1 Evaluation of lignin contents in tropical forages using different analytical methods and 2 3 4 5 6

their correlation with degradation of insoluble fiber

Daiany I. Gomesa, Edenio Detmanna, , Sebastio de C. Valadares Filhoa, Romualdo S. Fukushimab, Marjorrie A. de Souzaa, Tiago N.P. Valentec, Augusto C. de Queiroza

a/ Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Viosa, Viosa, Minas Gerais, Brazil

8 b/ Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, Pirassununga, So Paulo, Brazil 9

c/ Laboratrio de Zootecnia e Nutrio Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brazil

10 11 12Abstract 13

Objetivou-se comparar os teores de lignina em forragens tropicais por diferentes

14mtodos analticos e avaliar sua correlao com os parmetros da degradao da fibra em 15detergente neutro (NDF) em forragens tropicais. Os teores de lignina foram avaliados por 16solubilizao da celulose em cido sulfrico (LSA), por oxidao com permanganato de 17potssio (LPM), pelo mtodo de Klason (KL) e por solubilizao em brometo de acetila a 18partir da fibra em detergente cido (ABLadf) e a partir da parede celular (ABLcw). Foram 19utilizadas amostras de dez gramneas e de dez leguminosas. Os teores de lignina obtidos pelos 20mtodos gravimtricos foram expressos tambm na forma corrigida para contaminao 21protica, sendo referenciados como LSAp, LPMp e KLp. A fraes potencialmente 22degradvel (pdNDF) e indegradvel (iNDF) e a taxa fracional de degradao (kd) da fibra em 23detergente neutro (NDF) foram estimados por intermdio de ensaio in vitro. A correo para 24protena contaminante implicou redues significativas (P<0.05) nos teores de LSA, KL e

1 Corresponding author. Present address: Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Viosa, Viosa-

2MG, Brazil, 36571-000. Tel./fax: +55 31 3899 2252. E-mail address: detmann@ufv.br (E. Detmann). 3 1

25LPM, sendo as redues mais proeminentes para KL. Verificou-se interao (P<0.05) entre 26mtodo analtico e grupo de forrageiras para os teores de lignina (g/kg of dry matter). 27Diferenas entre gramneas e leguminosas foram verificadas (P<0.05) com os mtodos LSAp 28e LPMp, que indicaram maiores valores para leguminosas, e ABLcw, o qual, por sua vez, 29indicou maior estimativa para gramneas. Considerando-se somente gramneas, maior 30estimativa do teor de lignina (P<0.05) foi conferida pelo mtodo KLp, seguido de LPMp e 31ABLcw, que no diferiram (P>0.05), LSAp e ABLadf. Para leguminosas, as maiores 32estimativas (P<0.05) foram conferidas por KLp, seguidas por LPMp, LSAp e ABLcw e 33ABLadf, sendo estes ltimos similares (P>0.05). As estimativas dos teores de lignina obtidas 34pelos mtodos LSAp e LPMp apresentaram comportamento similar, associando-se 35significativamente (P<0.05) com os teores de iNDF e com kd e LAG. Contudo, para ambos os 36mtodos, no se detectou diferena entre gramneas e leguminosas quanto ao intercepto ou 37coeficiente de inclinao da funo ajustada (P>0.05). Correlaes mais fortes foram 38observadas entre LPMp e os parmetros de degradao da NDF em relao quelas obtidas 39com o mtodo LSAp. Os teores de KLp se associaram (P<0.05) com todos os parmetros de 40degradao da NDF. No entanto, diferente dos mtodos LSAp e LPMp, verificou-se 41diferenciao entre gramneas e leguminosas quanto ao intercepto da funo ajustada 42(P<0.05), observando-se valores superiores de iNDF e LAG e inferiores de kd para as 43leguminosas. Os mais fortes coeficientes de correlao entre todos os mtodos avaliados 44foram obtidos com LPMp e KLp. Os teores de lignina estimados pelo mtodo ABLcw no se 45correlacionaram (P>0.05) com nenhum dos parmetros da dinmica de degradao da NDF. 46Verificou-se correlao (P<0.05) entre os teores de lignina estimados pelo mtodo ABLadf e 47os teores de iNDF. Contudo, o coeficiente de correlao foi menos forte em comparao 48queles verificados para os mtodos LSAp, KLp e LPMp. A partir dos resultados obtidos 49conclui-se que os mtodos gravimtricos LSA, LPM e KL produzem resduos contaminados

50por compostos nitrogenados. A correo para estes contaminantes sugerida, notadamente 51para KL, para que os teores de lignina sejam expressos com maior exatido. Associaes 52entre lignina e os parmetros de degradao ruminal da NDF so mais bem estabelecidas 53utilizando-se as estimativas produzidas pelos mtodos KLp e LPMp. 54Key words: degradation rate, intake, nitrogenous compounds, rumen ammonia nitrogen, 55signal grass, supplementation 56Abbreviations: ABLadf, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the 57acid detergent fiber; ABLcw, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from 58the cell wall matrix; CP, crude protein; DM, dry matter; EE, ether extract; iNDF, indigestible 59fraction of neutral detergent fiber; kd, fractional degradation rate of neutral detergent fiber; 60LAG, discrete lag for fibre degradation; LSA, lignin determined by solubilization of cellulose 61with sulphuric acid; LSAp, lignin determined by solubilization of cellulose with sulphuric 62acid and correctd for protein; LPM, lignin determined by oxidation with potassium 63permanganate; LPMp, lignin determined by oxidation with potassium permanganate and 64corrected for protein; KL, lignin determined by Klason method; KLp, lignin determined by 65Klason method and corrected for protein; aNDFap, neutral detergent fiber assayed with a heat 66stable amylase and corrected for ash and protein; NDF, neutral detergent fibre; pdNDF, 67potentially degradable fraction of neutral detergent fibre; NFC, non-fibrous carbohydrates; 68OM, organic matter. 69 701.Introduction 71 A quantificao do valor nutricional dos alimentos para ruminantes envolve estudos

72que avaliam, principalmente, a frao fibrosa das forragens, a qual tem importncia 73fundamental nos trpicos, pois fornece quantidade significativa de energia a baixo custo. Esta,

74por apresentar variabilidade naturalmente superior aos demais componentes qumicos, deve 75ocupar posio central na avaliao energtica (Detmann et al., 2004; 2008a). 76 Vrios fatores so apontados na tentativa de esclarecer a utilizao das forragens pelo

77animal, no intuito de se otimizar o desempenho dos ruminantes nos trpicos. Os aspectos 78associados constituio da parede celular so apontados como os responsveis pelo menor 79consumo de forragem e desempenho animal nos trpicos (Paulino et al., 2008). Dos 80componentes da parede celular, a lignina tida como principal limitante da degradao dos 81polissacardeos fibrosos no rmen (Van Soest, 1994). 82 A digesto da parede celular requer populao microbiana ativa com capacidade de

83utiliz-la. Desta maneira, a forma como o substrato trabalhado depende da ao dos sistemas 84enzimticos durante o tempo no qual a interao enzima:substrato ocorre, ou seja, da 85efetividade do processo de degradao ou digesto (Detmann et al., 2008a). Portanto, os 86componentes da parede celular que impedem a colonizao e utilizao da frao fibrosa dos 87alimentos devem ser estudados criteriosamente para serem entendidos no apenas como 88estruturas qumicas absolutas, mas tambm no tocante sua influncia sobre o processo 89dinmico da degradao ruminal. 90 Em grande parte das avaliaes nutricionais tem-se ignorado a complexidade dos

91mecanismos biolgicos de digesto, pois o teor de lignina tem sido correlacionado com a 92digestibilidade pontual da forragem (Van Soest, 1963; Smith et al., 1972; Jung and Vogel, 931986; Jung and Varel, 1988; Savioli and Fukushima, 2000; Fukushima and Hatifield, 2004) 94Entretanto, o processo de utilizao do substrato no trato gastrintestinal do ruminante abrange 95vrios fatores mais complexos. Portanto, torna-se importante do ponto de vista biolgico a 96forma com que so estabelecidas as associaes entre as variveis de limitao (teor de 97lignina) e as variveis relacionadas efetividade e ao potencial de ao microbiana sobre o 98substrato (fibra insolvel).

99

Afirmar qual mtodo deve ser usado para quantificar o teor de lignina em forragens

100tropicais no parece ser bem claro em termos de fornecer medida acurada do total de lignina 101realmente presente nas amostras. No entanto, de um ponto de vista nutricional e funcional, os 102mtodos para quantificao de lignina devem ser vistos como um meio para se verificar a 103poro do alimento que corresponde aos efeitos deletrios sobre a digesto dos carboidratos 104fibrosos, e no como valores qumicos absolutos. 105 Nenhuma medida da qualidade da forragem pode estar totalmente incorreta, mas a

106utilidade dos dados resultantes de esforos dirigidos para a melhoria da qualidade da forragem 107 limitada pela forma como o material caracterizado (Jung and Allen, 1995). Portanto, a 108afirmao sobre qual mtodo representa mais acuradamente a quantidade de lignina e qual 109estabelece melhor a associao com os fenmenos biolgicos do processo de degradao 110ruminal de forragens tropicais permanece ainda indefinida. 111 Objetivou-se avaliar o teor de lignina em forragens tropicais por diferentes mtodos

112analticos e avaliar sua associao com parmetros da degradao da fibra em detergente 113neutro (NDF) em gramneas e leguminosas tropicais. 1142.Material and Methods 1152.1.Location and samples 116 O experimento foi realizado nas dependncias do Laboratrio de Nutrio Animal do

117Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viosa, Viosa, Brasil, e no 118Laboratrio de Lignina da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de 119So Paulo, Pirassununga, Brasil. 120 Foram avaliadas dez gramneas: Pennisetum purpureum, Brachiaria decumbens,

121Panicum repens, Brachiaria humidicula, Andropogon gayanus, Panicum maximum cv. 122Aruana, Panicum maximum cv. Mombaa, Brachiaria brizantha cv. Xaras, tifton 85 123(Cynodon sp.) e Panicum maximum cv. Massai; e dez leguminosas: Arachis pintoi, Medicago

124sativa, Leucaena leucocephala, Galactia striata, Dolichos lablab, Centrosema pubescens, 125Glycine weghtii, Gliricidia sepium, Stylosantes guianenensis e Cajanus cajan. As forrageiras 126eram cultivadas em canteiros de 2 x 4 m. Todas as amostras foram obtidas por corte rente ao 127solo no ms de dezembro de 2008. As plantas apresentavam aproximadamente 45 dias de 128rebrotao. 129 As amostras foram secas em estufa com ventilao forada (60C) e processadas em

130moinho de facas (1 mm). 1312.2.Laboratory analyses 132 Samples were analyzed regarding dry matter (DM, index no. 934.01), organic matter

133(OM, index no. 942.05), crude protein (CP, index no. 954.01), and ether extract (EE, index 134no. 920.39) contents according to the methods of the AOAC (1990). In the NDF analysis, the 135samples were treated with a heat stable alpha amylase, without using sodium sulphite, and 136corrected for residual ash (Mertens, 2002) and contaminant protein (Licitra et al., 1996) 137(Table 1). 138 Os teores de lignina nas forragens foram quantificados por cinco mtodos distintos:

139mtodo da solubilizao da celulose por cido sulfrico, aps extrao com detergente cido 140(LSA); mtodo da oxidao por permanganato de potssio, aps extrao com detergente 141cido (LPM); mtodo de Klason (KL); mtodo da lignina solvel em brometo de acetila, aps 142extrao com detergente cido (ABLadf); e mtodo da lignina solvel em brometo de acetila, 143a partir do resduo de parede celular (ABLcw). 144 Para quantificao do teor de LSA, foi pesado em potes de polietileno (120 mL)

145aproximadamente 1 g de amostra, adicionando-se 100 mL de detergente cido (Van Soest and 146Robertson, 1985). Depois de vedados, os frascos foram autoclavados (105C/1 hora; Pell and 147Schofield, 1993). O resduo insolvel em detergente cido foi retido por filtrao sob vcuo

148em cadinhos filtrantes, lavado seqencialmente com gua quente e acetona e submetido 149secagem em estufa (105C/16 horas). 150 Posteriormente, os cadinhos filtrantes contendo os resduos foram acondicionados em

151potes de polietileno, adicionando-se aproximadamente 30 mL de cido sulfrico (12 M), 152homogeneizando-se com auxlio de basto de vidro. Em seqncia, adicionou-se cido 153sulfrico (12 M) at atingir-se metade da altura do cadinho, procedendo-se homogeneizao 154aps 30 minutos (Van Soest and Robertson, 1985). 155 Aps trs horas os cadinhos foram submetidos filtrao sob vcuo e lavagem com

156gua quente at a completa retirada do cido. O material foi seco em estufa (105C/16 horas), 157obtendo-se a massa do resduo composto por lignina e resduo mineral. A seguir, os cadinhos 158foram transferidos para mufla (500C) onde permaneceram por trs horas. A massa de lignina 159foi calculada pela perda de peso aps a incinerao. 160 Para quantificao do teor de protena residual sobre a lignina, alquotas dos resduos

161obtidos aps o tratamento com cido sulfrico foram avaliadas segundo o mtodo de Kjeldhal 162(AOAC, 1990). 163 O teor de KL foi baseado na hidrolise cida da frao insolvel em gua (Theander

164and Westerlund, 1986). Neste mtodo, o material no foi submetido previamente extrao 165com detergente cido. Aproximadamente 250 mg de amostra foram acondicionados em potes 166de polietileno com capacidade de 120 mL. Adicionou-se 3 mL de cido sulfrico (12 M) 167sobre a amostra, a qual foi homogeneizada com auxilio de basto de vidro. Em seguida, os 168potes foram transferidos para banho-maria (30C/1 hora), procedendo-se homogeneizao 169a cada 30 minutos. Em seguida adicionou-se aos potes 80 mL de gua destilada. Os potes 170foram ento vedados e autoclavados (105C/1 hora). 171 Aps o passo da autoclave, com o contedo ainda morno, o material insolvel foi

172transferido quantitativamente sob vcuo para cadinhos filtrantes, procedendo-se lavagem

173com gua quente e secagem (105C/16 horas). Em seguida, os cadinhos foram levados para 174mufla (500C) durante trs horas. A lignina foi obtida pela diferena de peso entre os resduos 175insolvel em cido sulfrico e aps incinerao. 176 Para quantificao do teor de protena residual associada lignina, alquotas dos

177resduos obtidos aps o tratamento com cido sulfrico foram avaliadas segundo o mtodo de 178Kjeldhal (AOAC, 1990). 179 Para avaliao da LPM obteve-se inicialmente o resduo insolvel em detergente cido

180de forma similar ao descrito para a avaliao da LSA. Em seqncia, os cadinhos filtrantes 181com o resduo foram colocados em bandeja de polietileno com uma camada de gua destilada 182de 2 a 3 cm. Foram adicionados 30 mL de soluo saturada de KMnO4 e soluo-tampo (2:1; 183Van Soest and Wine, 1968), respectivamente. Ateno especial foi conferida para que o nvel 184da soluo nos cadinhos filtrantes permanecesse em cerca de 50% da altura dos cadinhos, 185cobrindo toda a amostra. O contedo foi constantemente homogeneizado com bastes de 186vidro. Aps 2 horas o precipitado foi retido por filtrao sob vcuo. 187 Os cadinhos filtrantes com os resduos foram transferidos para uma bandeja limpa,

188com lmina de gua similar descrita anteriormente. Foram adicionados 30 mL da soluo de 189desmineralizao (Van Soest and Wine, 1968). Aps 30 minutos a soluo foi filtrada sob 190vcuo, procedeu-se lavagem do resduo com soluo de etanol (800 mL/L) e acetona. Os 191cadinhos com o resduo foram levados para estufa (105C/16 horas). A massa de lignina foi 192dada pela diferena entre a massa de resduo insolvel em detergente cido e a massa do 193resduo aps o tratamento acima descrito. 194 Posteriormente, alquotas dos resduos obtidos aps o tratamento com as solues de

195permanganato e desmineralizadora foram avaliadas segundo o mtodo de Kjeldhal (AOAC, 1961990). O teor de protena associada lignina foi obtido pela diferena entre os teores de 197protena insolvel em detergente cido (Licitra et al., 1996) e de protena no resduo obtido.

10

198

Para o isolamento da parede celular para avaliao de ABLcw, alquotas de

199aproximadamente 10 g foram acondicionadas em sacos de tecido-no tecido (100 g/m; 15 x 20010 cm) previamente pesados. Os sacos foram acondicionados em extrator tipo Soxhlet 201provido de manta aquecedora. A amostra foi submetida extrao seqencial com gua, 202etanol, clorofrmio:metanol (2:1) e acetona. Aproximadamente 250 mL de cada soluo 203foram utilizados at a completa retirada dos pigmentos, deixando o contedo residual da 204amostra incolor. Aps a drenagem da maior poro da gua da amostra, realizou-se a extrao 205com etanol (96%) usando o mesmo equipamento. A extrao completou-se quando o liquido 206residual estava incolor. Em seguida procedeu-se s extraes com clorofrmio:metanol (2:1) e 207acetona, definindo-se o ponto final de maneira similar s extraes anteriores. O material foi 208transferido para estufa com ventilao forada (60C/72 horas). 209 A preparao do material para quantificao da ABLadf foi realizada de forma similar

210ao descrito para a avaliao da LSA. 211 Os resduos obtidos para avaliao dos teores de ABLcw e ABLadf foram analisados

212segundo recomendaes de Fukushima and Kerley (s.d.). 213 Foram pesados 100 mg de parede celular ou acid detergent residue em tubo de vidro

214de centrifuga com tampa de teflon. Adicionaram-se 10 mL da soluo de brometo de acetila 215em cido actico (250 mL/L), homogeneizando-se lentamente. Em seguida realizou-se a 216digesto dos resduos em banho-maria (50C/2 horas). A cada 30 minutos o contedo foi 217homogeneizado. Em conjunto bateria de tubos efetuou-se o branco. Depois dos tubos 218resfriarem, o material foi centrifugado (2000 x g/15 min). Em seguida alquota de 0,5 mL das 219solues, contendo cerca de 5 mg dos resduos, foi pipetado em tubo de ensaio contendo 6,5 220mL de cido actico glacial e 2 mL de NaOH (0.3 M). O material foi homogeneizado. 221Adicionou-se 1 mL de soluo de cloridrato de hidroxilamina (0.5 M), procedendo-se a nova 222homogenizao.

11

223

A leitura da soluo foi realizada em comprimento de onda de 280 nm. As

224absorbncias foram convertidas em concentrao segundo equao sugerida por Fukushima 225and Kerley (s.d.): 226 L = 227(1), 228em que: L = concentrao de lignina (mg/mL); e A = absorbncia. 229 Os teores de ABLadf e ABLcp foram considerados isentos de contaminao por
A 0,0009 23 ,077

230protena (Morrison, 1972a), no havendo, portanto, correo. 2312.3.Evaluation of NDF degradation 232 Para os procedimentos de avaliao in vitro da dinmica de degradao da NDF,

233alquotas de forragem (350 mg of DM) foram acondicionadas em frascos de vidro com 50 mL 234de volume total. Posteriormente, foram adicionados 28 mL de soluo tampo (McDougall, 2351949), com pH previamente ajustado para 6,8 por intermdio de asperso com CO2. 236 Os frascos foram mantidos em sala climatizada (39C) para prvia hidratao das

237amostras. Durante o processo de hidratao, foi coletado lquido ruminal proveniente de um 238bovino doador, fistulado no rmen, mantido nas proximidades da sala de incubao. O animal 239foi alimentado ad libitum com dieta mista (80% de volumoso) e teve acesso irrestrito a gua e 240mistura mineral completa (6% de fsforo). 241 O lquido foi coletado na regio de interface lquido:slido do ambiente ruminal,

242filtrado por uma camada tripla de gaze, acondicionado em recipiente trmico e imediatamente 243transportado sala de incubao. Foram adicionados 7 mL de inculo ruminal por frasco, 244procedendo-se imediatamente saturao do ambiente de incubao com CO2 e vedao 245dos frascos. Os frascos foram mantidos a 39C, sob agitao orbital (40 rpm). A retirada dos 246gases oriundos da fermentao foi realizada a cada trs horas com o auxlio de agulhas.

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10

247

Foram avaliados os tempos de 0, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72 e 96 horas de incubao. O

248procedimento de incubao foi repetido quatro vezes, perfazendo-se o total de quatro 249avaliaes por tempo de incubao para cada amostra de forragem. Ao final de cada tempo de 250incubao, os frascos foram retirados da sala climatizada, sendo o contedo filtrado sob vcuo 251em cadinhos filtrantes. 252 Os cadinhos foram ento acondicionados em frascos de polietileno (120 mL), aos

253quais se adicionaram 50 mL de detergente neutro (Mertens, 2002). Aps serem vedados, os 254frascos foram autoclavados (105C/1 hora; Pell and Schofield, 1993). Aps este tratamento, 255procedeu-se novamente filtrao sob vcuo e lavagem seqencial do resduo com gua 256quente e acetona. A NDF residual foi obtida aps secagem do material em estufa no 257ventilada (105C/16 horas). 258 Os resduos de NDF nos diferentes tempos, para cada forrageira, foram submetidos,

259por intermdio do algoritmo de Gauss-Newton, implementado no PROC NLIN do SAS, ao 260ajustamento do modelo logstico no-linear descrito por Van Milgen et al. (1991): 261 Rt = pdNDF (1 + t ) exp( t ) + iNDF 262(2), 263em que: Rt = resduo no-degradado de NDF no tempo t (%); pdNDF = frao 264potencialmente degradvel da FDN (%); iNDF = frao indegradvel da NDF (%); = taxa 265fracional conjunta de latncia e degradao da pdNDF (h-1); e t = tempo (h). 266 Em virtude de o parmetro representar conjuntamente as taxas de latncia e utilizando-se as

267degradao, estimou-se a taxa fracional de degradao a partir de 268propriedades da distribuio gama-2 (Ellis et al., 1994): 269 kd = 0.59635 270(3), 271em que: kd = taxa fracional de degradao da pdNDF (h-1).

13

11

272 273(1997):

As estimativas de latncia discreta foram obtidas segundo derivaes de Vieira et al.

274 LAG = 275(4),

R (0) R (t i ) + ti R ' (t i )

276em que: LAG = latncia discreta (h); R(0) = resduo de NDF no degradado em t = 0 (%); 277R(ti) = resduo no-degradado de NDF obtido no ponto de inflexo da curva de degradao 278(%); R(ti) = derivada da curva ajustada de degradao para o ponto de inflexo (mxima taxa 279de degradao do substrato) (h-1); ti = tempo equivalente ao ponto de inflexo da curva de 280degradao (h). 281 282 t i =
1

Os valores de ti foram obtidos segundo descries de Van Milgen et al. (1991):

(5).

2832.4.Statistical analyses 284 As comparaes entre os valores de lignina brutos e corrigidos para protena

285contaminante foram realizados de forma independente para LSA, LPM e KL por intermdio 286do ajustamento de equao de regresso linear simples dos valores corrigidos (varivel 287independente) sobre os valores brutos (varivel independente), sendo a avaliao estatstica 288conduzida sob a hiptese de nulidade (Mayer et al., 1994): 289 H 0 : 0 = 0 and 1 = 1 290(6). 291 Para o caso de no-rejeio da hiptese de nulidade, concluiu-se pela similaridade

292entre valores brutos e corrigidos. 293 A comparao direta quanto aos teores de lignina obtida pelos diferentes mtodos nos

294diferentes grupos de espcies (gramneas ou leguminosas) foi conduzida segundo 295delineamento inteiramente casualizado de acordo com o modelo:

14

12

296 Yijk = + Gi + S (i ) j + M k + GM ik + ijk 297(7), 298em que: = constante geral; Gi = efeito relativo ao grupo de espcies i (grass or legume; 299efeito fixo); S(i)j = efeito da espcie j aninhado ao grupo i (efeito aleatrio); Mk = efeito do 300mtodo de anlise k (efeito fixo); GMik = interao entre o grupo de espcies i e o mtodo de 301anlise k (efeito fixo); e 302
ijk

= erro aleatrio.

As relaes entre os teores de lignina obtidos pelos diferentes mtodos e as

303caractersticas de degradao da NDF (kd, LAG and iNDF) foram avaliadas por regresso 304linear, utilizando-se varivel dummy (Draper and Smith, 1966), segundo o modelo bsico: 305 Yij = 0 + 1 D + 2 Lij + 3 ( D Lij ) + eij 306(8), 307em que: Yij = varivel dependente observada na espcie j do grupo i; Lij = teor de lignina 308(g/kg NDF); D = varivel dummy correspondente ao grupo de espcies, sendo D = 0 para 309gramneas e D = 1 para leguminosas; e eij = erro aleatrio. 310 A escolha do melhor modelo para descrio das relaes foi realizada por intermdio

311da tcnica de backward regression (Draper and Smith, 1966). 312 Todos os procedimentos estatsticos foram realizados por intermdio do programa

313SAS (PROC MIXED e PROC NLIN), adotando-se 0,05 como nvel crtico de probabilidade 314para o erro tipo I. 3153.Results 316 A correo para protena contaminante reduziu, em mdia, em 1.3, 12.8 e 3.3% os

317teores de LSA, KL e LPM, respectivamente, em gramneas. No tocante a leguminosas, 318observaram-se redues de 2.8, 22.7 e 6.8%, na ordem descrita anteriormente (Tabela 2). Este 319comportamento indica que a contaminao por protena sobre os teores de lignina avaliados 320gravimetricamente foi superior em leguminosas em comparao a gramneas.

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13

321

Considerando-se ambas as unidades de expresso dos teores de lignina (g/kg DM e

322g/kg NDF), a correo para protena contaminante implicou redues (P<0,05) nos teores de 323LSA, KL e LPM (Tabela 3; Figura 1). 324 Em virtude da reduo (P<0.05) dos teores de LSA, KL e LPM em funo das

325correes, os demais resultados e discusses foram baseados considerando-se somente os 326valores corrigidos, os quais passam a serem referenciados como LSAp, KLp e LPMp. Esta 327deciso se baseou no fato de os compostos nitrogenados da parede celular no exercerem 328efeitos refratrios degradao sobre os carboidratos fibrosos e permitir-se comparao mais 329acurada com os teores de ABLadf e ABLcw, os quais so considerados isentos de 330contaminao protica. 331 Verificou-se efeito de interao (P<0.05) do mtodo analtico e grupo de forrageira

332para os teores de lignina (Tabela 4). Considerando-se a unidade g/kg DM, diferenas entre 333gramneas e leguminosas foram obtidas (P<0.05) com os mtodos LSAp e LPMp, que 334indicaram maiores valores para leguminosas, e ABLcw, o qual, por sua vez, indicou maior 335estimativa para gramneas. Considerando-se somente gramneas, maior estimativa (P<0.05) 336foi conferida pelo mtodo KLp, seguido de LPMp e ABLcw, que no diferiram (P>0.05), 337LSAp e ABLadf. Para leguminosas, as maiores estimativas (P<0.05) foram conferidas por 338KLp, seguidas por LPMp, LSAp e ABLcw e ABLadf, sendo estes ltimos similares (P>0.05) 339(Tabela 4). 340 Quando considerados os teores de lignina como frao da NDF (g/kg NDF),

341diferenas entre grupos de forrageiras foram apontadas (P<0.05) pelos mtodos LSAp, KLp e 342LPMp, sendo as estimativas superiores para leguminosas. No foram observadas diferenas 343(P>0.05) entre grupos com os mtodos ABLadf e ABLcw Considerando-se somente as 344gramneas, maiores estimativas (P<0.05) foram obtidas com o mtodo KLp, as quais foram 345seguidas por LPMp e LSAp, que no diferiram (P>0.05), e ABLcw e ABLadf, tambm

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346similares entre si (P>0.05). Para leguminosas, o comportamento foi similar ao anteriormente 347descrito considerando-se a unidade g/kg DM (Tabela 4). 348 Apesar das diferenas entre mtodos (Tabela 4), verificou-se que os mtodos LSAp,

349KLp e LPMp correlacionaram-se mutuamente (P<0.05), observando-se estimativas de 350coeficientes de correlao moderadas a fortes (Tabela 5). Por outro lado, os mtodos 351espectrofomtricos ABLadf e ABLcw no se correlacionaram (P>0.05) entre si ou com os 352mtodos gravimtricos (Tabela 5). 353 Considerando-se que os efeitos inibitrios da lignina sobre a degradao so

354observados somente sobre a frao fibrosa, as associaes com os parmetros da degradao 355da NDF foram interpretadas considerando-se somente a unidade g/kg NDF. De forma similar 356ao anteriormente descrito, os teores de lignina obtidos pelos mtodos gravimtricos foram 357considerados nas formas corrigidas para a contaminao por protena. 358 As estimativas dos teores de lignina obtidas pelos mtodos LSAp e LPMp

359apresentaram comportamento similar, associando-se (P<0.05) com os teores de iNDF e com 360kd e LAG (Tabela 6; Figuras 2 e 3). Contudo, para ambos os mtodos, no se detectou 361comportamento diferenciado para gramneas e leguminosas quanto ao intercepto ou 362coeficiente de inclinao da funo ajustada (P>0.05). Correlaes mais fortes foram 363observadas entre LPMp e os parmetros de degradao da NDF em comparao LSAp 364(Tabela 6). 365 Os teores de KLp se associaram (P<0.05) com todos os parmetros de degradao da

366FDN (Tabela 6). No entanto, diferente dos mtodos LSAp e LPMp, verificou-se diferenciao 367entre gramneas e leguminosas quanto ao intercepto da funo ajustada (P<0.05), observando368se valores superiores de iNDF e LAG e inferiores de kd para as leguminosas, 369independentemente da concentrao de lignina (Figura 4). A incluso de um parmetro 370adicional, a partir do qual se consideraram peculiaridades relativas ao grupo de forrageiras

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371conferiu a KLp os coeficientes de correlao mais fortes entre todos os mtodos avaliados. 372Contudo, ao ajustar-se os coeficientes de correlao para o nmero de parmetros no modelo, 373verificou-se serem estes similares aos obtidos com o mtodo LPMp (Tabela 6). 374 Os teores de lignina estimados pelo mtodo ABLcw no apresentaram relao

375(P>0.05) funcional com nenhum dos parmetros da dinmica de degradao da NDF. Para 376todos estes, apenas percebeu-se a diferena mdia entre grupos de forrageiras (Figura 5). 377 Verificou-se associao (P<0.05) entre os teores de lignina estimados pelo mtodo

378ABLadf e os teores de iNDF; no se observando, contudo, diferenciao entre gramneas e 379leguminosas (P>0.05). No entanto, o coeficiente de correlao foi menos forte em 380comparao queles verificados para os mtodos LSAp, KLp e LPMp (Tabela 6). Em adio, 381de forma similar ao mtodo ABLcw, no foram verificadas relaes funcionais (P>0.05) entre 382lignina e os parmetros kd e LAG (Tabela 6), nos quais somente se detectou a diferena 383mdia entre grupos de forrageiras (Figura 6). 3844.Discussion 385 No presente trabalho ficou evidenciado que a contaminao protica afetou

386significativamente o teor de lignina quando avaliado por todos os mtodos gravimtricos 387(Tabelas 2 e 3). Verificou-se, contudo, que esta contaminao se mostrou mais evidente para 388KL em comparao a LSA e LPM (Figura 1). 389 A correo protica em KL reduziu, em mdia, em 1.99 e 3.89 pontos percentuais

390(19.9 e 38.9 g/kg DM) os teores de lignina (Tabela 2). Estes resultados corroboram aqueles 391obtidos por Chang et al. (2008), que obtiveram redues de 2.5 a 3.2 pontos percentuais com 392a correo protica nos teores de KL em Arabdopsis. 393 Entre os mtodos gravimtricos empregados para avaliao de lignina, KL apresenta

394maior contaminao protica (Fukushima and Hatfield, 2001), o que constitui um dos 395principais vieses das estimativas obtidas por este mtodo. A KL foi inicialmente desenvolvida

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396para avaliao do teor de lignina em madeira. Neste tipo de material no se observam 397problemas por contaminao com protena, devido sua baixa concentrao nas amostras 398(Whitehead and Quicke, 1964; Theander and Westerlund, 1986). Entretanto, a utilizao de 399KL sem nenhuma adaptao para se quantificar o teor de lignina em forragens torna-se 400complicada devido presena significativa de compostos nitrogenados no resduo insolvel, 401os quais poderiam ser erroneamente quantificados como lignina (Van Soest, 1994). 402 Os compostos nitrogenados associados ao resduo de lignina podem se originar de

403quatro fontes potenciais: nitrognio que se encontra naturalmente associado parede celular; 404nitrognio ligado a artefatos de Maillard; nitrognio ligado a taninos; e queratinas de origem 405animal (Van Soest, 1994). Este ltimo caso no se aplica aos presentes resultados. 406 Presume-se que leguminosas apresentem maior contaminao por protena do que

407gramneas (Fukushima and Hatfield, 2001), como verificado neste estudo (Tabela 2). Embora 408leguminosas apresentem teores naturalmente superiores de protena em relao s gramneas, 409o nvel de CP de uma amostra no se correlaciona com a intensidade de contaminao 410protica nos resduos de lignina (Hatfield et al., 1994), o que reforado pelo comportamento 411homogneo dos pares ordenados de ambos os grupos de forrageiras quando considerada sua 412contaminao (Figura 1). Contudo, como apresentado anteriormente, a correo para 413contaminao protica de KL promoveu reduo mdia no teor de lignina de 38.9 g/kg DM 414em leguminosas, comparados a 19.9 g/kg DM em gramneas (Tabela 2). Ao menos parte desta 415maior contaminao em leguminosas pode estar associada ao maior teor de taninos, o que 416propiciaria a formao de complexos insolveis com os componentes proticos das forragens 417(Van Soest, 1994; Poppi and McLenann, 1995). 418 A anlise do teor de lignina laboriosa, consome tempo e pode produzir resduos

419constitudos parcialmente por artefatos que superestimam o teor de lignina (Van Soest, 1963). 420Parte da contaminao protica associada lignina pode ser atribuda formao de artefatos

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421pela reao de Maillard. Contudo, a formao destes ocorre principalmente em temperaturas 422de secagem iguais ou superiores a 65C, o que no foi utilizado neste estudo (60C). Por outro 423lado, a utilizao de temperaturas adequadas, associada ao uso de estufas com ventilao, 424reduz a formao destes artefatos por acelerarem a retirada de umidade do material, a qual 425necessria para ocorrncias das reaes no enzimticas (Van Soest, 1994). 426 De outra forma, o uso de temperaturas elevadas durante o processo de extrao

427poderia estar associado formao de artefatos que contm nitrognio. Contudo, a reao de 428Maillard desfavorecida em meios cidos (Eskin et al., 1971), no havendo evidncias de 429formao de artefatos insolveis entre a protena do contedo celular e os produtos da 430hidrlise dos carboidratos da parede celular (Hatfield et al., 1994). 431 Desta forma, a despeito da possibilidade de formao de complexos com taninos em

432leguminosas, a maior parte da contaminao protica associada KL parece estar associada 433reteno no resduo insolvel de compostos nitrogenados naturalmente presentes na parede 434celular. 435 A parede celular contm protenas que possuem papel estrutural na matriz, as quais

436podem apresentar ligaes cruzadas com a lignina (Whitmore, 1982). Contudo, no est claro 437se os compostos nitrogenados presentes no resduo insolvel da KL representam protena 438intacta, fragmentos de protena, protena modificada ou cidos nuclicos (Hatfield et al., 4391994). No entanto, independentemente da origem dos compostos nitrogenados, o principal 440problema no fracionamento qumico do tecido fibroso da planta consiste na separao 441eficiente entre protena e lignina (Van Soest, 1963). 442 A principal diferena analtica entre os mtodos KL e LSA consiste na seqncia com

443que a concentrao do cido sulfrico e a temperatura de extrao so utilizadas, o que causa 444efeitos diferentes na hidrlise dos polissacardeos (Hatfield et al., 1994). Contudo, h de se 445ressaltar que em KL no se utiliza detergente catinico (brometo de cetil trimel amnio,

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446CTAB) como adjuvante na retira de materiais a serem solubilizados, o qual proporciona a 447limpeza do material que ser submetido hidrolise cida. Assim, o detergente cido (soluo 448de H2SO4, 0.5 M; e CTAB, 20 g/L) responsvel pela obteno de resduo aproximadamente 449livre da interferncia protica (Van Soest and Robertson, 1985), promovendo solubilizao de 450grande parte da protena associada parede celular (Van Soest, 1994). 451 Devido utilizao da extrao prvia com detergente cido, LPM apresentou

452contaminao protica tambm inferior a KL, sendo, contudo, levemente superior 453contaminao observada em LSA (Figura 1). Isto parece ser justificado pelo fato de que 454algumas protenas no removidas pelo detergente cido podem reagir com o permanganato e 455serem quantificadas como lignina (Van Soest and Wine, 1968). 456 Segundo Van Soest (1994), mesmo conduzindo-se as anlises de lignina

457cuidadosamente, a contaminao ainda existir, independentemente do mtodo gravimtrico 458utilizado, o que corrobora os resultados aqui obtidos (Tabela 3). Desta forma, para correta 459expresso das concentraes de lignina obtidas pelos mtodos gravimtricos, deve-se levar 460em considerao a correo para contaminao protica (Henriques et al., 2007), 461principalmente na utilizao de KL. 462 Neste contexto, a comparao direta entre mtodos foi realizada relevando-se a

463correo para contaminao protica nos resduos mensurados gravimetricamente, evitando464se confundimento, uma vez que h diferenas entre estes na intensidade de contaminao 465(Figura 1) e os resultados obtidos espectrofotometricamente so considerados isentos deste 466tipo de contaminante (Fukushima and Kerley, s.d.). 467 O teor de lignina em amostras de forragens varia de acordo com o mtodo de

468isolamento qumico da molcula polifenlica. As propriedades fsicas da lignina so 469geralmente alteradas por cidos fortes, os quais promovem polimerizao e condensao

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470adicional e pode converter parte do material originalmente solvel em produtos insolveis 471(Van Soest, 1994). 472 A diferena entre os mtodos quanto ao teor de lignina mensurado na mesma amostra

473deve-se, possivelmente, forma de atuao dos reagentes. Isto implica que diferentes 474procedimentos analticos propiciam estimativas diferentes do contedo de lignina (Fukushima 475and Dehority, 2000). 476 Os mtodos para anlise de lignina podem ser divididos em trs categorias principais:

477os gravimtricos, que removem os constituintes da parede celular exceto a lignina, como LSA 478e KL; os gravimtricos que oxidam a lignina da matriz da parede celular, como LPM; e os 479mtodos de solubilizao com quantificao espectrofotomtrica, como ABLadf e ABLcw. 480 Contudo, a despeito das peculiaridades qumicas de cada mtodo, diferenas nos

481resultados podem ser obtidas em funo dos passos preparatrios da amostra. A utilizao de 482detergente cido, embora tenha por principal funo a reduo de contaminao protica (Van 483Soest, 1994), em geral, subestima o valor de lignina das forragens, principalmente em 484gramneas (Lowry et al., 1994) devido solubilizao parcial de componentes fenlicos 485(Lowry et al., 1994; Fukushima and Hatfield, 2001; Fukushima et al., 2009). Estes aspectos 486suportam, em geral, os menores valores de lignina verificados para LSAp e LPMp em 487comparao a KLp, e para ABLadf em comparao a ABLcw (Tabela 4). 488 Apesar de serem ambos gravimtricos e precedidos de extrao com detergente cido,

489verificou-se maiores estimativas de lignina para LPMp em comparao a LSAp (Tabela 4). 490Segundo Van Soest and Wine (1968), a relao LPM:LSA seria de aproximadamente 1.2:1. 491Considerando-se os valores expressos na Tabela 4 (g/kg NDF), obtm-se as razes 1.30:1 e 4921.23:1 para gramneas e leguminosas, respectivamente; relaes prximas quela descrita por 493Vans Soest and Wine (1968).

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A avaliao da lignina por oxidao em permanganato de potssio pode ser afetada

495por alguns componentes da amostra como, por exemplo, fenis e outras substncias 496insaturadas, como taninos e pigmentos, que no so completamente removidos durante a 497extrao com detergente cido. Estas substncias reagiriam com a soluo de permanganato e 498seriam contabilizadas como lignina, principalmente em gramneas imaturas (Van Soest and 499Wine, 1968), ampliando o valor total de lignina da amostra. Isto justificaria, ao menos em 500parte, as maiores estimativas de LPMp em relao a LSAp (Tabela 4). 501 Geralmente considera-se que a principal limitao para a utilizao do mtodo KL seja

502a contaminao protica, a qual gera vis positivo sobre as estimativas (Van Soest and 503Robertson, 1985; Kondo et al., 1987). Entretanto, uma vez havendo correo, os valores mais 504elevados da KLp no podem ser atribudos protena contaminante. 505 Apesar do mtodo KL ter sido desenvolvido com fins de extrair lignina em madeira

506(Van Soest, 1994), este pode ser utilizado para quantificar a lignina de alimentos usados na 507nutrio de ruminantes. Contudo, mesmo aps modificaes, nas quais se incluiu o 508aquecimento indireto (Theander and Westerlund, 1986), o mtodo continua sendo aplicado 509sobre a amostra integral. Desta forma, especula-se que o cido sulfrico pode solubilizar parte 510da hemicelulose contida na parede celular, a qual precipita com a diluio do cido com gua, 511sendo quantificado como lignina (Van Soest, 1967). Compostos como o cido D512galacturnico, cido D-glucurnico e D-xilose, podem ser convertidos em compostos 513aromticos em meios aquosos aquecidos e levemente acidificados (Popoff and Theander, 5141976), similares segunda etapa do mtodo KL. 515 No entanto, Hatfield et al. (1994) verificaram que a contaminao por carboidratos na

516lignina obtida pelo mtodo KL poderia ser considerada pequena a ponto de no contribuir 517com poro significativa do resduo. Por outro lado, estes autores verificaram que a relao 518siringil:guaiacil dos resduos de lignina obtidos pelos mtodos LSA e KL foram similares.

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519Desta forma, parece no haver contaminao significativa com compostos fenlicos formados 520a partir de carboidratos, os quais poderiam alterar a relao sirinigil:guaiacil. 521 Assim, a diferena entre KLp e LSAp, e por conseguinte, entre KLp e LPMp, residira

522sobre a solubilizao de parte da lignina pelo detergente cido (Hatfield et al., 1994; Lowry et 523al., 1994). Neste caso, a dissoluo da matriz de hemicelulose pelo detergente cido deixaria 524parte da lignina sem o suporte dado pela hemicelulose, permitindo sua solubilizao (Lowry 525et al., 1994). Neste sentido, h evidencias que a KLp fornece estimativas mais acuradas do 526teor total de lignina em amostras de forragens do que a LSAp, especialmente em gramneas 527(Kondo et al., 1987; Hatfield et al., 1994; Jung et al. 1997). 528 A lignina solvel em brometo de acetila baseia-se na leitura a 280 nm aps

529solubilizao em soluo de brometo de acetila em acido actico (250 mL/L), procedimento 530espectrofotomtrico desenvolvido, em princpio, para quantificar o teor de lignina em 531pequenas amostras de madeira (Johnson et al., 1961). Este mtodo foi modificado para ser 532utilizado em amostras de forragens, as quais apresentam quantidade considervel de protena 533que interfere significativamente no teor de lignina mensurado (Morrison, 1972a; 1972b). 534Fukushima et al. (2009) verificaram, contudo, que o efluente da soluo de detergente cido 535em diversas gramneas apresentava picos de absorbncia semelhantes aos da lignina retida no 536resduo insolvel em detergente cido. Neste sentido, a avaliao do teor de lignina em 537brometo de acetila tendo como base que a parede celular forneceria estimativas mais 538verossmeis do teor de lignina de forragens (Iiyama and Wallis, 1990; Fukushima and 539Dehority, 2000; Fukushima and Hatfield, 2001; Fukushima and Savioli, 2001; Fukushima and 540Hatfield, 2004; Chang et al., 2008). 541 O isolamento da parede celular, com lavagem seqencial com gua, etanol,

542clorofrmio e acetona busca representar a quantidade de polissacardeos da parede vegetal de 543forma verossmil (Fukushima and Hatfield, 2004). Assim, a preparao da parede celular

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544caracteriza-se por valores mais elevados quando comparados a outros mtodos de isolamento 545de componentes da parede celular, como ADF e NDF. Porm, os componentes no-lignina e 546outros compostos fenlicos, como os taninos, se no removidos durante o passo da preparao 547da parede celular, podem ser dissolvidos na soluo de brometo de acetila, levando a 548interferncias durante a leitura da amostra (Morrison, 1972a). 549 Entretanto, a falta de padres para calibrao do espectrofotmetro consiste no

550principal fator de limitao para utilizao rotineira do mtodo (Savioli et al., 2000). Desta 551maneira, em recente trabalho utilizou-se lignina extrada com brometo de acetila e 552conseguinte correo quanto ao teor de carboidratos, cinzas, gua e protena para construo 553de curva padro universal, tentando-se reduzir o procedimento analtico para apenas digesto 554da amostra e leitura espectrofotomtrica (Fukushima and Kerley, s.d.), sendo utilizada neste 555trabalho. 556 Os teores de lignina obtidos para gramneas pelo mtodo ABLcw foram maiores que

557os obtidos pelo mtodo LSAp (Tabela 4). Este resultado pode ser suportado devido 558solubilizao parcial da lignina durante a extrao com detergente cido para obteno de 559LSAp, corroborando os resultados de outros autores (Fukushima and Dehority, 2000; 560Fukushima and Savioli, 2001; Fukushima and Hatfield, 2004). 561 Para leguminosas, contudo, os teores de lignina obtidos com os mtodos ABLadf e

562ABLcw foram similares, ao passo que ABLcw produziu estimativas inferiores a LSAp, 563comportamento diferenciado em relao ao observado para gramneas (Tabela 4) e que 564contraria os pressupostos para as diferenas entre mtodos apresentados anteriormente. 565 De forma geral, os teores de lignina obtidos pelo mtodo ABLcw mostram-se

566superiores aos obtidos com os mtodos LSAp (Fukushima and Dehority, 2000). Contudo, 567alguns resultados diferentes destes podem ser observados na literatura (Fukushima and 568Savioli, 2001).

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Uma das dificuldades da quantificao de lignina em brometo de acetila reside sobre a

570obteno de padro espectrofotomtrico satisfatrio de lignina (Savioli et al., 2000; Hatfield 571and Fukushima, 2005). De forma geral, as avaliaes de lignina em brometo de acetila foram 572mais intensamente conduzidas em amostras de gramneas em comparao a leguminosas. O 573conjunto de amostras utilizado por Fukushima and Kerley (s.d.) para construo de curva 574padro universal apresentava somente trs leguminosas em um domnio formado por amostras 575oriundas de 14 espcies, incluindo, alm das leguminosas, gramneas, espcies arbreas e trs 576ligninas comerciais. Considerando-se que a composio qumica da lignina de gramneas e 577leguminosas diferente (Van Soest, 1994), as aparentes distores obtidas neste trabalho 578podem indicar que a eficincia de predio da curva padro universal (Equao 1), embora 579aparentemente alta para gramneas, pode ser baixa para leguminosas. 580 O simples conhecimento do teor de NDF de um alimento no capaz de gerar

581informaes sobre o potencial da fibra insolvel em ser aproveitada no trato gastrintestinal 582dos animais ruminantes. Em outras palavras, dois alimentos podem apresentar teores de NDF 583similares, mas potenciais de aproveitamento distintos. Isto torna as inferncias baseadas 584somente em teores limitadas do ponto de vista nutricional, exigindo-se conhecimento acerca 585da dinmica de degradao das diferentes fontes de NDF no ecossistema ruminal, permitindo586se a ampliao do conhecimento sobre digestibilidade efetiva e sobre o potencial de 587implementao de efeitos restritivos fsicos sobre o consumo voluntrio (Detmann, 2010). 588 Neste estudo, trs parmetros da dinmica de degradao da FDN foram investigados.

589A iNDF permite o entendimento da potencialidade de aproveitamento da FDN, sendo o 590complemento natural da frao potencialmente degradvel (pdNDF). Desta forma, o teor de 591iNDF de uma forragem expressa de forma inversamente proporcional a capacidade de 592fornecimento energtico do alimento a partir de sua poro fibrosa insolvel (Detmann et al., 5932008a). A kd expressa a velocidade com a qual a pdNFD degradada pelos sistemas

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594enzimticos microbianos, apresentando intima associao com a efetividade da extrao 595energtica a partir da NDF e com o efeito de enchimento ruminal da fibra insolvel 596(Detmann, 2010). Por sua vez, LAG permite estimar a ocorrncia dos eventos preparatrios s 597atividades de degradao, os quais englobam aspectos fsicos (e.g. hidratao) e 598microbiolgicos (e.g. fixao microbiana, sntese de enzimas, etc) (Detmann et al., 2009). 599 Contudo, as disponibilidades de infra-estrutura e tempo constituem fatores limitantes

600para a obteno de dados relativos dinmica de degradao da NDF em toda e qualquer 601situao. Isto demanda, em vias prticas, a obteno de elemento capaz de gerar informao 602que permita discriminar com rapidez e relativa preciso fontes diferentes de NDF no tocante 603sua capacidade de aproveitamento por um animal ruminante. 604 Por ser indigestvel e agir na reduo da frao fibrosa potencialmente degradvel

605(Traxler et al., 1998), a lignina geralmente aceita como a entidade primria responsvel pela 606limitao da degradao dos componentes fibrosos das forragens (Smith et al., 1972; Van 607Soest, 1994). A estimao laboratorial de sua concentrao rpida e demanda menor infra608estrutura em comparao realizao de estudos in situ ou in vitro da dinmica de degradao 609da NDF. No entanto, semelhana do anteriormente discutido, havendo diferentes mtodos 610analticos, que podem mensurar componentes qumicos diferentes, torna-se necessria a 611identificao, entre estes, daquele que melhor expressa poder de discriminao no tocante aos 612aspectos da degradao ruminal da NDF. Segundo Lowry et al. (1994), deve-se considerar 613mais importante na avaliao de alimentos para ruminantes os aspectos da fermentao no 614rmen para definir a frao da parede celular deletria aos microrganismos, em vez de se 615definirem fraes qumicas exatas. 616 De forma geral, LSAp e LPMp foram similares em termos de relao com os

617parmetros da degradao da NDF (Tabela 6), apresentando resultados biologicamente 618coerentes, considerando-se associaes positivas entre o teor de lignina e o teor de iNDF e

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619LAG, e negativas entre lignina e kd (Tabela 6; Figuras 2 e 3). Contudo, mesmo estando 620relacionados entre si (Tabela 5), correlaes mais fortes foram verificadas com o mtodo 621LPMp em comparao a LSAp (Tabela 6). Estes resultados agregam queles obtidos por 622Traxler et al. (1998) e Clipes (2007), que observaram maior acurcia na predio da iNDF a 623partir de LPM em comparao a LSA em gramneas e leguminosas. 624 Como discutido anteriormente, a ao do cido sulfrico em LSA reside sobre a

625oxidao dos componentes celulsicos da parede celular vegetal aps prvia extrao com 626detergente cido (Van Soest and Robertson, 1985), mantendo os componentes fenlicos como 627resduo; enquanto que, a ao do permanganato de potssio se baseia na solubilizao dos 628compostos fenlicos da parede celular vegetal, tambm aps tratamento prvio com 629detergente cido, produzindo resduo no qual se concentram os compostos celulsicos. 630 Embora os mtodos LSA e LPM possam parecer perfeitamente complementares,

631problemas residem sobre a definio exata do limite de ao de cada um dos reagentes (Van 632Soest, 1994), fazendo com que as estimativas dos teores de lignina obtidas por ambos os 633mtodos no sejam similares, com verificado neste estudo (Tabela 4). A maior diferena entre 634a ao do cido sulfrico e do permanganato de potssio parece ser percebida nas regies 635limites entre os compostos celulsicos e fenlicos, regio esta na qual se espera que haja 636maior ao inibitria da lignina sobre a degradao microbiana no ambiente ruminal (Traxler 637et al., 1998; Clipes, 2007). 638 Desta forma, especula-se que a ao diferenciada dos reagentes supracitados possa

639levar a diferenciaes qualitativas associadas s estimativas gravimtricas dos teores de 640lignina dos alimentos. Ou seja, a ao inibitria associada aos compostos fenlicos retidos 641como lignina, e suas particularidades de extrao nas regies limtrofes com os carboidratos 642da parede celular, poderiam apresentar diferentes associaes com a frao indegradvel da

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643FDN (Clipes, 2007), o que atribuiria melhor associao com os teores de LPMp em 644comparao a LSAp (Tabela 6). 645 As diferenas entre gramneas e leguminosas apontadas por LSAp e LPMp so

646atribudas somente concentrao de lignina nas amostras, uma vez que nenhum parmetro 647especfico para diferenciao entre estes foi significativo (Tabela 6). 648 Por outro lado, as associaes entre os parmetros da degradao da NDF e os teores

649de KLp contemplaram, alm das diferenas de concentrao entre amostras, parmetro 650relativo diferenciao do intercepto da funo para gramneas e leguminosas (Tabela 6; 651Figura 4). Esta discriminao adicional em relao a LSAp parece estar associada perda da 652frao de lignina solvel em detergente cido, como discutido anteriormente. Neste contexto, 653a incluso de parmetro adicional na funo conferiu KLp correlaes mais fortes em 654relao a LSAp, mesmo considerando-se o ajustamento para o nmero de parmetros do 655modelo (Tabela 6). Estes resultados contrariam os obtidos por Jung et al. (1997), que 656verificaram correlaes similares entre KL e LSA e a digestibilidade in vitro e in vivo da 657NDF. 658 Considerando-se os coeficientes de correlao ajustados para o nmero de parmetros

659no modelo, as estimativas de LPMp e KLp foram igualmente efetivas em se associar aos 660parmetros da degradao da NDF (Tabela 6). Estes mtodos apresentaram teores de lignina 661superiores aos obtidos por LSAp (Tabela 4). Neste contexto, especula-se que esta frao 662superior dos mtodos KLp e LPMp possa conter componentes que exercem papel 663significativo sobre a degradao da fibra insolvel, os quais no seriam quantificados em 664LSAp, o que poderia justificar as correlaes mais fracas observadas com este mtodo 665(Tabela 6). 666 De forma geral, excetuando-se a relao entre ABLadf e iNDF, no foram observadas

667associaes funcionais significativas entre os teores de lignina obtidos pelos mtodos

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668especrofotomtricos e os parmetros da degradao da NDF (Tabela 6; Figuras 5 e 6), o que 669reforado pela falta de correlao entre estes e as estimativas fornecidas pelos mtodos 670gravimtricos (Tabela 5). 671 Investigaes recentes sobre a avaliao da lignina solvel em brometo de acetila tm

672atentado possibilidade de se obter estimativas mais acuradas do teor de lignina em 673alimentos, com minimizao das interferncias por outros compostos, utilizando como base, 674principalmente, a parede celular em detrimento ao resduo insolvel em detergente cido 675(Fukushima and Dehority, 2000; Fukushima and Hatfield, 2004; Fukushima et al., 2009). 676 Em alguns trabalhos tem se observado que as correlaes entre os teores de ABLcw e

677digestibilidade in vitro da DM ou de componentes da parede celular so mais fortes do que 678aquelas obtidas com LSA ou LPM (Fukushima and Dehority, 2000; Fukushima and Hatfield, 6792004). Contudo, nestes trabalhos, os padres espectrofomtricos foram obtidos de forma 680independente para cada material avaliado, diferente da curva padro universal proposta por 681Fukushima and Kerley (s.d.) e adotada neste trabalho. 682 Segundo Fukushima and Dehority (2000), a lignina extrada de uma forragem no

683poderia ser utilizada como padro para a anlise de diferentes espcies ou de forragens em 684diferentes estdios de maturidade. Equaes de regresso de base emprica, como aquela 685proposta por Fukushima and Kerley (s.d.) so populao-dependentes. Estes modelos so 686baseados exclusivamente nas informaes experimentais e no necessariamente sobre alguma 687teoria ou fundamento biolgico. Assim, mesmo com bom ajustamento aos dados, o modelo 688deve ser considerado especfico para as condies nas quais os dados foram obtidos. Neste 689caso, a amplitude de sua habilidade para predio ser limitada (Forbes and France, 1993). 690 Desta forma, considerando-se informaes prvias (Fukushima and Dehority, 2000;

691Fukushima and Hatfield, 2004), a ausncia de associao entre os teores de ABLadf e ABLcw 692pode estar associada ineficincia de predio da curva padro sugerida por Fukushima and

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693Kerley (s.d.). Isto mantm a restrio associada avaliao da lignina solvel em brometo de 694acetila no tocante necessidade de obteno de padres especficos para cada tipo de material 695avaliado. 6965.Conclusions 697 Os teores de lignina obtidos pelo mtodo de Klason, por solubilazao da celulose em

698cido sulfrico ou por oxidao com permanganato de potssio apresentam contaminao 699significativa por protena. Assim, correo sugerida, notadamente para a lignina Klason, 700para que os teores de lignina sejam expressos com maior exatido. Leguminosas produzem 701contaminao protica mais proeminente em relao a gramneas. 702 Associaes entre lignina e os parmetros de degradao ruminal da fibra em

703detergente neutro so mais bem estabelecidas utilizando-se as estimativas produzidas pelos 704mtodos de Klason e pela oxidao em permanganato de potssio. 705Acknowledgments 706 The authors wish to thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e

707Tecnolgico (CNPq), the Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais 708(FAPEMIG-PPM), and the INCT Cincia Animal for financial support. 709References 710Association of Official Analytical Chemistry AOAC, 1990. Official methods of analysis. 71115th ed. AOAC International, Arlington. 712Bacha, C.B., 2006. Determinao do teor de lignina em amostras de gramneas ao longo do 713crescimento atravs de trs mtodos analticos e implicaes com as equaes de Cornell Net 714Carboydrate and Protein System. Faculdade de Medicina Veterinria e

715Zootecnia/Universidade de So Paulo, Pirassununga, (M.S. Thesis).

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855Table 1 856Chemical composition of forages Forage P. purpureum B. decumbens P. repens B. humidicola A. gayanus P. maximum cv Aruana P. maximum cv Mombaa B. brizantha cv Xaras Cynodon sp P. maximum cv Massai Arachis pintoi Medicago sativa Leucena leucocephala Galactia striata Dolichos lablab Centrozema pubescens Glicine wightti Gliricidia sepium Stylosantes guianenensis Cajanus cajan DMa b 20.02 30.58 31.07 29.02 29.05 34.75 29.46 27.21 31.25 32.10 19.87 25.69 34.25 33.29 19.58 26.27 24.32 17.62 30.42 29.38 OMa c 88.66 92.06 95.15 93.09 94.04 94.21 90.56 93.31 94.65 93.29 91.88 91.67 93.42 92.48 91.43 93.26 90.49 93.47 94.24 94.92 CPa c Grasses 11.37 7.85 9.73 7.02 8.79 7.80 10.39 8.68 10.74 7.26 Legumes 17.61 21.96 22.08 19.87 16.87 15.69 17.82 19.68 12.75 16.98 EEa c 2.13 3.69 2.54 2.31 2.32 2.51 1.28 2.38 2.40 2.15 1.88 4.85 3.97 2.69 2.98 2.08 3.65 1.55 2.70 2.90 aNDFapa c 65.80 71.03 71.48 72.30 73.67 73.65 69.04 71.98 69.23 79.95 40.36 39.87 40.89 40.71 44.36 68.09 51.23 59.80 54.69 69.25 NFCa c 9.36 9.49 11.40 11.45 9.25 10.25 9.88 10.27 12.28 3.90 32.04 24.97 26.48 29.21 27.22 7.40 17.78 12.44 24.10 5.79

857a DM, dry matter; OM, orgnica matter; CP, crude protein; EE, ether extract; aNDFap, neutral detergent fiber

858assayed with a heat stable amylase and corrected for ash and protein.
859b g/kg as fed. 860c g/kg DM.

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861Table 2 862Descriptive statistics for the evaluated variables

a

Item

NDFap LSA LSAp KL KLp LPM LPMp ABLcw ABLadf LSA LSAp KL KLp LPM LPMp ABLcw ABLadf pdNDF iNDF LAG kd

Grasses Legumes Mean Standard Error Mean Standard Error g/kg dry matter 568.5 13.4 412.4 19.7 63.4 3.5 92.3 6.8 62.6 3.4 89.7 5.9 154.2 6.6 171.3 17.8 134.3 5.9 132.4 14.9 83.9 2.2 116.8 5.2 81.1 2.1 108.9 5.5 79.7 5.3 53.1 15.8 46.9 3.5 41.6 2.1 g/kg NDF 111.5 5.8 224.1 13.7 110.3 5.6 217.7 11.9 271.8 12.3 413.8 38.7 236.8 11.1 319.3 32.2 147.8 3.5 286.1 12.0 142.8 3.4 266.6 12.7 141.4 10.8 131.8 7.9 82.8 6.3 101.3 3.1 Degradation parameters 630.7 15.4 489.6 26.8 369.3 15.4 510.4 26.8 3.43 0.15 4.71 0.38 0.0498 0.0022 0.0376 0.0028

863a NDFap, neutral detergent fiber corrected for ash and protein; LSA, lignin determined by solubilization of

864cellulose with sulphuric acid; LSAp, lignin determined by solubilization of cellulose with sulphuric acid and 865correctd for protein; KL, Klason lignin; KLp, Kalosn lignin corrected for protein; LPM, lignin determined by 866oxidation with potassium permanganate; LPMp, lignin determined by oxidation with potassium permanganate 867and corrected for protein; ABLadf, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the acid 868detergent fiber; ABLcw, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the cell wall matrix; 869pdNDF, potentially degradable fraction of neutral detergent fiber (g/kg NDF); iNDF, indigestible fraction of 870neutral detergent fiber (g/kg NDF); LAG, discrete lag (h); kd, fractional degradation rate of potentially 871degradable neutral detergent fiber (h-1).

39

37

872Table 3 873Estimates of regression parameters of relationship between crude (X) and protein corrected 874(Y) lignin contents according to different gravimetric methods
a

Methods LSA KL LPM LSA KL LPM

Regression parameters Intercept Slope 4.8238 5.4141 3.5644 6.7810 31.3182 6.5452 g/kg DM 0.9163 0.7859 0.9109 g/kg NDF 0.9370 0.7196 0.9135

r 0.9941 0.9010 0.9772 0.9960 0.9345 0.9920

sxy 1.61 11.34 2.98 4.06 22.44 6.42

Valor-Pb <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001

875a LSA, lignin determined by solubilization of cellulose with sulphuric acid; KL, Klason lignin; LPM, lignin 876determined by oxidation with potassium permanganate.
877b H0: 0 = 0 and 1 = 1 (Equation 6).

40

38

878Table 4 879Evaluation of interaction effect between analytical method and forage groups on avaerage 880lignin contents Methoda LPMp g/kg DMb 81.1Bb 108.9Ab g/kg NDFb 142.8Bb 266.6Ab

Forage Grasses Legumes Grasses Legumes

LSAp 62.6Bc 89.7Ac 110.3Bc 217.7Ac

KLp 134.3Aa 132.4Aa 236.8Ba 319.3Aa

ABLcw 79.7Ab 53.1Bd 141.4Ab 131.8Ad

ABLadf 46.9Ad 41.6Ad 82.8Ac 101.3Ad

sem 6.24

13.18

881a LSAp, lignin determined by solubilization of cellulose with sulphuric acid and correctd for protein; KLp,

882Kalosn lignin corrected for protein; LPMp, lignin determined by oxidation with potassium permanganate and 883corrected for protein; ABLadf, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the acid detergent 884fiber; ABLcw, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the cell wall matrix.
885b Means in the column followed by different capital letters or in the row followed by different lower minuscule

886letters are different according to Fishers LSD (P<0.05).

41

39

887Table 5 888Partial correlations between lignin contents (g/kg NDF) obtained by different methods Methoda b c Method KLp LPMPp ABLcw ABLadf LSAp 0.7397
0.0003

KLp --0.6545
0.0024

LPMp --0.3760
0.1126

ABLcw

0.5954
0.0072

-0.0046
0.9850

0.0743
0.7625

---0.0103

0.2034

0.1044

0.1550

0.4036 0.6705 0.5263 0.9667 a 889 LSAp, lignin determined by solubilization of cellulose with sulphuric acid and correctd for protein; KLp,

890Kalosn lignin corrected for protein; LPMp, lignin determined by oxidation with potassium permanganate and 891corrected for protein; ABLadf, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the acid detergent
892b The correlation estimates are adjusted regarding forage group effect. 893c Subscribed values correspond to descriptive level of probability for type I error associated with H0: = 0.

42

40

894Table 6 895Estimates of regression parameters for relationship between parameters of neutral detergent 896fiber degradation and lignin contents obtained by different methods Itemc 0 1 2 3 Valor-P r r sxy 0 1 2 3 Valor-P r r sxy 0 1 2 3 Valor-P r r sxy Methoda b KLp LPMp iNDF (g/kg NDF) 255.9 187.7 111.3 --0.4790 1.2817 ----<0.0001 0.0004 0.8534 0.8237 0.8333 0.8121 58.68 71.56 kd (h-1) 0.0605 0.0637 -0.0067 ---0.000045 -0.000095 ----0.0030 0.0010 -0.7179 -0.6934 -0.6744 -0.6710 0.0066 0.0066 LAG (h) 2.45 2.16 0.63 --0.0041 0.0088 ----0.0019 0.0007 0.7372 0.7077 0.6974 0.6867 0.58 0.58

LSAp 242.3 --1.2292 --0.0001 0.7698 0.7541 67.20 0.0590 ---0.000087 --0.0046 -0.6200 -0.5901 0.0072 2.60 --0.0080 --0.0038 0.6301 0.6013 0.64

ABLcw 369.3 141.1 ----0.0002 ----69.29 0.0499 -0.0106 ----0.0056 ----0.0073 3.43 0.98 ----0.0040 ----0.64

ABLadf 179.8 --2.8263 --0.0208 0.5209 0.4779 87.27 0.0499 -0.0106 ----0.0056 ----0.0073 3.43 0.98 ----0.0040 ----0.64

897a LSAp, lignin determined by solubilization of cellulose with sulphuric acid and correctd for protein; KLp,

898Kalosn lignin corrected for protein; LPMp, lignin determined by oxidation with potassium permanganate and 899corrected for protein; ABLadf, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the acid detergent 900fiber; ABLcw, lignin determined by solubilization with acetyl bromide from the cell wall matrix.
901b iNDF, indigestible fraction of neutral detergent fiber; LAG, discrete lag); kd, fractional degradation rate of

902potentially degradable neutral detergent fiber.

903c See more details about parameters in Equation 8. 904d Correlations adjusted for the number of parameters in the adjusted model (Draper and Smith, 1966).

43

41

150 Y=X 120

LASp (g/kg MS)

90

p k A/ Sg L ( ) M D

60

30

0 0 30 60 90 120 150 LAS (g/kg MS) LSA (g/kg DM)

905
300 270 240 210 LKp (g/kg MS) 180 150 120 90 60 30 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 LK (g/kg MS) KL (g/kg DM) Y= X

906
150 Y= X 120

LPERp (g/kg MS)

pM Lg KD ) k / ( p k M/ Pg L ( ) M D

90

60

30

0 0 30 60 90 120 150 LPER (g/kg MS) LPM (g/kg DM)

907 908Figure 1 909 Relao entre os teores de lignina brutos e isentos de protena (p) obtidos pelos mtodos do 910 cido sulfrico (LAS), de Klason (LK) e do permanganato (LPER) (+ = gasses; = legumes).

44

42

911

912

913 914Figure 2 915Relao entre os teores de lignina em cido sulfrico corrigida de protena (LSAp) e teor de 916fibra em detergente neutro indigestvel (iNDF), taxa fracional de degradao da fibra em 917detergente neutro potencialmente degradvel (kd) e latncia discreta (LAG) (+ = grasses; = 918legumes).

45

43

919

920

921 922Figure 3 923Relao entre os teores de lignina em permanganato de potssio corrigida de protena (LPMp) 924e teor de fibra em detergente neutro indigestvel (iNDF), taxa fracional de degradao da fibra 925em detergente neutro potencialmente degradvel (kd) e latncia discreta (LAG) (+ = grasses; 926 = legumes).

46

44

927

928

929 930Figure 4

47

45

931Relao entre os teores de lignina Klason corrigida de protena (KLp) e teor de fibra em 932detergente neutro indigestvel (iNDF), taxa fracional de degradao da fibra em detergente 933neutro potencialmente degradvel (kd) e latncia discreta (LAG) (+ = grasses; = legumes).

48

46

934

935

936 937Figure 5 938Relao entre os teores de lignina em brometo de acetila com base na parede celular (LBApc) 939e teor de fibra em detergente neutro indigestvel (FDNi), taxa fracional de degradao da fibra 940em detergente neutro potencialmente degradvel (kd) e latncia discreta (LAG) (+ = grasses; 941 = legumes).

49

47

942

943

944 945Figure 6 946Relao entre os teores de lignina em brometo de acetila a partir do resduo insolvel em 947detergente cido (ABLadf) e teor de fibra em detergente neutro indigestvel (iNDF), taxa 948fracional de degradao da fibra em detergente neutro potencialmente degradvel (kd) e 949latncia discreta (LAG) (+ = grasses; = legumes).

50

48