REKAYASA GENETIKA

Resume

Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Genetika II yang dibina oleh Prof. Dr. A. Duran Corebima, M. Pd, dan Prof. Dr. Hj. Siti Zubaidah, M. Pd

Oleh: Kelompok 4 Off. A Shefa Dwijayanti R. (109341417189) Ika Sukmawati (109341421811)

The Learning University

UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI November 2011

REKAYASA GENETIKA Pada rekayasa genetika dilakukan manipulasi atas materi genetic dengan cara menambah atau menghilangkan gen-gen tertentu. Pada teknologi ini juga digunakan vector atau sarana lain untuk memindahkan gen atau fragmen DNA antara lain injkesi mikro, fusi protoplas, elektroporasi, kopresipitasi fosfat dan endositosis, serta proyektil mikro. Setelah klon rekombinan hasil rekayasa dipertahankan, klon diseleksi dan diberdayakan dengan analisis genetic, diagnosis molekuler, terapi gen, sidik jari DNA, serta bioteknologi. Ada beberapa pengertian rekayasa genetika (genetic engineering), yaitu: 1. Rekayasa genetika adalah manipulasi sifat genetic suatu organisme dengan cara mengintroduksi atau mengeliminasi gen-gen tertentu (Micklos, dkk, 1990) 2. Rekayasa genetika adalah manipulasi genetic dalam sel untuk menghasilkan sesuatu sifat yang dikehendaki, kadang-kadang disebut teknologi rekombinan DNA (Rasmussen, dkk, 1990). 3. Rekayasa genetika adalah teknik mengubah konstitusi genetic sel atau individu dengan cara pemindahan selektif, insersi, atau dengan cara modifikasi gen baik yang individual maupun yang berupa perangkat gen. (Klug, dkk, 1994). Dari beberapa pengertian tersebut dapat dirangkum bahwa rekayasa genetika adalah manipulasi atas materi genetic dengan cara menambah atau menghilangkan gen-gen tertentu. Berbagai fenomena genetic alami sebenarnya menjadi model alami dari teknologi rekayasa genetika, antara lain crossing over, gene pick up, transduksi, insersi, delesi, translokasi, fusi dan fisi, yang dapat berakibat terjadinya penambahan atau peniadaan sesuatu atau beberapa gen. PROSES REKAYASA GENETIKA Teknik-teknik Rekayasa Genetika Terdapat berbagai teknik yang digunakan dalam rekayasa genetika, misalnya transfer vector, injeksi mikro, fusi protoplas, dan elektroporasi. Selain itu juga terdapat teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis, serta teknik proyektil mikro. Transfer Vektor Transfer vector merupakan cara memasukkan suatu gen ke dalam sel baru dengan menggunakan pembawa (carrier) khusus. Transfer semacam ini memanfaatkan prose salami seperti pada transfer DNA oleh bakteri dan virus. Vektor yang digunakan dalam teknik ini dapat

berupa plasmid, bakteriofag, dan kosmid atau cosmid. Selain itu juga tedapat Shuttle vector atau vector ulang-alik yang berupa molekul DNA. Sifat yang harus dimiliki molekul DNA sebagai vector: 1. Mampu melakukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara membawahi suatu ori. 2. Mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim restriksi khusus yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA. 3. Membawahi suatu penanda yang dapat dimanfaatkan untuk identifikasi sel-sel inang yang mengandungnya, 4. Mudah terbebas kembali dari sel inang. Selain sifat-sifat diatas, molekul DNA yang digunakan untuk vector sebaiknya memiliki berat molekul rendah dan mampu member sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada sel inang. 1. Plasmid Contoh plasmid misalnya pSC101 (58 M dal), ColE1 (4,2 M dal) dan RSF2124 (7,4 M dal). Plasmid tersebut terbentuk secara in vivo pada E. coli. Contoh lain plasmid E. coli misalnya pBR322 (4363 kb) dan pUC19 (2686 kb) yang merupakan derivate dari pBR322 yang ukurannya lebih kecil sehingga memungkinkan untuk insersi fragmen DNA yang lebih besar.

Gambar Plasmid PBR322

2. Bakteriofag Bakteriofag yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E. coli adalah bakteriofag yang seluruh gennya sudah diidentifikasi dam dipetakan, dan urutan yang digunakan sebagai vector

keseluruhan genomnya sudah diketahui. Seluruh derivat fag

transfer sudah direkayasa sehingga hanya siklus litik yang mungkin. Derivat tersebut diperoleh dengan cara membuang berbagai bagian kelompok gen di daerah tengah. Bakteriofag lain yang digunakan sebagai vector adalah M13 yang memiliki materi genetic berupa unting tunggal. Jika M13 menginfeksi sel bakteri, DNA unting tunggal bereplikasi menghasilkan suatu model DNA unting ganda yang disebut RF atau replication form yang dipandang setara dengan plasmid. DNA asing dapat diinsersikan ke dalam tapaktapak pemutusan enzim restriksi tunggal pada genom. Klon yang dihasilkan M13 dapat digunakan untuk pengurutan DNA atau sebagai template untuk perubahan urut-urutan klon akibat mutasi. 3. Kosmid Kosmid adalah vector yang dibangun atau dibuat di laboratorium memanfaatkan uruturutan cos dan fag yang berguna untuk pemasukan/ pengumpulan kromosom ke dalam

kepala fag yang juga untuk fungsi resistensi terhadap antibiotic serta replikasi. Suatu kosmid memiliki sebuah urut-urutan on suatu penanda dominan yang dapat dipilih seperti amp serta tapak-tapak restriksi unik untuk insersi dan pengklonan fragmen DNA.

Gambar Bagan Cosmid

4. Vektor ulang-alik (Shuttle vector) Selain vector transfer seperti plasmid, bakteriofag dan kosmid, sudah

dikembangkan juga vector lain untuk memasukkan molekul-molekul DNA rekombinan ke dalam sel makhluk prokariotik lain maupun yang eukariotik. Sudah terdapat vector yang dapat digunakan untuk memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam dua atau lebih macam sel makhluk hidup yang berbeda yang disebut vector ulang alik atau shuttle vector. Vektor ulang alik adalah vector pengklon yang dapat bereplikasi di dalam dua atau lebih makhluk hidup inang. 5. Injeksi mikro, fusi protoplas, elektroporasi, kepresipitasi kalsium fosfat dan endositosis serta proyeksi mikro Pada injeksi mikro digunakan jarum mikroskopis untuk memasukkan DNA melalui membrane sel sasaran termasuk ke dalam inti sel. Pada fusi protoplas terjadi pelarutan dua membrane sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel dapat bergabung menjadi satu, misalnya fusi antara sel-sel yang dikultur dengan protoplas bakteri yang mengandung DNA eksogen. Berkaitan dengan fusi protoplas sudah dikembangkan suatu system transformasi sederhana yang memanfaatkan liposom yang tersusun atas lipida kationik. Liposom tidak hanya membentuk kompleks dengan DNA tapi juga melekat pada sel hewan yang dikultur dan lapisan-lapisan itu efisien melakukan transformasi yang mungkin terjadi melalui fusi dengan membrane plasma. Pemanfaatan liposom sebagai system transformasi atau transfeksi disebut lipofeksi. Pada teknik elektroporasi digunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membrane sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Perlakuan dengan cosmid sebelum kejutan listrik meningkatkan frekuensi efisiensi transformasi. Teknik elektroporasi ini sangat sukses pada sel hewan. Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis butir-butir kopresipitasi kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis. Teknik tersebut adalah cara umum memasukkan DNA ke dalam sel-sel mamalia. Pada teknik proyektil mikro, DNA maupun RNA ditembakkan ke dalam sel, dan merupakan cara yang sama sekali baru untuk memasukkan asam nukleat ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Dengan pengujian pada Alium cepa, sudah terbukti bahwa DNA yang masuk ke

dalam sel bersama proyektil mikro diekspresikan. Pada teknik proyektil mikro tidak dibutuhkan kultur sel ataupun perlakuan jaringan resipien. Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan Urutan proses yang menjadi prosedur dasar pada teknik DNA rekombinan yang dperantarai vector adalah sebagai berikut: 1. Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuclease restriksi yang mengenal dan memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik. 2. Segmen-segmen tersebut digabung ke molekul DNA lain dnegan bantuan vector yang dapat bereplikasi secara otonom 3. Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Di dalam sel tersebut molekul DNA rekombinan direplikasi menghasilkan salinan-salinan yang disebut klon. 4. Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang, dimurnikan, dan dianalisis 5. Sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskannya kepada seluruh sel turunan, menghasilkan populasi sel identik yang semuanya membawahi urutan yang diklon 6. DNA yang diklon ditranskripsikan, RNAd nya ditranslasikan, dan produk-produk gennya diisolasi dan dikaji.

Pertanyaan: 1. Sebutkan sifat-sifat yang harus dimiliki oleh molekul DNA sebagai vector! Jawab: Sifat yang harus dimiliki molekul DNA sebagai vector: a. Mampu melakukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara membawahi suatu ori. b. Mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim restriksi khusus yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA. c. Membawahi suatu penanda yang dapat dimanfaatkan untuk identifikasi sel-sel inang yang mengandungnya, d. Mudah terbebas kembali dari sel inang. Selain sifat-sifat diatas, molekul DNA yang digunakan untuk vector sebaiknya memiliki berat molekul rendah dan mampu member sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada sel inang.

2. Bagaimana urutan prosedur dasar pada teknik DNA rekombinan yang diperantarai vector? Jawab: Urutan proses yang menjadi prosedur dasar pada teknik DNA rekombinan yang dperantarai vector adalah sebagai berikut: a. Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuclease restriksi yang mengenal dan memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik. b. Segmen-segmen tersebut digabung ke molekul DNA lain dnegan bantuan vector yang dapat bereplikasi secara otonom c. Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Di dalam sel tersebut molekul DNA rekombinan direplikasi menghasilkan salinan-salinan yang disebut klon. d. Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang, dimurnikan, dan dianalisis

e. Sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskannya kepada seluruh sel turunan, menghasilkan populasi sel identik yang semuanya membawahi urutan yang diklon f. DNA yang diklon ditranskripsikan, RNAd nya ditranslasikan, dan produk-produk gennya diisolasi dan dikaji.