BASES DA MEDICINA CELULAR E MOLECULAR II

ROTEIROS AULAS PRTICAS BACTERIOLOGIA 2009

Docentes:

Beatriz E. Cabilio Guth: bec.guth@unifesp.br Rosa Maria Silva: rmsilva01@unifesp.br Sylvia C. Leo: sylvia.leao@unifesp.br Tnia A. Tardelli Gomes tatg.amaral@unifesp.br Coordenadora do Amaral:

REGRAS DE CONDUTA MICROBIOLOGIA

NO

LABORATRIO

DE

As aulas prticas de bacteriologia foram planejadas para mostrar a voc, estudante de Medicina, os princpios e os mtodos clssicos utilizados em laboratrios de diagnstico microbiolgico. Nessas aulas, voc trabalhar com uma variedade de bactrias, algumas patognicas para o homem. , portanto, essencial que voc siga as regras de segurana estabelecidas para um laboratrio de microbiologia, a fim de evitar contaminaes do grupo ou de funcionrios. 1. Desinfete sua bancada no incio e ao trmino de cada aula prtica. Com isso, estar destruindo os microrganismos que podero contaminar suas culturas e os que tenham contaminado a rea de trabalho. 2. No coma nem fume no laboratrio. Se a bancada ou o equipamento tiver sido contaminado acidentalmente com qualquer microrganismo, comer ou fumar um meio eficiente para uma autocontaminao. 3. Use sempre o avental. Se ele acidentalmente ficar contaminado, no deve ser utilizado fora do laboratrio.

4. Lave as mos ao sair do laboratrio.

5. Avise o professor em caso de contaminao acidental. 6. No coloque materiais contaminados (pipetas, lminas, etc) sobre o balco. Sempre haver um recipiente prprio para coloc-los.

1. Aula Prtica 11/02/2009 NUTRIO, CRESCIMENTO E METABOLISMO BACTERIANO

O METABOLISMO bacteriano compreende reaes de DEGRADAO de compostos (CATABOLISMO) para obteno de ENERGIA que ser utilizada em reaes de SNTESE (ANABOLISMO). As REAES METABLICAS necessitam de ALTA ENERGIA, o que causaria um superaquecimento da clula. Este problema resolvido com o auxlio de ENZIMAS que DIMINUEM A ENERGIA necessria para que as reaes metablicas ocorram. As bactrias podem utilizar diferentes fontes de Carbono e de Energia.

FONTES DE CARBONO

FONTES DE ENERGIA

CO2

Compostos Orgnicos

Compostos Orgnicos e Inorgnicos

Bactrias Autotrficas

Bactrias Heterotrficas

Bactrias Quimiotrficas

Bactrias Fototrficas

A MAIORIA DAS BACTRIAS, bem como todos os fungos, protozorios e animais so QUIMIO-HETEROTRFICAS, pois sua fonte de energia pode ser de compostos tanto orgnicos como inorgnicos e sua fonte de carbono so os compostos orgnicos.

A OBTENO DE ENERGIA se faz atravs de REAES DE XIDOREDUO e esta energia armazenada em molculas como ATP, NADH, FADH.

As bactrias tm 3 formas de acumular energia: RESPIRAO AERBICA,

RESPIRAO ANAERBICA E FERMENTAO. RESPIRAO AERBICA = O OXIGNIO O ACEPTOR FINAL DE eGLICOSE GLICLISE (AC. PIRVICO) CICLO DE KREBS e
-

CADEIA DE

TRANSPORTE DE

38 ATP + CO2 + H2O SOMENTE OCORRE NA PRESENA DE OXIGNIO

RESPIRAO ANAERBICA = OUTRO COMPOSTO INORGNICO O ACEPTORFINAL DE e-

(NO3-, SO4= , CO3= , etc.)

GLICOSE GLICLISE (AC. PIRVICO) CICLO DE KREBS TRANSPORTE DE eCADEIA DE

> 2 ATP + (NO2 ou N2 ou H2S ou CH4 , etc.) SOMENTE OCORRE NA AUSNCIA DE OXIGNIO

FERMENTAO = COMPOSTOS ORGNICOS SO OS ACEPTORES FINAIS DE e(AC. LTICO, ETANOL, etc.) GLICOSE GLICLISE (AC. PIRVICO) COMPOSTOS ORGNICOS + 2 ATP

NO UTILIZA OXIGNIO, MAS OCORRE TANTO NA PRESENA COMO NA AUSNCIA DE OXIGNIO

O CRESCIMENTO BACTERIANO significa AUMENTO DO NMERO de indivduos na populao e, portanto, requer DIVISO CELULAR. 1 2 4 ........... 2
n

A DIVISO CELULAR necessita que as clulas bacterianas estejam METABOLICAMENTE ATIVAS. Existem CONDIES FSICAS E QUMICAS TIMAS para que as reaes metablicas ocorram e que as bactrias se dividam aumentando a populao.

REQUERIMENTOS FSICOS PARA O CRESCIMENTO BACTERIANO

TEMPERATURA h bactrias adaptadas para crescer a 0oC, outras preferem 90oC. Entretanto, a maioria das espcies de importncia mdica cresce entre 20 e 40oC. a maioria tem pH timo de crescimento em torno de 7,0. o citoplasma bacteriano contm cerca de 80% de H2O necessria para que as reaes metablicas ocorram. A perda de gua intracelular leva parada do metabolismo e, portanto, do crescimento bacteriano.

pH

UMIDADE

QUESTES POR QUE SE USA A GELADEIRA OU O CONGELADOR PARA CONSERVAR OS

ALIMENTOS POR MAIS TEMPO?

POR QUE A CARNE SALGADA SE CONSERVA POR LONGO TEMPO, MESMO TEMPERATURA AMBIENTE?

POR QUE O LEITE CONDENSADO NO SE ESTRAGA COM A RAPIDEZ DO LEITE

COMUM?

REQUERIMENTOS QUMICOS PARA O CRESCIMENTO BACTERIANO

CARBONO NITROGNIO ENXFRE FSFORO constitui 50% do peso seco celular constitui 15% do peso seco celular constituem 3 % do peso seco celular

ctions K++, Mg++, Ca++ metais Fe, Cu, Zn outros elementos - traos

OXIGNIO com relao classificadas em: AERBIAS ESTRITA necessidade de oxignio, as bactrias so

NO VIVEM SEM O2 ELIMINAM RADICAIS O2- E H2O2 pela ao das enzimas SUPERXIDO-DISMUTASE (SOD), CATALASE E PEROXIDASE.
SOD

2 [O2-] + 2 [H+]

H2O2 + O2
catalase peroxidase

O2 + H2O H2O

OBS.: algumas reaes no esto balanceadas

ANAERBIAS FACULTATIVAS ANAERBIAS ESTRITAS

A PRESENA DE O2 INDIFERENTE USAM O O2 DA GUA PARA FORMAR ALGUNS COMPOSTOS, MAS NO O USAM PARA OBTER ENERGIA TM SUPERXIDO-DISMUTASE, MAS NO TM CATALASE PRECISAM DE O2 EM BAIXAS CONCENTRAES

ANAERBIAS AEROTOLERANTES MICROAERFILOS

A EXPOSIO AO O2 GERA PRODUTOS TXICOS, DURANTE AS REAES DE XIDO-REDUO. ESTES PRODUTOS SO MUITO REATIVOS E DANIFICAM PROTENAS, DNA E LIPDEOS. PARA INATIV-LOS SO NECESSRIAS ENZIMAS COMO A SUPERXIDODISMUTASE, CATALASE E PEROXIDASE.

EXERCCIO SOBRE NECESSIDADE DE OXIGNIO Voc recebeu 4 tubos contendo cada um, um tipo de cultura bacteriana. O meio de cultura, no caso, possui um redutor de oxignio e um indicador de oxignio, que fica rseo na presena de O2. Identifique as regies do tubo aonde h presena e ausncia de O2. Com relao exigncia de O2 para seu metabolismo: qual o tipo de bactria no tubo 1? Por qu? qual o tipo de bactria no tubo 2? Por qu? Qual o tipo de bactria no tubo 3? Por qu? Qual o tipo de bactria no tubo 4? Por qu?

CULTIVO BACTERIANO
Para estudar as bactrias, ou para utiliz-las na indstria, por exemplo, h necessidade de cultiv-las. Para isto, desenvolveram-se meios de cultivo utilizados em laboratrio. De um modo geral, as bactrias de importncia mdica podem ser cultivadas em meios lquidos ou meios slidos. TCNICAS DE INOCULAO: A inoculao dos meios de cultura pode ser feita com fio ou ala de platina, pipeta, palitos ou suabes esterilizados, assim como materiais de plstico estreis descartveis. As seguintes normas devem ser seguidas nas inoculaes dos meios de cultura: a) O fio e ala de platina devem sempre ser flambados antes e depois de qualquer inoculao, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro, na chama do bico de Bunsen. importante deix-los esfriar (sem assoprar) por alguns segundos antes de entrarem em contato com a cultura bacteriana a ser inoculada. Este procedimento no dever ser utilizado no caso de fios e alas de material plstico descartvel, os quais devero ser usados diretamente e descartados em recipiente apropriado. b) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com meio de cultura devem sempre ser abertos prximo chama do bico de Bunsen. c) A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida aps a retirada e antes da colocao da tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balco, sendo retirada e mantida presa pelo dedo mnimo da mo direita durante a inoculao.

No entanto, para o CULTIVO DE BACTRIAS ANAERBIAS imprescindvel que se retire todo o Oxignio do meio de cultivo e que a cultura seja incubada na ausncia desse gs. Para isso, existem tcnicas apropriadas.

Jarra de Anaerobiose contm um catalisador para a seguinte reao: O2 + 2H2 paldio 2H2O

Cmara de Anaerobiose

Entretanto, NO ESQUEA, AINDA HOJE existem bactrias NO CULTIVVEIS em meios de laboratrio, sendo as de maior importncia mdica: Mycobacterium leprae Treponema pallidum Chlamydia, ricktsias

ASPECTOS DO METABOLISMO BACTERIANO

Diferentes bactrias podem utilizar uma variedade enorme de substratos para obter energia e elementos bsicos para as suas reaes de sntese metablica. Cada gnero ou espcie bacteriana tem um conjunto de enzimas que lhe permitir a utilizao de determinados substratos, algumas podendo ser utilizadas para diferenciar uma espcie de outra. Voc recebeu uma placa com um meio de cultura contendo, entre outros nutrientes, 0,2% de amido. Essa placa foi semeada com duas culturas bacterianas: a Escherichia coli e o Bacillus circulans. Uma delas produz a enzima amilase que hidrolisa o amido (polmero de -D-glicose) presente no meio de cultura, para poder utiliz-lo como uma fonte de energia. Sabendo que o amido em contato com iodo torna-se escuro, adicione iodo sobre a superfcie da placa e responda: - Qual a bactria produtora de amilase? - Como voc chegou a esta concluso?

CONCEITO DE CULTURA PURA

Em muitas situaes fundamental que se trabalhe com culturas bacterianas puras, isto , culturas aonde haja somente um nico tipo de microorganismo. Para isto necessrio o conhecimento de mtodos que permitam avaliar a pureza de uma cultura. H vrios mtodos de cultivo de bactrias e diferentes formulaes de meios de cultura que sero vistos ao longo das aulas prticas. Siga as orientaes do professor para fazer o que se pede a seguir:

Voc recebeu trs tubos de ensaio contendo as culturas A, B e C em estoque. - com o auxlio de ala descartvel estril, semeie as trs culturas separadamente em meio lquido. - os tubos semeados sero incubados a 37oC e utilizados na aula seguinte.

CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO

O ciclo de vida de uma cultura bacteriana conhecido como CURVA DE CRESCIMENTO. O tempo de gerao o tempo necessrio para que a populao dobre em nmero. A maioria das bactrias tem um tempo de gerao entre 1 e 3 horas. Mas, existem bactrias de grande importncia mdica que tm um tempo de gerao que pode chegar a ser de 12 horas (Ex. Mycobacterium tuberculosis, Leptospira interrogans). Se voc semear uma bactria em um tubo contendo meio lquido e analisar a cultura em termos de bactrias viveis, voc observar, ao longo do tempo, uma tpica curva de crescimento bacteriano, representada no grfico abaixo:

Nmero de bactrias viveis

2 1

t (horas) Fase 1 = Fase lag = a cultura est se adaptando ao meio, tem baixa taxa de diviso celular. Fase 2 = Fase logartmica = a cultura apresenta diviso em taxa constante. Fase 3 = Fase estacionria = no. de bactrias viveis igual ao no. de bactrias mortas. Fase 4 = Fase de declnio ou morte = no. de bactrias mortas > no. de viveis.

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2 Aula: CULTIVO. MEIOS SELETIVOS E DIFERENCIAIS. COLORAO DE GRAM Esta coleo de experimentos prticos ser desenvolvida em trs dias, tendo como objetivo introduzir o aluno s tcnicas de cultivo, isolamento e identificao presuntiva de diferentes espcies bacterianas. Nossa proposta que as espcies bacterianas contidas em uma mesma cultura sejam isoladas e identificadas por meio de provas bioqumicas, a exemplo do que ocorre na identificao de patgenos bacterianos presentes em material clnico proveniente de stios contendo uma microbiota normal.

1. dia: 12/02/2009
CULTIVO BACTERIANO BACTERIANO Como mencionado na aula anterior as bactrias podem ser cultivadas em meios lquidos ou meios slidos. Os meios de cultura podem ser seletivos quando contm uma substncia que inibe o crescimento de um determinado grupo de bactrias, mas permite o crescimento de outras. Alguns meios slidos so chamados diferenciais quando permitem diferenciar colnias que apresentam propriedades distintas.

Exerccio 1: Compare as culturas A, B e C, semeadas anteriormente em meio lquido, entre si e com o contedo de um tubo contendo o mesmo meio de cultura no inoculado.

Voc consegue identificar em qual delas houve crescimento bacteriano? Por qu?

Compare agora as culturas A, B, C com a cultura D entregue pelo professor. possvel identificar se estas culturas bacterianas so culturas puras?

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Exerccio 2: a. Homogeneze as 3 culturas bacterianas (culturas A, B e C) crescidas em meio lquido e semeie cada uma dessas culturas em placas de Petri contendo gar nutriente, gar sangue e gar MacConkey, para a obteno de colnias isoladas, de acordo com as instrues do professor e a descrio abaixo. b. Homogeneze tambm a cultura D e semeie em uma outra placa de gar MacConkey para a obteno de colnias isoladas. c. Identifique as placas com os nmeros do laboratrio e da turma e entregue-as ao monitor para que sejam incubadas at o dia seguinte, em estufa a 37C.

2o dia: 13/02/2009

Observe cada uma das culturas A, B, C e D semeadas em uma placa contendo meio slido. possvel agora verificar se alguma delas uma cultura bacteriana pura? Por qu?

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Exerccio 3: Observe novamente as placas semeadas e responda: 1. gar nutriente: a. Houve crescimento de colnias? b. Que colorao apresenta as colnias crescidas? 2. Agar sangue: a. Houve crescimento de colnias? b. Que alteraes voc observa no meio? 3. Agar MacConkey: a. Houve crescimento de colnias? b. Que colorao apresenta as colnias crescidas? c. Houve fermentao da lactose? Em quais colnias?

Exerccio 4: a. Realize um esfregao de uma colnia crescida em MacConkey e de uma colnia hemoltica crescida em gar sangue, de acordo com as instrues do professor e as orientaes abaixo. b. Repita o procedimento para fazer um esfregao de material colhido de mucosa oral, com cotonete. c. Realize a colorao de Gram, conforme as instrues.

COLORAO DE GRAM

http://www.meddean.luc.edu/lumen/DeptWebs/microbio/med/gram/gram-stn.htm

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A colorao de Gram (Hans Christian Gram, 1884) diferencia bactrias em Gram-positivas e Gram-negativas. Organismos Gram-positivos e Gram-negativos se diferenciam drasticamente na organizao das estruturas externas membrana plasmtica.

PREPARO DO ESFREGAO
1. Coloque uma gota de soluo salina sobre uma lmina de microscopia. 2. Com palito esterilizado, toque uma colnia isolada e suspendaa na salina.

3. Homogeneze a suspenso e espalhe-a sobre a lmina, de forma a obter uma camada homognea e pouco densa (esfregao). 4. Seque o material ao ar e fixe levemente passando rapidamente sobre a chama do bico de Bunsen.

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COLORAO
1. Cobrir toda a lmina com soluo de cristal violeta. 2. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia. 3. Cobrir a lmina com lugol (KI + I2). 4. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia. 5. Inclinar a lmina e gotejar lcool etlico a 95% at que no haja desprendimento de corante. 6. Lavar a lmina rapidamente em gua corrente. 7. Cobrir com fucsina de Gram. 8. Aguardar 30 segundos. 9. Lavar a lmina e secar com papel (sem esfregar).

3. Dia: 18/02/2009 Exerccio 5: Exame ao Microscpio Inicialmente, focalize com as objetivas de menor aumento e depois coloque uma gota de leo de cedro sobre o esfregao e focalize em imerso (o objeto aumentado 1000x). Observe o tipo de colorao (Gram + ou Gram -), a forma e o tipo de arranjo das bactrias fornecidas. Ao trmino da observao, limpe a objetiva de imerso com papel absorvente.

RESPONDA
- Como se explica a diferena de colorao das bactrias Gram-positivas e Gramnegativas?

- O que aconteceria com uma bactria Gram-positiva tratada com lisozima (hidrolisa as ligaes entre acares da camada de peptideoglicano, desestabilizando-a)?

- Qual a utilidade prtica da colorao de Gram para o mdico?

- Que outros elementos voc pde observar no esfregao de mucosa oral? 19

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EXPERIMENTOS DE GENTICA BACTERIANA 1 dia: 04/03/09 Os experimentos delineados a seguir demonstram a ocorrncia de alterao gentica em uma das bactrias utilizadas. O objetivo determinar qual bactria foi modificada e qual(is) evento(s) gentico(s) poderia(m) explicar o resultado obtido.

Amostras bacterianas utilizadas e suas caractersticas relevantes Marcas de Resistncia* Amostra A [E.coli J53 (pR1)] B [E. coli MA 3456] Fermentao de lactose lac + lac
_

cromossmicas Nal

plasmidiais Et, Clo, Ap -

* Et = estreptomicina, Clo = cloranfenicol, Ap = ampicilina, NaI = cido nalidxico

As duas culturas bacterianas sero colocadas em contato, de acordo com as condies abaixo: IEm um tubo de ensaio adicione: - 1 ml de cultura em caldo TSB da amostra A - 1 ml de cultura em caldo TSB da amostra B - 1 ml de caldo TSB II Incube essa mistura (M) bem como as culturas parentais (A e B) a 37oC, durante 1 hora pelo menos.

Experimento 1: Utilizando palitos estreis, semeie as amostras A, B e a mistura M em placas contendo meio seletivo MacConkey (Nal 50 g/mL + Ap 50 g/mL), de acordo com o esquema abaixo. Para controle de viabilidade, semeie as mesmas culturas no meio de MacConkey sem drogas. Incube as placas a 37 oC por 16-18 h. M B A

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2 DIA: 05/03/09 Leitura do experimento 1 I - Registre os resultados obtidos Bactria A B M II - Compare as caractersticas das colnias crescidas e responda: - Quem a bactria crescida na placa com droga? crescimento em meio sem droga crescimento em meio com droga

- Neste momento, quais as hipteses possveis para explicar o ocorrido?

Experimento 2: Determine a resistncia das amostras A, B e M (resultante da mistura semeada em meio seletivo) para as drogas cido Nalidxico (Nal), Estreptomicina (Et), Cloranfenicol (Co) e Ampicilina (Ap), utilizando o seguinte protocolo: com palito estril, pegue algumas colnias crescidas na placa com droga (M) e semeie em placas de MacConkey contendo cada droga isoladamente, nas concentraes de: Nal = 50 g/ml, Ap = 50 g/ml, Co = 30 g/ml, Et = 20 g/ml. faa o mesmo com as amostras A e B. Incube as placas a 37oC por 16-18h.

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3 DIA: 06/03/09 L2: I - Faa a leitura do teste de resistncia, observando presena ou ausncia de crescimento bacteriano nas placas com droga. Observe tambm a capacidade de fermentao da lactose. Preencha a tabela abaixo: Crescimento na presena de Bactria A B M - Em vista dos resultados obtidos, qual das hipteses que voc considerou anteriormente seria a mais vivel para explicar o ocorrido? Por qu? Nal Et Clo Ap Padro de Resistncia Fermentao de lactose

- Como voc poderia comprovar a sua hiptese utilizando mtodos moleculares?

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AGENTES ANTISSPTICOS Como exemplos de processos de antissepsia sero utilizados antisspticos comerciais de uso corrente.

1 dia: 04/03/09 EXPERIMENTO 1 A. ANTISSPTICO PARA ENXAGUE BUCAL Dividir uma placa de gar sangue em trs partes, marcando t0, t1 e t2.

t0 t2

t1

Friccionar um cotonete estril na mucosa da bochecha e semear em t0, em ziguezague. Bochechar com parte da soluo fornecida por 1 min. Aguardar 3 min e repetir a coleta de material, semeando em t1. Bochechar novamente por 1 min, aguardar 3 min e semear em t2. As placas sero incubadas a 37o.C.

EXPERIMENTO 2 B. ANTISSPTICOS PARA USO NA PELE Umedecer um cotonete estril em salina, esfregar em uma regio do brao, por ex., e semear em uma metade de placa de gar nutriente.

Umedecer um segundo cotonete no anti-sptico distribudo, passar no outro brao e aguardar 5 min. A seguir, umedecer um terceiro cotonete em salina, passar na zona desinfetada e na outra metade da placa. As placas sero incubadas a 37oC.

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2 dia: 05/03/09 LEITURA DOS EXPERIMENTOS SOBRE A AO DE ANTISSPTICOS Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento em cruzes (+ a ++++).

Crescimento Antissptico Para enxague bucal Antissptico Antissptico 1 Antissptico 2 Antissptico 3 Antissptico 4 Antissptico 5 a b t0 t1 t2

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ANTIBIOGRAMA

O antibiograma o mtodo utilizado em laboratrio de anlises clnicas para avaliar o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos de bactrias isoladas de processos infecciosos. Aps processamento microbiolgico do material clnico colhido do paciente (p/ex. urina, secrees diversas - de orofaringe, vaginal, uretral, etc., aspirado brnquico, entre outros), a(s) bactria(s) suspeita(s) isolada(s) freqentemente deve(m) ser submetida(s) anlise de seu perfil de susceptibilidade para que o mdico possa ter uma orientao sobre o tratamento antimicrobiano mais adequado. A metodologia para realizao do antibiograma padronizada e deve ser executada com rigor. No teste de difuso Kirby-Bauer, discos de papel filtro impregnados com antimicrobianos so depositados sobre a superfcie do meio onde se inoculou uma suspenso padronizada do organismo a ser testado. O antimicrobiano se difunde no meio e, caso a bactria apresente alguma susceptibilidade a este antimicrobiano, seu crescimento ser inibido ao redor do disco. A medida do dimetro da zona de inibio do crescimento usada para determinar a susceptibilidade ou resistncia a determinado antimicrobiano, por comparao com tabelas padronizadas. O meio slido Muller-Hinton recomendado para realizao de antibiograma da maioria das bactrias isoladas de espcimes clnicos. O experimento que ser realizado em classe tem como objetivo realizar e discutir a tcnica; tanto os antimicrobianos como as bactrias que sero testadas foram escolhidos de modo a ilustrar os diferentes resultados que podem ser obtidos com esta tcnica. importante salientar que, na rotina de um laboratrio clnico, existem parmetros para a escolha dos discos de antimicrobianos, dependendo da espcie de bactria que foi isolada, do perfil de resistncia apresentado por esta espcie na regio e do tipo de infeco, especialmente no caso de infeces adquiridas no hospital. Muitas variveis podem influir na qualidade e confiabilidade do teste e sero discutidas em classe.

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1. Dia 10/03/09 - Com auxlio de uma pipeta, retirar UMA GOTA da cultura bacteriana fornecida e inocular em soluo salina. ATENO: observar a turvao da suspenso que deve ser semelhante ao padro fornecido (108 bactrias/mL) - Mergulhar um suabe estril na suspenso preparada, retirar o excesso de lquido comprimindo-o contra a parede interna do tubo e semear em toda a superfcie da placa de Muller-Hinton, de forma homognea em trs direes. - Deixar a placa secar e, com auxlio de uma pina, aplicar os discos de antibiticos sobre a superfcie semeada, de forma equidistante e mantendo uma distncia de ~ 2 cm das bordas. conveniente marcar com a caneta, na base da placa de Petri, os locais onde os discos sero colocados. Pression-los levemente, com a pina, aps a aplicao. - Incubar as placas por 16-18 h.

2. Dia 11/03/09

LEITURA DO ANTIBIOGRAMA

Realizar a leitura do antibiograma, medindo os dimetros dos halos de inibio de crescimento em mm e determinando o perfil de resistncia com o auxlio da Tabela padro abaixo.

halo disco

mm

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Tabela: Dimetro de halos com diferentes agentes antimicrobianos Dimetro mais prximo (mm) Agente quantidade observaes antimicrobiano no disco Resistente Intermedirio Suscetvel AMINOGLICOSDEOS Amicacina Gentamicina Exceto para enterococos altamente resistentes 30 g 10 g <14 <12 15-16 13-14 >17 >15

Canamicina Netilmicina Estreptomicina Tobramicina QUINOLONAS Ciprofloxacina Enoxacina Lomefloxacina cido Nalidxico Norfloxacina Ofloxacina OUTROS Cloranfenicol Clindamicina Nitrofurantoina Rifampim Sulfonamidas Trimetoprim Trimetoprim/ sulfametoxazol

30 g 30 g 10 g 10 g 5 g 10 g 10 g 30 g 10 g 5 g 30 g 2 g 300 g 5 g 300 g 5 g 1.25/ 23.75 g

<13 <12 <11 <12 <15 <14 <18 <13 <12 <12 <12 <14 <14 <16 <12 <10 <10

14-17 13-14 12-14 13-14 16-20 15-17 19-21 14-18 13-15 13-15 13-17 15-20 15-16 17-19 13-16 11-15 11-15

>18 >15 >15 >15 >21 >18 >22 >19 >16 >16 >18 >21 >17 >20 >17 >16 >16

Preencher o quadro abaixo com os resultados obtidos: Bactria Padro de Resistncia

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18/05/2009

IDENTIFICAO DE BACTRIAS

Nesta aula, sero discutidos alguns mtodos empregados na identificao de bactrias patognicas para o hospedeiro humano.

EXPERIMENTO 1. Voc recebeu duas placas de Agar MacConkey e duas placas de Agar sangue, cada uma delas contendo uma mistura de bactrias distintas (misturas A e B). Para identificar as bactrias contidas nessas misturas: 1. Observe as placas semeadas com a mistura A e responda: - Houve crescimento na placa de MacConkey? Qual o significado desse achado?

- Houve crescimento na placa de Agar Sangue? Quais as caractersticas das colnias crescidas nessa placa?

2. Observe as placas semeadas com a mistura B e responda: - Houve crescimento na placa de MacConkey? Que alteraes voc observa nas colnias crescidas neste meio? Qual o significado desse achado? Anote os resultados na tabela da Pgina 4.

- Houve crescimento na placa de Agar Sangue? Que alteraes voc observa nas colnias crescidas neste meio?

EXPERIMENTO 2.

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Selecione uma colnia de cada tipo da placa de Agar Sangue da mistura A e faa o ensaio de catalase conforme descrito a seguir.

PROVA DA CATALASE 1. Com o auxlio de palito esterilizado, toque uma colnia e misture-a a uma gota de H2O2 10 V na superfcie de uma lmina de microscpio. 2. Obs.: Quando a colnia obtida de uma placa de Agar Sangue, essencial que o meio de cultura no seja removido da superfcie, pois hemcias contm catalase. 3. A produo de bolhas de gs indicativa de teste positivo. A catalase catalisa a seguinte reao: 2 H2 O2 2 H2O + O2

Anote os resultados na tabela da Pgina 3. EXPERIMENTO 3. Para as colnias que apresentarem resultado positivo para a prova de catalase, realizar a prova da coagulase. PROVA DA COAGULASE Selecione duas colnias da placa de Agar Sangue, que tenham dado resultado positivo na prova da catalase. Com auxlio de palitos esterilizados, homogeneze as duas colnias em um mesmo tubo contendo 0,5 ml de plasma de coelho. O outro tubo servir como um controle negativo da prova de coagulase. Incline suavemente os tubos, girando-o sem agitar. Identifique-os e os entregue ao professor, que ir incub-los a 37C at o dia seguinte (ou, no mnimo, por 4 horas). EXPERIMENTO 4. Com o auxlio do fio esterilizado, selecione uma colnia de cada tipo da placa de MacConkey semeada com a mistura B e inocule cada uma delas nos meios EPM e MiLi, conforme a explicao do professor, para a realizao de provas bioqumicas. Os tubos sero incubados a 37C por 24 horas. 19/05/2009

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Leitura do EXPERIMENTO 3 (PROVA DA COAGULASE) Proceda leitura inclinando o tubo para os lados, procurando detectar a formao de um cogulo. Anote os resultados observados na tabela abaixo e consulte o esquema de identificao (Pgina 5) para determinar o gnero e a espcie bacterianos. IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS A PARTIR DE GAR SANGUE SEMEADAS COM A MISTURA A Colnia 1 2 Tipo de Hemlise Catalase Coagulase Identificao

Leitura do EXPERIMENTO 4 (PROVAS BIOQUMICAS) Para identificar as amostras bacterianas Gram-negativas contidas na placa de MacConkey, proceda leitura dos ensaios bioqumicos realizados, de acordo com a tabela anexa (Pgina 5). Registre os resultados na tabela abaixo. Conclua sua identificao e compare com os resultados de outras bactrias fornecidas e com os meios de EPM e MiLi no inoculados.

IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS A PARTIR DE GAR MacCONKEY SEMEADA COM MISTURA B Colnia 1 2 Mac Conkey EPM Ferm. Lac Gs H2S Urease LTD MiLi Mot. Indol Lisina Identificao

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Esquema para identificao de algumas bactrias patognicas e no-patognicas

Bacilos Gram -

Provas Bioqumicas

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