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BiotecnologiaMolecular
MestradoIntegradoemEngenhariaBiolgica UniversidadedoMinho

Protenas recombinantes Clonagem,expressoe purificao

17deNovembrode2011 17 d N b d 2011

EduardoCoelho LaraFranco

o Sistemasdeexpresso Sistemasemantibiticos o Clonagem o Expressoproteica o Purificao deprotenas o Utilizao deparceiros defuso

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Produodeprotenas Produtodeelevadointeressenomercadoactualdemolculas bioactivas

Medicina Diagnstico Alimentao Nutrio Detergentes

Txteis Couro Papel Polmeros Plsticos

Necessidadedemetodologiasquepermitam: Elevadosrendimentosdeproduo Obtenodeprotenaactiva Baixocustoecomplexidadedeprocesso Nveisdepurezasatisfatrios

ProtenasversusProtenasrec combinantes

Protenas

Protenasrecombinantes

Sintetizadasportodos osseres vivos. Sintetizadasdeforma natural. Essenciais vida de todososorganismos vivos. Biomolculas

Sintetizadasatravsda tecnologiadeDNA recombinante. Sintetizadaspor manipulao/alterao genticadoorganismo hospedeiro. Muitasaplicaes: medicina,indstria (qumica,farmacutica, (qumica farmacutica alimentar) investigao,

Componentesqumicos maisimportantes do mais importantes do ponto devista estrutural.

Sequncia de aminocidos Sequnciadeaminocidos Traduo proteica DNA mRNA Protena

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TecnologiadaDNArecom mbinante

DNAdeinteresse

Vetordeexpresso

Hospedeirodeexpresso

Promotor

DNAdeinteresse

Origemde replicao Marca de seleo

Sistemadeexpresso Sistema de expresso

Promotor

DNAdeinteresse

Sistemasdeexpresso Marc deseleo ca

Origemde replicao

Marca de seleo

Funes:
Permiteaseleoepropagaodovetornaclulahospedeira. Necessriaparaqueoplasmdeosemantenhanaclula.graasaelaqueoplasmdeotil paraaclula. para a clula

Sobcondiesseletivasapenasconseguemsobreviveras clulasquecontmoplasmdeocomamarcadeseleo apropriada.

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Promotor

DNAdeinteresse

Origemde replicao

Sistemasdeexpresso Marc deseleo ca

Marca deseleo

Genesqueconferemresistnciaaumdado Genes que conferem resistncia a um dado antibitico (ex.:ampicilina,kanamicina,...) aoqualaclulahospedeirasensvel. Osmaisutilizados
Desvantagens

Sistemassemantibiticos Si ibi i

Riscosparaasadehumanadevido disseminaodogenederesistncia. Perdadepressoseletiva(como resultadodadegradaodoantibitico). resultado da degradao do antibitico) Cargametablicaexcessivaparaaclula hospedeiradevidoexpresso constitutivadogenederesistncia.
Antibitico

Ultrapassartodasasdesvantagensdossistemas convencionais(comantibiticos). Podemlevarobtenodecaractersticas muitodesejveis,comoumaumentode produoacentuadodaprotenarecombinante. Geralmenteutilizamestirpesmutantes. Ex.:Sistematoxinaantitoxina(Postsegregational killing PSK) Complementaognicaessencial(Essential genecomplementation) Sistematitulaooperadorrepressor(ORT OperatorrepressorTitration)

Expressoproteica

Expressoproteica

SistemaStabyExpress(DelphiGenetics)

Sistemadeexpressosema antibiticos

Sistemadeseleotoxina antitoxina

Antdoto Toxina Alvo Genedeinteresse

Antdoto/antitoxina

Crescimentodabactria

Vetordeexpresso

Marca deseleo

HospedeirodeexpressoE.coliSE1 (estirpe mutante)

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ClonagemdoDNAdeinteresse

Enzimasderestrio Enzimas de restrio do MultipleCloningSite

DNAdeinteresse

Vetordeexpresso

Vetordeexpresso

DNA de interesse DNA template

PCR
Primer forward

NdeI

Primer reverse

XhoI

ClonagemdoDNAdeinteresse

ObtenodoDNAdeinte eresse

dNTPs

AmplificaodoDNAdeinteresse

Produto PCR (PPCR ) Adeninas DNA NdeI DNA de interesse template X hoI DNA Adeninas template

EletroforesedeDNA

Visualizar o PPCR

Eletroforese deDNA

GeldeagarosedosPPCRs

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CortarosPPCRs dogel

Kitdeextraco e purificao deDNA

PPCR

Cl lonagemdoDNAdeinteress se

Is solamentoepurificaodoPPCR R

PPCRemsoluoaquosa GeldeagarosedosPPCRs
Produto PCR (PPCR ) Adeninas DNA NdeI DNA de interesse template X hoI DNA Adeninas template

LigaodoPPCR aovetorde clonagem

PPCR

Transformar clulasE.coli

pGEMrecombinante

VetordeclonagempGEM E.coli

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PPCR

ClonagemdoDNAdeinteresse

SequenciaodoDNAdein nteresse

Crescimento emplaca

E.coli
Kitdeextrao e purificao deDNAplasmdico

pGEM recombinante

DeteodemutaesnoDNAdeinteresse

Sequenciao

pGEMrecombinante emsoluoaquosa

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VantagensemutilizarovetordeclonagempGEM:

ClonagemdoDNAdeinteressenove etordeexpresso

ClonagemdoDNAdeinteresse

Permiteidentificarosclonesrecombinantes(genelacZ codificaparaaenzimagalactosidase;inserodo DNAdeinteressenovetor colniasdecorbranca). FacilitaavisualizaodadigestodoPPCRcomNdeIe XhoI.

VetordeclonagempGEM Vetor de clonagem pGEM

200pb

DNAdeinteresse DigestocomNdeIeXhoI
Produto PCR (PPCR ) Adeninas DNA NdeI DNA de interesse template X hoI DNA Adeninas template

10pb
Impossvelver emgeldeagarose

RestodoPPCR

PPRC

3015pb

RestodopGEM PPCR DigestocomNdeIeXhoI

200pb

DNAdeinteresse

Ambososfragmentossovisveisemgeldeagarose

pGEMrecombinante 13

Confirmaodasequncia (sequenciao)

Marcador
pGEM pGEM

ClonagemdoDNAdeinteressenove etordeexpresso

ClonagemdoDNAdeinteresse

PPCR

DNAdeinteresse

DNAdeinteresse

Digestocom NdeIeXhoI
DNAdeinteresse DNA de interesse

Geldeagarosedoresultadodasdigestes pGEMrecombinante
NdeI DNA de interesse XhoI
CortaroDNAdeinteresse dogel Kitdeextraoepurificao deDNA

NdeI

DNA de interesse

X hoI

LigaodoDNAdeinteresse aovetordeexpresso

DNAdeinteresseemsoluoaquosa Vetordeexpresso

DNAde interesse

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ClonagemdoDNAdeinteressenove etordeexpresso

DNA de interesse

X hoI

NdeI

ClonagemdoDNAdeinteresse

Transformarclulas E.ColiSE1

NdeI

DNA de interesse

XhoI

pStaby1.2 recombinante

pStaby1.2 recombinante

E.ColiSE1
Crescimento emplaca

Deteodemutaes noDNAdeinteresse

Sequenciao

Kitdeextrao e purificao deDNAplasmdico

Expresso proteica

pStaby1.2recombinante emsoluoaquosa

Protenarecombinante

Cloneconfirmadoporsequenciao
Crescimento celular o/n (37Ceagitao)

Expressoproteica

Prcultura Inoculaodemeio comaprcultura

Expressoproteica

Crescimentocelulardurante3h (37Ceagitao)

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AdiodeIPTG
Expressoproteica

Expressoproteica

Crescimentocelulardurante3h (37Ceagitao)

Induoproteicadurante4h (37Cecomagitao)

X hoI

DNA de interesse

NdeI

pStaby1.2 recombinante

NdeI

DNA de interesse

X hoI

pStaby1.2 recombinante

E.ColiSE1

E.ColiSE1

Expressoproteica

Papel doIPTG

IPTG:
Anlogodalactose. Ligaseaorepressorlac,permitindoaligaodaRNApolimeraseaopromotoreatranscrio dogenedeinteresse.

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Protenarecombinante + ProtenasdaE.coli

E.ColiSE1

Extraoproteica
e

Purificaoproteica

Purificaodeprotenas Passomaisrepresentativonoscustosdeproduo Processostradicionaismorososedebaixorendimento

necessriasentre810 operaesunitriaspara recuperaesnaordemdos1,7 eos0,6%

Consoanteautilizaodaprotenapodemsernecessrios diferentesgrausdepureza g p Pureza >99% 9599% <95% Aplicao Uso teraputico,estudosin vivo Caracterizaofsicoqumica Produodeanticorpos, sequenciao

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Problemainicial

Comoencontrarumaagulhanumpalheiro? Caractersticasdaagulha Caractersticas da agulha Caractersticasdapalha Factordeseparao? Comoencontrarumapedranummontedeareia? Caractersticasdapedra Caractersticasdaareia Factordeseparao?

Purificaodeprotenas Parmetroscaractersticosdeumaprotena: aminocidos estruturatridimensional domnios funcionais domniosfuncionais Composiodoextracto: Mltiplasprotenas Lpidos Sacardeos Sais . FactordeSeparao: carga hidrofobicidade pesomolecular afinidade Caractersticospara cadaprotena

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Purificaoporcromatografia Ascaractersticasdeumadeterminadaprotenaconferemlhe capacidadedeinteragircomumelementoimobilizadonumamatriz Interacesintermoleculares forasinicas ligaesdiplo pontesdehidrognio forasdeVan derWaals interaes hidrofbicas

Cadaprotenapossuipropriedadesdistintas Escolhadamatrizessencial

Metodologiageraldepurificaoporcromatografia Aligaopromovidapelocontactodaprotenacomamatrizatravs defluxocromatogrfico p p Processopodeserdivididoem3passos: Ligao Passagemdaprotenana matrizcompromooda ligao

Lavagem

Remoodecomponentes ligadosindesejadamente

Eluio

Passagemdeuma soluoquequebraa ligaodaprotenacoma matriz

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Mtodoscromatogrficos Cadaprotenapossuicaractersticasdistintasquedeterminam: Mecanismodeligao Matrizdepurificao Condiesdeeluio

Diversidadedeprocessoscromatogrficos

Exclusomolecular Peneirarprotenas Amatrizpossuiumaestruturaporosacapazde fraccionarasprotenasnoextractodeacordo comoseupesomolecular

Aplicvelatodasasprotenas Baixa resoluo e especificidade Baixaresoluoeespecificidade Menosadversaparaaprotenaalvo

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Cromatografiadetrocainica

Separaobaseadanacargade superfciedaprotena

PontoIsoelctrico:ValordepHnoqualamolculaapresentauma carganula ProcessodependentedopHdasoluo pH>pI >Protenacaregada negativamente g Trocaaninica pH<pI >Protenacarregada positivamente Trocacatinica

Protenapermutacomum iodeigualsinal adsorvido namatriz Eluio efectuasecomo aumentodaconcentraodo iocompetidorpelaligao Processosimplese poucoadversoparaa protenaalvo Permiteum fraccionamentodas protenasdaamostra

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Cromatografiadeinteracohidrofbica
Cadaaminocidopossuiumahidrofobicidade caracterstica

Existnciaderegieshidrofbicasna superfciedaprotena

Altasconcentraesdesaisemsoluo promovemaexposiodasregies hidrofbicas Ligaoaoelementoigualmente hidrofbicoimobilizadonamatriz hidrofbico imobilizado na matriz Eluio decorrecomoabaixamentoda concentraodesais Maisespecfica Condiesgeralmentepoucoadversas

Cromatografiadeafinidade Umaprotenapodepossuirafinidadeporumelementoespecfico imobilizadonumamatriz Anticorpo Antignio Enzima Substrato Protena Io

Elevadaespecificidadeeforadeligao +Maiorgraudepureza Necessidadederecorrera condiesdeeluio maisadversas pararecuperaraprotena

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Purificaodeprotenasrecombinantes emEscherichia coli Problemaadicional Comoencontrarumpalitonumpalheiro?

Oquefazerquandoasprotenasdoextractopossuem caractersticasextremamentesemelhantes? Tags defuso Expressodaprotenaalvojuntamentecomumparceiroquepossua umaafinidadeconhecidaporumamatriz

Aumentosdesolubilidadeeexpresso Melhoriasnapurificao

Utilizaodetags deafinidadenapurificaodeprotenasheterlogas Ostags deafinidadetmacapacidadede interagircomumelementoimobilizado numamatriz Elevadaafinidadedeligao Elevada afinidade de ligao

Especificidadenaseparao

Recuperaodaprotenadesejadaa partirdeumextractocomplexo

Concepodeprocessosdepurificaomaiseconmicoseeficazes

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Algunsexemplosdetags depurificao HisTag Caudade6histidinas quepossui afinidadepelonquel Glutathione Stransferase Tag queconsistenumaenzimaque possuiafinidadepelaglutationa

Maltose Binding Protein Tag quepossuiafinidadepelamaltose imobilizadanumamatriz

Remoodotag Otag podeinterferirnaactividadedaprotenaalvo

Incorporao de um local de clivagem entre o tag e a protena ao nvel d vector d expresso l do de

Utilizaodeproteases Utilizao de proteases especficasparacortaraprotena defuso Separaodotag daprotenaalvopor purificaodomesmo

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Purificaodeprotenasemprtica Colunasdepurificao: Empacotadascomresinasdeadsoro Xerogis Aerogis Gisdecompsito

Leitosporososnosquaisaplicadoofluxo cromatogrfico

Recuperaodasfracespara R d f anlisedaprotena 1 Extractonopurificado 2 Fraconoaderida 3 Fracespurificadas 12 3

Sistemasautomatizados

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

Execuoautomatizadados procedimentos Acompanhamentoemtempo real Recolhaautomticadefraces

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FIM

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