Caderno de Farmcia, v. 2, n. 1, p. 28-36, 1986.

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ISSN 0102-6593

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digitalizado do original: Caderno de Farmcia, v. 2, n. 1, p. 28-36, 1986

DIAGNSTICO LABORATORIAL DA DIFTERIA

RODRIGUES, L.F.
Coord. Unidade de Bacteriologia, Hospital So Lucas, P. Alegre, RS; Prof. Fac. Medicina, PUC-RS, Equipe de Bacteriologia IPB/SSMA- RS)

RESUMO: A difteria representa ainda uma ameaa, apesar do estgio atual do desenvolvimento na rea de sade. 0 tratamento adequado depende, entre outros fatores, do reconhecimento laboratorial. 0 autor analisa fatores que podem interferir no diagnstico laboratorial da difteria. UNITERMOS: difteria, diagnstico laboratorial, diferenciao laboratorial ABSTRACT: LABORATORIAL DIAGNOSTIC OF DIPHTHERIA. Diphtheria still represents a threat in the present development of health care. The successful treatment, among other factors, call for an efficient laboratory diagnostic. Factors limiting the analytical diagnostic are analyzed by the Author. KEYWORDS: diphtheria, laboratorial diagnostic, laboratorial differentiation INTRODUO Apesar de nossos conhecimentos sobre sua etiopatogenia, seus aspectos cnicos, teraputicos e profilaxia, a difteria ainda uma ameaa entre ns. Fatores que contribuem para que isso acontea esto relacionados com a vacinao deficiente, controle inadequado dos contatos familiares e diagnstico-tratamento retardados. A difteria deve ser sempre cogitada quando diante de uma criana febril e prostrada, sendo obrigatria a procura de pseudomembrana na orofaringe, sem, no entanto, esquecer a possibilidade de existncia de formas isoladas (nasal ou larngea). O diagnstico mdico repousa em seus aspectos clnicos e epidemiolgicos e a letalidade diminui na vigncia do diagnstico precoce e instalao rpida da teraputica especfica. Diversas patologias abaixo relacionadas so freqentemente confundidas com a difteria nas suas diversas localizaes.

Tabela 1. Diagnstico diferencial da difteria TIPO Difteria cutnea Difteria nasal Difteria amigdaliana ou farngea Difteria larngea CARACTERSTICA impetigo, ectima, eczema, lceras rinite estreptoccica, sifiltica, corpo estranho nasal amigdalite estreptoccica, angina mucoltica de Paul Vincent, agranulocitose crupe viral, laringite estridulosa, epiglotite aguda, corpo estranho.

A formao de pseudomembrana tpica parece no depender da produo de exotoxinas pelos microorganismos, uma vez que produzida nas infeces por germes atoxinognicos. Nos casos brandos pode no estar presente. A virulncia do C. diphteriae repousa principalmente no seu poder toxinognico devido a uma potente exotoxina. A molcula da toxina diftrica pode ser dissociada em dois fragmentos pela ao da tripsina e posterior reduo de suas pontes S-S. Desta forma obtm-se dois fragmentos. O fragmento A, que mais leve do que o B e responsvel pela leso bioqumica celular, atingindo, entretanto, somente o citoplasma da clula associada ao fragmento B. A microbiota normal encontrada nas diversas localizaes ir trazer problemas para o diagnstico laboratorial, que demorado, mas

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deve ser realizado, no para uma deciso teraputica, mas para comprovao do diagnstico clnico, posterior controle ou no dos contatos familiares e tambm como critrio de cura microbiolgica. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS Colheita do material: Retirado das leses existentes, ulceraes, criptas das amgdalas, exsudatos de orofaringe e de nasofaringe, (que so localizaes mais comuns), ou de outras leses cutneas conjuntivais e genitais externas, etc..., por meio de swab estril, antes da administrao de qualquer teraputica microbiana. recomendada uma cultura separada do material de nasofaringe. Este procedimento principalmente satisfatrio no caso de enfermo convalescente ou de portador assintomtico, uma vez que o material da orofaringe pode dar resultado negativo. Na colheita do material da orofaringe no remover a pseudomembrana, mas apenas levantar seu bordo a fim de retirar o material por baixo, j que a remoo da pseudomembrana acelera a absoro da toxina. Observar que se colhermos o material do centro da leso ou sem os cuidados necessrios, teramos provavelmente bacilos inviveis e um grande nmero de bactrias da microbiota da orofaringe. Transporte do material: O material deve ser semeado imediatamente, porm se isso no possvel o transporte no meio de Pai ou Leoffler o prefervel, permanecendo o swab no interior do tubo. Entretanto o transporte do swab tambm pode ser feito em gel de slica. Exame microscpico presuntivo por bacterioscopia direta - (Mtodo de Gram e Albert Laybourn): Tem como resultado bastonetes gram positivos, em paliadas e/ou letras chinesas, apresentando os grnulos metacromticos escuros e corpos bacilares em verde claro. A bacterioscopia direta de valor apenas presuntivo, podendo fornecer resultados negativos em casos clnicos tpicos, acompanhados depois de alteraes eletrocardiogrficas e dados anatomopatolgicos. Pode-se observar microrganismos de morfologia no caracterstica de C. diphtheriae e, no entanto, os cultivos mostram-se positivos. O percentual de erros da bacterioscopia direta da ordem de 39,2 %, sendo 7,6 % de falsos negativos e 31,6 % de falsos positivos, uma vez que "difterides" e tambm outros microrganismos (Nocardia, actinomicetos)

podem simular a morfologia do bacilo diftrico e que ainda pode exibir formas cocides. Em concluso, na bacterioscopia direta, mesmo em casos positivos, o laboratrio pode deixar de observar microrganismos sugestivos do bacilo da difteria em esfregaos corados pelos mtodos. Mas nos casos tpicos o microrganismo est presente em grande nmero nas leses e na pseudomembrana. Isolamento de C. diphtheriae em casos suspeitos por semeadura direta (Fig. 1). O laboratrio receber o material adequadamente colhido com swab a partir da garganta e da nasofaringe. As placas de Agar sangue e Agar chocolate telurito so inoculadas em um pequeno segmento. Logo aps, realiza-se o esgotamento do material com a alga bacteriolgica para a obteno de colnias isoladas. Com o mesmo swab semeamos (com movimento de rotao de 360 graus) no meio de Pai ou Loeffler. O swab poder ser deixado no o interior do tubo e incubado a 35 a 37 C, aerobicamente. Um esfregao dever ser realizado a partir do meio de Loeffler aps 8 a 12 horas de incubao e corado pelo mtodo de Gram e Albert-Laybourn. Em muitas ocasies possvel fazer o esfregao com apenas 2 horas de incubao em meio de Loeffler. Aps o exame microscpico, onde foram observados microrganismos com a morfologia celular tpica do bacilo diftrico, pode-se enviar um diagnstico presuntivo ao mdico: presena de bacilos com caractersticas morfotintoriais de C. diphtheriae. Aps 18 horas de incubao o cultivo no meio de Pai ou Loeffler deve ser semeado no Agar chocolate telurito. O Agar sangue ser examinado aps 18 a 24 horas de incubao para afastar a hiptese de estreptoccica e ainda para surpreender amostras do bacilo diftrico que so inibidas pelo telurito. O Agar chocolate telurito, apresentando colnias isoladas e suspeitas, originar o inculo para o meio de King e para o teste de toxinogenicidade (na ausncia de U.V. repicar em meio de Loeffler). Convm enfatizar a necessidade de se procurar pescar vrias colnias suspeitas uma vez que amostras no produtoras de toxinas so encontradas junto com as produtoras. Amostras atoxinognicas, porm, fluorescentes, necessitam de estudo bioqumico adicional, pois podem ser bacilos diftricos.

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Swab 8-12h

A.C.T* 24-48h

Agar Sangue*

Loeffler* ou Pai 18h

A. Layborn

Pesquisa estreptococos beta-hemolticos A.C.T

Pescar colnias suspeitas

King B 24h

I.D.R. **** Toxinogenicidade a,b**

Loeffler***

Fluoresc. +

Fluoresc. -

Difterides

Gram e A.Layborn

Testes Bioqumicos Figura 1 - Pesquisa de casos suspeitos. Isolamento e identificao. *: procedimentos essenciais para identificao e confirmao do bacilo diftrico com um nmero mnimo de meios; **: a - confirmao do resultado negativo. Amostras IDR negativa devem dar fluorescncia negativa; b- fluorescncia positiva com IDR negativa -suspeitar de bacilos diftricos atoxinognicos (relativamente freqentes) ou difterides fluorescentes (raros); ***: na ausncia do King (U.V.); ****: alternativa (Elek). Pesquisas de portadores: (Fig. 2). Uma vez que o material proveniente dos contatos familiares e portadores, pode ser relativamente pobre, isto , pode conter poucas clulas do C. diphtheriae, prefervel inocular antes nos meios de Pai ou Loeffler e a seguir no Agar chocolate telurito. Se o material vai ser enviado a um laboratrio distante poder permanecer incubado por uma noite. Se a pr-incubao no for possvel, o swab dever ser umedecido com algumas gotas de caldo ou soluo salina isotnica estril e semeado em Pai ou Loeffler e incubado overnight. Se h uma grande demora (6 a 9 semanas) no transporte do swab dessecado para o laboratrio, o bacilo diftrico pode ser recuperado pela introduo do swab em um tubo com caldo Todd-Hewitt adicionado de 3 % de sangue de coelho e incubar a mistura por uma noite antes da inoculao no meio com telurito. O crescimento obtido nos meios de Pai ou Loeffler semeado em Agar chocolate telurito para obteno de colnias isoladas. As placas so examinadas 24/48 h aps. Se a leitura for negativa aps 48 h desprezar as placas. As colnias suspeitas so repicadas para o meio de King (na ausncia de U.V. repicar para meio de Loeffler) e incubadas por uma noite. A partir das amostras fluorescentes realiza-se uma bacterioscopia (Gram e Albert-Laybourn). Se a morfologia celular lembrar o C. diphtheriae passaremos ao teste de toxinogenicidade e as provas bioqumicas.

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Swab Loeffler ou Pai 18h A.C.T. 4-48h Pesquisar colnias suspeitas

King B* 18-24h Fluorescncia Positiva

Loeffler 18-24h Fluorescncia Negativa

Difterides Gram e Albert Layborn IDR Bioqumica

Figura 2: Pesquisa de portadores. Isolamento e identificao. *: no contando com o meio de King, repicar as colnias suspeitas para o meio de Loeffler. BIBLIOGRAFIA 1.FORMIGA, L.C.D. Normas tcnicas para o diagnstico laboratorial da difteria. Braslia: Ministrio da Sade, Secretaria Nacional de Laboratrios de Sade Pblica. 2.RODRIGUES, L.F. Normas tcnicas do Instituto de Pesquisas Biolgicas. Porto Alegre: Secretaria da Sade e do Meio Ambiente.

Documento redigitalizado por Elias G. Schunck, Monitor da Disciplina FAR 02011/FFAR/UFRGS, programa ProGRAD.