a utilizao dos mesmos. Apesar disso, vale ressaltar que as contribuies fornecidas pelo desenvolvimento de protocolos de superovulao em guas s tecnologias de reproduo assitida j so notveis, podendo tornar-se ainda mais significativas com o avanar das pesquisas. 5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 14

ALVARENGA, M.A. et al. Ovarian superstimulatory response and embryo production in mares treated with equine pituitary extract twice daily. Theriogenology, v.56, p.879887, 2001. BZARD, J. et al. Preovulatory maturation of ovarian follicles and oocytes in unstimulated and superovulated mares. Biol. Reprod. Monog., v.1, p.261-271, 1995. BUNGARTZ, L.; NIEMANN, H. Assessment of the presence of a dominant follicle and selection of dairy cows suitable for superovulation by a single ultrasound examination. J. Reprod. Fertil., v.101, p.583-591, 1994. CARMO, M.T. Comparao entre doses constantes e decrescentes de extrato de pituitria eqina na induo de superovulao em guas. 2003. 156p. Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. DOCCHIO, M.J.D.; JILLELLA, D.; LINDSEY, B.R. Factors that influence follicle

recruitment, growth and ovulation during ovarian superstimulation in heifers: opportunities to increase ovulation rate and embryo recovery by delaying the exposure of follicles to LH. Theriogenology, v.51, p.9-35, 1999. DIPPERT, K.D. et al. Fertilization rates in superovulated and spontaneously ovulating mares. Theriogenology, v.41, p.1411-1423, 1994. DIPPERT, K.D. et al. Initiation of superovulation in mares 5 or 12 days after ovulation using equine pituitary extract with or without GnRH analogue. Theriogenology, v.38, p.695-710, 1992. DONALDSON, L.H.; WARD, D.N.; GLENN, S.D. Use of porcine follicle stimulating hormone after chromatographic purification in superovulation of cattle. Theriogenology, v.25, n.6, p.747-757, 1986. 15

DOUGLAS, R.H. Review of induction of superovulation and embryo transfer in the equine. Theriogenology, v.11, n.1, p.33-46, 1979. GASTAL, E.L. et al. Role of diameter differences among follicles in selection of a future dominant follicle in mares. Biol. Reprod., v.57, p.1320-1327, 1997. GINTHER O.J.; BERGFELT, D.R. Effect of GnRH treatment during the anovulatory season on multiple ovulation rate and on follicular development during the ensuing pregnancy in mares. J. Reprod. Fertil., v.88, p.119-126, 1990. GINTHER, O.J. et al. Selection of the dominant follicle in cattle: role of two-way functional coupling between follicle-stimulating hormone and the follicles. Biol. Reprod., v.62, p.920-927, 2000. GINTHER, O.J. Major and minor waves during the equine estrous cycle. J. Equine Vet. Sci., v.13, p.18-25, 1993. GINTHER, O.J. Reproductive biology of the mare: basic and applied aspects. 2.ed. Equiservices, 1992. 642p. GUILLOU, F.; COMBARNOUS, Y. Purification of equine gonadotropins and comparative study of their acid-dissociation and receptor-binding specificity. Biochim. Biophys. Acta, v.755, p.229-236, 1983. HOFFERER, S. et al. Induction of ovulation and superovulation in mares using equine LH and FSH separated by hydrophobic interaction chromatography. J. Reprod. Fertil., v.98, p.597-602, 1993. HOFFERER, S.; DUCHAMP, G.; PALMER, E. Ovarian response in mares to prolonged tratment with exogenous equine pituitary gonadotrophins. J. Reprod. Fertil. Suppl., v.44, p.341-349, 1991. 16

IRVINE, C.H.G. Endocrinology of the estrous cycle of the mare: applications to embryo transfer. Theriogenology, v.15, n.1, p.85-104, 1981. JOHNSON, A.L. Gonadotropin-releasing hormone treatment induces follicular growth and ovulation in seasonally anestrous mares. Biol. Reprod., v.36, p.1199-1206, 1987. JOHNSON, A.L. Induction of ovulation in anestrous mares with pulsatile administration of gonadotropin-releasing hormone. Am. J. Vet. Res., v.47, n.5, p.983-986, 1986. LAPIN, D.R.; GINTHER, O.J. Induction of ovulation and multiple ovulations in seasonally anovulatory and ovulatory mares with an equine pituitary extract. J. Anim. Sci., v.44, n.5, p.834-842, 1977. MACHADO, M.S. et al. Dinmica folicular, nmero de ovulaes e embries recuperados em guas submetidas a tratamento superovulatrio, utilizando-se extrato de pituitria eqina e FSH eqino purificado. In: XV CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUO ANIMAL, 2003, Porto Seguro. Anais do XV Congresso Brasileiro de Reproduo Animal, 2003 (no prelo). MCCUE, P.M. et al. Ovulation and embryo recovery rates following immunization of mares against an inhibin alpha-subunit fragment. Theriogenology, v.38, p.823-831, 1992. MCCUE, P.M.; HUGHES, J.P.; LASLEY, B.L. Effect on ovulation rate of passive immunisation of mares against inhibin. Equine Vet. J., v.15, p.103-106, 1993 (Supl.). MCCUE, P.M. Superovulation. In: SQUIRES, E.L. (Ed). The veterinary clinics of north america equine practice: diagnostic techniques and assisted reproductive technology. W. B. Saunders, 1996. p.1-11.

17

MCKINNON, A.O. et al. Increased ovulation rates in mares after immunisation against recombinant bovine inhibin -subunit. Equine Vet. J., v.24, n.2, p.144-146, 1992. NAMBO, Y. et al. Effect of passive immunization against inhibin on FSH secretion, folliculogenesis and ovulation rate during the follicular phase of the estrous cycle in mares. Theriogenology, v.50, p.545-557, 1998. PALMER, E.; HAJMELI, G.; DUCHAMP, G. Gonadotrophin treatmens increase ovulation rate but not embryo production from mares. Equine Vet. J. Suppl., v.15, p.99-102, 1993. PIERSON, R.A.; GINTHER, O.J. Ovarian follicular response of mares to an equine pituitary extract after suppression of follicular development. Anim. Reprod. Sci., v.22, p.131-144, 1990. ROSAS, C.A. et al. Evaluation of two treatments in superovulation of mares. Theriogenology, v.49, p.1257-1264, 1998. SCOGGIN, C.F. et al. Strategies to improve the ovarian response to equine pituitary extract in cyclic mares. Theriogenology, v.58, p.151-164, 2002. SIROIS, J.; KIMMICH, T.L.; FORTUNE, J.E. FSH injections early in the cycle induce double ovulations in mares. Theriogenology, v.37, n.1, p.300, 1992. SQUIRES E.L. et al. Reproductive characteristics of spontaneous single and double ovulating mares and superovulated mares. J. Reprod. Fertil. Suppl., v.35, p.399-403, 1987a. SQUIRES, E.L. et al. Comparison of equine pituitary extract and follicle stimulating hormone for superovulating mares. Theriogenology, v.26, n.5, p.661-670, 1986.

18

SQUIRES, E.L. et al. Spontaneous multiple ovulation in the mare and its effect on the incidence of twin embryo collections. Theriogenology, v.28, n.5, p.609-613, 1987b. SQUIRES, E.L.; SEIDEL JR, G.E. Superovulation. In: Collection and transfer of equine embryos. Anim. Reprod. Biothecnol. Lab. Bulletin, n.8, p.32-38, 1995. WOODS, G.L.; GINTHER, O.J. Collection and transfer of multiple embryos in the mare. Theriogenology, v.21, n.3, 1984. WOODS, G.L.; GINTHER, O.J. Follicular dynamics in mares treated with an equine pituitary extract. Theriogenology, v.23, p.297-308, 1985. WOODS, G.L.; GINTHER, O.J. Induction of multiple ovulations during the ovulatory season in mares. Theriogenology, v.20, n.3, p.347-355, 1983a. WOODS, G.L.; GINTHER, O.J. Ovarian response, pregnancy rate, and incidence of multiple fetuses in mares treated with an equine pituitary extract. J. Reprod. Fertil. Suppl., v.32, p.415-421, 1982. WOODS, G.L.; GINTHER, O.J. Recent studies relating to the collection of multiple embryos in the mare. Theriogenology, v.19, n.1, 1983b. WOODS, G.L.; SCRABA, S.T.; GINTHER, O.J. Prospects for induction of multiple ovulations and collection of multiple embryos in the mare. Theriogenology, v.17, n.1, 1982.

19