Bioqumica Analtica 2011/2012 Licenciatura em Bioqumica/FCUL

Departamento de Qumica e Bioqumica

Srie de Problemas #4 Respostas

Alexandra Salvado, n 40267 e Andreia Sousa, n 40261 Questo 4.1. Para determinar aproximadamente a massa molecular relativa do Proteassoma 20S, pode recorrer-se ao grfico de Ferguson. Obtm-se este grfico representando funo da concentrao do gel expressa em %T (figura 1). Atravs das rectas de calibrao obtm-se o Kr (medida do efeito de retardao que a migrao da protenas sofreu pelo gel), sendo que este corresponde ao declive das rectas. Atravs do quadro seguinte (quadro 1) elaborou-se um grfico de Kr em funo da massa molecular relativa (figura 2).
Grfico de Ferguson 2,5 2,0 log10 Rf 1,5 1,0 0,5 0,0 2,5 3,0 %T
Figura 1. Grfico de Ferguson. Quadro 1. Valores de Kr e de Mr para as diferentes

em

lcool desidrogenase y = -0,058x + 2,121 Apoferritina y = -0,158x + 2,216 Tiroglobulina y = -0,234x + 2,313 Proteassoma 26S y = -0,772x + 3,489 Proteassoma 20 S 4,0 y = -0,24x + 2,285

protenas.

Kr lcool Desidrogenase Apoferritina Tiroglobulina Proteossoma 26S Proteossoma 20 S

0,058 0,158 0,234 0,772 0,240

Mr /KDa 150 443 669 2600 ?

3,5

Kr em funo da Mr 1 0,8 Kr 0,6 0,4 0,2 0 0 1000 2000 Mr/ KDa 3000

Como o Kr do proteassoma 20 S 0,240, atravs da recta de calibrao da figura 2 possvel determinar a sua massa molecular relativa:

y = 0,0003x + 0,028

Figura 2.Representao grfica de Kr em funo de Mr

Questo 4.2. A tcnica referida nesta questo de duas dimenses: inicialmente separam-se os tripptidos por cromatografia em papel e depois ao cromatograma obtido aplica-se uma electroforese em papel. Na cromatografia em papel a separao efectuada em funo da polaridade dos solutos presentes na amostra. Neste caso, a fase mvel apolar (mistura de solventes orgnicos: gua/butanol/cido actico, pH 4,5) e a fase estacionria polar.(gua adsorvida no papel).

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Srie de Problemas #4 Respostas Na electroforese em papel, pelo facto das protenas possurem diferentes cargas globais a

um dado pH, permite que misturas das mesmas sejam separadas por electroforese. Protenas com carga global negativa migram para o nodo (plo positivo); protenas com carga global positiva migram para o ctodo (plo negativo) Atendendo s caractersticas dos tripptidos elaborou-se o quadro seguinte:
Quadro 2. Resumo das propriedades (carga e polaridade) dos pptidos e dos aminocidos que os constituem, a pH 6,5.

A Asn Asn Arg Lys Tripptido Carga dos resduos de aminocidos Polaridade dos resduos de aminocidos Carga Global Polaridade global

B Asn Leu Phe

C Asp Phe His

D Leu Phe Val

E Leu 0 Apolar Phe -1 Apolar

+1 Polar

+1 Polar

0 Polar

+1 Polar

0 Apolar

-1 Apolar

+1 Polar

0 Polar

-1 Apolar

0 Polar

0 Apolar

-1 Apolar

+1 Apolar

+2 Polar (+++)

0 Apolar (++)

0 Polar (++)

-1 Apolar (++)

0 Apolar (+++)

Atravs do quadro anterior retira-se que na cromatografia em papel o factor de retardao ( ), por ordem crescente ser:

Na electroforese em papel, B, C e E no migram, D migra para o nodo (+) e A migra para o ctodo (-). O resultado esperado do mapa peptdico est representado na figura abaixo.
Figura 3. 1. Cromatograma da electroforese em papel; 2. Mapa peptdico (cromatograma seguida de electroforese)

Questo 4.3.
A amostra de protenas inicialmente sujeita a focagem isoelctrica (riscas verticais)

e posteriormente a SDS-PAGE (riscas horizontais). Na focagem isoelctrica, as protenas so separadas com base no seu pI. No SDS-PAGE as protenas so separadas com base na sua massa molecular relativa. comum encontrar riscas verticais com vrias protenas alinhadas, pois a um dado pH existem muitas protenas com o mesmo pI (e diferentes massas moleculares). No entanto, raro encontrar riscas horizontais, com vrias protenas alinhadas porque raro existirem protenas com a mesma massa molecular relativa.

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