A N A L I T I C O S

M E T O D O S

E N

A L I M E N T A R I A
D E A N A L I S I S

O F I C I A L E S

Aceites y grasas

PANREAC QUIMICA, S.A. ha publicado desde hace aos la coleccin de Mtodos Analticos en Alimentaria, que creemos ha sido de gran utilidad por la gran acogida que han tenido por parte de nuestros clientes.
M E T O D O S A N A L I T I C O S E N A L I M E N T A R I A

Durante todo este tiempo se han producido modificaciones tanto en los mtodos propuestos en la legislacin, como en la oferta de nuevos productos fabricados y distribuidos por Panreac. Las nuevas ediciones de los Mtodos Analticos en Alimentaria irn recogiendo todas estas modificaciones y se irn actualizando de manera acorde. La incorporacin de Espaa en la Unin Europea y la transposicin de las Directivas Comunitarias en la Legislacin Espaola hace que, cada vez ms, se utilicen los mtodos de las Normativas Comunitarias en el trabajo habitual. Por tanto, las nuevas ediciones se realizarn con los mtodos establecidos en las Directivas. Este principio se ha introducido en la nueva edicin del folleto Aceites y Grasas y se ir implementando en las nuevas ediciones actualizadas de los distintos mtodos.

Los ttulos de las 6 monografas son:

Aceites y grasas Aguas potables de consumo pblico y aguas de bebida envasadas Carne y productos crnicos Cereales, derivados de cereales y cerveza Leche y productos lcteos Productos derivados de la uva, aguardientes y sidras
Obviamente esta edicin ha sido actualizada con las disposiciones publicadas hasta el momento, que establecen nuevos procedimientos o que modifican notablemente caractersticas anteriormente establecidas. Por ltimo, comentarles que estn a su disposicin adems de esta coleccin, nuestros: Catlogo General de Reactivos PANREAC Catlogo ADITIO de Aditivos Alimentarios Manual Bsico de Microbiologa CULTIMED.

Aceites y grasas
C O N T E N I D O
Recoge una transcripcin ntegra de los mtodos oficiales de anlisis publicados en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas: NL248/1 de 5.9.91 Reglamento (CEE) N2568/91 de la Comisin de 11 de julio de 1991 actualizados con las siguientes modificaciones hasta la fecha: (Mayo 1999). NL150/17 de 2.6.92 Reglamento (CEE) N1429/92 de la Comisin de 26 de mayo de 1992 NL258/49 de 28.10.95 Reglamento (CE) N2527/95 de la Comisin de 27 de octubre de 1995 L341/25 de 12.12.97 Reglamento (CE) N2472/97 de la Comisin de 11 de diciembre de 1997 L28/5 de 4.2.98 Reglamento (CE) N282/98 de la Comisin de 3 de febrero de 1998 L85/3 de 20.3.98 Reglamento (CE) N623/98 de la Comisin de 19 de marzo de 1998 A continuacin de los mtodos de anlisis se indican los reactivos Panreac recomendados.

Aceites
Anexo I: Caractersticas de los aceites de oliva .......................................... 12 Anexo II: Determinacin del grado de acidez 1. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Objeto ....................................................... Principio..................................................... Reactivos................................................... Material...................................................... Procedimiento............................................ Expresin................................................... 14 14 14 15 15 15

Anexo VI: Determinacin del contenido en eritrodiol y uvaol Introduccin . .................................................... 1. Objeto ....................................................... 2. Principio .................................................... 3. Material y aparatos .................................... 4. Reactivos .................................................. 5. Procedimiento ........................................... 6. Expresin de los resultados ....................... 27 27 27 27 27 27 28

Anexo VII: Determinacin de los cidos grasos situados en la posicin 2 de los triglicridos de aceites y grasas 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Objeto........................................................ Campo de aplicacin ................................. Principio..................................................... Equipo ....................................................... Reactivos................................................... Preparacin de la muestra ......................... Preparacin de las placas cromatogrficas ......................................... 8. Procedimiento............................................ 9. Expresin de los resultados ....................... 10. Notas......................................................... 28 28 28 28 29 30 30 30 31 31

Anexo III: Determinacin del ndice de perxidos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Objeto ....................................................... Ambito de aplicacin ................................ Definicin .................................................. Principio .................................................... Aparatos .................................................... Reactivos .................................................. Muestra ..................................................... Procedimiento............................................ Expresin de los resultados ...................... 15 15 15 15 15 16 16 16 16

Anexo IV: Determinacin del contenido de ceras mediante cromatografa de gases con columna capilar 1. Objeto........................................................ 2. Principio .................................................... 3. Aparatos ................................................... 4. Reactivos .................................................. 5. Procedimiento ........................................... 6. Expresin de los resultados ...................... Apndice .......................................................... 17 17 17 17 18 19 19

Anexo VIII: Determinacin del porcentaje de trilinolena 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Objeto........................................................ Campo de aplicacin ................................. Principio..................................................... Aparatos .................................................... Reactivos................................................... Preparacin de las muestras...................... Procedimiento............................................ Clculo y expresin de los resultados ........ 31 31 32 32 32 32 32 32

Anexo V: Determinacin de la composicin y del contenido de esteroles mediante cromatografa de gases con columna capilar 1. Objeto ....................................................... 2. Principio .................................................... 3. Material ..................................................... 4. Reactivos .................................................. 5. Procedimiento ........................................... 6. Expresin de los resultados ...................... Apndice .......................................................... 20 20 20 20 21 24 24

Anexo IX: Prueba espectrofotomtrica en el ultravioleta Introduccin ...................................................... 1. Objeto........................................................ 2. Principio..................................................... 3. Material y aparatos..................................... 4. Reactivos................................................... 5. Procedimiento............................................ 6. Expresin de los resultados ....................... Apndice I: Preparacin de la almina y control de su actividad ............................ Apndice II: Ajuste del espectrofotmetro.......... 35 35 35 35 35 35 36 36 36

Anexo X "A": Anlisis de los steres metlicos de los cidos grasos mediante cromatografa de gases 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Objeto........................................................ Reactivos................................................... Aparatos .................................................... Procedimiento............................................ Expresin de los resultados ....................... Caso especial de determinacin de los ismeros trans ........................................... Caso especial de utilizacin de un catarmetro (funcionamiento basado en el principio de los cambios de conductividad trmica)............................... Informe del anlisis..................................... 37 37 37 38 41 42

2. 3. 4.

Equipo ....................................................... 48 Reactivos................................................... 49 Procedimiento de anlisis........................... 49

Anexo XIII: 1. Neutralizacin y decoloracin del aceite de oliva en laboratorio..................................... 1.1 Neutralizacin del aceite ............................. 1.1.1 Equipo..................................................... 1.1.2 Reactivos ................................................ 1.1.3 Modo de operar ...................................... 1.2 Decoloracin del aceite neutro................. 1.2.1 Equipo..................................................... 1.2.2 Modo de operar ......................................

8.

44 44

49 49 49 49 50 50 50 50

Anexo X "B": Preparacin de los steres metlicos de los cidos grasos de conformidad con los puntos I y II del anexo VI del Reglamento (CEE) N 72/77 Introduccin ...................................................... 1. Objeto........................................................ Procedimiento A 2. Principio del mtodo ............................. 3. Material y aparatos................................ 4. Reactivos.............................................. 5. Procedimiento....................................... Procedimiento B 2. Principio del mtodo ............................. 3. Material y aparatos................................ 4. Reactivos.............................................. 5. Procedimiento....................................... Procedimiento C 2. Principio del mtodo ............................. 3. Material y aparatos................................ 4. Reactivos.............................................. 5. Procedimiento....................................... Procedimiento D 2. Principio del mtodo ............................. 3. Material y aparatos................................ 4. Reactivos.............................................. 5. Procedimiento....................................... Procedimiento E 2. Principio del mtodo ............................. 3. Material y aparatos................................ 4. Reactivos.............................................. 5. Procedimiento....................................... 44 45 45 45 45 45 46 46 46 46 46 46 46 47 47 47 47 47 48 48 48 48

Anexo XIV: Notas complementarias 2, 3 y 4 del captulo 15 de la nomenclatura combinada 1. Nota 2A ..................................................... Nota 2B ..................................................... Nota 2C ..................................................... Nota 2D ..................................................... Nota 2E ..................................................... Nota 3 ....................................................... Nota 4 ....................................................... 50 51 52 52 52 52 52

2. 3.

Anexo XV: 1. Contenido en aceite de los orujos de aceituna 1.1 Material............................................... 52 1.2 Reactivo ............................................. 53 Modo de operar......................................... 53 Expresin de los resultados ....................... 54

2. 3.

Anexo XVI: Determinacin del ndice de yodo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Objeto........................................................ Definicin ................................................... Principio..................................................... Reactivos................................................... Material...................................................... Preparacin de la muestra ......................... Procedimiento............................................ Expresin de los resultados ....................... 54 54 54 54 55 55 55 55

6
Anexo XI: Determinacin del contenido en solventes halogenados voltiles en el aceite de oliva 1. Principio del mtodo .................................. 48

Anexo XVII: Mtodo para la determinacin de estigmastadienos en los aceites vegetales 1. 2. Objetivos.................................................... 56 Aplicacin .................................................. 56

M
3. 4. 5. 6. Fundamento .............................................. Instrumental ............................................... Reactivos................................................... Metodologa............................................... 56 56 56 57

Anexo XVIII: Determinacin del contenido de triglicridos con ECN42 (diferencia entre el contenido terico y los datos obtenidos por HPLC) 1. 2. 3. 4. 5. 6. Objeto........................................................ Campo de aplicacin ................................. Principio..................................................... Mtodo ...................................................... Evaluacin de los resultados ...................... Ejemplo...................................................... 60 60 60 60 65 66

Relacin de reactivos y productos auxiliares Panreac que se utilizan en los mtodos de Anlisis de Aceites y Grasas................................................... 72

Relacin de aditivos y coadyuvantes tecnolgicos para uso alimentario industrial............................................... 74

M
REGLAMENTO (CEE) N 2568/91 DE LA COMISIN de 11 de julio de 1991 relativo a las caractersticas de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus mtodos de anlisis tarn determinados Estados miembros para crear dichos paneles, procede autorizar que se recurra a paneles existentes en otros Estados miembros; Considerando que, para garantizar el correcto funcionamiento del sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importacin de orujo de oliva, es conveniente prever un mtodo nico para la determinacin del contenido en aceite de estos productos; Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno prever un perodo limitado para la salida al mercado del aceite que haya sido envasado antes de la entrada en vigor del presente Reglamento; Considerando que procede derogar el Reglamento (CEE) n 1058/77 de la Comisin (3), cuya ltima modificacin la constituye el Reglamento (CEE) n 1858/88 (4); Considerando que el Comit de gestin de las materias grasas no ha emitido dictamen alguno en el plazo establecido por su presidente,

LA COMISIN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS, Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Econmica Europea. Visto el Reglamento n 136/66/CEE del Consejo, de 22 de septiembre de 1966, por el que se establece la organizacin comn de mercados en el sector de las materias grasas (1), cuya ltima modificacin la constituye el Reglamento (CEE) n 3577/90 (2), y, en particular, su artculo 35 bis, Considerando que en el Anexo del Reglamento n 136/66/CEE se establecen las denominaciones y definiciones de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva comercializados dentro de cada Estado miembro, as como en los intercambios intracomunitarios y con terceros pases; Considerando que, para poder distinguir los diferentes tipos de aceite, procede definir las caractersticas fisicoqumicas de cada uno de ellos, as como las caractersticas organolpticas de los aceites vrgenes, a fin de garantizar as la pureza y calidad de estos productos, sin perjuicio de otras disposiciones existentes en la materia; Considerando que conviene determinar de manera uniforme en toda la Comunidad la presencia de las caractersticas de los diferentes tipos de aceite; que, para ello, procede establecer los mtodos comunitarios de anlisis qumico y de valoracin organolptica; que conviene, sin embargo, permitir que durante un perodo transitorio se utilicen otros mtodos de anlisis que sean aplicados en los Estados miembros, estableciendo al mismo tiempo que en caso de presentarse resultados divergentes prevalezcan los obtenidos a travs del mtodo comn; Considerando que la definicin de las caractersticas fisicoqumicas de los aceites de oliva y de sus mtodos de anlisis comporta la adaptacin de las notas complementarias del captulo 15 de la nomenclatura combinada; Considerando que el mtodo de valoracin de las caractersticas organolpticas de los aceites vrgenes requiere la creacin de unos paneles de catadores seleccionados y especialmente adiestrados; que conviene, por lo tanto, prever el plazo necesario para instaurar una estructura de este tipo; que, dadas las dificultades a las que se enfren-

HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO: Artculo 1 1. Se considerarn aceites de oliva vrgenes, a que se refieren las letras a), b), y c) del punto 1 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, los aceites cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas, respectivamente, en los puntos 1, 2 y 3 del Anexo I del presente Reglamento. 2. Se considerar aceite de oliva virgen lampante, a que se refiere la letra d) del punto 1 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 4 del Anexo I del presente Reglamento. 3. Se considerar aceite de oliva refinado, a que se refiere el punto 2 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 5 del Anexo I del presente Reglamento. 4. Se considerar aceite de oliva, a que se refiere el punto 3 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 6 del Anexo I del presente Reglamento. 5. Se considerar aceite de orujo de oliva crudo, a que se refiere el punto 4 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 7 del Anexo I del presente Reglamento.

(1) DO n 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66. (2) DO n L 353 de 17. 12. 1990, p. 23.

(3) DO n L 128 de 24. 5. 1977, p. 6. (4) DO n L 166 de 1. 7. 1988, p. 10.

6. Se considerar aceite de orujo de oliva refinado, a que se refiere el punto 5 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 8 del Anexo I del presente Reglamento. 7. Se considerar aceite de orujo de oliva, a que se refiere el punto 6 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 9 del Anexo I del presente Reglamento. Artculo 2

El anlisis contradictorio ser realizado por el panel de catadores de conformidad con las disposiciones citadas anteriormente. Para la valoracin de las caractersticas organolpticas con ocasin de operaciones relacionadas con el rgimen de intervencin, el panel de catadores proceder a aquella con arreglo a las disposiciones del Anexo XII.
*Nota: Al no considerarse la valoracin organolptica un anlisis qumico, se ha omitido el anexo XII. Si est interesado en l, no dude en solicitarlo.

Artculo 3 1. Las caractersticas de los aceites, previstas en el Anexo I, se determinarn empleando los mtodos de anlisis siguientes: para determinar los cidos grasos libres, expresados en porcentaje de cido oleico, el mtodo recogido en el Anexo II, para determinar el ndice de perxidos, el mtodo recogido en el Anexo III, para determinar los alcoholes alifticos, el mtodo recogido en el Anexo IV, para determinar el contenido de esteroles, el mtodo recogido en el Anexo V, para determinar el eritrodiol + uvaol, el mtodo recogido en el Anexo VI, para determinar los cidos grasos saturados en la posicin 2 del triglicrido, el mtodo recogido en el Anexo VII, para determinar el contenido de trilinolena, el mtodo recogido en el Anexo VIII, para el anlisis espectrofotomtrico, el mtodo recogido en el Anexo IX, para determinar la composicin de cidos grasos, el mtodo recogido en los Anexos X A y X B, para determinar los solventes halogenados voltiles, el mtodo recogido en el Anexo XI, para la valoracin de las caractersticas organolpticas de los aceites de oliva vrgenes, el mtodo recogido en el Anexo XII, que se aplicar de conformidad con el apartado 2, para la prueba de la refinacin, el mtodo recogido en el Anexo XIII. para determinar los estigmastadienos, el mtodo recogido en el Anexo XVII. (Modificado por el Reglamento 656/95) para determinar la composicin de los triglicridos de ECN42, el mtodo que figura en el Anexo XVIII. (Modificado por el Reglamento 2472/97) 2. El analista, asistido en su caso por expertos, llevar a cabo la valoracin de las caractersticas organolpticas con arreglo al procedimiento descrito en la ficha de degustacin contemplada en el Anexo XII. En caso de que el anlisis determine caractersticas organolpticas distintas de las resultantes de la denominacin del producto, el analista someter la muestra al examen de un panel de catadores, con arreglo a las disposiciones del Anexo XII.* Hasta el 28 de febrero de 1993 (modificado por el Reglamento 183/93), la introduccin de los mtodos de anlisis previstos en el artculo 2 no ser bice para que los Estados miembros empleen otros mtodos comprobados y cientficamente vlidos, siempre que con ello no se obstaculice la libre circulacin de los productos reconocidos conformes a la normativa en aplicacin de los mtodos comunitarios. Los Estados miembros interesados comunicarn a la Comisin dichos otros mtodos antes de utilizarlos. En caso de que alguno de estos otros mtodos d un resultado diferente del alcanzado por el mtodo comn, se considerar vlido el resultado obtenido en aplicacin del mtodo comn. Artculo 4 1. A fin de apreciar las caractersticas organolpticas, los Estados miembros constituirn paneles de catadores seleccionados y entrenados de acuerdo con las normas previstas en el mtodo descrito en el Anexo XII. 2. En caso de que un Estado miembro tenga dificultades para constituir un panel en su territorio podr recurrir a un panel que se halle establecido en otro Estado miembro. Artculo 5 Las notas complementarias 2, 3 y 4 del captulo 15 de la nomenclatura combinada que figura en el Anexo I del Reglamento (CEE) no 2658/87 del Consejo (5) sern sustituidas por el texto que figura en el Anexo XIV del presente Reglamento. (Modificado por el Reglamento 183/93) Artculo 6 1. El contenido en aceite de orujo de aceituna y dems residuos de la extraccin del aceite de oliva (cdigos NC 2306 90 11 y 2306 90 19) se determinar con arreglo al mtodo recogido en el Anexo XV.

10

(5) Do n L 256 de 7. 9. 1987, p. 1.

M
2. El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresar como porcentaje del extracto seco en peso. Artculo 7 Sern aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de sustancias extraas distintas de las mencionadas en el Anexo XI. Artculo 8 1. Cada Estado miembro comunicar a la Comisin las medidas adoptadas en aplicacin del presente Reglamento. 2. Cada Estado miembro comunicar a la Comisin, al inicio de cada semestre una recapitulacin de los datos analticos de las determinaciones efectuadas durante el semestre precedente. Estos resultados sern examinados por el Comit de gestin de las materias grasas con arreglo al procedimiento previsto en el artculo 39 del Reglamento n 136/66/CEE. Artculo 9 Queda derogado el Reglamento (CEE) n 1058/77. Artculo 10 1. El presente Reglamento entrar en vigor el tercer da siguiente al de su publicacin en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas. No obstante, el mtodo que figura en el Anexo XII se aplicar a partir del 1 de enero de 1992, excepto en lo que se refiere a las operaciones relacionadas con la intervencin. El presente Reglamento no se aplicar a los aceites de oliva y de orujo de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento y comercializados hasta el 31 de octubre de 1992. El presente Reglamento ser obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro. Hecho en Bruselas, el 11 de julio de 1991. Por la Comisin RAY MAC SHARRY Miembro de la Comisin ANEXOS Indice Anexo I: Caractersticas de los aceites de oliva Anexo II: Determinacin del grado de acidez Anexo III: Determinacin del ndice de perxidos Anexo IV: Determinacin del contenido de ceras mediante cromatografa de gases con columna capilar (Modificado por el Reglamento 183/93) Anexo V: Determinacin de la composicin y del contenido de esteroles mediante cromatografa de gases en columna capilar Anexo VI: Determinacin del eritrodiol y uvaol Anexo VII: Determinacin de los cidos grasos saturados en la posicin 2 de los triglicridos de aceites y grasas Anexo VIII: Determinacin del porcentaje de trinolena Anexo IX: Prueba espectrofotomtrica en el ultravioleta Anexo X "A": Anlisis de los steres metlicos de los cidos grasos mediante cromatografa de gases Anexo X "B": Preparacin de los steres metlicos de los cidos grasos Anexo XI: Determinacin del contenido en solventes halogenados voltiles en el aceite de oliva Anexo XII: Valoracin organolptica del aceite de oliva virgen Anexo XIII: Neutralizacin y decoloracin del aceite de oliva en laboratorio (Modificado por el Reglamento 183/93) Anexo XIV: Notas complementarias 2, 3 y 4 del captulo 15 de la nomenclatura combinada Anexo XV: Contenido de aceite de los orujos de aceituna Anexo XVI: Determinacin del ndice de yodo Anexo XVII: Mtodo para la determinacin de estigmastadienos en los aceites vegetales (Modificado por el Reglamento 656/95) Anexo XVIII: Mtodo para la determinacin de la composicin de los triglicridos de ECN42 (Modificado por el Reglamento 2472/97)

11

Categora

1. Aceite de oliva virgen extra 0,20 0,20 > 0,20 0,20 0,3 0,6 0,5 0,5 0,20 0,20 > 350 2,0 0,20 2,0 1,8 350 1,5 350 1,5 0,3 350 1,3 0,50 0,3 250 1,3 0,15 0,2 250 1,3 0,15 0,2 2,60 2,60 3,70 3,40 3,30 5,50 5,30

2. Aceite de oliva virgen

3. Aceite de oliva virgen corriente

4. Aceite de oliva virgen lampante

5. Aceite de oliva refinado -

6. Aceite de oliva

7. Aceite de orujo de oliva crudo

8. Aceite de orujo de oliva refinado

9. Aceite de orujo de oliva

(1) Lmite mximo total de compuestos halogenados detectados mediante captura de electrones. Para cada uno de los componentes el lmite mximo es de 0,10 mg/kg. (2) Suma de ismeros que podran (o no podran) separarse mediante una columna capilar. (3) Para la verificacin de aceite refinado, cuando el K270 sobrepase el lmite de la categora correspondiente, deber procederse a la determinacin del K270 despus de ser tratado con almina. Notas: Los resultados de los anlisis debern expresarse con el mismo nmero de decimales que los previstos para cada caracterstica. La ltima cifra deber aumentarse en una unidad si la cifra siguiente es superior a 4. Para cambiar de categora a un aceite o declararlo no conforme a su pureza bastar con que una sola de las caractersticas no se ajuste a los lmites fijados. Las caractersticas indicadas con asterisco (*), relativas a la calidad del aceite, implican lo siguiente: en el caso del aceite de oliva virgen lampante, los lmites (excepto el de K232) no debern respetarse simultneamente; en el caso de los dems aceites de oliva vrgenes, el incumplimiento de uno de los lmites supondr un cambio de categora, aunque seguirn clasificados dentro de una de las categoras de los aceites de oliva vrgenes.

12
ANEXO I (modificado por el Reglamento (CE) N 2472/97) CARACTERSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA
Ceras mg/kg cidos grasos saturados en posicin 2 de los triglicridos (%) Estigmastadienos (2) mg/kg Diferencia entre ECN42 y HPLC y ECN42 clculo terico K232 (*) K270 (*) K270 despus de pasar por almina (3) D-K (*) Panel test (*)

Acidez (%) (*)

ndice de Disolventes perxidos halogenados mg/kg meq O2/kg (*) (*) (1)

1,0

20

0,20

250

1,3

0,15

0,2

2,50

0,20 0,25 0,25 > 0,25 1,20 1,00 2,50 2,00

0,10 0,10 0,10 0,11 -

0,01 0,01 0,01 0,16 0,13 0,25 0,20

6,5 5,5 3,5 < 3,5 -

2,0

20

3,3

20

> 3,3

> 20

0,5

1,5

15

> 0,5

0,5

1,5

15

Contenido de cidos Brasicasterol (%) Campesterol (%) Estigmasterol (%) Betasitosterol (1) (%)

Categora

Mirstico (%)

Sumas Sumas de de los los ismeros ismeros translinoleicos y Colesterol Lino- Araqu- Eicose- Beh- Lignotransoleicos translinolnicos (%) lnico lnico noico nico crico (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)

Delta-7- Esteroles Estigmas- totales tenol (mg/kg) (%)

Eritrodiol y uvaol (%)

1. Aceite de oliva virgen extra 2. Aceite de oliva virgen 3. Aceite de oliva virgen corriente 4. Aceite de oliva virgen lampante 5. Aceite de oliva refinado 6. Aceite de oliva 7. Aceite de orujo de oliva crudo 8. Aceite de orujo de oliva refinado 9. Aceite de orujo de oliva

0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,05 0,05 0,05 0,10 0,20 0,20 0,20 0,40 0,40

0,05 0,05 0,05 0,10 0,30 0,30 0,10 0,35 0,35

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2

4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

< Camp. < Camp. < Camp. < Camp. < Camp. < Camp. < Camp.

93,0 93,0 93,0 93,0 93,0 93,0 93,0 93,0 93,0

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

1000 1000 1000 1000 1000 1000 2500 1800 1600

4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 12 12 > 4,5

(1) Suma de: Delta-5,23-Estigmastadienol + Clerosterol + Sitosterol + Sitostanol + Delta-5-Avenasterol + Delta-5-Avenasterol + Delta-5,24-Estigmastadienol.

Nota: Los resultados de los anlisis debern expresarse con el mismo nmero de decimales que los previstos para cada caracterstica. La ltima cifra deber aumentarse en una unidad si la cifra siguiente es superior a 4. Para cambiar de categora a un aceite o declararlo no conforme a su pureza bastar con que una sola de las caractersticas no se ajuste a los lmites fijados.

13

ANEXO II DETERMINACIN DEL GRADO DE ACIDEZ 1. OBJETO Determinar los cidos libres en los aceites de oliva. El contenido en cidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada segn el mtodo convencional. 1.1. Principio Disolucin de la muestra en una mezcla de disolventes y valoracin de los cidos grasos libres mediante una solucin etanlica de hidrxido potsico. 1.2. Reactivos Todos los reactivos deben ser de calidad analtica reconocida y el agua utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente. 1.2.1. Mezcla de ter dietlico y etanol de 95% (V/V), en proporcin de volumen 1:1. Nota: El ter dietlico es muy inflamable y puede formar perxidos explosivos. Debe utilizarse tomando especiales precauciones. Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilizacin con la solucin de hidrxido potsico (1.2.2) en presencia de 0,3 ml de la solucin de fenolftalena (1.2.3) por cada 100 ml de mezcla. Nota: Si no es posible utilizar ter dietlico, puede sustituirse por una mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno. Si fuera necesario, el etanol podra sustituirse, a su vez, por 2-propanol.

1.2.2. Solucin etanlica valorada de hidrxido potsico, = 0,1M o, en caso necesario, = 0,5M. Nota 1. Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilizacin, la concentracin exacta de la solucin etanlica de hidrxido potsico. Debe utilizarse una solucin que haya sido preparada por lo menos cinco das antes y decantada en un frasco de vidrio marrn cerrado con tapn de goma. La solucin debe ser incolora o de color amarillo paja. Nota: Se puede preparar una solucin incolora y estable de hidrxido potsico de la manera siguiente: Llevar a ebullicin, y mantener sta a reflujo durante una hora, 1000 ml de etanol con 8 g de hidrxido potsico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inmediatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de hidrxido potsico. Dejar reposar durante varios das y decantar el lquido claro sobrenadante, separndolo del precipitado de carbonato potsico. La solucin tambin puede prepararse de la manera siguiente sin efectuar la destilacin: aadir 4 ml de butilato de aluminio a 1000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos das. Decantar el lquido sobrenadante y disolver en l la cantidad necesaria de hidrxido potsico. La solucin est lista para ser utilizada. 1.2.3. Solucin de 10 g/l de fenolftalena en etanol de 95-96% (V/V) o solucin de 20 g/l de azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy coloreados) en etanol de 95-96% (V/V).

REACTIVO Etanol de 95 % (V/V) Etanol Etanol de 95-96% (V/V) ter dietlico Hidrxido potsico 2-Propanol Solucin de 10 g/l de fenolftalena en etanol de 95-96% (V/V) Solucin etanlica valorada de hidrxido potsico, = 0,1 M Solucin etanlica valorada de hidrxido potsico, = 0,5 M Tolueno Virutas de aluminio

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 121085 Etanol 96% v/v PA

132770 121515 131090 281327 182146 181519 131745 A13805

Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO Potasio Hidrxido 85% lentejas PA 2-Propanol PA-ACS-ISO Fenolftalena solucin 1% RV Potasio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) etanlica SV Potasio Hidrxido 0,5 mol/l (0,5N) etanlica SV Tolueno PA-ACS-ISO Aluminio, virutas, 99+%

14

M
1.3. Material Material habitual de laboratorio, y en particular: 1.3.1. Balanza analtica 1.3.2. Matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad 1.3.3. Bureta de 10 ml de capacidad, con graduacin de 0,05 ml 1.4. Procedimiento 1.4.1. Preparacin de la muestra para la prueba La determinacin se efectuar en una muestra filtrada. Si el contenido global de humedad e impurezas es inferior al 1%, se utilizar la muestra tal cual. 1.4.2. Muestra para la prueba Tomar la muestra, segn el grado de acidez previsto, de acuerdo con el cuadro siguiente: Grado de acidez previsto <1 1a4 4 a 15 15 a 75 > 75 Peso de la muestra (en g) 20 10 2,5 0,5 0,1 Precisin de la pesada de la muestra (en g) 0,05 0,02 0,01 0,001 0,0002 siendo: V : volumen en ml de la solucin valorada de hidrxido potsico utilizada. c : concentracin exacta, en moles por litro, de la solucin de hidrxido potsico utilizada. M: peso molecular del cido en que se expresa el resultado (cido oleico = 282). P: peso en gramos de la muestra utilizada. Se tomar como resultado la media aritmtica de dos determinaciones.

ANEXO III DETERMINACIN DEL NDICE DE PERXIDOS

1. OBJETO La presente norma describe un mtodo para la determinacin del ndice de perxidos de los aceites y grasas. 2. MBITO DE APLICACIN La presente norma es aplicable a los aceites y grasas animales y vegetales. 3. DEFINICIN El ndice de perxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de oxgeno activo por kg de grasa) de perxidos en la muestra que ocasionan la oxidacin del yoduro potsico en las condiciones de trabajo descritas. 4. PRINCIPIO La muestra problema, disuelta en cido actico y cloroformo, se trata con solucin de yoduro potsico. El yodo liberado se valora con solucin valorada de tiosulfato sdico. 5. APARATOS Todo el material utilizado estar exento de sustancias reductoras u oxidantes. Nota: No engrasar las superficies esmeriladas. 5.1. Navecilla de vidrio de 3 ml 5.2. Matraces con cuello y tapn esmerilados, de 250 ml de capacidad aproximadamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco (nitrgeno o, preferiblemente, dixido de carbono). 5.3. Bureta de 25 o 50 ml, graduada en 0,1 ml.

Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2) 1.4.3. Determinacin Disolver la muestra (1.4.2) en 50 a 150 ml de la mezcla de ter dietlico y etanol (1.2.1), previamente neutralizada. Valorar, agitando, con la solucin de hidrxido potsico de 0,1M (1.2.2) (vase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloracin rosa de la fenolftalena debe permanecer al menos durante 10 segundos). Nota 1: La solucin etanlica valorada de hidrxido potsico (1.2.2) puede sustituirse por una solucin acuosa de hidrxido potsico o sdico siempre que el volumen de agua aadido no provoque una separacin de las fases. Nota 2: Si la cantidad necesaria de la solucin de hidrxido potsico de 0,1M supera los 10 ml, debe utilizarse una solucin de 0,5M. Nota 3: Si la solucin se enturbia durante la valoracin, aadir una cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que la solucin se aclare. 1.5 Expresin de la acidez en porcentaje de cido oleico La acidez, expresada en porcentaje de cido oleico es igual a: M 100 VxcxM V x c x x = 1000 P 10 x P

15

6. REACTIVOS 6.1. Cloroformo para anlisis, exento de oxgeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco. 6.2. cido actico glacial para anlisis, exento de oxgeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco. 6.3. Solucin acuosa saturada de yoduro potsico, recin preparada, exenta de yodo y yodatos.

6.4. Solucin acuosa de tiosulfato sdico 0,01N o 0,002N valorada exactamente; la valoracin se efectuar inmediatamente antes del uso. 6.5. Solucin de almidn, en solucin acuosa de 10 g/l, recin preparada con almidn soluble.

REACTIVO cido actico glacial para anlisis Almidn soluble Cloroformo para anlisis Solucin acuosa de tiosulfato sdico 0,01 N Solucin acuosa de tiosulfato sdico 0,002 N Solucin de almidn, en solucin acuosa de 10 g/l Yoduro potsico

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131008 Acido Actico glacial PA-ACS-ISO 121096 Almidn de Patata soluble PA 131252 Triclorometano estabilizado con etanol PA-ACS-ISO 181723 Prepararlo a partir de Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l (0,1N) SV diluido convenientemente con agua 181723 Prepararlo a partir de Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l (0,1N) SV diluido convenientemente con agua 283146 Almidn solucin 1% RV 131542 Potasio Yoduro PA-ACS-ISO

7. MUESTRA La muestra se tomar y almacenar al abrigo de la luz, y se mantendr refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y hermticamente cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de corcho.

8. PROCEDIMIENTO El ensayo se realizar con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con precisin de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un matraz (5.2) una cantidad de muestra en funcin del ndice de perxidos que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente: ndice de perxidos que se supone (meq de O2/kg) Peso de la muestra problema (en g) de 5,0 a 2,0 de 2,0 a 1,2 de 1,2 a 0,8 de 0,8 a 0,5 de 0,5 a 0,3

10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rpidamente la muestra problema mediante agitacin. Aadir 15 ml de cido actico (6.2) y, a continuacin, 1 ml de solucin de yoduro potsico (6.3). Cerrar rpidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida entre 15 y 25C. Aadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solucin de tiosulfato sdico (6.4) (solucin 0,002N si se presuponen valores inferiores a 12 y solucin 0,01N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando la solucin de almidn (6.5) como indicador. Efectuar dos determinaciones por muestra. Realizar simultneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solucin de tiosulfato sdico 0,01N (6.4), sustituir los reactivos.

9. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS El ndice de perxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxgeno activo por kg de grasa se calcula mediante la frmula siguiente: V x N x 1000 IP = P

16

de 0 a 12 de 12 a 20 de 20 a 30 de 30 a 50 de 50 a 90

Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la muestra problema. Aadir

M
siendo: V: ml de solucin valorada de tiosulfato sdico (6.4) empleados en el ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo en blanco. N: normalidad exacta de la solucin de tiosulfato sdico (6.4) empleada. P: peso, en gramos de la muestra problema. El resultado ser la media aritmtica de las dos determinaciones efectuadas. 3.3.3. Detector de ionizacin de llama y convertidor-amplificador. 3.3.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.3.3), con un tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo y velocidad del papel variable. 3.3.5. Columna capilar de vidrio o slice fundida, de 10-15 m (6) de longitud y 0,25-0,32 mm de dimetro interior, con un recubrimiento interno de SE52 o SE-54 lquido, o equivalente, de un espesor que oscile entre 0,10 y 0,30 m . Recomendacin Panreac: 723310.10 Columna capilar para GC PERMABOND SE-52 de 10 m de longitud, 0,32 mm de ID y 0,25 m de espesor de capa. 3.4. Microjeringa para inyeccin en columna, de 10 l de capacidad, provista de una aguja cementada. 4. REACTIVOS 4.1. Gel de slice 70-230 mesh, artculo 7754 Merck. Mantener el gel en el horno durante cuatro horas a una temperatura de 500C. Dejar enfriar y aadir un 2% de agua. Agitar bien para homogeneizar la mezcla. Mantener al abrigo de la luz durante al menos 12 horas antes de su uso. Recomendacin Panreac: 711037.1000 POLYGOPREP 60-130, tamao partcula 63-200 m 4.2. n-Hexano, de calidad para cromatgrafa. 4.3. ter etlico, de calidad para cromatogrfa. 4.4. n-Heptano, de calidad para cromatografa. 4.5. Solucin patrn de laurilaraquidato al 0,1 % (m/v) en hexano (patrn interno). 4.6. Gas portador: hidrgeno puro, de calidad para cromatografa de gases. 4.7. Gases auxiliares: hidrgeno puro, de calidad para cromatografa de gases, aire puro, de calidad para cromatografa de gases.

ANEXO IV (Modificado por los Reglamentos (CEE) N 183/93 y 177/94) DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE CROMATOGRAFA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR 1. OBJETO El presente mtodo describe un procedimiento para la determinacin del contenido de ceras en determinados aceites y grasas en las condiciones de ensayo. Puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obtenido mediante extraccin (aceite de orujo de oliva). 2. PRINCIPIO Fraccionamiento de la grasa o aceite, a los que se habr aadido un patrn interno adecuado, mediante cromatografa en columna de gel de slice hidratado. Recuperacin de la fraccin eluida en las condiciones de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicridos) y, a continuacin, anlisis directo mediante cromatografa de gases columna capilar. 3. APARATOS 3.1. Matraz Erlenmeyer de 25 ml. 3.2. Columna de vidrio para cromatografa de 15 mm de dimetro interior y 30-40 cm de longitud. Recomendacin Panreac: 727401 Columna para cromatografa "flash" con adaptador y vlvula de tefln. 20 mm ID x 400 mm longitud. 3.3. Cromatgrafo de gases adecuado con columna capilar, dotado de un sistema de introduccin directa en la columna, que incluya los siguientes elementos: 3.3.1. Horno termosttico para las columnas, que pueda mantener la temperatura deseada con una oscilacin mxima de 1C. 3.3.2. Inyector en fro para introduccin directa en la columna.

17

(6) En la Directiva consta errneamente como mm

REACTIVO ter etlico para cromatografa n-Heptano, de calidad para cromatografa n-Hexano, de calidad para cromatografa

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 362551 Eter Dietlico estabilizado con etanol (UV-IR-HPLC) PAI 362062 n-Heptano (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI 362063 n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI

5. PROCEDIMIENTO 5.1. Separacin de la fraccin de las ceras 5.1.1. Preparacin de la columna cromatogrfica. Suspender en n-hexano anhidro 15 g de gel de slice hidratado al 2% e introducir en la columna. Dejar sedimentar espontneamente. Completar la sedimentacin con ayuda de un vibrador elctrico, a fin de obtener una banda cromatogrfica ms homognea. Hacer pasar 30 ml de n-hexano para eliminar las posibles impurezas. 5.1.2. Cromatografa en columna. Pesar con exactitud 500 mg de la muestra en un matraz de 25 ml; aadir una cantidad de patrn interno apropiada, en funcin del contenido de ceras que se presuma; por ejemplo, aadir 0,1 mg de laurilaraquidato si se trata de aceite de oliva y 0,25-0,50 mg si se trata de aceite de orujo de oliva. Transferir la muestra preparada a la columna cromatogrfica, que se habr acondicionado como se indica en el punto 5.1.1 con ayuda de dos porciones de 2 ml de n-hexano. Dejar fluir el disolvente hasta que se site a 1 mm por encima del nivel superior del absorbente. A continuacin, iniciar la elucin cromatogrfica; recoger 140 ml de la mezcla de n-hexano y ter etlico en la proporcin de 99:1 a un ritmo de 15 gotas aproximadamente cada diez segundos (2,1 ml/minuto). Secar la fraccin resultante en un evaporador rotatorio hasta que se haya eliminado casi todo el disolvente. Eliminar los ltimos 2 o 3 ml mediante una corriente dbil de nitrgeno y aadir a continuacin 10 ml de n-heptano. 5.2. Anlisis por cromatografa de gases 5.2.1. Operaciones preliminares y acondicionamiento de la columna. 5.2.1.1. Instalar la columna en el cromatgrafo de gases, conectando el terminal de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector. Comprobar el funcionamiento general del cromatgrafo de gases (funcionamiento de los circuitos de gas, eficacia del detector y del registrador, etc.). 5.2.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla. Hacer pasar a travs de la columna una corriente ligera de gas y, a continuacin, encender el cromatgrafo de gases. Calentar gradualmente hasta alcanzar una temperatura de

18

ensayo (vase la nota). Mantener esta temperatura durante al menos dos horas y, a continuacin, ajustar el aparato a las condiciones de ensayo (regulacin del flujo del gas, encendido de la llama, conexin con el registrador electrnico, regulacin de la temperatura del horno para la columna, regulacin del detector, etc.). Registrar la seal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la exigida para efectuar el anlisis. La lnea de base deber ser lineal, sin picos de ningn tipo, y no deber presentar deriva. Una deriva rectilnea negativa indica que las conexiones de la columna no son correctas; una deriva positiva indica que la columna no ha sido acondicionada adecuadamente. Nota: La temperatura de acondicionamiento deber ser en todo momento al menos 20C inferior a la temperatura mxima especificada para el eluyente que se utilice. 5.2.2. Eleccin de las condiciones de ensayo 5.2.2.1. Las condiciones de ensayo son generalmente las siguientes: temperatura de la columna: se parte de una temperatura inicial de 80C que se incrementa a razn de 30C/minuto hasta los 120C, y que, a continuacin, se programa para que aumente 5C/minuto hasta alcanzar los 340C; temperatura del detector: 350C; velocidad lineal del gas portador: hidrgeno, 20-35 cm/segundo, sensibilidad instrumental: 4-16 veces la atenuacin mnima, sensibilidad del registrador: 1-2 mV desde el fondo de la escala, velocidad del papel: 30 cm/hora, cantidad inyectada: 0,5-1 l de solucin. Estas condiciones pueden modificarse en funcin de las caractersticas de la columna y del cromatgrafo de gases (a fin de obtener cromatogramas que renan las siguientes condiciones: el tiempo de retencin del patrn interno C32 debe ser de 25 2 minutos y el pico ms representativo de las ceras debe estar comprendido entre el 60 y el 100% desde el fondo de la escala). 5.2.2.2. Determinar los parmetros de integracin de los picos de manera que se obtenga una evaluacin correcta de las reas de los picos considerados. 5.2.3. Realizacin del anlisis

M
5.2.3.1.Tomar 1 l de solucin con la microjeringa de 10 l; sacar el mbolo hasta que la aguja est vaca. Introducir la aguja en el sistema de inyeccin e inyectar rpidamente despus de 1 o 2 segundos. Despus de 5 segundos aproximadamente, extraer lentamente la aguja. 5.2.3.2. Llevar a cabo el registro hasta que las ceras se hayan eluido completamente. La lnea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas (5.2.1.2). 5.2.4. Identificacin de los picos Identificar los picos sobre la base de los tiempos de retencin, comparndolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condiciones y cuyos tiempos de retencin sean conocidos. La figura 1 presenta un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen. 5.2.5. Anlisis cuantitativo 5.2.5.1.Determinar con ayuda del integrador las reas de los picos correspondientes al patrn interno y a los steres alifticos de C40 a C46. 5.2.5.2. Determinar el contenido de cada uno de los steres en mg/kg de materia grasa, aplicando la siguiente frmula: Ax ms 1000 ster (mg/kg) = As m siendo: Ax : rea del pico de cada uno de los steres; As : rea del pico del laurilaraquidato; ms: peso, en miligramos, del laurilaraquidato aadido; m: peso, en gramos, de la muestra tomada para la determinacin.

6. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Expresar los contenidos de las distintas ceras y la suma de esos contenidos en mg/kg de materia grasa.

APNDICE Determinacin de la velocidad lineal del gas Inyectar de 1 a 3 l de metano (propano) en el cromatgrafo de gases, despus de haberlo ajustado a las condiciones de ensayo normales. Medir el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de su inyeccin hasta la aparicin del pico (tM). La velocidad lineal en cm/segundo viene dada por la frmula L/tM, siendo L la longitud de la columna expresada en cm y t M el tiempo medido en segundos.

19
FIGURA 1: Cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen I.S. = Patrn interno del ster C32 1 = steres C36 2 = steres C38 4 = steres C42 5 = steres C44 3 = steres C40 6 = steres C46

ANEXO V DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN Y DEL CONTENIDO DE ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR 1. OBJETO El presente mtodo describe un procedimiento para la determinacin del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como contenido de cada uno de los esteroles analizados y como contenido total de esteroles. 2. PRINCIPIO Saponificacin de la materia grasa, a la que se habr aadido a-colestanol como patrn interno, con una solucin etanlica de hidrxido potsico; a continuacin, extraccin del insaponificable con ter etlico. Separacin de la fraccin de esteroles del insaponificable extrado mediante cromatografa en placa de gel de slice bsica; los esteroles recuperados del gel de slice se transforman en trimetilsililteres y se analizan mediante cromatografa de gases con columna capilar. 3. MATERIAL 3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esmeriladas. 3.2. Embudos de separacin de 500 ml. 3.3. Matraces de 250 ml. 3.4. Equipo completo de cromatografa en capa fina, utilizando placas de vidrio de 20x20 cm. Recomendacin Panreac: 809013 Placa TLC. Slica gel standard. Vidrio. SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20 cm. 704050 Cubeta de desarrollo ranurada con tapa 20x20 cm. 704054 Spray pulverizador. 3.5. Lmpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm. Recomendacin Panreac: 704048 Cabina de visualizacin UV. 3.6. Microjeringa de 100 l y 500 l. 3.7. Embudo cilndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 m), de 2 cm de dimetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispositivo adecuado para la filtracin en vaco y una junta esmerilada macho 12/21. 3.8. Matraz cnico para vaco de 50 ml, con junta esmerilada hembra 12/21 acoplable al embudo filtrante (3.7). 3.9. Probeta de 10 ml de fondo cnico con tapn hermtico.

3.10. Equipo de cromatografa de gases que pueda funcionar con columna capilar, provisto de un sistema de divisin de flujo formado por: 3.10.1. Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con precisin de 1C. 3.10.2. Inyector con elemento vaporizador de vidrio tratado con persilano. 3.10.3. Detector de ionizacin de llama y convertidor-amplificador. 3.10.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y con velocidad de papel variable. 3.11. Columna capilar de vidrio o slice fundida, de 20 a 30 m de longitud y de 0,25 a 0,32 mm de dimetro interno, recubierta interiormente de lquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile entre 0,10 y 0,30 m. Recomendacin Panreac: 733056.25 Columna capilar de slica fundida (fase no enlazada qumicamente) FS-SE-54 de 25 m de longitud, 0,25 mm de ID y 0,25 m de espesor de capa 3.12. Microjeringa de 10 l para cromatografa de gases, con aguja endurecida. 4. REACTIVOS 4.1. Hidrxido potsico, solucin etanlica 2N aproximadamente: disolver, enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidrxido potsico (valoracin mnima del 85%) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol. Conservar la solucin en botellas de vidrio oscuro bien cerradas. 4.2. ter etlico de calidad para anlisis. 4.3. Sulfato sdico anhidro de calidad para anlisis. 4.4. Placas de vidrio recubiertas con gel de slice, sin indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya preparadas para el uso). Recomendacin Panreac: 809013 Placa TLC. Slica gel standard. Vidrio. SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20cm 4.5. Hidrxido potsico, solucin etanlica 0,2N: disolver 13 g de hidrxido potsico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol. 4.6. Benceno para cromatografa. 4.7. Acetona para cromatografa. (Vase 5.2.2). 4.8. Hexano para cromatografa. (Vase 5.2.2). 4.9. ter etlico para cromatografa. (Vase 5.2.2). 4.10. Cloroformo de calidad para anlisis. 4.11. Solucin patrn para cromatografa en capa fina: colesterol o fitosteroles, solucin al 2% en cloroformo. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93)

20

M
4.12. Solucin de 2,7-diclorofluorescena al 0,2% en etanol. Para hacerla ligeramente bsica se aaden algunas gotas de solucin alcohlica 2N de hidrxido potsico. 4.13. Piridina anhidra para cromatografa. 4.14. Hexametildisilazano. 4.15. Trimetilclorosilano. 4.16. Solucin problema de trimetilsililteres de los esteroles: preparar en el momento del uso a partir de esteroles puros o de mezclas de esteroles obtenidos de aceites que los contengan. 4.17. a-colestanol, disolucin al 0,2% (m/V) en cloroformo (patrn interno). 4.18. Gas portador: hidrgeno o helio de calidad para cromatografa de gases. 4.19. Gases auxiliares: hidrgeno de calidad para cromatografa de gases, aire de calidad para cromatografa de gases.

REACTIVO Acetona para cromatografa Benceno para cromatografa Cloroformo de calidad para anlisis Colesterol 2,7-diclorofluorescena Etanol ter etlico de calidad para anlisis ter etlico para cromatografa Hexametildisilazano Hexano para cromatografa Hidrxido potsico Piridina anhidra para cromatografa Sulfato sdico anhidro de calidad para anlisis Trimetilclorosilano

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 361007 Acetona (UV-IR-HPLC) PAI 361192 Benceno (UV-IR-HPLC) PAI 131252 Triclorometano estabilizado con etanol PA-ACS-ISO A11470 Colesterol, 99+% 133606 2',7'-Diclorofluorescena PA-ACS 121085 Etanol 96% v/v PA 132770 Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO 362551 Eter Dietlico estabilizado con etanol (UV-IR-HPLC) PAI A15139 1,1,1,3,3,3-Hexametildisilazano, 98+% 362063 n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI 121515 Potasio Hidrxido 85% lentejas PA 481457 Piridina seca (mx. 0,01% de agua) DS-ACS 131716 Sodio Sulfato anhidro PA-ACS-ISO A13651 Trimetilclorosilano, 98+%

5. PROCEDIMIENTO 5.1. Preparacin del insaponificable. 5.1.1. Con la microjeringa de 500 l introducir en el matraz de 250 ml un volumen de disolucin de a-colestanol al 0,2% en cloroformo (4.17) que contenga una cantidad de a-colestanol correspondiente al 10% aproximadamente del contenido de esteroles en la alcuota de la muestra para la determinacin. Por ejemplo, para 5 g de muestra aadir 500 l de la solucin de a-colestanol al 0,2%, si se trata de aceite de oliva, y 1500 l, si se trata de aceite de orujo de oliva. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93) Evaporar en corriente de nitrgeno hasta sequedad y, a continuacin, pesar con precisin, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada. En el caso de aceites con un alto contenido de colesterol puede producirse un pico cuyo tiempo de retencin sea idntico al del colestanol. En tal caso el anlisis de la fraccin de esteroles debe realizarse

dos veces: con patrn interno y sin l, o hay que utilizar betulinol en lugar de colestanol. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93) 5.1.2. Aadir 50 ml de solucin etanlica de hidrxido potsico 2N, adaptar el refrigerante de reflujo y calentar en bao Mara con ligera ebullicin, agitando enrgica e ininterrumpidamente hasta que se produzca la saponificacin (la solucin se vuelve lmpida). Calentar durante 20 minutos ms y, a continuacin, aadir 50 ml de agua destilada por la parte superior del refrigerante; separar el refrigerante y enfriar el matraz a 30C aproximadamente. 5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de separacin de 500 ml, mediante varios lavados con un total aproximado de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de ter etlico, agitar enrgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar hasta la separacin de las fases (nota 1). Separar la fase acuosa inferior pasndola a un segundo embudo de separacin. Efectuar otras

21

22

dos extracciones de la fase acuosa por el mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de ter etlico. Nota 1: Las posibles emulsiones podrn eliminarse aadiendo pequeas cantidades de alcohol etlico o metlico con un pulverizador. 5.1.4. Reunir las fracciones etreas en un mismo embudo de separacin y lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de lavado presente reaccin neutra. Una vez eliminada el agua de lavado, secar con sulfato sdico anhidro y filtrar sobre sulfato sdico anhidro a un matraz de 250 ml previamente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeas cantidades de ter etlico. 5.1.5. Destilar el ter hasta que queden unos pocos ml; a continuacin, secar con un vaco ligero o en una corriente de nitrgeno, completando el secado en una estufa a 100C durante 15 minutos aproximadamente; dejar enfriar en un desecador y pesar. 5.2. Separacin de la fraccin de esteroles. 5.2.1. Preparacin de las placas bsicas: sumergir completamente las placas con gel de slice (4.4) en la solucin etanlica 0,2N de hidrxido potsico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana durante dos horas y, por ltimo, mantenerlas en una estufa regulada a 100C durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en un desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas sometidas a este tratamiento debern utilizarse en un plazo de quince das como mximo). Nota 2: Si se utilizan placas bsicas de gel de slice para la separacin de la fraccin de esteroles, ya no es necesario tratar el insaponificable con almina. De este modo, todos los compuestos de naturaleza cida (cidos grasos y otros) quedan retenidos en la lnea de aplicacin, y la banda de los esteroles aparece perfectamente diferenciada de la banda de los alcoholes alifticos y triterpnicos. 5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de benceno-acetona 95:5 (v/v) hasta una altura de 1 cm aproximadamente. Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y ter etlico 65:35 (v/v). Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar transcurrir media hora como mnimo, de forma que se alcance el equilibrio lquido-vapor. En las caras interiores de la cubeta pueden colocarse tiras de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elucin ms uniforme y regular de los componentes. Nota 3: Para que las condiciones de elucin sean perfectamente reproducibles, la mezcla de desarrollo deber cambiarse en cada prueba. 5.2.3. Preparar una solucin de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5% aproximadamente y,

con la microjeringa de 100 l, depositar 0,3 l de dicha solucin en una placa cromatogrfica (5.2.1) a unos 2 cm de uno de los bordes, formando una lnea lo ms fina y uniforme posible. A la altura de la lnea de aplicacin se depositan, en un extremo de la placa, de 2 a 3 l de la solucin de referencia de esteroles (4.11) para poder identificar la banda de esteroles una vez efectuado el desarrollo. 5.2.4 Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica en el punto 5.2.2. Deber mantenerse una temperatura ambiente entre 15 y 20C. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elucin hasta que el frente del disolvente se site a 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la placa bajo una campana unos minutos. 5.2.5. Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solucin de 2,7-diclorofluorescena. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede identificarse la banda de los esteroles mediante comparacin con la mancha obtenida a partir de la solucin de referencia; marcar con lpiz negro los lmites de la banda a lo largo de los mrgenes de fluorescencia. 5.2.6. Rascar con una esptula metlica el gel de slice contenido en el rea delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el embudo filtrante (3.7); aadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la esptula metlica y filtrar en vaco, recogiendo el filtrado en el matraz cnico (3.8) acoplado al embudo filtrante. Lavar el residuo en el embudo tres veces con ter etlico (empleando cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo matraz cnico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solucin residual al tubo de ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrgeno, recoger con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, introducir en una estufa a 105C durante unos 10 minutos, dejar enfriar en el desecador y pesar. El residuo que queda en el tubo de ensayo est formado por la fraccin de esteroles. 5.3. Preparacin de los trimetilsililteres. 5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fraccin de esteroles el reactivo de silanizacin formado por una mezcla de piridina-hexametildisilazano-trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razn de 50 l por miligramo de esteroles, evitando toda absorcin de humedad (nota 5). Nota 4: Existen soluciones comerciales listas para el uso. Adems, tambin existen otros reactivos de silanizacin, como el bis-trimetilsililacetamida + 1% de trimetilclorosilano, que se diluye en el mismo volumen de piridina anhidra.

M
5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa disolucin de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como mnimo, a temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos; la solucin lmpida queda lista para el anlisis mediante cromatografa de gases. Nota 5: La formacin de una ligera opalescencia es normal y no ocasiona ninguna interferencia. La formacin de una floculacin blanca o la aparicin de una coloracin rosa son indicios de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este caso deber repetirse la prueba. 5.4. Cromatografa de gases. 5.4.1. Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna. 5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatgrafo uniendo uno de los extremos de la columna al inyector y el otro al detector. Efectuar los controles generales del equipo para cromatografa de gases (estanqueidad de los circuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de divisin de flujo y del sistema de registro, etc.). 5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a travs de la columna, encender el equipo de cromatografa de gases e iniciar un calentamiento gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20C superior a la temperatura de trabajo (nota 6). Mantener dicha temperatura durante 2 horas como mnimo; a continuacin, poner el equipo completo en condiciones de funcionamiento (regulacin del flujo de gases y de la relacin de split, ignicin de la llama, conexin con el registrador electrnico, regulacin de la temperatura del horno del detector y del inyector, etc.) y registrar la seal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para el anlisis. El trazado de la lnea de base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe presentar deriva. Una deriva rectilnea negativa indica que las conexiones de la columna no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicionamiento de la columna es insuficiente. Nota 6: La temperatura de acondicionamiento deber ser siempre, como mnimo 20C inferior a la temperatura mxima prevista para la fase estacionaria utilizada. 5.4.2. Eleccin de las condiciones de trabajo. 5.4.2.1. Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes: temperatura de la columna: 260C 5C, temperatura del evaporador: 280C, temperatura del detector: 290C, velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35 cm/s, hidrgeno 30 a 50 cm/s, relacin de split de 1/50 a 1/100, sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuacin mnima, sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e. velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora, cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 l de solucin de TMSE. Estas condiciones pueden modificarse en funcin de las caractersticas de la columna y del cromatgrafo, de modo que se obtengan cromatogramas que cumplan los siguientes requisitos: el tiempo de retencin del b-sitosterol debe ser de 20 5 minutos, el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido medio del 3%), 15 5% del fondo de escala; para el aceite de soja (contenido medio del 20%), 80 10% del fondo de escala, se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los picos no slo se separen sino que se resuelvan completamente, es decir, que el trazo del pico llegue a la lnea de base antes de que se inicie el pico siguiente. No obstante, podr admitirse una resolucin incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse utilizando la perpendicular. 5.4.3. Realizacin del anlisis. 5.4.3.1.Con la microjeringa de 10 l tomar 1 l de hexano, aspirar 0,5 l de aire y, a continuacin, entre 0,5 y 1 l de la solucin problema; elevar el mbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vaca. Introducir la aguja a travs del septum y, despus de 1 o 2 segundos, inyectar rpidamente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente. 5.4.3.2.Continuar el registro hasta la completa elucin de los TMSE de los esteroles presentes. La lnea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones exigidas (5.4.1.2). 5.4.4. Identificacin de los picos. Para la identificacin de los diferentes picos se utilizan los tiempos de retencin y la comparacin con mezclas de TMSE de los esteroles analizadas en las mismas condiciones. La elucin de los esteroles se efecta en el orden siguiente: colesterol, brasicasterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, D-7-campesterol, D-5,23-estigmastadienol, clerosterol, b-sitosterol, sitostanol, D-5-avenasterol, D-5,24-estigmastadienol, D-7-estigmastenol, D-7avenasterol. En el cuadro I figuran los tiempos de retencin correspondientes al b-sitosterol para las columnas SE 52 y SE 54. Las figuras 1 y 2 ilustran los cromatogramas tpicos de algunos aceites. 5.4.5. Determinacin cuantitativa. 5.4.5.1.Calcular las reas de los picos del a-colestanol y de los esteroles utilizando el integrador. No se tomarn en cuenta los picos de aquellos componentes que no figuren en el cuadro I. El factor de respuesta para el a-colestanol debe considerarse como 1. 5.4.5.2.Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los esteroles, expresado en

23

mg/100 g de materia grasa: Ax ms 100 esterol x = As m siendo: Ax : rea del pico del esterol x, As : rea del pico del a-colestanol, ms : peso de a-colestanol aadido, en miligramos, m : peso de la muestra tomado para la determinacin, en gramos. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93)

Ax % del esterol X = x 100 A siendo: Ax : rea del pico de x, A: suma de las reas de todos los picos. APNDICE Determinacin de la velocidad lineal del gas Inyectar en el cromatgrafo, preparado para trabajar en condiciones normales, de 1 a 3 l de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de la inyeccin hasta el momento en que aparece el pico (tM). La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.

6. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS 6.1. Se registran el contenido de cada uno de los esteroles en mg/100 g de materia grasa y, como esteroles totales, su suma. 6.2. El porcentaje de cada uno de los esteroles simples es la razn entre el rea del pico correspondiente y la suma de las reas de los picos de los esteroles.

Cuadro I Tiempos de retencin relativos de los esteroles Pico Identificacin Tiempo de retencin Columna SE 54 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Colesterol Colestanol Brasicasterol 24-metilencolesterol Campesterol Campestanol Estigmasterol D-7-campesterol D-5,23-estigmastadienol Clerosterol b-sitosterol Sitostanol D-5-avenasterol D-5,24-estigmastadienol D-7-estigmastenol D-7-avenasterol D-5-colesten-3-b-ol 5-a-colestan-3-b-ol [24S]-24-metil-D-5,22-colestadien-3-b-ol 24-metilen-D-5,24-colestadien-3-b-ol [24R]-24-metil-D-5-colesten-3-b-ol [24R]-24-metil-colestan-3-b-ol [24S]-24-etil-D-5,22-colestadien-3-b-ol [24R]-24-metil-D-7-colesten-3-b-ol [24R,S]-24-etil-D-5,23-colestadien-3-b-ol [24S]-24-etil-D-5,25-colestadien-3-b-ol [24R]-24-etil-D-5-colesten-3-b-ol 24-etil-colestan-3-b-ol [24Z]-24-etiliden-D-5-colesten-3-b-ol [24R,S]-24-etil-D-5,24-colestadien-3-b-ol [24R,S]-24-etil-D-7,24-colesten-3-b-ol [24Z]-24-etiliden-D-7-3-b-ol 0,67 0,68 0,73 0,82 0,83 0,85 0,88 0,93 0,95 0,96 1 1,02 1,03 1,08 1,12 1,16 Columna SE52 0,63 0,64 0,71 0,80 0,81 0,82 0,87 0,92 0,95 0,96 1 1,02 1,03 1,08 1,12 1,16

24

14 15 16

Figura 1 Cromatograma de la fraccin de esteroles de un aceite de oliva bruto

25

Figura 2 Cromatograma de la fraccin de esteroles de un aceite de oliva refinado

26

M
ANEXO VI DETERMINACIN DEL CONTENIDO EN ERITRODIOL Y UVAOL INTRODUCCIN El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de los dioles eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, caracterstico de algunos tipos de materias grasas. Su concentracin es mucho ms elevada en los aceites de oliva obtenidos mediante extraccin que en los obtenidos mediante presin o en el aceite de pepita de uva y, por lo tanto, su determinacin puede servir para comprobar la existencia de aceite de oliva obtenido mediante extraccin. 1. OBJETO El presente mtodo describe un procedimiento para determinar el eritrodiol en las materias grasas. 2. PRINCIPIO La materia grasa se saponifica con una solucin etanlica de hidrxido potsico; a continuacin se extrae el insaponificable con ter etlico y se purifica pasndolo por una columna de almina. El fraccionamiento del insaponificable se realiza mediante cromatografa en capa fina en placa de gel de slice y se aslan la banda de la fraccin esterlica y la del eritrodiol. Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en trimetilsililteres y seguidamente se analiza la mezcla mediante cromatografa de gases. El resultado se expresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto de eritrodiol + esteroles. 3. MATERIAL Y APARATOS 3.1. El mismo material que el indicado para el mtodo del Anexo V (Determinacin del contenido de esteroles). 4. REACTIVOS 4.1. Los mismos reactivos que los indicados para el mtodo del Anexo V (Determinacin del contenido de esteroles). 4.2. Solucin patrn de eritrodiol al 0,5% en cloroformo. 5. PROCEDIMIENTO 5.1. Preparacin del insaponificable Se realiza tal como se indica en el apartado 5.1.2 del mtodo del Anexo V 5.2. Separacin del eritrodiol y los esteroles 5.2.1. Vase el apartado 5.2.1 del mtodo del Anexo V. 5.2.2. Vase el apartado 5.2.2 del mtodo mencionado. 5.2.3. Preparar una solucin del insaponificable al 5% en cloroformo. Con una microjeringa de 0,1 ml depositar 0,3 ml de esta solucin en una placa cromatogrfica a aproximadamente 1,5 cm del borde inferior de la placa, formando una banda lo ms fina y uniforme posible. Depositar en un extremo de la placa, como referencia, algunos microlitros de las soluciones de colesterol y eritrodiol. 5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica en el apartado 5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de unos 20C. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elucin hasta que el frente del disolvente se site a 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa. Sacar sta de la cubeta de desarrollo y evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente. 5.2.5. Pulverizar la placa uniformemente con la solucin alcohlica de 2',7'-diclorofluorescena. Al examinar la placa a la luz ultravioleta pueden identificarse las bandas de los esteroles y del eritrodiol mediante comparacin con las referencias; delimitar las bandas con una punta ligeramente por el exterior de los mrgenes de fluorescencia. 5.2.6. Rascar con una esptula metlica el gel de slice contenido en las reas delimitadas. Reunir el material obtenido en un matraz cnico de 50 ml; aadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo de filtro poroso vertiendo el gel de slice sobre el propio filtro. Lavar tres veces con 10 ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el filtrado en un matraz esfrico de 100 ml. Evaporar hasta obtener un volumen de 4 a 5 ml, transvasar al tubo de centrifugado de fondo cnico de 10 ml previamente tarado, evaporar hasta sequedad mediante calentamiento suave en corriente de nitrgeno y pesar. 5.3. Preparacin de los trimetilsililteres Se realiza tal como se indica en el apartado 5.3 del mtodo del Anexo V. 5.4. Cromatografa de gases Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del mtodo citado. Las condiciones operativas de la cromatografa de gases deben cumplir los requisitos necesarios para analizar los esteroles y, adems, permitir la separacin de los TMSE del eritrodiol y del uvaol. Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta que se produzca la elucin de los esteroles presentes, el eritrodiol y el uvaol; identificar los picos (el eritrodiol y el uvaol tienen tiempos de retencin relativos, respecto al b-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55, respectivamente) y

27

calcular sus reas de la misma forma que para los esteroles. 6. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS A1 + A2 Eritrodiol, % = x 100 A1 + A2 + Aesteroles siendo: A1 : rea del pico del eritrodiol, A2 : rea del pico del uvaol, Aesteroles: suma de las reas de los esteroles presentes. Los resultados deben expresarse con una cifra decimal. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93)

ridos bajo la accin de la lipasa pancretica durante un tiempo determinado. Separacin de los monoglicridos resultantes mediante cromatografa en capa fina y metanlisis de estos monoglicridos. Anlisis de los steres metlicos mediante cromatografa gas-lquido. 4. EQUIPO 4.1. Matraz de fondo redondo de 100 ml. 4.2. Matraz de fondo redondo de 25 ml con boca esmerilada. 4.3. Refrigerante de aire de 1 m de longitud, adaptable al matraz 4.2. 4.4. Matraz erlenmeyer de 250 ml. 4.5. Vaso de precipitados de 50 ml. 4.6. Embudo de separacin de 500 ml. 4.7. Columna para cromatografa, de vidrio, con dimetro interior de 13 mm y longitud de 400 mm, provista de un disco de vidrio poroso y de una llave. Recomendacin Panreac: 727401 Columna para cromatografa "flash" con adaptador y vlvula de tefln. 20 mm ID x 400 mm longitud. 4.8. Tubo de centrfuga de 10 ml con tapn de vidrio esmerilado. 4.9. Bureta de 5 ml graduada en 0,05 ml. 4.10. Jeringa hipodrmica de 1 ml provista de una aguja fina. 4.11. Microjeringa que pueda dispensar gotas de 3-4 ml. 4.12. Aplicador para cromatografa en capa fina. 4.13. Placas de vidrio de 20 x 20 cm para cromatografa en capa fina. Recomendacin Panreac: 809013 Placa TLC. Slica gel standard. Vidrio. SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20 cm. 4.14. Cubeta de desarrollo para cromatografa en capa fina, de vidrio, provista de una tapa de vidrio esmerilado, adecuada para las placas de 20 x 20 cm. Recomendacin Panreac: 704050 Cubeta de desarrollo ranurada con tapa 20x20 cm. 4.15. Pulverizador para cromatografa en capa fina. Recomendacin Panreac: 704054 Spray pulverizador. 4.16. Estufa regulada a 103 2C. 4.17. Termostato regulable a una temperatura comprendida entre 30 y 45C con precisin de 0,5C. 4.18. Evaporador rotatorio. 4.19. Vibrador elctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de centrfuga. 4.20. Lmpara ultravioleta para examinar las placas de capa fina. Recomendacin Panreac: 704048 Cabina de visualizacin UV.

ANEXO VII DETERMINACIN DE LOS CIDOS GRASOS SITUADOS EN LA POSICIN 2 DE LOS TRIGLICRIDOS DE ACEITES Y GRASAS

1. OBJETO La presente norma describe un mtodo para la determinacin de la composicin porcentual de cidos grasos que se encuentran esterificados en la posicin 2 (oposicin interna) de los triglicridos. 2. CAMPO DE APLICACIN La presente norma es aplicable a los aceites y grasas cuyo punto de fusin se sita por debajo de los 45C, debido a las caractersticas especiales de la accin de la lipasa pancretica. No es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan cantidades importantes de cidos grasos con 12 tomos de carbono o menos (aceites de coco y de palmiste, materias grasas butricas), de cidos grasos altamente insaturados (con ms de cuatro enlaces dobles) que tengan 20 tomos de carbono o ms (aceites de pescado y de mamferos marinos) o de cidos grasos que tengan grupos con funciones oxigenadas, adems del grupo cido. 3. PRINCIPIO Neutralizacin de los aceites y grasas si fuera necesario. Purificacin mediante tratamiento en columna de almina. Hidrlisis parcial de los triglic-

28

M
Para el control de la actividad lipsica: 4.21. pH-metro. Recomendacin Panreac: 923 501 pHmetro digital pH 300. 4.22. Agitador espiral. 4.23. Bureta de 5 ml. 4.24. Cronmetro. Para la eventual preparacin de la lipasa: 4.25. Agitador de laboratorio, adecuado para dispersar y mezclar materiales heterogneos. 5. REACTIVOS 5.1. n-Hexano o, en su defecto, ter de petrleo (punto de ebullicin 30-50C), de calidad para cromatografa. 5.2. 2-Propanol, o etanol, 95% (v/v) de calidad para anlisis. 5.3. 2-Propanol, o etanol, solucin acuosa 1/1. 5.4. ter dietlico, exento de perxidos. 5.5. Acetona. 5.6. cido frmico, al menos de 98% (p/p). 5.7. Solvente de desarrollo: una mezcla de n-hexano (5.1), ter dietlico (5.4) y cido frmico (5.6) en las proporciones 70/30/1 (v/v/v). 5.8. Almina activada para cromatografa, neutra, actividad l segn Brockmann. 5.9. Gel de slice con aglutinante, de calidad para cromatografa en capa fina. 5.10. Lipasa pancretica de calidad adecuada (vanse las notas 1 y 2). 5.11. Hidrxido sdico en solucin acuosa de 120 g/l. 5.12. cido clorhdrico, solucin acuosa 6N. 5.13. Solucin acuosa de 220 g/l de cloruro de calcio (CaCl2). 5.14. Solucin acuosa de 1 g/l de colato sdico (de calidad enzimtica). 5.15. Solucin tampn: solucin acuosa de tris-hidroximetil-aminometano 1M, ajustada a pH = 8 con cido clorhdrico (5.12) (controlar con un potencimetro). 5.16. Solucin de 10 g/l de fenolftalena en etanol al 95% (v/v). 5.17. Solucin de 2 g/l de 2',7'-diclorofluorescena en etanol al 95% (v/v); alcalinizar ligeramente aadiendo 1 gota de solucin de hidrxido sdico 1N por 100 ml. Para el control de la actividad lipsica: 5.18. Aceite neutralizado. 5.19. Solucin acuosa de hidrxido sdico 0,1N. 5.20. Solucin acuosa de 200 g/l de colato sdico (de calidad enzimtica). 5.21. Solucin acuosa de 100 g/l de goma arbiga.

REACTIVO Acetona cido clorhdrico cido frmico, al menos de 98% (p/p) Cloruro de calcio Colato sdico 2,7-diclorofluorescena Etanol, 95% (v/v) de calidad para anlisis Etanol al 95% (v/v) ter de petrleo (punto de ebullicin 30-50C), de calidad para cromatografa ter dietlico, exento de perxidos Goma arbiga Hidrxido sdico Hidrxido sdico 1N n-Hexano de calidad para cromatografa 2-Propanol de calidad para anlisis Solucin acuosa de hidrxido sdico 0,1N Solucin de 10 g/l de fenolftalena en etanol al 95% (v/v) Tris-hidroximetil-aminometano

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131007 Acetona PA-ACS-ISO 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO 131030 cido Frmico 98% PA-ACS 121221 Calcio Cloruro anhidro, polvo PA 121215 Calcio Cloruro 2-hidrato escoriforme PA A17074 cido clico, sal sdica, 99% 133606 2',7'-Diclorofluorescena PA-ACS 121085 Etanol 96% v/v PA 361315 132770 142061 131687 182415 362063 131090 181694 281327 131940 ter de Petrleo 40-60C (UV) PAI Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO Goma Arbiga polvo PRS Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) SV n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI

29
2-Propanol PA-ACS-ISO Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV Fenolftalena solucin 1% RV Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS

6. PREPARACIN DE LA MUESTRA Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al mtodo del Anexo II es inferior al 3%, se efectuar directamente la purificacin en columna de almina como se describe en el punto 6.2. Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al mtodo del Anexo II, es superior al 3%, se efectuar una neutralizacin alcalina en presencia de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y a continuacin se realizar la purificacin en columna de almina descrita en el punto 6.2. 6.1. Neutralizacin alcalina en presencia de un solvente. Introducir en el embudo de separacin (4.6) aproximadamente 10 g de aceite crudo y aadir 100 ml de hexano (5.1), 50 ml de 2-propanol (5.2), algunas gotas de solucin de fenolftalena (5.16) y el volumen de solucin de hidrxido sdico (5.11) correspondiente a la acidez libre del aceite ms un 0,3 % de exceso. Agitar enrgicamente durante 1 minuto, aadir 50 ml de agua destilada, agitar de nuevo y dejar reposar. Una vez que se haya producido la separacin, separar la capa inferior que contiene los jabones. Separar, asimismo, todas las capas intermedias (muclago, materias insolubles). Lavar la solucin de hexano del aceite neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solucin de 2-propanol (5.3), hasta que desaparezca el color rosa de la fenolftalena. Eliminar la mayor parte del hexano mediante destilacin en vaco en el evaporador rotatorio (4.18); desecar el aceite en vaco a 30-40C mediante una corriente de nitrgeno puro hasta la completa eliminacin del hexano. 6.2. Purificacin con almina. Preparar una suspensin de 15 g de almina activada (5.8) en 50 ml de hexano (5.1) y verterla en la columna cromatogrfica (4.7), removiendo al mismo tiempo. Dejar que la almina se asiente uniformemente y esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del absorbente. Verter cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un matraz de fondo redondo (4.1). 7. PREPARACIN DE LAS PLACAS CROMATOGRFICAS

Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla semifluida (4.12) y recubrir las placas limpias con una capa de 0,25 mm de espesor. Secar las placas al aire durante 15 minutos y a continuacin en la estufa (4.16) a 103 2C durante 1 hora. Antes del uso, enfriar las placas en un desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse placas preparadas. 8. PROCEDIMIENTO 8.1. Hidrlisis con lipasa pancretica. Pesar en el tubo de centrfuga (4.8) 0,1 g aproximadamente de la muestra preparada; si la muestra es aceite lquido, proceder como se indica a continuacin; si es una grasa slida, disolverla en 0,2 ml de hexano (5.1), aplicando, si es necesario, un ligero calentamiento. Aadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solucin tampn (5.15). Agitar bien, pero con cuidado, y aadir a continuacin 0,5 ml de la solucin de colato sdico (5.14) y 0,2 ml de la solucin de cloruro de calcio (5.13). Cerrar el tubo con el tapn esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando humedecer el tapn) e introducir el tubo inmediatamente en el termostato (4.17) a 40 0,5C y agitar manualmente durante 1 minuto exacto. Sacar el tubo del termostato y agitar enrgicamente con el vibrador elctrico (4.19) durante 2 minutos exactos. Enfriar de inmediato en agua corriente; aadir 1 ml de cido clorhdrico (5.12) y 1 ml de ter dietlico (5.4). Tapar y mezclar enrgicamente con el vibrador elctrico. Dejar en reposo y extraer la capa orgnica con la jeringa (4.10), tras centrifugar si fuese necesario. 8.2. Separacin de los monoglicridos por cromatografa en capa fina. Con ayuda de la microjeringa (4.11) colocar el extracto a 1,5 cm aproximadamente del borde inferior de la placa cromatogrfica, depositndolo de manera que forme una lnea fina, uniforme y lo ms estrecha posible. Introducir la placa en una cubeta de desarrollo (4.14) bien saturada y desarrollar con el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20C hasta 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa. Secar la placa al aire a la temperatura de la cubeta y pulverizarla con la solucin de 2',7'-diclorofluorescena (5.17). Identificar la banda de los monoglicridos (Rf aproximadamente 0,035) con luz ultravioleta (4.20). 8.3. Anlisis de los monoglicridos por cromatografa gas-lquido. Raspar con una esptula la banda citada en el punto 8.2 (procurando no raspar los componentes que permanezcan en la lnea de base) y pasarla al

30

Limpiar perfectamente las placas de vidrio (4.13) con etanol, ter de petrleo y acetona para eliminar cualquier rastro de materia grasa. Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de polvo de slice (5.9). Aadir 60 ml de agua destilada. Tapar y agitar enrgicamente durante 1 minuto.

matraz de metilacin (4.2). Tratar directamente la slice recogida como se indica en el Anexo X-B, de modo que los monoglicridos se transformen en steres metlicos, y, a continuacin, examinar los steres mediante cromatografa en fase gaseosa, como se describe en el Anexo X-A. 9. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Calcular la composicin de los cidos grasos situados en la posicin y expresar el resultado con una cifra decimal (nota 3). 10. NOTAS

Nota 1: Control de la actividad lipsica Preparar una emulsin oleosa como sigue: agitar en un mezclador adecuado una mezcla constituida por 165 ml de solucin de goma arbiga (5.21), 15 g de hielo picado y 20 ml de aceite neutralizado (5.18). En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml de esta emulsin, 0,3 ml de solucin de colato sdico (5.20) y 20 ml de agua destilada. Colocar el vaso en un termostato a 37C 0,5C (nota 4) e introducir los electrodos del pH-metro (4.21) y un agitador espiral (4.22); despus, aadir gota a gota con una bureta (4.23) solucin de hidrxido sdico (5.19) hasta obtener un pH de 8,5. Aadir una suspensin acuosa de la lipasa (vase a continuacin) en cantidad suficiente. Se mide el pH y, tan pronto como alcance el valor de 8,3, se pone en marcPsugc(Pr)1onciH-metrsvas, aaend1(o)]TJ T* -000.1 Twe ldixido sdico (5.19[(gota a go,en)Tj T* 039 0 Tw ( e

mente adecuado para detectar la presencia de pequeas cantidades de aceites semisecantes (ricos en cido linoleico) en aceites vegetales cuyo principal cido graso insaturado sea el cido oleico, como es el caso de los aceites de oliva. 3. PRINCIPIO Separacin de los triglicridos en funcin de su nmero equivalente de carbonos mediante cromatografa de lquidos de alta resolucin en fase inversa e interpretacin de los cromatogramas. 4. APARATOS 4.1. Cromatgrafo de lquidos de alta resolucin con control termosttico de la temperatura de la columna. 4.2. Sistema de inyeccin con un volumen de 10 ml. 4.3. Detector: refractmetro diferencial. La sensibilidad en toda la escala deber ser como mnimo de 10-4 unidades de ndice de refraccin. 4.4. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de dimetro interior, rellena de par-

tculas de slice de 5 mm de dimetro con un 22-23% de carbono en forma de octadecilsilano (nota 2). 4.5. Registrador y/o integrador. 5. REACTIVOS Los reactivos debern ser de calidad para anlisis. Los disolventes de elucin debern desgasificarse y podrn reciclarse varias veces sin que ello afecte a las separaciones. 5.1. Cloroformo. 5.2. Acetona. 5.3. Acetonitrilo. 5.4. Fase mvil: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarn para obtener la separacin deseada; comenzar con una mezcla 50:50). 5.5. Disolvente de solubilizacin: acetona o mezcla de acetona-cloroformo 1:1. 5.6. Triglicridos de referencia: pueden utilizarse bien triglicridos comerciales (tripalmitina, triolena, etc.), en cuyo caso se reflejarn en un grfico los tiempos de retencin frente al nmero equivalente de carbonos, alternativamente un cromatograma de referencia del aceite de soja (vanse las notas 3 y 4 y las figuras 1 y 2).

REACTIVO Acetona Cloroformo Acetonitrilo Tripalmitina

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131007 Acetona PA-ACS-ISO 131252 Triclorometano estabilizado con etanol PA-ACS-ISO 131881 Acetonitrilo PA-ACS A10922 Glicerol tripalmitato, 98%

6. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS Preparar del siguiente modo una solucin al 5% de las muestras que vayan a analizarse: pesar 0,5 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de 10 ml y enrasar hasta 10 ml con el disolvente de solubilizacin (5.5). 7. PROCEDIMIENTO 7.1. Instalar el sistema cromatogrfico. Bombear fase mvil (5.4) a razn de 1,5 ml/mm para purgar el sistema completo. Esperar hasta que se obtenga una lnea de base estable. Inyectar 10 ml de la muestra preparada como se indica en el punto 6. 8. CLCULO Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Utilcese el mtodo de normalizacin interna, es decir, considrese que la suma de las reas de los picos de los diferentes triglicridos es igual a 100%.

Calcular el porcentaje relativo de cada triglicrido mediante esta frmula: rea del pico % del triglicrido = x 100 reas de los picos donde: reas de los picos: suma de las reas de los picos El resultado se expresa con un decimal. Nota 1: El orden de elucin puede determinarse calculando el nmero equivalente de carbonos, que a menudo viene dado por la relacin NEC = NC 2n, siendo NC el nmero de carbonos y n el nmero de enlaces dobles; es posible calcularlo con una precisin mucho mayor tomando en consideracin el origen del enlace doble. Si no, nl y nln son el nmero de enlaces dobles atribuible a los cidos oleico, linoleico y linolnico, respectivamente, el nmero equivalente de carbonos puede calcularse mediante la relacin siguiente:

32

M
NEC = NC do no dl nl dln nln Los coeficientes do, dl y dln pueden calcularse mediante los triglicridos de referencia. En las condiciones que se especifican en el presente mtodo, la relacin que se obtenga ser similar a la siguiente: NEC = NC [2,60 no] [2,35 nl] [2,17 nln] Nota 2: Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333; Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art 50377 o similares. Recomendacin Panreac: 728032.46 Columna para HPLC, cartucho ChromCart , CC250/4.6 Lichrospher 100 RP18,5 mm. Nota 3: Algunos triglicridos de referencia tambin permiten calcular la resolucin respecto a la triolena: a= TR' /TR'olena utilizando el tiempo de retencin corregido TR' = TR TR disolvente. La representacin grfica del log a frente a f (nmero de enlaces dobles) permite determinar los valores de retencin de todos los triglicridos de los cidos grasos contenidos en los triglicridos de referencia (vase la figura 2). Nota 4: La eficacia de la columna debe permitir separar claramente el pico de la LLL (trilinolena) de los triglicridos con tiempo de retencin prximo. Nota 5: En el caso de los aceites vrgenes lampantes y de los aceites de orujo de oliva brutos, para obtener una buena separacin del pico de la trilinolena de los picos adyacentes o de posibles sustancias interferentes, se debe purificar previamente el aceite segn la metodologa siguiente: Se lleva a cabo la absorcin de 200 l de aceite sin diluir en una columnita de slice slida para extraccin de lquido (tipo SEP PAK silica cartridgewaters part. n 51900). Recomendacin Panreac: 731829 Cartucho SPE, Slica gel, CHROMAFIX 400-SiOH, 400 mg La elucin de los triglicridos se efecta con 20 ml de hexano anhidro para HPLC en un tiempo mximo de 20 segundos. El producto eluido se seca en una corriente de nitrgeno y se recoge con isopropanol o acetona (5 ml). Se inyectan entre 10 y 20 l en HPLC. Es necesario comprobar que la composicin de cidos grasos del aceite sea la misma antes y despus de la purificacin, dentro de los lmites de error del mtodo analtico adoptado.

Figura 1 Cromatograma de una muestra de aceite de soja

33
Nota: P: cido palmtico; St: cido esterico; O: cido oleico; L: cido linoleico; Ln: cido linolnico.

Figura 2 Representacin grfica del log alfa frente a f (nmero de enlaces dobles)

Nota: La: cido lurico; My: cido mirstico; P: cido palmtico; St: cido esterico; O: cido oleico; L: cido linoleico; Ln: cido linolnico.

34

M
ANEXO IX PRUEBA ESPECTROFOTOMTRICA EN EL ULTRAVIOLETA INTRODUCCIN La prueba espectrofotomtrica en el ultravioleta puede proporcionar indicaciones sobre la calidad de una materia grasa, su estado de conservacin y las modificaciones inducidas por los procesos tecnolgicos. Las absorciones en las longitudes de onda indicadas en el mtodo se deben a la presencia de sistemas dinicos y trinicos conjugados. Los valores de estas absorciones se expresan en extincin especfica E1%,1cm (extincin de una solucin de la materia grasa al 1% en el disolvente determinado, en un espesor de 1 cm) que se expresar convencionalmente como K, tambin denominado coeficiente de extincin. 1. OBJETO El mtodo describe el procedimiento de ejecucin de la prueba espectrofotomtrica en el ultravioleta de las materias grasas. 2. PRINCIPIO La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la extincin de la solucin a las longitudes de onda prescritas, respecto al disolvente puro. A partir de los valores espectrofotomtricos se calculan las extinciones especficas. REACTIVO Almina bsica para cromatografa en columna Ciclohexano de calidad para espectrofotometra Isooctano de calidad para espectrofotometra n-Hexano para cromatografa 5. PROCEDIMIENTO 5.1. La muestra debe ser perfectamente homognea y estar exenta de impurezas en suspensin. Los aceites lquidos a temperatura ambiente se filtran con papel de filtro a una temperatura aproximada de 30C, las grasas slidas se homogeneizan y se filtran a una temperatura superior en 10C como mximo a su temperatura de fusin. 5.2. Se pesan con precisin 0,25 g aproximadamente de la muestra preparada y se colocan en 3. MATERIAL Y APARATOS 3.1. Espectrofotmetro para medidas de extincin en el ultravioleta entre 220 y 360 nm, con posibilidad de lectura para cada unidad nanomtrica. 3.2. Cubetas de cuarzo, con tapadera, con paso ptico de 1 cm. Las cubetas, llenas de agua o de otro disolvente adecuado, no deben presentar entre ellas diferencias superiores a 0,01 unidades de extincin. 3.3. Matraces aforados de 25 ml. 3.4. Columna de cromatografa, de 270 mm de longitud y 35 mm de dimetro en la parte superior: de 270 mm de longitud y 10 mm de dimetro en la parte inferior. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93) 4. REACTIVOS 4.1. Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometra: debe tener, respecto al agua destilada, una transmitancia del 60% como mnimo a 220 nm y del 95% como mnimo a 250 nm; o ciclohexano de calidad para espectrofotometra: debe tener, respecto al agua destilada, una transmitancia del 40% como mnimo a 220 nm y del 95% como mnimo a 250 nm. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93) 4.2. Almina bsica para cromatografa en columna, preparada y controlada como se describe en el apndice I. 4.3. n-Hexano para cromatografa.

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 121100 Aluminio xido Bsico PA 361250 362064 362063 Ciclohexano (UV-IR-HPLC) PAI Iso-Octano (UV-IR-HPLC) PAI n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI un matraz aforado de 25 ml, se completa con el disolvente adecuado y se homogeneiza. La solucin resultante debe estar perfectamente clara. Si presenta opalescencia o turbidez, se filtrar rpidamente con papel de filtro. 5.3. Se llena una cubeta con la solucin obtenida y se miden las extinciones, usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de onda comprendidas entre 232 y 276 nm. Los valores de extincin obtenidos deben estar comprendidos en el intervalo entre 0,1 y 0,8; en caso contrario

35

es necesario repetir la medida utilizando soluciones ms concentradas o ms diluidas segn el caso. 5.4. Cuando se quiera determinar la extincin especfica despus del tratamiento con almina se proceder del siguiente modo: en la columna para cromatografa se introducen 30 g de almina bsica en suspensin en hexano; despus de asentarse el absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta 1 cm aproximadamente sobre el nivel superior de la almina. Se disuelven 10 g de materia grasa, homogeneizada y filtrada tal como se describe en el punto 5.1, en 100 ml de hexano y se vierte esta solucin en la columna. Se recoge el lquido eluido y se evapora totalmente el disolvente en vaco a una temperatura inferior a 25C. Con la materia grasa as obtenida se procede inmediatamente tal como se indica en el punto 5.2. 6. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS 6.1. Se expresan las extinciones especficas o coeficientes de extincin a las diversas longitudes de onda, calculadas como sigue: El Kl = ce siendo: Kl : extincin especfica a la longitud de onda lambda, El : extincin medida a la longitud de onda lambda, c : concentracin de la disolucin en g por 100 ml, e : espesor de la cubeta en cm. Los resultados deben expresarse con dos cifras decimales. 6.2. La prueba espectrofotomtrica del aceite de oliva segn el mtodo oficial de los Reglamentos de la CEE requiere la determinacin de la extincin especfica, en solucin en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y 270 nm, y la determinacin de K definido como: Km 4 + Km + 4 K = Km - 2

APNDICE I Preparacin de la almina y control de su actividad A.1.1. Preparacin de la almina En un recipiente que pueda cerrarse hermticamente se echa la almina previamente desecada en horno a 380-400C durante tres horas, se aade agua destilada en una proporcin de 5 ml por 100 g de almina, se cierra rpidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar durante 12 horas como mnimo antes del uso. A.1.2. Control de la actividad de la almina Se prepara una columna para cromatografa con 30 g de almina. Se opera tal como se describe en el apartado 5.4. Se hace pasar a travs de la columna una mezcla formada por: 95% de aceite de oliva virgen, con extincin especfica a 268 nm menor que 0,18, 5% de aceite de cacahuete tratado con tierras decolorantes en el proceso de refinado, con una extincin especfica a 268 nm mayor o igual que 4. Si, despus del paso por la columna, la mezcla presenta una extincin especfica a 268 nm mayor que 0,11, la almina es aceptable; en otro caso se debe aumentar el porcentaje de hidratacin.

APNDICE II Ajuste del espectrofotmetro A.2. El aparato debe revisarse peridicamente (por lo menos cada seis meses) tanto en lo que se refiere a la conformidad de la longitud de onda como a la exactitud de la respuesta. A.2.1. El control de la respuesta de la longitud de onda puede hacerse mediante una lmpara de vapor de mercurio o mediante filtros adecuados. A.2.2. Para controlar la clula fotoelctrica y el fotomultiplicador se procede como sigue: se pesan 0,2 g de cromato potsico de calidad para espectrofotometra, se disuelven, en un matraz aforado de 1000 ml, en una solucin de hidrxido potsico 0,05N y se completa hasta el enrase. De la solucin obtenida se toman exactamente 25 ml, se transvasan a un matraz aforado de 500 ml y se completa hasta el enrase con la misma solucin de hidrxido potsico. Se mide la extincin a 275 nm de la solucin as obtenida, utilizando la solucin de hidrxido potsico como referencia. La extincin medida en cubeta de 1 cm deber ser de 0,200 0,005.

36

donde Km es la extincin especfica a la longitud de onda m, longitud de onda de mxima absorcin alrededor de 270 nm.

M
REACTIVO Cromato potsico Hidrxido potsico 0,05N RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 121497 Potasio Cromato PA 181517 Prepararlo a partir de Potasio Hidrxido 1 mol/l (1N) SV diluido convenientemente con agua 3.1. Cromatgrafo de gases El cromatgrafo de gases constar de los siguientes elementos: 3.1.1. Sistema de inyeccin Utilizar un sistema de inyeccin: a) con columnas de relleno, con un espacio muerto lo ms pequeo posible (en este caso, el sistema de inyeccin podr calentarse a una temperatura que sea entre 20 y 50C superior a la de la columna); o b) con columnas capilares; en este caso, el sistema de inyeccin estar especialmente diseado para poder operar con esa clase de columnas; podr utilizarse un inyector con divisin de flujo o un inyector "on column". Nota 2: En ausencia de cidos grasos con menos de 16 tomos de carbono, podr utilizarse un inyector de aguja mvil. 3.1.2. Horno El horno podr calentar la columna a 260C como mnimo y mantener dicha temperatura con una oscilacin mxima de 1C, si se emplea una columna de relleno, y de 0,1C, si se emplea una columna capilar. Este ltimo requisito es especialmente importante si se utiliza una columna de slice fundida. Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento programado, sobre todo en el caso de cidos grasos con menos de 16 tomos de carbono. 3.1.3. Columna de relleno 3.1.3.1.Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse (es decir, vidrio o acero inoxidable) y de las dimensiones siguientes: a) Longitud: de 1 a 3 m. Con cidos grasos de cadena larga (ms de C20) es conveniente utilizar una columna relativamente corta. Para el anlisis de cidos con 4 o 6 tomos de carbono se recomienda una columna de 2 m. b) Dimetro interior: de 2 a 4 mm. Nota 3: Si hay componentes poliinsaturados con ms de tres enlaces dobles, pueden descomponerse en una columna de acero inoxidable. Nota 4: Puede utilizarse un sistema con doble columna de relleno. Recomendacin Panreac: 710006 Columna de acero inoxidable con relleno standard, 6' long., 1/8" OD, 2 mm ID. 3.1.3.2.Relleno, que incluya los siguientes elementos:

ANEXO X A ANLISIS DE LOS STERES METLICOS DE LOS CIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFA DE GASES 1. OBJETO El presente mtodo internacional proporciona orientaciones generales para determinar, mediante cromatografa de gases con columna de relleno o capilar, la composicin cualitativa y cuantitativa de una mezcla de steres metlicos de cidos grasos obtenidos con arreglo al Anexo X B. El mtodo no es aplicable a los cidos grasos polimerizados. 2. REACTIVOS 2.1. Gas portador Gas inerte (nitrgeno, helio, argn, hidrgeno, etc.), perfectamente desecado y que contenga menos de 10 mg/kg de oxgeno. Nota 1: El hidrgeno, que slo se emplea como gas portador en las columnas capilares, puede duplicar la velocidad del anlisis, pero es peligroso. Existen dispositivos de seguridad. 2.2. Gases auxiliares 2.2.1. Hidrgeno (pureza 99,9%) exento de impurezas orgnicas. 2.2.2. Aire u oxgeno, exento de impurezas orgnicas. 2.3. Patrn de referencia Una mezcla de steres metlicos de cidos grasos puros, o los steres metlicos de una grasa de composicin conocida y, preferentemente, similar a la de la materia grasa objeto de anlisis. Deber evitarse la oxidacin de los cidos grasos poliinsaturados. 3. APARATOS Las normas que figuran a continuacin se refieren al equipo ordinario para cromatografa de gases, utilizando columnas de relleno y/o capilares y un detector de ionizacin de llama. Podr utilizarse cualquier aparato cuya eficacia y resolucin se ajusten a lo dispuesto en el punto 4.1.2.

37

38

a) Soporte: tierra de diatomeas lavada con cido y silanizada, u otro soporte inerte adecuado, con un margen estrecho de tamao de grano (margen de 25 m, entre 125 y 200 m); el tamao medio de grano estar en funcin del dimetro interior y de la longitud de la columna. b) Fase estacionaria: lquido polar de tipo polister (por ejemplo: polisuccinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato de etilenglicol, etc.), cianosiliconas o cualquier otro lquido que permita efectuar la separacin cromatogrfica exigida (vase el punto 4). La fase estacionaria deber constituir del 5% (m/m) al 20% (m/m) del relleno. Para algunas separaciones podr utilizarse una fase fija no polar. Recomendacin Panreac: 705103 Chromosorb recubierto con fase estacionaria Dietilenglicol succinato / 10% en Chromosorb W-AW. 3.1.3.3.Acondicionamiento de la columna Estando la columna desconectada del detector, si es posible, calentar el horno gradualmente hasta 185C y hacer pasar a travs de la columna recin preparada una corriente de gas inerte a razn de 20-60 ml/min durante 16 horas como mnimo a la temperatura citada y, a continuacin, a la temperatura de 195C durante 2 horas ms. 3.1.4. Columna capilar Recomendacin Panreac: 733060.25 Columna capilar FS-CW 20 M, 25 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor. 3.1.4.1.Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse (generalmente, vidrio o slice fundida). El dimetro interior estar comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se someter a un tratamiento adecuado (por ejemplo, preparacin de la superficie, inactivacin) antes de introducir el recubrimiento de fase fija. En la mayora de casos, es suficiente una longitud de 25 m(3). 3.1.4.2.Fase estacionaria de tipo poliglicol [poli(etilenglicol) 20 000], polister (polisuccinato de butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas), generalmente. Son apropiadas las columnas de fase qumicamente ligada. Nota 5: Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la identificacin y separacin del cido linolnico y de los cidos C20. El espesor de la fase estar comprendido entre 0,1 y 0,2 m. 3.1.4.3.Montaje y acondicionamiento de la columna. Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares (es decir, instalacin de la columna en el horno, eleccin y montaje de las juntas (estanqueidad), conexin de los extremos de la columna al inyector y al detector (reduccin de los espacios muertos). Colocar la columna bajo un flujo

de gas portador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa) para una columna de 25 mm de longitud y 0,3 mm de dimetro interior]. Acondicionar la columna programando el gradiente de temperatura del horno a 3C/min a partir de la temperatura ambiente hasta alcanzar una temperatura 10C inferior al lmite de descomposicin de la fase estacionaria. Mantener el horno a esa temperatura durante 1 hora hasta que se estabilice la lnea de base. Restablecer la temperatura de 180C para trabajar en condiciones isotrmicas. Nota 6: En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previamente acondicionadas. 3.1.5. Detector que puede calentarse a una temperatura superior a la de la columna. 3.2. Jeringa Tendr una capacidad mxima de 10 l y estar graduada en 0,1 l. 3.3. Registrador Si se emplea la curva del registrador para calcular la composicin de la mezcla analizada, se necesita un registrador electrnico de alta precisin compatible con los aparatos utilizados. El registrador deber tener las siguientes caractersticas: a) tiempo de repuesta inferior a 1,5 s y, preferiblemente, inferior a 1 s (el tiempo de repuesta es el tiempo que tarda la pluma registradora en pasar de 0 a 90% despus de la introduccin instantnea de una seal del 100%); b) ancho del papel: 20 cm como mnimo; c) velocidad del papel: ajustable a valores comprendidos entre 0,4 cm/min y 2,5 cm/min. 3.4. Integrador La utilizacin de un integrador electrnico permite efectuar clculos rpidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibilidad adecuada y la correccin de la desviacin de la lnea de base debe ser satisfactoria. 4. PROCEDIMIENTO Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a 4.3 slo son vlidas si se emplea un detector de ionizacin de llama. Como alternativa puede emplearse un cromatgrafo de gases con catarmetro (cuyo funcionamiento se basa en el principio de los cambios de conductividad trmica). En ese caso, las condiciones de ensayo debern modificarse como se indica en el punto 6. 4.1. Condiciones de ensayo 4.1.1. Determinacin de las condiciones operativas ptimas 4.1.1.1.Columna de relleno Al establecer las condiciones de ensayo debern tenerse en cuenta las variables siguientes:

(3) En la Directiva consta errneamente como mm

M
a) longitud y dimetro de la columna; b) composicin y cantidad de la fase estacionaria; c) temperatura de la columna; d) flujo del gas portador; e) resolucin exigida; f) tamao de la muestra problema, determinado de modo que el conjunto del detector y el electrmetro d una respuesta lineal; g) duracin del anlisis. Como norma general, las cifras de las tablas 1 y 2 permitirn obtener los resultados deseados, es decir, al menos 2000 platos tericos por metro de longitud de columna en el caso del estearato de metilo, y su elucin en 15 minutos aproximadamente. Cuando el aparato lo permita, la temperatura del inyector deber ser de 200C aproximadamente y la del detector deber ser igual o superior a la de la columna. Por lo general, la razn entre la velocidad de flujo del hidrgeno suministrado al detector de ionizacin de llama y la del gas portador oscila entre 1:2 y 1:1, en funcin del dimetro de la columna. El flujo del oxgeno es de 5 a 10 veces superior al del hidrgeno. Tabla 1 Dimetro interior de la columna mm 2 3 4 Tabla 2 Concentracin de la fase fija % (m/m) 5 10 15 20 Temperatura de la columna C 175 180 185 185 Flujo del gas portador ml/min 15 a 25 20 a 40 40 a 60 : metlicos de manteca de cacao) en proporciones aproximadamente equivalentes. Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de manera que el mximo del pico del estearato de metilo se registre aproximadamente 15 minutos despus del pico del disolvente. Utilizar una cantidad suficiente de la mezcla de steres metlicos, de manera que el pico del estearato de metilo se eleve a tres cuartos aproximadamente de la escala completa. Calcular el nmero n de platos tericos (eficacia) mediante la siguiente frmula: dr1 n = 16 a1

la resolucin R mediante la siguiente frmula: 2 R = a1 + a2 siendo: dr1 : a1 y a2 distancia en mm, desde el inicio del cromatograma hasta el mximo del pico del estearato de metilo, anchura, en mm, de los picos del estearato de metilo y del oleato de metilo, respectivamente, medida entre los puntos de interseccin de las tangentes en los puntos de inflexin de la curva con la lnea de base, distancia, en mm, entre los dos mximos de los picos del estearato de metilo y del oleato de metilo.

y el ndice de resolucin "Ir" mediante la siguiente frmula: a b siendo: a : altura del pico ms pequeo, medida a partir de la lnea de base; b : altura del punto ms bajo del valle comprendido entre los dos picos adyacentes, medida a partir de la lnea de base. (Modificado por el Reglamento (CEE) N 1429/92)

4.1.1.2.Columna capilar Las propiedades de eficacia y permeabilidad de las columnas capilares implican que la separacin de los constituyentes y la duracin del anlisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la columna. Por lo tanto, para optimizar las condiciones operativas ser necesario manipular este parmetro (o, lo que es ms sencillo, la presin en cabeza de columna) segn se desee mejorar las separaciones o efectuar un anlisis rpido. 4.1.2. Determinacin del nmero de platos tericos (eficacia) y de la resolucin (figura 1) Efectuar el anlisis de una mezcla de estearato de metilo y de oleato de metilo (por ejemplo, steres

39

Figura 1 Cromatograma para determinar el nmero de platos tericos (eficacia) y la resolucin

Se establecern unas condiciones de anlisis que permitan obtener al menos 2 000 platos tericos por metro de longitud de columna para el estearato de metilo y una resolucin de 1,25 como mnimo. 4.2. Muestra problema Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 l a 2 l de la solucin de steres metlicos preparados con arreglo al Anexo X B e inyectarlos en la columna. En el caso de steres no disueltos, preparar una solucin de 100 mg/ml aproximadamente en heptano de calidad para cromatografa e inyectar de 0,1 l a 1 l de esta solucin. Si slo se desean detectar los componentes presentes en cantidades muy pequeas, se podr aumentar el tamao de la muestra (hasta 10 veces). 4.3. Anlisis Como norma general, las condiciones de ensayo son las que se especifican en el punto 4.1.1. No obstante, cuando se determinan cidos con menos de 12 tomos de carbono es posible operar

40

a menor temperatura de columna, mientras que cuando se determinan cidos grasos con ms de 20 tomos de carbono es posible operar a una temperatura mayor. A veces se puede utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programacin de temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene steres metlicos de cidos grasos con menos de 12 tomos de carbono, inyectar la muestra a 100C (o a 50 60C si hay cido butrico) y elevar inmediatamente la temperatura a razn de 4 8 C/min hasta alcanzar el nivel deseado. En algunos casos es posible combinar ambos procedimientos. Tras el calentamiento programado, se contina la elucin a temperatura constante hasta que todos los componentes se hayan eluido. Si el instrumento no puede efectuar un calentamiento programado, se opera a dos temperaturas fijas comprendidas entre 100 y 195C. Si es necesario, se recomienda que se efecte un anlisis con dos fases fijas de diferente polaridad para comprobar la ausencia de picos ocultos, por ejemplo en caso de presencia simultnea de C18:3 y C20:0 o C18:3 y C18:2 conjugados.

M
4.4. Preparacin del cromatograma y las grficas de referencia Analizar la mezcla patrn de referencia (2.3) aplicando las mismas condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las distancias de retencin de los cidos grasos que la componen. Representar grficamente en papel semilogartmico, para cualquier grado de insaturacin, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retencin en funcin del nmero de tomos de carbono. En condiciones isotrmicas, las grficas de los steres de cadena lineal con el mismo grado de insaturacin deben formar lneas rectas. Dichas lneas rectas deben ser aproximadamente paralelas. Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de picos ocultos, es decir, una resolucin insuficiente para separar dos componentes. 5. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS 5.1. Anlisis cualitativo Identificar los picos del estearato de metilo de la muestra a partir de los grficos citados en el punto 4.4, si es necesario por interpolacin. 5.2. Anlisis cuantitativo 5.2.1. Determinacin de la composicin Salvo en casos excepcionales, utilizar el mtodo de normalizacin interna, es decir, partir del principio de que todos los componentes de la muestra estn representados en el cromatograma, de manera que el total de las reas situadas debajo de cada pico representa el 100% de los constituyentes (elucin total). Si el equipo incluye un integrador, utilizar las cifras que ste proporcione. En caso contrario, determinar el rea situada debajo de cada pico multiplicando la altura del pico por el ancho a la mitad de la altura y, cuando sea necesario, tomar en consideracin las atenuaciones utilizadas durante el registro. 5.2.2. Mtodo de clculo 5.2.2.1.Caso general Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como porcentaje en masa de steres metlicos), mediante la determinacin del porcentaje que representa el rea de su pico en relacin con la suma de las reas de todos los picos, aplicando la frmula siguiente: Ai x 100 A siendo: Ai : rea del pico correspondiente al componente i. A : suma de las reas de todos los picos. Expresar el resultado con una cifra decimal. Nota 7: En este caso general se considera que el resultado del clculo basado en las reas relativas representa el porcentaje en peso. Para los casos en que no es vlida esta consideracin, vase el punto 5.2.2.2. 5.2.2.2.Utilizacin de factores de correccin En algunos casos, por ejemplo en presencia de cidos grasos con menos de 8 tomos de carbono o de cidos con grupos secundarios, si se utilizan detectores de conductividad trmica o si es necesario alcanzar mayor nivel de exactitud, deben aplicarse factores de correccin para convertir los porcentajes de las reas de los picos en porcentajes en peso de los componentes. Determinar los factores de correccin con un cromatograma obtenido del anlisis de una mezcla de referencia de steres metlicos de composicin conocida en condiciones de ensayo idnticas a las empleadas para el anlisis de la muestra. La frmula que se aplicar a la muestra de referencia para obtener el porcentaje en peso del componente i es la siguiente: mi x 100 m siendo: mi : peso del componente i de la muestra de referencia, m : suma de los pesos de los diversos componentes de la muestra de referencia. A partir del cromatograma de la muestra de referencia (4.4) calcular el porcentaje (rea/rea) del componente i del siguiente modo: Ai x 100 A siendo: Ai : rea del pico correspondiente al componente i, A : suma de las reas de todos los picos. El factor de correccin se calcula del siguiente modo: mi x A Ki= Ai x m Por lo general, los factores de correccin se expresan con relacin a KC16, de modo que los factores relativos se convierten en lo siguiente: Ki K'i= KC16

41

En la muestra, el contenido de cada componente i, expresado como porcentaje en peso de los steres metlicos, es el siguiente: K'i x Ai x 100 (K'i x Ai) Expresar los resultados con una cifra decimal. 5.2.2.3.Utilizacin de patrn interno En algunos anlisis (por ejemplo, cuando no se cuantifican todos los cidos grasos por estar presentes simultneamente cidos de 4 y 6 tomos de carbono y cidos de 16 y 18 tomos de carbono, o cuando es necesario determinar la cantidad absoluta de un cido graso en la muestra) es preciso utilizar un patrn interno. Se emplean con frecuencia cidos grasos de 5, 15 o 17 tomos de carbono. Debe determinarse, si es necesario, el factor de correccin del patrn interno. El porcentaje en peso del componente i, expresado como steres metlicos, se calcula mediante esta frmula: mp x K'i x Ai x 100 m x K'p x Ap siendo: Ai : rea del pico correspondiente al componente i. Ap : rea del pico correspondiente al patrn interno. K'i : factor de correccin del componente i (con relacin a KC16). K'p: factor de correccin del patrn interno (con relacin a KC16). m : peso, en mg, de la muestra. mp : peso, en mg, del patrn interno. Expresar los resultados con una cifra decimal. 6. CASO ESPECIAL DE DETERMINACIN DE LOS ISMEROS TRANS (Reglamento (CEE) N 1429/92) Es posible determinar el contenido de ismeros trans de los cidos grasos con un nmero de tomos de carbono comprendido entre 10 y 24 por separacin de los steres metlicos, utilizando columnas cromatogrficas capilares con una polaridad especial. 6.1. Columna capilar de silicio de un dimetro interno comprendido entre 0,25 mm y 0,32 mm y de 50 m de longitud, recubierta de una capa de cianopropisilicona de un espesor comprendido entre

0,1 y 0,3 m (tipo SP 2340, tipo SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 o similar). Recomendacin Panreac: 726089.60 Columna capilar para GC, OPTIMA 240, 60 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor. 6.2. Los steres metlicos se preparan segn el procedimiento B descrito en el Anexo X "B". Las materias grasas con una acidez libre superior al 3% deben neutralizarse previamente con arreglo al punto 6.1 del Anexo VII. 6.3. Las condiciones generales de trabajo para la cromatografa en fase gaseosa son las siguientes: temperatura de la columna programada de 150 a 230C (por ejemplo, 165C durante 15 minutos y a continuacin un aumento de 5C por minuto hasta alcanzar 200C), temperatura del inyector: 250C si se utiliza el sistema de inyector divisor o la temperatura inicial de la columna si se emplea el sistema "on column", temperatura del detector: 260C, flujo del gas vector (helio e hidrgeno): 1,2 ml/minuto. La cantidad inyectada debe ser tal que, en las condiciones de sensibilidad empleadas, la altura del pico correspondiente al ster metlico del cido araqudico sea igual o superior al 20% del fondo de escala. 6.4. La identificacin de los diversos steres metlicos se efecta comparando los tiempos de retencin con los de las mezclas de referencia (tal y como se indica en el punto 2.3). Los steres de los cidos grasos trans son eluidos antes que los ismeros cis correspondientes. En la figura 2 se presenta un ejemplo de cromatograma.

42

M
Figura 2 Cromatograma de gases tipo relativo a la determinacin de los ismeros trans de los cidos grasos con columna capilar

Cromatograma de gases tipo relativo a la determinacin de los ismeros trans de los cidos grasos con la columna capilar 726089.60 (recomendacin Panreac)

43

6.5. La eficacia de la columna determinada con arreglo al punto 4.1.2 deber permitir una separacin, con un ndice de resolucin superior a 2, de determinadas parejas crticas, como la formada por el grupo de los cidos transisoleicos y el pico del cido oleico (trans C18:1/cis C18:1). 6.6. La proporcin de los diversos cidos grasos trans se calcula estableciendo la relacin entre la superficie del pico correspondiente y la suma de las superficies de todos los picos presentes. Se toman en consideracin los porcentajes de los cidos: trans octadecenoicos (T 18:1), que en el Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de ismeros transoleicos, cis-trans y trans-cis octadecadienoicos [(CT/TC) 8:2], que en el Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de ismeros translinoleicos, trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis octadecatrienoicos [(TCT+CCT+CTC +TCC) 18:3], que en el Anexo I del presente Reglamento figuran como total de ismeros translinolnicos. Tabla 3 Variable Columna Soporte Concentracin de la fase estacionaria Gas portador Gases auxiliares Temperatura del inyector Flujo del gas portador Tamao de la muestra problema inyectada

Nota 8: Teniendo en cuenta las caractersticas particulares de este mtodo, los resultados deben darse con dos decimales. 7. CASO ESPECIAL DE UTILIZACIN DE UN CATARMETRO (FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL PRINCIPIO DE LOS CAMBIOS DE CONDUCTIVIDAD TRMICA) Para la determinacin de la composicin cualitativa y cuantitativa de una mezcla de steres metlicos de cidos grasos tambin podr utilizarse un cromatgrafo de gases provisto de un detector cuyo funcionamiento se base en el principio de los cambios de conductividad trmica (catarmetro). En ese caso, las condiciones establecidas en los puntos 3 y 4 debern modificarse como se indica en la tabla 3. Para el anlisis cuantitativo, utilizar los factores de correccin definidos en el punto 5.2.2.2.

Valor / condicin Longitud: 2 a 4 m Dimetro interior: 4 mm Tamao de grano entre 160 y 200 m De 15% a 25% (m/m) Helio o, en su defecto, hidrgeno, con el menor contenido de oxgeno posible Ninguno De 40 a 60C ms que la de la columna Normalmente entre 60 y 80ml/min Normalmente entre 0,5 y 2 l

8. INFORME DEL ANLISIS En el informe del anlisis se expondrn los mtodos utilizados para la preparacin de los steres metlicos y para la realizacin del anlisis mediante cromatografa de gases, as como los resultados obtenidos. Se mencionarn, asimismo, cualesquiera procedimientos de trabajo que no se especifiquen en la presente norma internacional o que se consideren facultativos, as como toda circunstancia que pueda haber influido en los resultados. El informe del anlisis incluir todos los datos necesarios para la completa identificacin de la muestra.

ANEXO X "B" PREPARACIN DE LOS STERES METLICOS DE LOS CIDOS GRASOS DE CONFORMIDAD CON LOS PUNTOS I Y II DEL ANEXO VI DEL REGLAMENTO (CEE) N 72/77 O SEGN EL MTODO QUE SE DESCRIBE A CONTINUACIN

44

INTRODUCCIN La eleccin del procedimiento a utilizar deber hacerse en funcin de la composicin de los cidos y de la acidez de la materia grasa que haya que examinar y del anlisis mediante cromatografa de gases que deba efectuarse.

M
En particular: cuando se trate de materias grasas que contengan cidos grasos inferior a C12, slo podrn utilizarse los procedimientos en tubo cerrado o con dimetlico, cuando se trate de materias grasas con una acidez superior al 3%, slo podrn utilizarse los procedimientos con mezcla de metanol y cido clorhdrico o con sulfato dimetlico, en la determinacin mediante cromatografa de gases de los ismeros trans, slo podrn utilizarse los procedimientos con metilato sdico o con sulfato dimetlico, el procedimiento con mezcla de metanol, hexano y cido sulfrico deber utilizarse en la preparacin de los steres metlicos de pequeas cantidades de materias grasas por separacin mediante cromatografa en capa fina. No se tendr en cuenta el insaponificable cuando no supere el 3%; en caso contrario, los steres metlicos debern prepararse a partir de los cidos grasos. 1. OBJETO 4. REACTIVOS A continuacin se describen cinco procedimientos para la preparacin de los steres metlicos de las materias grasas: a) con metilato sdico; b) con metilato sdico en tubo cerrado; c) con mezcla de metanol y cido clorhdrico en tubo cerrado; d) con sulfato dimetlico; 4.1. Metanol anhidro. 4.2. Solucin de metilato sdico en metanol al 1% aproximadamente. Se prepara disolviendo 0,34 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro. 4.3. ter etlico. 4.4. Solucin de cloruro sdico al 10%. 4.5. ter de petrleo 40-60C. e) con mezcla de metanol, hexano y cido sulfrico.

Procedimiento A 2. PRINCIPIO DEL MTODO La materia grasa objeto de anlisis se calienta a reflujo con alcohol metlico y metilato sdico. Los steres metlicos que se obtengan se extraen con ter etlico. 3. MATERIAL Y APARATOS 3.1. Matraz redondo de 100 ml con refrigerante de reflujo, provisto en su extremidad superior de un tubo para cal sdica, con junta esmerilada. 3.2. Probetas de 50 ml. 3.3. Pipeta de 5 ml graduada en divisiones de 0,1 ml. 3.4. Embudos de separacin de 250 ml. 3.5. Matraz redondo de 200 ml.

REACTIVO Cloruro sdico ter de petrleo 40-60C ter etlico Metanol anhidro Sodio metal

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO 132770 Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO 481091 Metanol seco (mx. 0,01% de agua) DS-ACS-ISO 131699 Sodio metal, barras PA-ACS

5. PROCEDIMIENTO 5.1. Introducir en el matraz de 100 ml 2 g de grasa previamente deshidratada en sulfato sdico y filtrada. Aadir 35 ml de metanol, acoplar el refrigerante y llevar a ebullicin mantenindola a reflujo durante algunos minutos. 5.2. Interrumpir el calentamiento, separar el refrigerante y aadir rpidamente 3,5 ml de la solucin de metilato sdico; acoplar nuevamente el refrigerante y hervir a reflujo durante 3 horas como

mnimo. La metilacin se habr completado cuando toda la materia grasa se haya disuelto y la mezcla de reaccin est perfectamente transparente a temperatura ambiente. 5.3. Enfriar y verter la mezcla de reaccin en una ampolla de separacin de 250 ml, aadir 35 o 40 ml de ter etlico, 100 ml de agua y 5 o 6 ml de la solucin de cloruro sdico al 10%. Agitar y esperar a que se produzca la separacin de las capas; transferir la fase acuosa a una segunda ampolla de separacin y extraerla de nuevo con 25 ml de ter etlico.

45

Aadir a los extractos etreos reunidos 50 ml de ter de petrleo 40-60C, lo que provocar la separacin del agua que debe eliminarse. Lavar la fase etrea tres veces con 10 o 15 ml de agua cada vez, desecar sobre sulfato sdico y pasar filtrando a travs de papel a un matraz redondo de 200 ml. Concentrar la solucin al bao Mara hasta unos 20 ml mientras se hace pasar una corriente de nitrgeno puro.

3. MATERIAL Y APARATOS 3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de unos 5 ml (altura: 40-45 mm, dimetro: 14-16 mm). 3.2. Pipeta de 1 ml graduada en divisiones de 0,1 ml. 4. REACTIVOS 4.1. Solucin de metilato sdico en metanol al 1,5% aproximadamente. Se prepara disolviendo 0,50 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro.

Procedimiento B 2. PRINCIPIO DEL MTODO La materia grasa objeto de anlisis es tratada con metilato sdico en solucin metanlica, en recipiente cerrado, a 85 90C.

REACTIVO Metanol anhidro Sodio metal

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 481091 Metanol seco (mx. 0,01% de agua) DS-ACS-ISO 131699 Sodio metal, barras PA-ACS

5. PROCEDIMIENTO 5.1. Introducir en el tubo de vidrio 2 g de materia grasa previamente deshidratada en sulfato sdico y filtrada. Aadir 0,3 g (unos 0,4 ml) de la solucin de metilato sdico y cerrar el tubo a la llama. 5.2. Mantener el tubo durante dos horas al bao Mara a una temperatura entre 85 y 90C agitndolo de vez en cuando. La esterificacin se habr conseguido cuando se vuelva transparente el contenido del frasco tras la sedimentacin de la glicerina y de los residuos de los reactivos. 5.3. Enfriar a temperatura ambiente. Abrir el tubo cuando se vayan a utilizar los steres metlicos. stos no necesitan de ninguna otra manipulacin antes de ser analizados.

Procedimiento C 2. PRINCIPIO DEL MTODO La materia grasa objeto de anlisis es tratada con una mezcla de metanol y cido clorhdrico, en tubo cerrado, a 100C. 3. MATERIAL Y APARATOS 3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de unos 5 ml (altura: 40-45 mm, dimetro: 14-16 mm). 3.2. Pipetas aforadas de 1 y 2 ml. 4. REACTIVOS 4.1. Solucin de cido clorhdrico en metanol al 2%. Se prepara con cido clorhdrico gaseoso y metanol anhidro (nota 1). 4.2. Hexano de calidad adecuada para cromatografa.

46

REACTIVO Hexano de calidad adecuada para cromatografa Metanol anhidro

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 362063 n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI 481091 Metanol seco (mx. 0,01% de agua) DS-ACS-ISO

M
5. PROCEDIMIENTO 5.1. Introducir en el tubo de vidrio 0,2 g de materia grasa, previamente deshidratada en sulfato sdico y filtrada, y 2 ml de la solucin de cido clorhdrico en metanol. Cerrar el tubo a la llama. 5.2. Mantener el tubo durante 40 minutos al bao Mara a 100C. 5.3. Enfriar el tubo en agua corriente, abrirlo, aadir 2 ml de agua destilada y 1 ml de hexano. Centrifugar y extraer la fase del hexano que estar lista para ser utilizada. 3. MATERIAL Y APARATOS 3.1. Tubo de ensayo de vidrio de paredes gruesas, de 20 ml aproximadamente de capacidad, con tapn esmerilado 10/19 y enganches de seguridad. 3.2. Refrigerante de reflujo de cinco ampollas con junta esmerilada 10/19. 3.3. Filtros de vidrio de fondo poroso, de graduacin G 2 y dimetro de 20 mm. 3.4. Tubos de ensayo de vidrio de fondo cnico, de unos 10 ml de capacidad. 3.5. Jeringas de 1 y 5 ml. 4. REACTIVOS Procedimiento D 2. PRINCIPIO DEL MTODO La materia grasa objeto de anlisis se saponifica con una solucin en alcohol metlico de hidrxido potsico, y despus se trata con sulfato dimetlico. Tras aadir cido clorhdrico, los steres metlicos formados se separan espontneamente. Mediante el tratamiento posterior con almina, se obtienen steres metlicos de elevada pureza. 4.1. Solucin al 10% de hidrxido potsico en alcohol metlico de calidad adecuada para cromatografa. 4.2. Solucin al 0,05% del indicador verde de bromocresol en alcohol metlico. 4.3. Sulfato dimetlico (d = 1,335 a 15C). 4.4. cido clorhdrico concentrado (d = 1,19) diluido 1:1 con alcohol metlico de calidad cromatogrfica. 4.5. xido de aluminio normalizado segn el mtodo Brockmann para cromatografa de adsorcin.

REACTIVO cido clorhdrico concentrado (d = 1,19) Alcohol metlico de calidad adecuada para cromatografa Hidrxido potsico xido de aluminio Solucin al 0,05% del indicador verde de bromocresol en alcohol metlico Sulfato dimetlico (d = 1,335 a 15C) 5. PROCEDIMIENTO

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131020 cido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO 361091 Metanol (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI 121515 121100 281760 162714 Potasio Hidrxido 85% lentejas PA Aluminio xido Bsico PA Verde de Bromocresol solucin 0,04% RV Dimetilo Sulfato PS do: la reaccin ser completa cuando el indicador pase del azul al amarillo. Al final, enfriar el tubo en agua corriente, abrirlo y aadir 5 ml de la solucin metanlica de cido clorhdrico. 5.3. Tras agitar durante unos segundos, inclinar el tubo y darle ligeras sacudidas que faciliten la aparicin de los steres metlicos en forma de masa oleosa (nota A). Retirar los steres metlicos con una jeringa, introducirlos en un tubo de fondo cnico, aadir un volumen de almina equivalente a un cuarto del volumen de los steres metlicos, agitar y filtrar con papel de filtro. Nota A: En caso de que no se produzca espontneamente la separacin de los steres metlicos, aadir al tubo 5 ml de agua y agitar.

5.1. Introducir en el tubo de ensayo de 20 ml unos 2,2 ml de materia grasa previamente deshidratada en sulfato sdico y filtrada; aadir 5 ml de la solucin de hidrxido potsico y algunos granos de piedra pmez para regular la ebullicin. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar agitando sobre llama pequea durante 5 minutos. Para que la saponificacin sea completa, la solucin deber volverse transparente. Por ltimo, enfriar en agua corriente y separar el refrigerante. 5.2. Aadir dos gotas del indicador y, lentamente, con la ayuda de una jeringa, 1 ml de sulfato dimetlico. Cerrar hermticamente el tubo de ensayo y agitar durante dos o tres minutos, introduciendo con frecuencia el fondo del tubo en agua hirvien-

47

Procedimiento E 2. PRINCIPIO DEL MTODO La materia grasa objeto de anlisis se calienta a reflujo con metanol, hexano y cido sulfrico. Los steres metlicos que se obtengan se extraern con ter de petrleo. 3. MATERIAL Y APARATOS 3.1. Tubo de ensayo de unos 20 ml de capacidad, con refrigerante de reflujo de aire, de 1 m aproximadamente de longitud, con junta esmerilada.

3.2. 3.3. 3.4. 3.5.

Pipeta aforada 5 ml. Ampolla de separacin de 50 ml. Probetas de 10 y 25 ml. Tubo de fondo cnico de 15 ml.

4. REACTIVOS 4.1. Reactivo de metilacin: metanol anhidro, hexano y cido sulfrico concentrado (d = 1,84) en la siguiente proporcin: 75:25:1 (V/V/V). 4.2. ter de petrleo 40-60C. 4.3. Sulfato sdico anhidro.

REACTIVO cido sulfrico concentrado ter de petrleo 40-60C Hexano Metanol anhidro Sulfato sdico anhidro 5. PROCEDIMIENTO

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO 132063 n-Hexano PA-ACS 481091 Metanol seco (mx. 0,01% de agua) DS-ACS-ISO 131716 Sodio Sulfato anhidro PA-ACS-ISO rarse con antelacin cantidades grandes de solucin metanlica de cido clorhdrico, ya que se conserva en perfectas condiciones en la oscuridad dentro de botellas con tapones de vidrio. Nota 2: Para controlar la ebullicin, introducir una varita de vidrio en el tubo y limitar la temperatura del bao Mara a 90C.

48

5.1. Introducir en el tubo de 20 ml el material recuperado de la placa y aadir 5 ml de reactivo de metilacin. 5.2. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar al bao Mara en ebullicin durante 30 minutos (nota 2). 5.3. Transferir cuantitativamente la mezcla a una ampolla de separacin de 50 ml con la ayuda de 10 ml de agua destilada y 10 ml de ter de petrleo. Agitar enrgicamente y esperar a que se produzca la separacin de las fases, extraer la capa acuosa y lavar la capa etrea dos veces con 20 ml de agua destilada. Aadir a la ampolla de separacin una pequea cantidad de sulfato sdico anhidro, agitar, dejar reposar unos minutos y pasar filtrando a un tubo de fondo cnico de 15 ml. Evaporar el disolvente al bao Mara haciendo pasar una corriente de nitrgeno. Nota 1: En el laboratorio pueden prepararse fcilmente pequeas cantidades de cido clorhdrico gaseoso por simple desplazamiento de la solucin comercial (r= 1,18), aadiendo algunas gotas de cido sulfrico concentrado (r= 1,84). El gas liberado se deseca fcilmente por borboteo a travs de cido sulfrico concentrado. Dado que el cido clorhdrico es absorbido por el metanol con mucha rapidez, se aconseja que se adopten las precauciones necesarias al disolverlo (es decir, introducir el gas a travs de un embudo pequeo invertido cuyo borde roce la superficie del lquido). Pueden prepa-

ANEXO XI DETERMINACIN DEL CONTENIDO EN SOLVENTES HALOGENADOS VOLTILES EN EL ACEITE DE OLIVA 1. PRINCIPIO DEL MTODO Anlisis por cromatografa en fase gaseosa segn la tcnica del espacio de cabeza (head space). 2. EQUIPO 2.1. Cromatografa de gases con detector de captura de electrones (ECD). 2.2. Equipo para espacio de cabeza (head space). 2.3. Columna de cromatografa en fase gaseosa de vidrio de 2 metros de largo y 2 mm de dimetro, fase estacionaria. OV 101 al 10% impregnado en cromosorb WAW-DMCS (tierra de diatomeas calcinada lavada con cido y silanizado (80-100 Mesh).

M
Recomendacin Panreac: 726785.50 Columna capilar OPTIMA 624, 50 m long., 0,25 mm ID, 1,40 m espesor. 2.4. Gas portador y gas auxiliar: nitrgeno para cromatografa de gases de pureza adecuada para la deteccin por captura de electrones. 2.5. Frascos de cristal de 10 a 15 ml provistos de septum de tefln y con una cpsula de aluminio con un orificio para toma de muestras con jeringa. Recomendacin Panreac: 70205.36 Vial encapsulable N 20-10 DIN, incoloro. 70234 Cpsula de aluminio con disco N 20 TB/oA color aluminio. 2.6. Pinzas capsuladoras para cerrar hermticamente. Recomendacin Panreac: 735120 Encapsuladora manual, N 20 para tapones encapsulables de 20 mm ID. 2.7. Jeringa para gases de 0,5 y 2 ml. 3. REACTIVOS Solventes halogenados con una pureza apropiada para su uso en cromatografa en la fase gaseosa. 4. PROCEDIMIENTO DE ANLISIS 4.1. Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en un frasco de cristal (no reutilizable), tapar el frasco de manera que quede cerrado hermticamente. Introducir el frasco en un bao con termostato a 70C durante 1 hora. Extraer con precisin, por medio de una jeringa, un volumen de 0,2 a 0,5 ml del espacio de cabeza. Inyectarlo en la columna del cromatgrafo de gases con las siguientes condiciones: temperatura inyector: 150C temperatura columna: 70-80C temperatura detector: 200-250C Podrn utilizarse otras temperaturas siempre que los resultados sean equivalentes. La inyeccin se puede realizar con el equipo para espacio de cabeza. 4.2. Soluciones de referencia. Preparar soluciones patrn utilizando aceite de oliva refinado sin trazas de solventes con concentraciones en hidrocarburos halogenados de 0,05 a 1 ppm (mg/kg) segn el contenido supuesto de la muestra. Para preparar la solucin de referencia, si es necesario diluir previamente el hidrocarburo halogenado patrn, puede utilizarse pentano. Recomendacin Panreac: 362006 n-Pentano (UV-IR-HPLC) PAI 4.3. Cuantificacin. Se efecta por clculo mediante la relacin de reas o alturas del pico de la muestra y de la solucin patrn cuya concentracin sea la ms prxima a la de la muestra. Si la desviacin es superior al 10%, ser necesario volver a hacer el anlisis, comparndolo con una nueva solucin patrn de concentracin tal que se ajuste a la desviacin relativa antes mencionada. El contenido se establecer efectuando la media de varias inyecciones. 4.4. Expresin de los resultados. Los resultados se expresarn en ppm (mg/kg). El lmite de deteccin del mtodo es de 0,01 mg/kg.

ANEXO XIII 1. NEUTRALIZACIN Y DECOLORACIN DEL ACEITE DE OLIVA EN LABORATORIO. (Modificado por el Reglamento (CE) 183/93) 1.1. Neutralizacin del aceite 1.1.1. Equipo vaso de 300 ml de forma alta, centrfuga con tubos de 100 ml, vaso de 250 ml, matraces de 100 ml, ampolla de decantacin de 1 litro. 1.1.2. Reactivos solucin acuosa de hidrxido de sodio al 12 %, solucin etanlica al 1 % de fenolftalena, hexano para anlisis, alcohol isoproplico puro para anlisis.

REACTIVO Alcohol isoproplico puro para anlisis Hexano para anlisis Hidrxido de sodio Solucin etanlica al 1 % de fenolftalena

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131090 2-Propanol PA-ACS-ISO 132063 n-Hexano PA-ACS 131687 Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO 281327 Fenolftalena solucin 1% RV

49

50

1.1.3. Modo de operar a) Aceites de acidez expresada en cido oleico inferior al 30% Introducir en un vaso de 300 ml de forma alta, 50 g de aceite bruto y calentar a 65C al bao Mara. Agitar lentamente, y aadir una cantidad de solucin de hidrxido de sodio al 12% que corresponda a la acidez libre del aceite con un exceso del 5%. Continuar agitando durante cinco minutos, manteniendo la temperatura a 65C. Trasladar el total a unos tubos de centrfuga de 100 ml, separar la masa jabonosa por centrifugacin. Verter el aceite decantado en un vaso de 250 ml y lavar con 50-60 ml de agua destilada hirviendo eliminando durante este proceso la capa acuosa con la ayuda de un sifn. Repetir los lavados hasta eliminar completamente los restos de jabn residual (desaparicin de la coloracin rosa en la fenolftalena). Centrifugar el aceite para eliminar las pequeas cantidades de agua residual. b) Aceites de acidez expresada en cido oleico superior al 30% Introducir en una ampolla de decantacin de un litro, 50 g de aceite bruto, 200 ml de hexano, 100 ml de alcohol isoproplico y una cantidad de solucin de hidrxido de sodio al 12% que corresponda a la acidez libre del aceite, con un exceso del 0,3%. Agitar enrgicamente durante un minuto. Aadir 100 ml de agua destilada, agitar de nuevo y dejar reposar. Despus de la separacin de las capas, dejar salir la capa inferior que contiene los jabones. Entre ambas capas (aceitosa por encima y acuosa por debajo) se forma frecuentemente una capa intermedia constituida por muclagos y sustancias insolubles que deber eliminarse igualmente. Proceder a continuacin al lavado de la solucin hexnica de aceite neutro con porciones de 50-60 ml de una solucin de alcohol isoproplico/agua destilada 1/1 (v/v) hasta la desaparicin de la coloracin rosa en la fenolftalena. Proceder a continuacin a la eliminacin completa del hexano por destilacin en vaco (por ejemplo, en el rotavapor). 1.2. Decoloracin del aceite neutro 1.2.1. Equipo matraz de 250 ml con 3 bocas que permitan la insercin de: a) un termmetro graduado en grados que permita hacer lecturas hasta 90C, b) un agitador mecnico que gire a 250-300 vueltas por minuto equipado para el funcionamiento en vaco, c) un rcor hacia la bomba de vaco, bomba de vaco, provista de un manmetro, capaz de lograr presiones residuales de 15-30 milibares.

1.2.2. Modo de operar Pesar en el matraz de 3 bocas cerca de 100 g del aceite neutralizado. Insertar el termmetro y el agitador, volver a unir a la bomba de vaco y calentar hasta 90C agitndolo. Mantener dicha temperatura, siempre bajo agitacin, hasta que el aceite que deba analizarse est completamente liberado de su humedad (treinta minutos aproximadamente). Interrumpir entonces el vaco y aadirle 2 a 3 g de tierra activada. Restablecer el vaco hasta obtener una presin residual de 15-30 milibares y, siempre con una temperatura de 90C, agitar durante 30 minutos a 250 vueltas por minuto aproximadamente. Filtrar a continuacin en caliente en un bao termoesttico (50-60C).

ANEXO XIV NOTAS COMPLEMENTARIAS 2, 3 Y 4 DEL CAPTULO 15 DE LA NOMENCLATURA COMBINADA (Modificado por los Reglamentos (CE) N 183/93, (CE) N 174/94, (CE) 656/95, (CE) N 2472/97 y (CE) N 2248/98) 1. Nota 2A: Slo pertenecern a las partidas nos 1509 y 1510 aceites que procedern exclusivamente del tratamiento de las aceitunas y cuyas caractersticas analticas relativas al contenido de cidos grasos y esteroles, establecidas mediante los mtodos que figuran en los anexos V, X A y X B del Reglamento (CEE) n 2568/91, sean las siguientes: Cuadro I Contenido de cidos grasos en porcentaje de los cidos grasos totales cidos grasos cido mirstico cido linolnico (1) cido araqudico cido eicosenoico cido behnico (2) cido lignocrico Porcentajes 0,05 0,9 0,6 0,4 0,3 0,2

(1) 1,0 para los aceites de oliva virgen de las subpartidas 1509 10 10 y 1509 10 90 originarios de Marruecos hasta el 31 de octubre de 2001. (2) 0,2 para los aceites del n 1509

M
Cuadro II Contenido de esteroles en porcentaje del total de esteroles Esteroles Colesterol Brasicasterol (1) Campesterol Estigmasterol (2) Beta-sitosterol (3) Delta-7-estigmasterol Porcentajes 0,5 0,1 4,0 < Campesterol 93,0 0,5 1) un ndice de perxido igual o superior a 20 meq de oxgeno activo/kg; 2) un contenido de disolventes halogenados voltiles totales superior a 0,20 mg/kg o por lo menos uno de ellos, superior a 0,10 mg/kg; 3) un coeficiente de extincin K270 superior a 0,25 y, tras el tratamiento del aceite con almina activada, no superior a 0,11; en efecto, algunos aceites con un contenido de cidos grasos libres, expresado en cido oleico, superior a 3,3 g por 100 g podrn tener, tras el paso por almina activada, con arreglo al mtodo indicado en el Anexo IX del Reglamento (CEE) N 2568/91, un coeficiente de extincin K270 superior a 0,10; en ese caso, tras la neutralizacin y decoloracin efectuadas en laboratorio con arreglo al mtodo indicado en el Anexo XIII del Reglamento antes mencionado, debern tener las siguientes caractersticas: un coeficiente de extincin K270 no superior a 1,20, una variacin (K) del coeficiente de extincin alrededor de 270 nm superior a 0,01 pero no a 0,16, es decir: K = Km 0,5 (Km-4 + Km+4) Km = es el coeficiente de extincin a la longitud de onda del vrtice mximo de la curva de absorcin alrededor de 270 nm, Km-4 y Km+4 = son los coeficientes de extincin a las longitudes de onda inferiores y superiores en 4 nm a la de Km; 4) caractersticas organolpticas que revelen defectos perceptibles con una intensidad superior al lmite de aceptabilidad y con un resultado de anlisis sensorial inferior a 3,5 con arreglo a la puntuacin contemplada en el anexo XII del Reglamento (CEE) n 2568/91. II. Se considerar "otro aceite de oliva virgen", tal como figura en la subpartida 1509 10 90, el aceite de oliva que presente las siguientes caractersticas: a) una acidez, expresada en cido oleico, no superior a 3,3 g/100 g; b) un ndice de perxidos no superior a 20 meq de oxgeno activo/kg; c) un contenido de ceras no superior a 250 mg/kg; d) un contenido de solventes halogenados voltiles totales no superior a 0,20 mg/kg y cada uno de ellos con un contenido no superior a 0,10 mg/kg; e) un coeficiente de extincin K270 no superior a 0,25 y, tras el paso del aceite por almina activada no superior a 0,10; f) una variacin del coeficiente de extincin (K) en la zona de 270 nm no superior a 0,01; g) caractersticas organolpticas que revelen defectos perceptibles con una intensidad inferior al lmite de aceptabilidad, con un resultado de anlisis

(1) 0,2 para los aceites de los cdigos NC 1510 (2) Condicin no vlida para el aceite de oliva virgen lampante (subpartida 1509 10 10) ni para el aceite de orujo de oliva en bruto (subpartida 1510 00 10). (3) Delta-5,23-estigmastadienol + clerosterol + Beta-sitosterol + sitostanol + Delta-5 avenasterol + Delta 5,24-estigmastadienol. No pertenecern a las partidas 1509 y 1510 los aceites de oliva modificados qumicamente (en particular, los aceites reesterificados) ni las mezclas de aceite de oliva con aceite de otro tipo. La presencia de aceite de oliva reesterificado o de aceites de otro tipo se determinar mediante el mtodo indicado en el anexo VII del Reglamento (CEE) n 2568/91. Nota 2B: Slo pertenecern a la subpartida 1509 10 los aceites de oliva definidos en los puntos I y II siguientes, obtenidos nicamente por procedimientos mecnicos o por otros procedimientos fsicos, en condiciones, especialmente trmicas, que no alteren el aceite, y que no hayan sido sometidos a ms tratamiento que el lavado, la decantacin, el centrifugado y la filtracin. Los aceites obtenidos a partir de la oliva mediante solventes pertenecern a la partida 1510. I. Se considerar aceite de oliva virgen lampante, tal como figura en la subpartida 1509 10 10 y cualquiera que sea su acidez, el aceite que presente: a) un contenido de ceras no superior a 350 mg/kg; b) un contenido de eritrodiol + uvaol no superior a 4,5%; c) un contenido de cidos grasos saturados en la posicin 2 de los triglicridos no superior a un 1,3%; d) la suma de ismeros transoleicos no superior a un 0,10% y la suma de ismeros translinoleicos + translinolnicos no superior a un 0,10%; e) un contenido de estigmastadieno no superior a 0,50 mg/kg; f) una diferencia entre la composicin segn la HPLC y la composicin terica de los triglicridos de ECN42 no superior a 0,3; y g) una o varias de las siguientes caractersticas:

51

sensorial igual o superior a 3,5, con arreglo a lo dispuesto en el anexo XII del Reglamento (CEE) n 2568/91; h) un contenido de eritrodiol + uvaol no superior a 4,5%; ij) un contenido de cidos grasos saturados en la posicin 2 de los triglicridos no superior a un 1,3%; k) la suma de ismeros transoleicos no superior a un 0,05% y la suma de ismeros translinoleicos + translinolnicos no superior a un 0,05%; l) un contenido de estigmastadienos no superior a 0,15 mg/kg; m) una diferencia entre la composicin segn la HPLC y la composicin terica de los triglicridos de ECN42 no superior a 0,2. Nota 2C: Pertenecer a la subpartida 1509 90 el aceite de oliva obtenido por tratamiento de los aceites de las subpartidas 1509 10 10 y/o 1509 10 90, incluso con adicin de aceite de oliva virgen, que presente las caractersticas siguientes: a) una acidez, expresada en cido oleico, no superior a 1,5 g/100 g; b) un contenido de ceras no superior a 350 mg/kg; c) un coeficiente de extincin K270 no superior a 1,0; d) una variacin del coeficiente de extincin (K) en la zona de 270 nm no superior a 0,13; e) un contenido de eritrodiol + uvaol no superior a 4,5%; f) un contenido de cidos grasos saturados en la posicin 2 de los triglicridos no superior a un 1,5%; g) la suma de los ismeros transoleicos no superior a un 0,20% y la suma de ismeros translinoleicos + translinolnicos no superior a un 0,30%; h) una diferencia entre la composicin segn la HPLC y la composicin terica de los triglicridos de ECN42 no superior a 0,3. Nota 2D: Se considerarn "aceites crudos", tal como figuran en la subpartida 1510 00 10, los aceites, principalmente los aceites de orujo de oliva, que presenten las siguientes caractersticas: a) una acidez, expresada en cido oleico, superior a 0,5 g/100 g; b) un contenido de eritrodiol + uvaol igual o superior a un 12%; c) un contenido de cidos grasos saturados en la posicin 2 de los triglicridos no superior a un 1,8%; d) la suma de los ismeros transoleicos no superior a un 0,20% y la suma de los ismeros translinoleicos + translinolnicos no superior a un 0,10%. e) una diferencia entre la composicin segn la HPLC y la composicin terica de los triglicridos de ECN42 no superior a 0,6.

Nota 2E: Pertenecern a la subpartida 1510 00 90 los aceites obtenidos por tratamiento de los aceites de la subpartida 1510 00 10, incluso con adicin de aceites de oliva virgen, y los que no presenten las caractersticas de los aceites contemplados en las notas complementarias 2 B, 2 C y 2 D. Los aceites de la presente subpartida deben tener un contenido de cidos grasos saturados en la posicin 2 de los triglicridos no superior a un 2,0%, la suma de ismeros transoleicos inferior a un 0,40% y la de los ismeros translinoleicos + translinolnicos inferior a un 0,35% y una diferencia entre la composicin segn la HPLC y la composicin terica de los triglicridos de ECN42 no superior a 0,5. 2. Nota 3: Se excluirn de las subpartidas 1522 00 31 y 1522 00 39: a) los residuos procedentes del tratamiento de grasas que contengan aceite cuyo ndice de yodo, determinado por el mtodo que figura en el anexo XVI del Reglamento (CEE) n 2568/91, sea inferior a 70 o superior a 100; b) los residuos procedentes del tratamiento de grasas que contengan aceite cuyo ndice de yodo est comprendido entre 70 y 100, pero en los que la superficie del pico correspondiente al tiempo de retencin de beta-sitosterol (1), determinada con arreglo a lo dispuesto en el anexo V del Reglamento (CEE) n 2568/91, presenta menos del 93,0% de la superficie total de los picos de los esteroles. 3. Nota 4: Los mtodos que debern aplicarse para determinar las caractersticas de los productos antes mencionados son los contemplados en los anexos del Reglamento (CEE) n 2568/91. A tal fin, tambin habr que tener en cuenta las notas a pie de pgina del anexo I del citado Reglamento. (1) Delta-5,23-estigmastadienol + clerosterol + Beta-sitosterol + sitostanol + Delta-5-avenasterol + Delta-5,24-estigmastadienol..

ANEXO XV 1. CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE ACEITUNA 1.1. Material aparato de extraccin apropiado tipo soxhlet, provisto de un matraz de 200 a 250 ml, bao por calefaccin elctrica (bao de arena, bao de agua, etc.) o placa calefactora, balanza analtica, estufa regulada a 80C como mximo, estufa de calefaccin elctrica provista de un dispositivo de termorregulacin regulada a 103C 2C y que permita realizar una insuflacin de aire o una presin reducida,

52

M
triturador mecnico fcil de limpiar y que permita el triturado del orujo sin calentamiento y sin disminucin sensible de su contenido en agua y en aceite, cartucho de extraccin y algodn hidrfilo o papel filtro, exentos de productos extrables por el hexano, (Consultar Tarifa Panreac. Filtracin-Cartuchos de extraccin) desecador, criba con agujeros de 1 mm de dimetro, piedra pmez en pequeos granos, previamente secada. Recomendacin Panreac: 211835 Piedra Pmez grnulos QP. 1.2. Reactivo n-hexano tcnico cuyo residuo en evaporacin completa deber ser inferior a 0,002 g para 100 ml.

REACTIVO n-hexano tcnico

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 132063 n-Hexano PA-ACS

2. MODO DE OPERAR 2.1. Preparacin de la muestra para ensayo Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador mecnico, previamente bien limpio, para reducirla a partculas que puedan atravesar completamente la criba. Utilizar aproximadamente una vigsima parte de la muestra para completar la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo, mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora. 2.2. Toma de muestra Pesar inmediatamente despus del triturado, alrededor de 10 g de la muestra para ensayo con una aproximacin de 0,01 g. 2.3. Preparacin del cartucho de extraccin Colocar la toma de muestra en el cartucho y taparlo con el tampn de algodn hidrfilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la muestra molida en dicho papel. 2.4. Presecado Cuando el orujo est muy hmedo (contenido en agua y en materias voltiles superior al 10%), efectuar un presecado colocando durante un tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa calentada a 80C como mximo, para llevar el contenido en agua y en materias voltiles por debajo del 10%. 2.5. Preparacin del matraz Pesar con aproximacin de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de piedra pmez, previamente secado en la estufa a 103C 2C y despus enfriado durante al menos una hora en el desecador. 2.6. Primera extraccin Colocar en el aparato de extraccin el cartucho (o el papel de filtro) que contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano. Adaptar el matraz al aparato de extraccin y colocarlo todo sobre la placa calefactora. Llevar la calefaccin a tal estado que el caudal de reflujo sea al

menos de tres gotas por segundo (ebullicin moderada, no tumultuosa). Despus de cuatro horas de extraccin, dejar enfriar. Quitar el cartucho del aparato de extraccin y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la mayor parte del disolvente que lo impregna. 2.7. Segunda extraccin Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea posible. Colocar de nuevo cuantitativamente la mezcla en el cartucho y sta en el aparato de extraccin. Empezar de nuevo la extraccin durante dos horas ms, utilizando el mismo matraz conteniendo la primera extraccin. La solucin obtenida en el matraz de extraccin deber ser lmpida. Si no fuere as, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer matraz y el papel de filtro con hexano. Recoger el filtrado y el disolvente en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadamente a 1 mg. 2.8. Eliminacin del disolvente y pesada del extracto Eliminar en el equipo de extraccin la mayor parte del disolvente. Eliminar los ltimos restos de ste calentando el matraz en la estufa a 103C 2C durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminacin, ya sea insuflando aire de vez en cuando o preferiblemente un gas inerte, o actuando bajo una presin reducida. Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y pesarlo con una precisin de 1 mg aproximadamente. Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones, dejar enfriar en el desecador y pesar. La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas deber ser inferior o igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante perodos de diez minutos seguidos de enfriamiento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a lo sumo, de 10 mg. Seleccionar la ltima pesada del matraz. Efectuar dos determinaciones.

53

3. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS 3.1. Modo de clculo y frmula a) El extracto expresado en peso del producto tal cual ser igual a: 100 S = m1 x mo donde: S es el porcentaje en peso del extracto del producto tal cual, m0 es el peso, en gramos, de la muestra, m1 es el peso, en gramos, del extracto seco.

2. DEFINICIN A los fines de la presente norma internacional, se aplicar la definicin siguiente: 2.1 ndice de yodo: el peso de yodo absorbido por la muestra en las condiciones de trabajo que se especifican en la presente norma internacional. El ndice de yodo se expresa en gramos de yodo por 100 g de muestra. 3. PRINCIPIO Disolucin de la muestra problema y adicin de reactivo de Wijs. Una vez transcurrido el tiempo que se especifica, adicin de solucin acuosa de yoduro potsico y valoracin del yodo liberado con solucin de tiosulfato sdico. 4. REACTIVOS Todos los reactivos sern de calidad analtica reconocida. 4.1. Yoduro potsico, solucin de 100 g/l, exento de yodatos o de yodo libre. 4.2. Engrudo de almidn. Mezclar 5 g de almidn soluble con 30 ml de agua, aadir esta mezcla a 1 000 ml de agua en ebullicin, hervir durante 3 minutos y dejar enfriar. 4.3. Solucin volumtrica patrn de tiosulfato sdico. c (Na2S2O3. 5H2O) = 0,1 mol/l, valorada como mximo 7 das antes de su uso. 4.4 Disolvente, preparado mezclando volmenes iguales de ciclohexano y cido actico. 4.5. Reactivo de Wijs, que contenga monocloruro de yodo en cido actico. Se utilizar reactivo de Wijs comercializado. Nota: El reactivo contiene 9 g de ICl3 + 9 g de I en cido actico.

Tomar como resultado la media aritmtica de las dos determinaciones, si las condiciones de repetitividad se cumplen. Expresar el resultado con un solo decimal. b) El extracto se relacionar con la materia seca utilizando la siguiente frmula: 100 S x = % grasa sobre extracto seco 100 U donde: S es el porcentaje en peso de extracto del producto tal cual ver a), U es su contenido en agua y en materias voltiles.

3.2. Repetitividad La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas simultneamente o rpidamente la una a continuacin de la otra mediante el mismo anlisis, no deber ser superior a 0,2 g de extracto de hexano por cada 100 g de muestra. En caso contrario, repetir sobre otras dos tomas de muestra. Si esta vez la diferencia es de nuevo superior a 0,2 g tomar como resultado la media aritmtica de las cuatro determinaciones efectuadas.

ANEXO XVI DETERMINACIN DEL NDICE DE YODO

54

1. OBJETO La presente norma internacional especifica un mtodo para la determinacin del ndice de yodo de las grasas y aceites animales y vegetales, en lo sucesivo denominados grasas.

M
REACTIVO cido actico Almidn soluble Ciclohexano Engrudo de almidn Solucin volumtrica patrn de tiosulfato sdico Yoduro potsico, solucin de 100 g/l Reactivo de Wijs RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 131008 cido Actico glacial PA-ACS-ISO 121096 Almidn de Patata soluble PA 131250 Ciclohexano PA-ACS-ISO 283146 Almidn solucin 1% RV 181723 Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l (0,1N) SV 171543 Potasio Yoduro solucin 10% p/v RE 281590 Reactivo de Wijs 0,1 mol/l (0,2N) RV

5. MATERIAL Material ordinario de laboratorio y, en particular, lo siguiente: 5.1. Navecillas de vidrio, apropiadas para la muestra problema y que puedan introducirse en los matraces (5.2). 5.2. Matraces erlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca esmerilada, provistos de sus correspondientes tapones de vidrio y perfectamente secos. 6. PREPARACIN DE LA MUESTRA QUE DEBER ANALIZARSE. Secar la muestra homogeneizada con sulfato sdico y filtrarla. 7. PROCEDIMIENTO 7.1. Tamao de la muestra El peso de la muestra vara en funcin del ndice de yodo previsto, como se indica en el cuadro 1. Cuadro 1 ndice de yodo previsto menos de 5 5 - 20 21 - 50 51 - 100 101 - 150 151 - 200 Peso de la muestra problema 3,00 g 1,00 g 0,40 g 0,20 g 0,13 g 0,10 g

deber utilizarse la boca para pipetear el reactivo de Wijs. Preparar del mismo modo un ensayo en blanco con el disolvente y el reactivo, pero sin la muestra problema. Para las muestras con un ndice de yodo inferior a 150, mantener los matraces en la oscuridad durante 1 hora; para las muestras con un ndice de yodo superior a 150, as como en el caso de productos polimerizados o considerablemente oxidados, mantener en la oscuridad durante 2 horas. Una vez transcurrido el tiempo correspondiente, agregar a cada uno de los matraces 20 ml de solucin de yoduro potsico (4.1) y 150 ml de agua. Valorar con la disolucin de tiosulfato sdico (4.3) hasta que haya desaparecido casi totalmente el color amarillo producido por el yodo. Aadir unas gotas de engrudo de almidn (4.2) y continuar la valoracin hasta el momento preciso en que desaparezca el color azul despus de una agitacin muy intensa. Nota: Se permite la determinacin potenciomtrica del punto final. 7.3. Nmero de determinaciones Efectuar 2 determinaciones de la muestra problema. 8. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS El ndice de yodo se expresa del siguiente modo: 12,69 c (V1 V2) p siendo: c : valor numrico de la concentracin exacta, expresada en moles por litro, de la solucin volumtrica patrn de tiosulfato sdico (4.3) utilizada; V1: valor numrico del volumen, expresado en mililitros, de la solucin de tiosulfato sdico (4.3) utilizada para el ensayo en blanco; V2: valor numrico del volumen, expresado en mililitros, de la solucin de tiosulfato sdico

Pesar la muestra problema con precisin de 0,1 mg en una navecilla cpsula de pesadas de vidrio 5.1. 7.2. Determinacin Introducir la muestra problema en un matraz de 500 ml (5.2). Aadir 20 ml del disolvente (4.4) para disolver la grasa. Agregar exactamente 25 ml del reactivo de Wijs (4.5), tapar el matraz, agitar el contenido y colocar el matraz al abrigo de la luz. No

55

(4.3) utilizada para la determinacin; p: valor numrico del peso, expresado en gramos, de la muestra problema (7.1). Se tomar como resultado la media aritmtica de las dos determinaciones, siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetibilidad.

ANEXO XVII MTODO PARA LA DETERMINACIN DE ESTIGMASTADIENOS EN LOS ACEITES VEGETALES 1. OBJETIVOS Determinacin de estigmastadienos en los aceites vegetales que presentan bajas concentraciones de dichos hidrocarburos, particularmente en el aceite de oliva virgen y en el aceite de orujo de oliva sin refinar. 2. APLICACIN Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal, teniendo en cuenta que nicamente se obtendrn medidas fiables cuando el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de 0,01 a 4,0 mg/kg. El mtodo resulta especialmente adecuado para detectar la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva, orujo de oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite de oliva virgen, dado que los aceites refinados contienen estigmastadienos y los aceites vrgenes no. 3. FUNDAMENTO Aislamiento de la materia insaponificable. Separacin de la fraccin de hidrocarburos esteroideos mediante cromatografa en columna de gel de slice y anlisis mediante cromatografa de gases en columna capilar. 4. INSTRUMENTAL 4.1. Matraces de 250 ml aptos para colocarles un refrigerante de reflujo. 4.2. Embudos de decantacin con capacidad para 500 ml. 4.3. Matraces de fondo redondo de 100 ml. 4.4. Rotavapor. 4.5. Columna de vidrio para cromatografa (1,52,0 cm de dimetro interno por 50 cm de longitud) provista de una llave de tefln y con una torunda de lana de vidrio o un disco de vidrio unterizado en el fondo. Para preparar la columna de gel de slice se vierte hexano en la columna de cromatografa hasta

que alcance una altura de aproximadamente 5 cm, llenndose a continuacin con una papilla de gel de slice en hexano (15 g en 40 ml) mediante la ayuda de varias porciones de hexano. Se deja sedimentar la mezcla en reposo, completndose la sedimentacin aplicando una ligera vibracin. Aadir sulfato sdico anhidro hasta una altura de aproximadamente 0,5 cm y finalmente eluir el exceso de hexano. Recomendacin Panreac: 727401 Columna para cromatografa "flash" con adaptador y vlvula de tefln. 20 mm ID x 400 mm longitud. 718002 Fibra de vidrio silanizada. 4.6. Cromatgrafo de gases equipado con detector de ionizacin de llama, inyector con divisin de flujo o "cold on -column" y horno programable con precisin de 1C. 4.7. Columna capilar de slice fundida (0,25 o 0,32 mm de dimetro interno x 25 m de longitud), recubierta con una pelcula de 0,25 m de espesor de la fase 5%-fenilmetilsilicona. Nota 1. Pueden utilizarse otras columnas con polaridades similares o inferiores. Recomendacin Panreac: 726022.25 Columna capilar para GC, OPTIMA 17, 25 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor 4.8. Integrador-registrador con capacidad para modo de integracin valle-valle. 4.9. Microjeringa de 5-10 l para cromatografa de gases con aguja fija. 4.10. Calentador de tipo manta o placa elctrica. 5. REACTIVOS Salvo indicacin en sentido contrario, nicamente se utilizarn reactivos de calidad para anlisis. Debe emplearse agua destilada o de pureza al menos equivalente. 5.1. Hexano o una mezcla de alcanos con un intervalo de ebullicin de 65-70C, destilados en columna rectificadora. Nota 2. El disolvente debe destilarse para eliminar impurezas. 5.2. Etanol de 96 v/v. 5.3. Sulfato sdico anhidro. 5.4. Solucin alcohlica de hidrxido potsico al 10%. Aadir 10 ml de agua a 50 g de hidrxido potsico, agitar y diluir seguidamente la mezcla en etanol hasta un volumen de 500 ml. Nota 3. La potasa alcohlica toma color marrn con el tiempo. Debe prepararse diariamente y se almacenar en botellas de vidrio oscuro cerradas hermticamente. 5.5 Gel de slice 60 para columna de cromatografa, de 70-230 mallas (referencia 7734 de Merck o similar).

56

M
Recomendacin Panreac: 815330 Adsorbente de slica 60, 0,063-0,2 mm. Nota 4. Por lo general, el gel de slice puede utilizarse directamente a partir del envase sin necesidad de tratamiento. Sin embargo, algunos lotes de slice pueden presentar baja actividad produciendo separaciones cromatogrficas inadecuadas. Cuando ello ocurra debe tratarse el gel de slice de la siguiente manera: activar el gel calentndolo a 550C durante un mnimo de cuatro horas. Tras el calentamiento poner el gel de slice a enfriar en un desecador y trasvasarlo a continuacin a un matraz con cierre hermtico. Se aade seguidamente un 2% de agua agitando hasta que dejen de verse grumos y el polvo fluya libremente. Si algn lote de gel de slice origina cromatogramas con picos que interfieran, dicho gel ser sometido al tratamiento anteriormente mencionado. Puede considerarse como alternativa la utilizacin de gel de slice 60 extrapuro (referencia 7754 de Merck). Recomendacin Panreac: 711037.1000 POLYGOPREP 60-130, tamao part.63-200 m 5.6. Solucin madre (200 ppm) de colesta-3,5dieno (Sigma, 99 % de pureza) en hexano (10 mg en 50 ml). 5.7. Solucin patrn de colesta-3,5-dieno en hexano con una concentracin de 20 ppm, que se obtiene diluyendo la solucin anterior. Nota 5. Si se mantiene la temperatura por debajo de 4C, las soluciones 5.6 y 5.7 permanecern inalteradas durante un mnimo de 4 meses. 5.8. Solucin de n-nonacosano en hexano con una concentracin aproximada de 100 ppm. 5.9. Gas portador para cromatografa: helio o hidrgeno de 99,9990 % de pureza. 5.10. Gases auxiliares para el detector de ionizacin de llama: aire purificado e hidrgeno de 99,9990 % de pureza.

REACTIVO Etanol de 96 v/v Etanol Hexano Hidrxido potsico Sulfato sdico anhidro

RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 121085 Etanol 96% v/v PA 132063 121515 131716 n-Hexano PA-ACS Potasio Hidrxido 85% lentejas PA Sodio Sulfato anhidro PA-ACS-ISO

6. METODOLOGA 6.1. Preparacin de la materia insaponificable: 6.1.1. Pesar 20 0,1 g de aceite en un matraz de 250 ml (4.1), aadir 1 ml de solucin patrn de colesta-3,5-dieno (20 g) y 75 ml de potasa alcohlica al 10%, colocar un refrigerante de reflujo y calentar a ebullicin suave durante 30 minutos. Retirar de la fuente de calor el matraz con la muestra y dejar enfriar ligeramente la solucin (el enfriamiento no debe ser total para evitar la decantacin de la muestra). Aadir 100 ml de agua y pasar la solucin a un embudo de decantacin (4.2) con ayuda de 100 ml de hexano. Agitar enrgicamente durante 30 segundos y dejar decantar. Nota 6. Si se produce emulsin, que no desaparece rpidamente, aadir pequeas cantidades de etanol. 6.1.2. Pasar la fase acuosa inferior a un segundo embudo de decantacin y someterla nuevamente a extraccin con 100 ml de hexano. Separar nuevamente la fase inferior y lavar los extractos de hexano (mezclndolos en otro embudo de decantacin) con tres porciones de 100 ml cada una de una

mezcla de agua y etanol (1:1) hasta obtener un pH neutro. 6.1.3. Pasar la solucin de hexano a travs de sulfato sdico anhidro (50 g), lavar con 20 ml de hexano y evaporar a 30C y presin reducida en un rotavapor hasta sequedad. 6.2. Separacin de la fraccin de hidrocarburos esteroideos: 6.2.1. Introducir el residuo en la columna de fraccionamiento con ayuda de dos porciones de 1 ml de hexano, distribuir la muestra en la columna dejando que el nivel de solucin descienda hasta la parte superior del sulfato de sodio y comenzar la elucin cromatogrfica con hexano a un flujo aproximado de 1 ml/min. Desechar los primeros 25-30 ml de eluido y recoger la fraccin siguiente de 40 ml. Despus, pasar esta fraccin a un matraz de fondo redondo de 100 ml (4.3). Nota 7. La primera fraccin contiene los hidrocarburos saturados (Figura 1a) y la segunda fraccin los esteroideos. Al proseguir con la elucin se obtiene escualeno y otros compuestos relacionados. Para poder obtener una buena separacin entre los hidrocarburos saturados y los esteroideos, es nece-

57

58

sario optimizar los volmenes de las fracciones. A tal efecto se debe ajustar el volumen de la primera fraccin de tal manera que cuando se analice la segunda, los picos correspondientes a los hidrocarburos saturados sean bajos (Figura 1c); cuando estos no aparezcan pero la intensidad del pico correspondiente al patrn sea reducida, debe disminuirse el volumen. De todas formas, puesto que no se produce solapamiento de los picos durante la cromatografa de gases, no es precisa una separacin completa entre los componentes de la primera y segunda fracciones siempre que las condiciones de la CG estn ajustadas como se indica en 6.3.1. Por lo general no es necesario optimizar el volumen de la segunda fraccin, puesto que existe una buena separacin con los componentes que eluyen posteriormente. Sin embargo, la presencia de un pico importante a 1,5 min, aproximadamente, por debajo del tiempo de retencin del patrn se debe al escualeno y revela una mala separacin. 6.2.2. Evaporar la segunda fraccin en rotavapor a 30C y presin reducida hasta sequedad. Disolver inmediatamente el residuo en 0,2 ml de hexano y mantener la solucin en el refrigerador hasta el momento de su anlisis. Nota 8. Los residuos 6.1.3 y 6.2.2 no deben mantenerse en seco a temperatura ambiente. Una vez obtenidos, es necesario aadirles disolvente y almacenarlos en un refrigerador. 6.3. Cromatografa de gases 6.3.1. Condiciones de trabajo para inyeccin con divisin de flujo. temperatura del inyector: 300C, temperatura del detector: 320C. integrador-registrador: los parmetros de integracin deben ser fijados de tal forma que la evaluacin de las reas sea correcta. La modalidad de integracin valle-valle es la ms recomendable, sensibilidad: aproximadamente 16 veces la atenuacin mnima, cantidad de disolucin inyectada: 1l, programacin de la temperatura del horno: temperatura inicial constante de 235C durante 6 minutos, seguida de un aumento gradual de 2C/min hasta alcanzar 285C, inyeccin con una divisin de flujo de 1: 15, gas portador: helio o hidrgeno a 120 kPa de presin. Dichas condiciones pueden modificarse en funcin de las caractersticas del cromatgrafo y de la columna con objeto de obtener cromatogramas que respondan a los siguientes requisitos: Pico del patrn interno situado con una aproximacin de 5 minutos en torno al tiempo citado en 6.3.2; el pico del patrn interno alcanzar, como mnimo, un 80% de la escala total. El sistema de cromatografa de gases deber comprobarse inyectando una mezcla de la solucin

madre de colestadieno (5.6) y de n-nonacosano (5.8). El pico del colesta-3,5-dieno deber aparecer antes que el del n-nonacosano (figura 1c); si esto no ocurre, pueden adoptarse dos soluciones: reducir la temperatura inicial del horno o sustituir la columna de cromatografa de gases por otra de polaridad inferior. 6.3.2. Identificacin de picos El pico del patrn interno aparece a un tiempo de retencin de, aproximadamente, 19 minutos, y el del estigmasta-3,5-dieno lo hace a un tiempo de retencin relativo de aproximadamente 1,29 (figura 1b). El estigmasta-3,5-dieno suele ir acompaado de pequeas cantidades de un ismero y, por lo general, ambos originan un solo pico cromatogrfico. No obstante, si la columna es demasiado polar, o tiene un gran poder de resolucin, el ismero puede aparecer en forma de un pequeo pico justo antes y cerca del estigmasta-3,5-dieno (figura 2). En estos casos, es preciso sumar las reas de los dos picos. Con el fin de estar seguro que los estigmastadienos eluyen como un solo pico se recomienda sustituir la columna por otra de menor polaridad o de mayor dimetro interior. Nota 9. Para obtener una referencia de los estigmastadienos puede utilizarse el anlisis de cualquier aceite vegetal refinado empleando menor cantidad de muestra (de 1 a 2 g). Los estigmastadienos dan lugar a un pico importante de fcil identificacin. 6.3.3. Anlisis cuantitativo El contenido de los estigmastadienos se determina aplicando la frmula Ab x Mc mg/kg de estigmastadienos = Ac x Mo en la cual: Ab = rea del pico de estigmastadienos (si el pico se halla dividido en dos picos, smese el rea de los dos picos.). Ac = rea del pico del patrn interno (colestadieno). Mc = peso de patrn aadido, en microgramos. Mo = peso de aceite empleado, en gramos. Lmite de 0,01 mg/kg. deteccin: aproximadamente

Figura 1 Cromatogramas procedentes del anlisis de muestras de aceite de oliva en columna capilar de slice fundida (0,25 mm de dimetro interno x 25 m) recubierta con una pelcula de 0,25 mm de grosor de 5%-fenilmetilsilicona. a) Primera fraccin (30 ml) de un aceite virgen marcado con el patrn. b) Segunda fraccin (40 ml) de un aceite de oliva que contiene 0,10 mg/kg de estigmastadienos. c) Segunda fraccin (40 ml) que incluye una pequea proporcin de la primera.

Figura 2 Cromatograma procedente del anlisis de una muestra de aceite de oliva refinado en una columna DB-5, en el que se aprecia el ismero del estigmasta-3,5-dieno.

59

ANEXO XVIII (Reglamento (CE) N 2472/97, modificado por Reglamento (CE) N 282/98) DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE TRIGLICRIDOS CON ECN42 (DIFERENCIA ENTRE EL CONTENIDO TERICO Y LOS DATOS OBTENIDOS POR HPLC) 1. OBJETO Determinacin de la composicin de triglicridos (TG) de los aceites de oliva, expresados en su nmero equivalente de carbonos (ECN) en funcin de las diferencias existentes entre el contenido terico, calculado a partir de la composicin de cidos grasos, y los resultados analticos obtenidos mediante cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC). 2. CAMPO DE APLICACIN La presente norma es aplicable a los aceites de oliva. El mtodo puede utilizarse para detectar la presencia de pequeas cantidades de aceites de semillas (ricos en cido linoleico) en todos los tipos de aceites de oliva. 3. PRINCIPIO El contenido terico de triglicridos con ECN42 (calculado sobre la base de la determinacin de la composicin de cidos grasos mediante GLC) y el contenido de triglicridos con ECN42 determinado mediante HPLC se corresponden dentro de unos lmites en el caso de los aceites puros. Las diferencias superiores a los valores establecidos en el Reglamento respecto a cada tipo de aceite indican que el aceite contiene aceites de semillas. 4. MTODO El mtodo para calcular el contenido terico de triglicridos con ECN42 y su diferencia respecto a los datos obtenidos mediante HPLC consiste esencialmente en coordinar los datos analticos obtenidos por otros mtodos. Pueden distinguirse tres fases: determinacin de la composicin de cidos grasos mediante cromatografa de gases en columna capilar, clculo de la composicin terica de triglicridos con ECN42, y determinacin de los triglicridos con ECN42 mediante HPLC.

4.1.4. Embudos de decantacin de 250 ml, con cono (macho) normalizado en el extremo inferior, para conexin con el extremo superior de la columna. 4.1.5. Varilla de vidrio de 600 mm de longitud. 4.1.6. Embudo de vidrio de 80 mm de dimetro. 4.1.7. Matraces aforados de 50 ml. 4.1.8. Matraces aforados de 20 ml. 4.1.9. Evaporador de rotacin. 4.1.10. Cromatografa de lquidos de alta resolucin, con control termosttico de la temperatura de la columna. 4.1.11. Sistema de inyeccin de volmenes de 10 l. 4.1.12. Detector: refractmetro diferencial. La sensibilidad de toda la escala deber ser como mnimo de 10-4 unidades de ndice de refraccin. 4.1.13. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de dimetro interior, rellena de partculas de slice de 5 m de dimetro con un 22-23% de carbono en forma de octadecilsilano (nota 2). Recomendacin Panreac: 728032.46 Columna para HPLC, cartucho Chrom Cart, CC250/4.6 Lichrospher 100 RP18,5 m. 4.1.14. Registrador o integrador. 4.2. Reactivos Los reactivos debern ser de calidad para anlisis. Los disolventes de elucin debern desgasificarse y podrn reciclarse varias veces sin que ello afecte a las separaciones. 4.2.1. ter de petrleo, 40-60C, grado cromatogrfico. 4.2.2. ter etlico, libre de perxidos, recin destilado. 4.2.3. Disolvente de elucin para la purificacin del aceite por cromatografa en columna: mezcla de ter de petrleo/ter etlico 87/13 (v/v). 4.2.4. Gel de slice, 70-230 mallas, tipo Merck 7734, con contenido de agua normalizado al 5% (p/p). 4.2.5. Lana de vidrio. 4.2.6. Acetona. 4.2.7. Acetonitrilo. 4.2.8. Disolvente de elucin para HPLC: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarn para obtener la separacin deseada; comenzar con una mezcla de 50:50). 4.2.9. Disolvente de solubilizacin: acetona. 4.2.10. Triglicridos de referencia: pueden utilizarse triglicridos comerciales (tripalmitina, triolena, etc.), en cuyo caso se reflejarn en un grfico los tiempos de retencin frente al nmero equivalente de carbonos, o bien cromatogramas de referencia correspondientes a aceite de soja, a una mezcla de aceite de soja y aceite de oliva 30:70 y a aceite puro de oliva (vanse las notas 3 y 4 y las figuras 1, 2, 3 y 4).

60

4.1. Aparatos 4.1.1. Matraces redondos de 250 y 500 ml. 4.1.2. Vasos de precipitados de 100 ml. 4.1.3. Columna de cromatografa de vidrio, de 21 mm de dimetro interior y 450 mm de longitud, con grifo y cono (hembra) normalizado en el extremo superior.

M
REACTIVO Acetona Acetonitrilo ter de petrleo, 40-60C, grado cromatogrfico ter etlico Gel de slice, 70-230 mallas Lana de vidrio Tripalmitina RECOMENDACIN PANREAC Cdigo Denominacin 361007 Acetona (UV-IR-HPLC) PAI 261881 Acetonitrilo (HPLC-isocrtico-preparativa) PAI 361315 ter de Petrleo 40-60C (UV) PAI 362551 815330 211376 A10922 ter Dietlico estabilizado con etanol (UV-IR-HPLC) PAI Adsorbente de slica 60, 0,063-0,2 mm Lana de Vidrio lavada QP Glicerol tripalmitato, 98%

4.3. Preparacin de la muestra Como pueden obtenerse falsos resultados positivos debido a la presencia de diversas sustancias que interfieren, la muestra debe someterse siempre a un proceso de purificacin segn el mtodo IUPAC 2.507, relativo a la determinacin de las sustancias polares en los aceites oxidados. 4.3.1. Preparacin de la columna cromatogrfica Llenar la columna (4.1.3) con aproximadamente 30 ml de disolvente de elucin (4.2.3); introducir un poco de lana de vidrio (4.2.5), empujndolo hasta el fondo de la columna con la varilla de vidrio (4.1.5). Preparar en un vaso de precipitados de 100 ml una suspensin con 25 g de gel de slice (4.2.4) en 80 ml de la mezcla de elucin (4.2.3) y transferirla a la columna con ayuda de un embudo de vidrio (4.1.6). Para realizar la transferencia total del gel de slice a la columna, lavar el vaso de precipitados con la mezcla de elucin y pasar tambin los lquidos de lavado a la columna. Abrir el grifo de la columna y dejar que salga el disolvente de ella hasta que su nivel se site aproximadamente 1 cm por encima del gel de slice. 4.3.2. Cromatografa en columna Pesar, con la precisin de 0,001 g, 2,5 0,1 g de aceite previamente filtrado, homogeneizado y, en caso necesario, deshidratado, en un matraz aforado de 50 ml (4.1.7). Disolver en 20 ml aproximadamente de disolvente de elucin (4.2.3). Si es necesario, calentar ligeramente para facilitar la disolucin. Enfriar a temperatura ambiente y enrasar con el disolvente de elucin. Introducir con una pipeta aforada 20 ml de solucin en la columna preparada como se indica en 4.3.1, abrir el grifo y hacer eluir el disolvente hasta el nivel de la capa de gel de slice. Eluir con 150 ml de disolvente de elucin (4.2.3), regulando el flujo de disolvente a 2 ml por minuto aproximadamente (de modo que pasen a travs de la columna 150 ml en 60-70 minutos). Recoger el eluido en un matraz redondo de 250 ml

(4.1.1) previamente tarado y pesado exactamente. Eliminar el disolvente a presin reducida (Rotavapor) y pesar el residuo que se utilizar en la preparacin de la solucin para el anlisis por HPLC y en la preparacin de los steres metlicos. Tras pasar por la columna, debe recuperarse como mnimo un 90% de la muestra en el caso de aceite de oliva de las categoras extravirgen, virgen y refinado ordinario, mientras que en el de los aceites lampantes y de orujo los porcentajes de recuperacin no pueden ser inferiores al 80%. 4.4. Anlisis por HPLC 4.4.1. Preparacin de las muestras para el anlisis cromatogrfico Preparar del siguiente modo una solucin al 5% de la muestra que vaya a analizarse: pesar 0,5 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de 10 ml y enrasar con el disolvente de solubilizacin (4.2.9). 4.4.2. Procedimiento Instalar el sistema cromatogrfico. Bombear el disolvente de elucin (4.2.8) a un ritmo de 1,5 ml/mn para purgar todo el sistema. Esperar hasta que se obtenga una lnea de base estable. Inyectar 10 l de la muestra preparada como se indica en el punto 4.3. 4.4.3. Clculo y expresin de los resultados Utilizar el mtodo de normalizacin interna, es decir, considerar que la suma de las superficies de los picos correspondientes a los distintos triglicridos de ECN entre 42 y 52 es igual al 100%. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicrido mediante la frmula siguiente: % de triglicrido = superficie del pico x 100 / suma de la superficies de los picos. El resultado se expresa con, como mnimo, dos decimales. Nota 1: El orden de elucin puede determinarse mediante el clculo del nmero equivalente de carbonos, que con frecuencia viene dado por la frmula ECN = CN-2n, siendo CN el nmero de carbonos y n el nmero de enlaces dobles; puede calcularse con mayor precisin teniendo en cuenta el origen

61

del enlace doble. Si no, nl y nln son los nmeros de enlaces dobles de los cidos oleico, linoleico y linolnico, respectivamente, el nmero equivalente de carbonos puede calcularse mediante la frmula siguiente: ECN = CN dono dlnl dlnnln, siendo do, dl y dln coeficientes que pueden calcularse mediante los triglicridos de referencia. En las condiciones que se especifican en el presente mtodo la frmula obtenida ser similar a la siguiente: ECN = CN (2,60 no) (2,35 nl) (2,17 nln) Nota 2: Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333 Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 o equivalente. Recomendacin Panreac: 728032.46 Columna para HPLC, cartucho Chrom Cart , CC250/4.6 Lichrospher 100 RP18,5 m. Nota 3: Con varios triglicridos de referencia tambin es posible calcular la resolucin con respecto a la triolena: a= TR' / TR triolena utilizando el tiempo de retencin reducido TR' = TR TR disolvente. La representacin grfica del log a frente a f (nmero de enlaces dobles) permite determinar los valores de retencin de todos los triglicridos de los cidos grasos contenidos en los triglicridos de cido graso (AG) cido palmtico cido palmitoleico cido esterico cido oleico cido linoleico cido linolnico Abreviatura P Po S O L Ln

referencia (figura 2). Nota 4: La resolucin de la columna debe permitir separar claramente el pico de la trilinolena de los picos de los triglicridos con un tiempo de retencin prximo. La elucin se prosigue hasta el pico de ECN52. Nota 5: Para obtener un cromatograma que permita la medicin correcta de las superficies de todos los picos de inters en la presente determinacin, es necesario que el segundo pico correspondiente a ECN50 tenga una altura igual al 50% de la escala completa del registrador. 4.5. Clculo de la composicin de triglicridos (% moles) a partir de los datos de GLC de cidos grasos (% superficie) 4.5.1. Determinacin de la composicin de cidos grasos La composicin de cidos grasos se determina con arreglo al mtodo de cromatografa de gases de la CEE que figura en el Anexo X A del Reglamento (CEE) n 2568/91, utilizando columna capilar. La preparacin de los steres metlicos se realiza segn el Anexo X B (solucin alcohlica de metilato sdico). 4.5.2. cidos grasos considerados para el clculo Los glicridos se agrupan en funcin de su nmero equivalente de carbonos (ECN), teniendo en cuenta las equivalencias que figuran a continuacin entre ECN y cidos grasos. Slo se han considerado los cidos grasos con 16 y 18 tomos de carbono, ya que son los nicos importantes para el aceite de oliva.

Peso molecular (PM) 256,4 254,4 284,5 282,5 280,4 278,4

ECN 16 14 18 16 14 12

4.5.3. Transformacin del % superficie en moles para todos los cidos grasos % sup. P moles P = PM P % sup. S moles S = PM S % sup. Po moles Po = PM Po (1) % sup. O moles O = PM O % sup. L moles L = PM L % sup. Ln moles Ln = PM Ln

62

4.5.5.2. cidos grasos insaturados en la posicin 2 [Po(2), O(2), L(2) y Ln(2)] % moles Po(1,2,3) % moles Po(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)] % moles AGI

% moles O(1,2,3) % moles O(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)] % moles AGI (5) % moles L(1,2,3) % moles L(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)] % moles AGI

% moles Ln(1,2,3) % moles Ln(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)] % moles AGI

4.5.5.3. cidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)] % moles P(1,2,3) % moles P(2) % moles P(1,3) = + % moles P(1,2,3) 2

% moles S(1,2,3) % moles S(2) % moles S(1,3) = + % moles S(1,2,3) 2

% moles Po(1,2,3) % moles Po(2) % moles Po(1,3) = + % moles Po(1,2,3) 2 (6) % moles O(1,2,3) % moles O(2) % moles O(1,3) = + % moles O(1,2,3) 2

% moles L(1,2,3) % moles L(2) % moles L(1,3) = + % moles L(1,2,3) 2

64

% moles Ln(1,2,3) % moles Ln(2) % moles Ln(1,3) = + % moles Ln(1,2,3) 2

M
4.5.6. Clculo de los triglicridos 4.5.6.1. TG con un cido graso (AAA; en este caso, LLL, PoPoPo) % moles A(1,3) * % moles A(2) * % moles A(1,3) % moles AAA = 10 000 4.5.6.2. TG con dos cidos grasos (AAB; en este caso, PoPoL, PoLL) % moles A(1,3) * % moles A(2) * % moles B(1,3) * 2 % moles AAB = 10 000 (8) % moles A(1,3) * % moles B(2) * % moles A(1,3) % moles ABA = 10 000

(7)

4.5.6.3. TG con tres cidos grasos diferentes (ABC; en este caso, OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn)

% moles A(1,3) * % moles B(2) * % moles C(1,3) * 2 % moles ABC = 10 000

% moles B(1,3) * % moles C(2) * % moles A(1,3) * 2 % moles BCA = 10 000

(9)

% moles C(1,3) * % moles A(2) * % moles B(1,3) * 2 % moles CAB = 10 000 Los triglicridos con ECN42 se obtienen mediante la suma de los nueve triglicridos, incluidos sus ismeros de posicin. El resultado se expresa con, como mnimo, dos decimales. 5. EVALUACIN DE LOS RESULTADOS Se comparan el contenido terico calculado y el determinado por HPLC. Si la diferencia entre los datos de HPLC y los datos tericos es superior al valor establecido para la categora correspondiente de aceite en el Reglamento, la muestra contiene aceite de semillas. Nota: Los resultados se expresan con una cifra decimal.

4.5.6.4. Triglicridos con ECN42 Los triglicridos siguientes con ECN42 se calculan segn las ecuaciones 7, 8 y 9, por orden previsto de elucin en HPLC (normalmente slo tres picos). LLL PoLL e ismero de posicin LPoL OLLn e ismeros de posicin OLnL y LnOL PoPoL e ismero de posicin PoLPo PoOLn e ismeros de posicin OPoLn y OLnPo PLLn e ismeros de posicin LLnP y LnPL PoPoPo SLnLn e ismero de posicin LnSLn PPoLn e ismeros de posicin PLnPo y PoPLn

65

6. EJEMPLO (Los numeros hacen referncia a las secciones del texto del mtodo) (4.5.1.) Clculo del porcentaje de moles de los cidos grasos a partir de los datos obtenidos mediante GLC (% superficie) Los datos siguientes de la composicin de cidos grasos se obtienen mediante GLC: AG P PM 256,4 % sup. 10,0 S 284,5 3,0 Po O L Ln 254,4 282,5 280,4 278,4 1,0 75,0 10,0 1,0

0,01054 moles S * 100 % moles S(1,2,3) = = 2,944% 0,35822 moles Vase frmula (2) 0,00393 moles Po * 100 % moles Po(1,2,3) = =1,097% 0,35822 moles Vase frmula (2) 0,26549 moles O *100 % moles O(1,2,3) = =74,113% 0,35822 moles Vase frmula (2) 0,03566 moles L * 100 % moles L(1,2,3) = = 9,956 % 0,35822 moles Vase frmula (2) 0,00359 moles Ln *100 % moles Ln(1,2,3) = =1,003 % 0,35822 moles Vase frmula (2) Total % moles = 100,0 % Suma de los cidos grasos saturados e insaturados en las posiciones 1, 2 y 3 de los TG: % moles AGS = 10,888% + 2,944% = 13,831% Vase frmula (3) % moles AGI = 100,000% 13,831% = 86,169% Vase frmula (3) (4.5.5.) Clculo de la composicin de cidos grasos en las posiciones 2 y 1-3 de los TG (4.5.5.1.) cidos grasos saturados en la posicin 2 [P(2) y S(2)] % moles P(2) = 10,888% * 0,06 = 0,653% moles Vase frmula (4)

(4.5.3.) Transformacin del % superficie en moles para todos los cidos grasos 10 moles P = = 0,03900 moles P 256,4 Vase frmula (1) 3 moles S = = 0,01054 moles S 284,5 Vase frmula (1) 1 moles Po = = 0,00393 moles Po 254,4 Vase frmula (1) 75 moles O = = 0,26549 moles O 282,5 Vase frmula (1) 10 moles L = = 0,03566 moles L 280,4 Vase frmula (1) 1 moles Ln = = 0,003594 moles Ln 278,4 Vase frmula (1) Total = 0,35822 moles TG (4.5.4) Normalizacin al 100% de los cidos grasos

% moles S(2) = 2,944% * 0,06 = 0,177% moles Vase frmula (4)

66

0,03900 moles P * 100 % moles P(1,2,3) = =10,888% 0,35822 moles Vase frmula (2)

M
(4.5.5.2.) cidos grasos insaturados en la posiciones 1 y 3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)] 1,097% % moles Po(2) = * (100 0,659 0,177) = 1,263 % moles Vase frmula (5) 86,169% 74,113% % moles O(2) = * (100 0,659 0,177) = 85,295 % moles 86,169% 9,956% % moles L(2) = * (100 0,659 0,177) = 11,458% moles 86,169% 1,003% % moles Ln(2) = * (100 0,659 0,177) = 1,154% moles 86,169% (4.5.5.3.) cidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)] 10,888 0,659 % moles P(1,3) = + 10,888 = 16,005% moles 2 2,944 0,177 % moles S(1,3) = + 2,944 = 4,327% moles 2 1,097 1,263 % moles Po(1,3) = + 1,097 = 1,015% moles 2 74,113 85,295 % moles O(1,3) = + 74,113 = 68,522% moles 2 9,956 11,458 % moles L(1,3) = + 9,956 = 9,205% moles 2 1,003 1,154 % moles Ln(1,3) = + 1,003 = 0,927% moles 2 (4.5.6) Clculo de triglicridos A partir de la composicin calculada de los cidos grasos en las posiciones sn-2 y sn-1,3 (vase el siguiente cuadro): AG en P S Po O L Ln Suma Posicin 1 y 3 16,005% 4,327% 1,015% 68,522% 9,205% 0,927% 100,0% Posicin 2 0,653% 0,177% 1,263% 85,295% 11,458% 1,154% 100,0%

Vase frmula (5)

Vase frmula (5)

Vase frmula (5)

Vase frmula (6)

Vase frmula (6)

Vase frmula (6)

Vase frmula (6)

Vase frmula (6)

Vase frmula (6)

67

Se calculan los triglicridos siguientes: LLL PoPoPo PoLL con un ismero de posicin SLnLn con un ismero de posicin PoPoL con un ismero de posicin PPoLn con dos ismeros de posicin OLLn con dos ismeros de posicin PLLn con dos ismeros de posicin PoOLn con dos ismeros de posicin (4.5.6.1.) TG con un cido graso (LLL, PoPoPo) 9,205% * 11,458% * 9,205% % moles LLL = = 0,09708 mol LLL 10 000 1,015% * 1,263% * 1,015% % moles PoPoPo = = 0,00013 mol PoPoPo 10 000 (4.5.6.2.) TG con dos cidos grasos (PoLL,SLnLn, PoPoL) 1,015% * 11,458% * 9,205% * 2 % moles PoLL + LLPo = = 0,02141 10 000 9,205% * 1,263% * 9,205% % moles LPoL = = 0,01070 10 000 0,03211 mol PoLL 4,327% * 1,154% * 0,927% * 2 % moles SLnLn + LnLnS = = 0,00093 10 000 0,927% * 0,177% * 0,927% % moles LnSLn = = 0,00002 10 000 0,00095 mol SLnLn Vase frmula (8) Vase frmula (7)

1,015% * 1,263% * 9,205% * 2 % moles PoPoL + LPoPo = = 0,00236 10 000 1,015% * 11,458% * 1,015% % moles PoLPo = = 0,00118 10 000 0,00354 mol PoPoL

(4.5.6.3.) TG con tres cidos grasos diferentes (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)

Vase frmula (9)

68

16,005% * 1,263% * 0,927% * 2 % moles PPoLn = = 0,00375 10 000 0,927% * 0,653% * 1,015% * 2 % moles LnPPo = = 0,00012 10 000

M
1,015% * 1,154% * 16,005% * 2 % moles PoLnP = = 0,00375 10 000 0,00762 mol PPoLn 68,522% * 11,458% * 0,927% * 2 % moles OLLn = = 0,14577 10 000 0,927% * 85,295% * 9,205% * 2 % moles LnOL = = 0,14577 10 000 9,205% * 1,154% * 68,522% * 2 % moles LLnO = = 0,14577 10 000 0,43671 mol OLLn 16,005% * 11,458% * 0,927% * 2 % moles PLLn = = 0,03400 10 000 0,927% * 0,653% * 9,205% * 2 % moles LnPL = = 0,00111 10 000 9,205% * 1,154% * 16,005% * 2 % moles LLnP = = 0,03400 10 000 0,06911 mol PLLn 1,015% * 85,295% * 0,927% * 2 % moles PoOLn = = 0,01605 10 000 0,927% * 1,263% * 68,522% * 2 % moles LnPoO = = 0,01605 10 000 68,522% * 1,154% * 1,015% * 2 % moles OLnPo = = 0,01605 10 000 0,04815 mol PoOLn ECN42 = 0,69540 mol TG

69

Figura 1: Representacin grfica del log alfa frente a f (nmero de enlaces dobles)

Nota: La:cido lurico; My: cido mirstico; P: cio palmtico; St: cido esterico; O: cido oleico L: cido linoleico; Ln: cido linolnico.

70

M
Figura 2: aceite de soja

Figura 3: aceite de soja/aceite de oliva 30/70

Figura 4 : aceite de oliva

71

Relacin de reactivos y productos auxiliares Panreac que se utilizan en los mtodos de Anlisis de Aceites y Grasas

72

M
361007 131007 261881 131881 131008 131019 131020 A17074 131030 131058 121096 283146 121100 A13805 361192 121221 121215 361250 131250 A11470 133606 162714 121085 361315 131315 132770 362551 281327 A10922 142061 A15139 362062 362063 132063 211376 361091 481091 362064 362006 211835 481457 121497 182146 181519 181517 121515 131542 171543 131090 281590 131659 181694 Acetona (UV-IR-HPLC) PAI Acetona PA-ACS-ISO Acetonitrilo (HPLC-isocrtico-preparativa) PAI Acetonitrilo PA-ACS Acido Actico glacial PA-ACS-ISO Acido Clorhdrico 35% PA-ISO cido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO cido clico, sal sdica, 99% cido Frmico 98% PA-ACS Acido Sulfrico 96% PA-ISO Almidn de Patata soluble PA Almidn solucin 1% RV Aluminio xido Bsico PA Aluminio, virutas, 99+% Benceno (UV-IR-HPLC) PAI Calcio Cloruro anhidro, polvo PA Calcio Cloruro 2-hidrato escoriforme PA Ciclohexano (UV-IR-HPLC) PAI Ciclohexano PA-ACS-ISO Colesterol, 99+% 2',7'-Diclorofluorescena PA-ACS Dimetilo Sulfato PS Etanol 96% v/v PA ter de Petrleo 40-60C (UV) PAI Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO Eter Dietlico estabilizado con etanol (UV-IR-HPLC) PAI Fenolftalena solucin 1% RV Glicerol tripalmitato, 98% Goma Arbiga polvo PRS 1,1,1,3,3,3-Hexametildisilazano, 98+% n-Heptano (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI n-Hexano PA-ACS Lana de Vidrio lavada QP Metanol (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI Metanol seco (mx. 0,01% de agua) DS-ACS-ISO iso-Octano (UV-IR-HPLC) PAI n-Pentano (UV-IR-HPLC) PAI Piedra Pmez grnulos QP Piridina seca (mx. 0,01% de agua) DS-ACS Potasio Cromato PA Potasio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) etanlica SV Potasio Hidrxido 0,5 mol/l (0,5N) etanlica SV Potasio Hidrxido 1 mol/l (1N) SV Potasio Hidrxido 85% lentejas PA Potasio Yoduro PA-ACS-ISO Potasio Yoduro solucin 10% p/v RE 2-Propanol PA-ACS-ISO Reactivo de Wijs 0,1 mol/l (0,2N) RV Sodio Cloruro PA-ACS-ISO Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV 182415 131687 131699 131716 181723 131745 131252 A13651 131940 281760 815330.1 Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) SV Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO Sodio metal, barras PA-ACS Sodio Sulfato anhidro PA-ACS-ISO Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l (0,1N) SV Tolueno PA-ACS-ISO Triclorometano estabilizado con etanol PA-ACS-ISO Trimetilclorosilano, 98+% Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS Verde de Bromocresol solucin 0,04% RV

Adsorbente de Slica 60, 0,063 0,2 mm 704048 Cabina de visualizacin UV. 70234 Cpsula de aluminio con disco N 20 TB/oA color aluminio. 731829 Cartucho SPE, Slica gel,CHROMAFIX 400-SiOH, 400 mg 728032.46 Columna para HPLC, cartucho ChromCart, CC250/4.6 Lichrospher 100 RP18,5 m. 733056.25 Columna capilar de slica fundida (fase no enlazada qumicamente) FS-SE-54 de 25 m de longitud, 0,25 mm de ID y 0,25 m de espesor de capa 733060.25 Columna capilar FS-CW 20 M, 25 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor. 726022.25 Columna capilar para GC, OPTIMA 17, 25 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor 726089.60 Columna capilar para GC, OPTIMA240, 60 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor. 726785.50 Columna capilar OPTIMA 624, 50 m long., 0,25 mm ID, 1,40 m espesor. 723310.10 Columna capilar para GC PERMABOND SE-52 de 10 m de longitud, 0,32 mm de ID y 0,25 m de espesor de capa. 710006 Columna de acero inoxidable con relleno standard, 6' long., 1/8" OD, 2 mm ID. 727401 Columna para cromatografa "flash" con adaptador y vlvula de tefln. 20 mm ID x 400 mm longitud 704050 Cubeta de desarrollo ranurada con tapa 20x20 cm. 705103 Chromosorb recubierto con fase estacionaria Dietilenglicol succinato / 10% en Chromosorb W-AW. 735120 Encapsuladora manual, N 20 para tapones encapsulables de 20 mm ID. 718002 Fibra de vidrio silanizada. 923 501 pHmetro digital pH 300. 809013 Placa TLC. Slica gel standard. Vidrio SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20 cm. 711037.1000 POLYGOPREP 60-130, tamao part.63-200 m 704054 Spray pulverizador. 70205.36 Vial encapsulable N 20-10 DIN, incoloro.

73

Relacin de aditivos y coadyuvantes tecnolgicos para uso alimentario industrial

PANREAC QUIMICA, S.A., fabrica adems de los reactivos para anlisis PANREAC, una lnea de aditivos y coadyuvantes tecnolgicos para uso alimentario industrial, que cumplen las especificaciones de pureza prescritas por The Food Chemicals Codex IV ed., complementadas con las exigencias especficas prefijadas por la legislacin espaola y comunitaria de la CEE. En la relacin que sigue se indica denominacin del producto, frmula y nmero de identificacin. Para mayor informacin, solicite nuestro catlogo ADITIO 2000.

74

M
Cdigo Producto Sinnimos Frmula N de identificacin

201003 204333 201007 201008 202342 201013 202034 202422 201014 201808 201018 201020 201019 202785 202512 201669 201030 201029 201032 202344 202042 201034 202368 202051 202591 203389 202786 202345 201810 201055 201883 201058 201065 201066 201792 202043 202035 201081 201102 201103 201130 201129 201119 201121 201116 201127 201126 202912 202028 201140 203464 204653

Aceite de Vaselina Acetofenona Acetona Acido Actico glacial Acido Adpico Acido L(+)-Ascrbico Acido L-Asprtico Acido DL-Asprtico Acido Benzoico Acido Ctrico anhidro Acido Ctrico 1-hidrato Acido Clorhdrico 37% Acido Clorhdrico 35% Acido Decanoico Acido Esterico (mezcla de cidos grasos) Acido Etilendiaminotetraactico Sal Disdica 2-hidrato Acido Frmico 98% Acido Frmico 85% Acido orto-Fosfrico 85% Acido Fumrico Acido L-Glutmico Acido L(+)-Lctico Acido Lurico Acido DL-Mlico Acido Mirstico Acido Nicotnico Acido Octanoico Acido Palmtico Acido Propinico Acido Srbico Acido Succnico Acido Sulfrico 95-98% Acido Tnico Acido L(+)-Tartrico Agar L-Alanina DL-Alanina Alcohol Benclico Aluminio Amonio Sulfato 12-hidrato Aluminio Potasio Sulfato 12-hidrato Amonaco 30% (en NH3) Amonaco 25% (en NH3) Amonio Carbonato Amonio Cloruro Amonio Hidrgeno Carbonato di-Amonio Hidrgeno Fosfato Amonio di-Hidrgeno Fosfato Amonio Hierro(III) Citrato pardo Amonio Hierro(III) Citrato verde Amonio Sulfato L-Arginina L-Arginina mono-Clorhidrato

C8H8O CH3COCH3 CH3COOH (CH2CH2COOH)2 C6H8O6 C4H7NO4 C4H7NO4 C6H5COOH C6H8O7 C6H8O7.H2O HCl HCl C10H20O2 C18H36O2 Na2H2C10H12N2O8.2H2O HCOOH HCOOH H3PO4 HOOCCHCHCOOH C5H9NO4 CH3CHOHCOOH C12H24 O2 C4H6O5 CH3(CH2)12COOH C6H5NO2 C8H16O2 C16H32O2 CH3CH2COOH C6H8O2 HOOCCH2CH2COOH H2SO4 (CHOH)2(COOH)2 C3H7NO2 C3H7NO2 C6H5CH2OH NH4Al(SO4)2.12H2O AlK(SO4)2.12H2O NH4OH NH4OH ~(NH4)3(CO3)2H+NH2COONH4 NH4Cl (Amonio Bicarbonato) NH4HCO3 (NH4)2HPO4 NH4H2PO4 (NH4)2SO4 C6H14N4O2 C6H15ClN4O2

E-260 E-355 E-300

E-210 E-330 E-330 E-507 E-507

E-236 E-236 E-338 E-297 E-620 E-270 E-296 E-375

E-280 E-200 E-363 E-513 E-334 E-406

E-523 E-522 E-527 E-527 E-503i E-510 E-503ii E-542ii E-342i E-381 E-381 E-517

75

Cdigo

Producto

Sinnimos

Frmula

N de identificacin

76

204109 L-Asparagina anhidra 202357 Benzolo Perxido humectado con ~25% de H2O 203977 D(+)-Biotina 201082 1-Butanol 201089 iso-Butanol 201429 Butanona 204233 2-ter-Butil-4-Metoxifenol 201202 n-Butilo Acetato 201211 Calcio Acetato x-hidrato 201212 Calcio Carbonato precipitado 201213 tri-Calcio di-Citrato 4-hidrato 201232 Calcio Cloruro 2-hidrato polvo 201214 Calcio Cloruro 6-hidrato 202824 Calcio Cloruro solucin 45% p/p (en CaCl2.2H2O) 201818 Calcio Estearato 201224 Calcio Formiato 201228 tri-Calcio Fosfato 203290 Calcio D-Gluconato 1-hidrato 201225 Calcio bis-(di-Hidrgeno-Fosfato) 1-hidrato 201227 Calcio Hidrgeno Fosfato anhidro 201226 Calcio Hidrgeno Fosfato 2-hidrato 202400 Calcio Hidrxido, polvo 201230 Calcio Lactato 5-hidrato 203238 Calcio Propionato 201235 Calcio Sulfato 2-hidrato 201237 Carbn Activo polvo 202416 Carboximetilcelulosa Sal Sdica baja viscosidad 204441 Carboximetilcelulosa Sal Sdica media viscosidad 203922 Carboximetilcelulosa Sal Sdica alta viscosidad 203645 L-Cistina 202825 2,6-Di-ter-Butil-4-Metilfenol 201286 1,2-Dicloroetano 201254 Diclorometano estabilizado con amileno 201877 1-Dodecanol 201303 Estao(II) Cloruro 2-hidrato 201086 Etanol absoluto 201085 Etanol 96% v/v 202695 Etanol 70% v/v 201318 Etilo Acetato 201319 Etilo (S)-(-)-Lactato 202047 L-Fenilalanina 202728 D(-)-Fructosa 202060 Gelatina 80-100 Blooms 204819 Gelatina 220-240 Blooms 201339 Glicerina 202329 Glicerina 87% 201922 Glicerina tri-Acetato 201340 Glicina

C4H8N2O3 C14H10O4 C10H16N2O3S C4H10O C4H10O (Metiletilcetona) C4H8O (BHA, Butilhidroxianisol) C11H16O2 C6H12O2 Ca(CH3COO)2.xH2O CaCO3 Ca3(C6H5O7)2.4H2O CaCl2.2H2O CaCl2.6H2O ~Ca(C18H35O2)2 C2H2CaO ~Ca3(PO4)2 C12H22CaO14.H2O (Calcio Difosfato) CaH4(PO4)2.H2O CaHPO4 CaHPO4.2H2O Ca(OH)2 Ca(CH3CHOHCOO)2.5H2O C6H10CaO4 CaSO4.2H2O

E-320 E-263 E-170i E-333iii E-509 E-509 E-509 E-470a E-238 E-341iii E-578 E341i E-341ii E-341ii E-526 E-327 E-282 E-516

E-466 E-466 E-466 E-921 E-321

(BHT, Butilhidroxitoluol)

C6H12N2O4S2 C15H24O ClCH2ClCH2 Cl2CH2 C12H26O SnCl2.2H2O CH3CH2OH CH3CH2OH CH3CH2OH CH3COOC2H5 C5H10O3 C9H11NO2 C6H12O6

E-512

(Glicerol) (Glicerol)

C3H8O3 C3H8O3 C9H14O6 H2NCH2COOH

E-422 E-422 E-1518 E-640

M
Cdigo Producto Sinnimos Frmula N de identificacin

201341 203140 202061 201076 202515 201362 202045 202198 201375 202046 203385 201396 202029 201399 201927 201395 201276 201404 201410 201413 202067 201091 201949 203332 201430 203209 204621 201479 201487 201490 201492 201494 201522 201513 201505 201480 201512 202333 201509 201486 201515 201524 201855 204321

D(+)-Glucosa D(+)-Glucosa 1-hidrato Goma Arbiga polvo Hidrgeno Perxido 30% p/v (100 vol.) estabilizado Hierro(III) Fosfato x-hidrato Hierro(II) Sulfato 7-hidrato L-Histidina L-Histidina mono-Clorhidrato 1-hidrato Lactosa 1-hidrato L-Leucina D(+)-Limoneno Magnesio Cloruro 6-hidrato Magnesio Estearato tri-Magnesio di-Fosfato 5-hidrato Magnesio Hidrgeno Fosfato 3-hidrato Magnesio Hidroxicarbonato 5-hidrato Magnesio Oxido Magnesio Sulfato 7-hidrato Manganeso(II) Cloruro 4-hidrato Manganeso(II) Sulfato 1-hidrato D(-)-Manita Metanol Metilo Benzoato Metilo-4-Hidroxibenzoato 4-Metil-2-Pentanona Parafina P.F. 51-53C en lentejas Parafina P.F. 60-65C Potasio Acetato Potasio Bromato Potasio Carbonato tri-Potasio Citrato 1-hidrato Potasio Cloruro Potasio Disulfito tri-Potasio Fosfato 1,5-hidrato Potasio Hexacianoferrato(II) 3-hidrato Potasio Hidrgeno Carbonato di-Potasio Hidrgeno Fosfato anhidro di-Potasio Hidrgeno Fosfato 3-hidrato Potasio di-Hidrgeno Fosfato Potasio Hidrgeno Tartrato Potasio Hidrxido 85% lentejas Potasio Nitrato Potasio Nitrito tetra-Potasio Pirofosfato anhidro

C6H12O6 C6H12O6.H2O E-414 H2O2 FePO4.xH2O FeSO4.7H2O C6H9N3O2 C6H10ClN3O2.H2O C12H22O11.H2O C6H13NO2 C10H16 MgCl2.6H2O ~Mg(C18H35O2)2 (Magnesio orto-Fosfato) Mg3(PO4)2.5H2O MgHPO4.3H2O (Magnesio Carbonato) C4H2Mg5O14.5H2O MgO MgSO4.7H2O MnCl2.4H2O MnSO4.H2O (Manitol) C6H14O6 CH3OH C8H8O2 C8H8O3 (Metil iso Butil Cetona) C6H12O E-343ii E-504ii E-530 E-518

E-511 E-470b

E-421

E-218

CH3COOK KBrO3 K2CO3 K3C6H5O7.H2O KCl K2S2O5 K3PO4.1 1/2 H2O (Potasio Ferrocianuro) K4Fe(CN)6.3H2O (Potasio Bicarbonato) KHCO3 (di-Potasio orto-Fosfato) K2HPO4 K2HPO4.3H2O (mono-Potasio orto-Fosfato) KH2PO4 (COO)2KH(CHOH)2 KOH KNO3 KNO2 K4O7P2

E-261 E-924 E-501i E-332ii E-508 E-224 E-340iii E-536 E-501ii E-340ii E-340ii E-340i E-336i E-525 E-252 E-249 E-450v

77

Cdigo

Producto

Sinnimos

Frmula

N de identificacin

201729 Potasio Sodio Tartrato 4-hidrato 201531 Potasio Sorbato 201532 Potasio Sulfato 201533 Potasio Sulfito 201537 Potasio Tartrato 1/2-hidrato 201540 Potasio Yodato 201542 Potasio Yoduro 203646 L-Prolina 201545 1,2-Propanodiol 201090 2-Propanol 201962 Propilo Galato 201633 Sodio Acetato anhidro 201632 Sodio Acetato 3-hidrato 203865 Sodio L(+)-Ascorbato 201637 Sodio Benzoato 201648 Sodio Carbonato anhidro 202032 Sodio Carbonato 1-hidrato 201647 Sodio Carbonato 10-hidrato 201655 tri-Sodio Citrato 2-hidrato 201656 tri-Sodio Citrato 5 1/2-hidrato 201659 Sodio Cloruro 201698 Sodio Disulfito 202363 Sodio Dodecilo Sulfato 201681 201680 201697 201683 201665 201638 201654 tri-Sodio Fosfato 1-hidrato tri-Sodio Fosfato 12-hidrato Sodio Fosfinato 1-hidrato Sodio L-Glutamato 1-hidrato Sodio Hidrgeno di-Acetato Sodio Hidrgeno Carbonato di-Sodio Hidrgeno Citrato 1 1/2-hidrato 201679 di-Sodio Hidrgeno Fosfato anhidro 201678 di-Sodio Hidrgeno Fosfato 12-hidrato 201965 Sodio di-Hidrgeno Fosfato 1-hidrato 201677 Sodio di-Hidrgeno Fosfato 2-hidrato 201709 di-Sodio di-Hidrgeno Pirofosfato 201686 Sodio Hidrxido escamas 201687 Sodio Hidrxido lentejas 203307 Sodio Lactato solucin 50% p/p 201702 Sodio Nitrato 201703 Sodio Nitrito 201711 tetra-Sodio Pirofosfato anhidro

(Lauril Sulfato Sdico)

NaK(COO)2(CHOH)2.4H2O CH3(CHCH)2COOK K2SO4 K2SO3 K2(COO)2(CHOH)2.1/2H2O KIO3 KI C5H9NO2 CH2OHCHOHCH3 CH3CH2CH2OH C10H12O5 CH3COONa CH3COONa.3H2O C6H7NaO6 C6H5COONa Na2CO3 Na2CO3.H2O Na2CO3.10H2O Na3C6H5O7.2H2O Na3C6H5O7.5 1/2 H2O NaCl Na2S2O5 C12H25NaSO4 Na3PO4.H2O Na3PO4.12H2O NaH2PO2.H2O C5H8NNaO4.H2O CH3COONaCH3COOH NaHCO3 C6H6Na2O7.1 1/2 H2O Na2HPO4 Na2HPO4.12H2O NaH2PO4.H2O NaH2PO4.2H2O H2Na2O7P2 NaOH NaOH C3H5NaO3 NaNO3 NaNO2 Na4P2O7 Na4P2O7.10H2O (NaPO3)6 Na2SO4 Na2SO4.10H2O Na2SO3 Na2(COO)2(CHOH)2 Na2(COO)2(CHOH)2.2H2O

E-337 E-202 E-515i E-336ii

E-310 E-262i E-262i E-301 E-211 E-500i E-500i E-500i E-331iii E-331iii E-223

E-339iii E-339iii E-621 E-262ii E-500ii E-331ii E-339ii E-339ii E-339i E-339i E-450i E-524 E-524 E-325 E-251 E-250 E-450iii E-450iii E-452i E-514i E-514i E-221 E-335ii E-335ii

(Sodio Diacetato) (Sodio Bicarbonato)

(di-Sodio orto-Fosfato)

(mono-Sodio orto-Fosfato)

78

201710 tetra-Sodio Pirofosfato 10-hidrato 201684 Sodio Polifosfato 201716 Sodio Sulfato anhidro 201715 Sodio Sulfato 10-hidrato 201717 Sodio Sulfito anhidro 201720 Sodio Tartrato anhidro 201719 Sodio Tartrato 2-hidrato

(tetra-Sodio Difosfato) (tetra-Sodio Difosfato)

M
201721 Sodio Tiosulfato 5-hidrato
Cdigo Producto Sinnimos

Na2S2O3.5H2O
Frmula N de identificacin

203064 201733 202475 202101 204644 202049 202048 201786 201788 201787

D(-)-Sorbita Talco lavado Tierra Silcea purificada y calcinada Titanio(IV) Oxido DL-a-Tocoferol L-Triptfano Vainillina Zinc Oxido Zinc Sulfato 1-hidrato Zinc Sulfato 7-hidrato

(Sorbitol)

C6H14O6 TiO2 C29H50O2 C11H12N2O2 C8H8O3 ZnO ZnSO4.H2O ZnSO4.7H2O

E-420i E-553b E171 E-307

79

NOTAS

80

M
NOTAS

81

Editado por: PANREAC QUIMICA, S.A. 040 -15 - 1000 - 11/99. Diseo: Pere Duran Impresin: CENTRE TELEMTIC EDITORIAL Dep. Legal: B-21.701-99

SRL