ANLISIS DE LA COMPOSICIN DE ALCOHOLES Y SU RELACIN CON EL ANLISIS SENSORIAL, AISLAMIENTO DE LEVADURAS EN AGUARDIENTE DEL MUNICIPIO RIVAS DVILA.

1.- INTRODUCCION

A nivel nacional el consumo de bebidas alcohlicas ha aumentado en los ltimos aos, y en el caso del aguardiente o miche que se produce artesanalmente en las diferentes zonas del territorio nacional, especialmente en los andes Venezolanos no escapan a esta realidad.

La elaboracin artesanal de bebidas alcohlicas no es regulada, por tal motivo se plantea el estudio piloto de los aguardientes de produccin artesanal en el municipio Rivas Dvila, Bailadores, del estado Mrida.

El cual pretende determinar la composicin de alcoholes presentes en dichos aguardientes, tomando como referencia a los aguardientes comerciales del estado Mrida.

La calidad de una bebida alcohlica no depende solo si cumple o no con los requerimientos establecidos por las normas vigentes de cada pas; se debe tomar en consideracin la opinin del consumidor final, quien tiene la responsabilidad de aceptar o rechazar el producto.

La relacin entre la composicin qumica y el anlisis sensorial es algo que se plantea en este estudio, lo que permitir mejorar el proceso de elaboracin del aguardiente artesanal.

Otro punto a tratar es la identificacin y aislamiento de la levadura, presente en el mosto fermentado, para su posterior utilizacin en otro tipo de fermentaciones y la elaboracin de subproductos propios de la fermentacin.

2.- HIPOTESIS DE TRABAJO:

Como el aguardiente que se produce a nivel artesanal en el Municipio Rivas Dvila del Estado Mrida Venezuela no cuenta con un control de calidad por parte de los productores, la composicin en alcoholes as como las trazas de metales pesados que durante su elaboracin pueden ser arrastrados al producto final, podran estar a niveles no permitidos para el consumo humano.

3.- OBJETIVOS:

3.1 Objetivos Generales

Determinar el perfil de alcoholes en muestras de aguardientes producidos en el estado Mrida.

Determinar la presencia de trazas de metales pesados en los aguardientes.

Aislar levaduras del mosto.

3.2 Objetivos especficos

Realizar un muestreo de aguardientes ARTESANALES en puestos de comercializacin al detal dentro del Municipio Rivas Dvila

Determinar el perfil de alcoholes de tres marcas comerciales locales de aguardiente como control.

Establecer concentraciones de alcoholes distintos al etanol presentes en los aguardientes.

Determinar la presencia de trazas de metales pesados en el producto final de venta al pblico.

Aislar levaduras presentes en el mosto fermentativo de panela y una vez aislada, identificarla y determinar el grado de alcohol que producen.

4.- MARCO TEORICO

1. FERMENTACION

La palabra fermentar procede del trmino latino fervere , que significa hervir. Dicho denominacin hace una idea del aspecto que toma el lquido, aunque en este caso la sensacin de agitacin se produce principalmente por el desprendimiento de CO2, no exento de un desprendimiento de calor. As lo que ahora se conoce como levadura antes de Pasteur se conoca como fermento . (Nacho acuario-disco-web).

La fermentacin puede ocurrir de una forma espontnea en la naturaleza. Por eso, es muy posible que apareciera por puro azar y que el hombre la encontrara tambin por pura casualidad (AARTOM, 2004).

De sobra es conocido que la fermentacin alcohlica es un proceso del que son responsables las levaduras propias del mosto o de la materia empleada como la flora epifitica de las uvas; o llevada a cabo por levaduras inoculadas al medio, previa seleccin. (Cruinier, 1991; Delteil, 1992).Hoy da la tendencia es utilizar levaduras cultivadas seleccionadas, aunque es preferible el empleo de levaduras autctonas seleccionadas. (Suarez e Iigo, 1990).

4.2 EL METABOLISMO DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA:

La fermentacin alcohlica es el proceso por el que los azcares contenidos en el mosto se convierten en alcohol etlico. Para llevar a cabo este proceso es necesaria la presencia de levaduras. En la actualidad, el uso de levaduras comerciales en forma de Levadura Seca Activa

(LSA) es una prctica habitual cada vez ms utilizada en bodega para la elaboracin de bebidas alcohlicas de calidad.

El proceso simplificado de la fermentacin alcohlica es el siguiente:

Azcares + levaduras

Alcohol etlico + CO2 + Calor + Otras sustancias.

Los rendimientos moleculares de la reaccin son:

GLUCOSA + 2ADP

2ETANOL + 2CO2+ 2ATP + 2H2O

Donde 1 gramo de glucosa genera 0,51 gramos de etanol y 0,49 gramos de carbnico.

A parte del etanol y el carbnico, tambin se forman otras sustancias generadas en la fermentacin alcohlica, estas son: glicerol, cido actico, cido lctico, cido pirvico, acetaldehdo, cido succnico, acetona, diacetilo, 2-3 butanodiol (butilenglicol), alcoholes superiores, steres, acetatos, vinil-fenoles y etil-fenoles principalmente.

4.3 PRODUCTOS DEL METABOLISMO DE LOS AZCARES POR LA LEVADURA:

De forma resumida, se presentan a continuacin los productos principales y los subproductos que se generan cuando se transforma el azcar del mosto y otros componentes al ser metabolizados por las levaduras fermentativas:

Etanol: El etanol representa el producto principal de la fermentacin alcohlica.

Es corriente admitir que un grado de etanol (1% vol.) en fermentacin alcohlica representa un consumo comprendido entre 16,5 y 17 gramos por litro de azcares reductores (glucosa o fructosa) dependiendo de las condiciones.

Carbnico: representa el segundo producto principal de la fermentacin alcohlica. Segn las cepas utilizadas en condiciones enolgicas, se puede

considerar un rendimiento medio de 0,4 a 0,5 gramos de CO2 por gramo de azcares fermentados.

Glicerol: Las concentraciones finales en condiciones enolgicas de glicerol, varan de 5 a 11 g/L segn la cepa de levadura. La produccin de glicerol sirve a Saccharomyces Cerevisiae para hacer frente a las fuertes presiones osmticas, abandonando la clula posteriormente por difusin pasiva a travs de la membrana.

cidos orgnicos: desde la fermentacin alcohlica se forman cidos orgnicos que pueden ser liberados al medio. Una gran parte de ellos derivan por un funcionamiento limitado del ciclo de los cidos tricarbxilicos. El cido succnico representa, como el glicerol, uno de los subproductos mayoritarios de la fermentacin alcohlica.

Alcoholes superiores y cidos cetnicos: La mayor parte de estos compuestos derivan de los aminocidos asimilados durante la fermentacin alcohlica. El grupo amino es eliminado por transaminacin y el cido cetnico es enseguida descarboxilado para convertirse en un aldehdo, conduciendo a la formacin de un alcohol superior que posee un carbono menos que el aminocido de origen.

steres: son producidos por reacciones enzimticas donde entra en juego los derivados acil grasos del Coenzima A y los alcoholes libres.

Acetona, 2,3-butanodiol y diacetilo: La acetona es un compuesto originado durante la fermentacin alcohlica y se forma en condiciones muy reductoras, transformndose finalmente en butanodiol.

Crecimiento y biomasa: durante la fase de crecimiento exponencial, las levaduras se multiplican durante 6 7 generaciones, generando una poblacin mxima de 120-130x106

clulas por mililitro. Esta biomasa solo representa 3 gramos de peso seco por litro. (Geiger E. y Piendl A. 1975).

4.4 ALGUNAS CONSIDERACIONES A TOMAR EN CUENTA EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA:

Segn (Palacios, llames 1956):

I. Materias primas: Se utilizan como materia los cereales, azucares, y melazas de remolacha azucarera y caa de azcar. Las melazas de caa de azcar son usadas principalmente en nuestro pas.

II. Aditivo: como nutriente, se utiliza Urea; como fuente de nitrgeno, fosfatos como fuente de fosfatos; elementos metlicos como trazas tales domo sodio, zinc, hierro y cobre entre otros.

III. Como antispticos se utilizan sulfatos y cidos sulfricos: los sulfatos actan como agentes catalizadores. El acido sulfrico tiene funciones como permitir el desdoblamiento de la sacarosa, precipitar los cationes calcio y magnesio, en forma de sulfatos (ya que son ligeramente txicos para la levadura) y disminuir el pH.

IV. Microorganismos utilizados: el microorganismo utilizado por excelencia es la levadura Saccharomyces Cerevisiae. Presenta las siguientes caractersticas:

Forma redonda o ligeramente ovalada.

Reproduccin por gemacin multilateral.

Fermenta la glucosa, sacarosa, maltosa y en cierto grado la galactosa.

No fermenta lactosa.

La temperatura ptima para la reproduccin es de 30C.

V. Factores que afectan la fermentacin alcohlica:

Concentracin de azucares.

Oxigeno.

Agitacin.

Temperatura.

5. LEVADURAS

Levadura es un nombre genrico que agrupa a una variedad de hongos, incluyendo tanto especies patgenas para plantas y animales, como especies no solamente inocuas sino de gran utilidad. De hecho, las levaduras constituyen el grupo de microorganismos ms ntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. Algunas especies de levaduras del gnero Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el proceso de fermentacin, propiedad que se ha explotado desde hace muchos aos en la produccin de pan y de bebidas alcohlicas, y que a su vez ha inspirado un sinnmero de obras de arte que ensalzan al Dios del vino y a aquellos que disfrutan su consumo. Desde el punto de vista cientfico, el estudio de las levaduras como modelo biolgico ha contribuido de manera muy importante a elucidar los procesos bsicos de la fisiologa celular.

Dentro del gnero Saccharomyces, la especie Cerevisiae constituye la levadura y el microorganismo eucariota ms estudiado. Este organismo se conoce tambin como la levadura de panadera, ya que es necesario agregarla a la masa que se utiliza para preparar el pan para que este esponje o levante; de hecho el trmino levadura proviene del latn levare, que significa levantar.(Gonzlez y Valenzuela. 2001)

La levadura Saccharomyces Cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dada su importancia en la industria panadera y vitivincola, as como por su capacidad de producir etanol. Este microorganismo muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es cultivado en medios lquidos con glucosa como fuente de carbono: la fase lag, la fase logartmica, el cambio diuxico, la fase postdiuxica y la fase estacionaria. La fase lag es un periodo de adaptacin en el cual la clula se prepara para dividirse. Durante la fase logartmica las clulas alcanzan su mxima velocidad de duplicacin y llevan a cabo un metabolismo fermentativo del que se produce etanol. Al disminuir la concentracin de glucosa, las clulas atraviesan por el cambio diuxico, un periodo breve de tiempo en el cual no hay divisin, y la clula cambia de un metabolismo fermentativo a uno respiratorio. En la fase postdiuxica las clulas usan como fuente de carbono el etanol producido durante la fase logartmica e incrementan su resistencia al estrs gradualmente; en tanto que la fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no hay divisin celular. En esta fase, las clulas acumulan carbohidratos de reserva como trehalosa y glucgeno, alcanzan el mximo nivel de resistencia a estrs y su pared celular se vuelve ms gruesa y resistente a la digestin por liticasa.(Werner washburne,1989).

En 1897, los hermanos Hans y Edward Buchner obtuvieron extractos libres de clulas moliendo levadura para pan con granos de arena, a los cuales adicionaron grandes cantidades de azcar de caa para evitar su posible contaminacin. Para su sorpresa, encontraron que el azcar se fermentaba rpidamente: por primera vez se haba descubierto un modelo para el estudio de la fermentacin alcohlica en un sistema carente de clulas. Este descubrimiento atrajo la atencin de los bioqumicos, que decidieron analizar cada uno de los pasos que conducan a la produccin de etanol y bixido de carbono a partir de la glucosa. Este trabajo implic el esfuerzo de muchos cientficos y dio como resultado el descubrimiento y descripcin del metabolismo del carbono; algunas de las vas metablicas que conocemos actualmente, llevan los nombres de los cientficos que participaron en este trabajo, como Embden y Meyerhof. La va metablica que permite la utilizacin de glucosa fue la primera ruta metablica descrita, y la metodologa empleada para lograrlo se utiliz para el estudio posterior de otras vas que constituyen el metabolismo celular.

6. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LEVADURAS

La importancia del conocimiento de la microflora radica en que est conformada por diferentes especies, que coexisten en el tiempo y se suceden secuencialmente en funcin de la tolerancia a la concentracin de azucares, la capacidad de resistencia o tolerancia al alcohol y la produccin de alcohol y metablitos secundarios.

En la mayora de los casos, el crecimiento en masa de las levaduras no resulta apropiado para su identificacin. En los cultivos con agar, es difcil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas, por lo que la observacin microscpica es la nica forma segura que existe para poderlas diferenciar. La mayora de las colonias jvenes de levaduras son hmedas y algo mucosas, y es posible que tengan aspecto harinoso. La mayora de las colonias son blanquecinas, algunas tienen un color crema o rosado. Algunas colonias cambian poco de aspecto cuando envejecen, otras se secan y se vuelven rugosas. Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metablica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un lquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en forma de pelcula, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de pelcula. Las levaduras fermentativas suelen crecer en toda la masa del lquido y producen CO2.

4.7 CLASIFICACIN E IDENTIFICACIN DE LEVADURAS

La clasificacin de las levaduras es compleja, no obstante el desarrollo de nuevas tcnicas basadas en Biologa Molecular, ha permitido separar o reagrupar las especies. Las levaduras pertenecen al Reino Fung y dentro de l a la divisin Eumicota que agrupa a los hongos verdaderos. En esta divisin, las levaduras se incluyen en 2 de las 5 subdivisiones de los Eumicetes, la Ascomycotina representada por las levaduras capaces de producir ascosporas, llamadas por ello esporgenas, y la Deuteromycotina representadas por las levaduras incapaces de formar esporas llamadas no esporgenas. Los gneros de las levaduras esporgenas englobados todos ellos en la familia Saccharomycetaceae, se distribuyen en 3 subfamilias. Los gneros de las levaduras no esporgenas constituyen la familia Cryptococcaceae. Adems las levaduras pueden ser clasificadas por debajo de los taxones gnero y especie, en subespecies y variedades, que a menudo adquieren rango de especie tras nuevas revisiones taxonmicas, o varias especies son unificadas en una sola como subespecies de la misma, con lo que la clasificacin se complica an ms y se incrementa el nmero de sinonimias. Los principales criterios utilizados para la clasificacin e identificacin de las levaduras son los siguientes:

1.- Produccin de ascosporas.

2.- Aspecto de las clulas vegetativas: forma, tamao, color, inclusiones.

3.- Forma de reproduccin asexual.

4.- Produccin de micelio.

5.- Forma de pelcula en medio liquido.

6.- Color de la colonia.

8.- Propiedades fisiolgicas: produccin de cido, actividad uresica.

9.- Caracterizacin bioqumica (Frazier y Weathoff, 1998; Hayes, 1993):

- Fermentacin de glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y rafinosa.

- Crecimiento en 18 sustratos carbonados:

Pentosas: D-xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, L-ramnosa.

Hexosas: D-glucosa.

Disacridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa.

Trisacridos: rafinosa.

Polisacridos: almidn.

Alcoholes: eritriol, ribitol, D-manitol, inositol.

cidos orgnicos: cido succnico, cido ctrico.

- Asimilacin de nitratos.

- Crecimiento a 37C.

- Crecimiento en medio con vitaminas.

- Produccin de almidn.

4.8 SELECCIN DE LEVADURAS

El estudio de la dinmica, cuantificacin y composicin de la microbiota responsable de las fermentaciones espontneas, ha mostrado diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, en las levaduras aisladas en una misma zona vitivincola e incluso dentro de los depsitos de una misma bodega. Las causas de esta variabilidad pueden ser: cambios en las tcnicas de aislamiento, cambios en las condiciones climticas, etc. Por tanto, la necesidad de asegurar la fermentacin alcohlica, as como la tipicidad y reproducibilidad de los vinos, requiere cada vez ms, el uso de cultivos iniciadores. Las levaduras seleccionadas se han utilizado con excelentes resultados en muchos pases, obtenindose productos finales de calidad ms uniforme que los que se producan con las fermentaciones espontneas. Este ltimo punto es el que genera el debate acerca de la utilizacin o no de inculos, ya que garantizan repetitividad a expensas de perder algo de complejidad en el producto. A pesar de que existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es ms efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son: especficas del rea, totalmente adaptadas a las condiciones climticas de la zona y a la materia prima, es decir al mosto a fermentar, son responsables al menos parcialmente, de las caractersticas nicas de los productos obtenidos.

Las caractersticas propias de la zona pueden ser por tanto, un aspecto interesante a la hora de seleccionar una levadura, aunque hay muchos otros que tambin se tienen que tomar en cuenta.

La importancia de estos parmetros puede ser relativa, dependiendo del producto para el cual quieren ser utilizados, algunos de los criterios utilizados para seleccionar levaduras se pueden observar ms adelante. Por tanto, la seleccin de la cepa adecuada para cada tipo de fermentacin es una estrategia muy importante para garantizar por un lado una fermentacin correcta, as como para mejorar las caractersticas del producto final, ya que las levaduras pueden producir compuestos que den un toque de distincin al producto obtenido, tales como el glicerol, steres, alcoholes superiores, etc. (Sociedad Venezolana de Microbiologa.2003).

9. AGUARDIENTE

El aguardiente artesanal o miche que se destila en el Municipio Rivas Dvila del Estado Mrida es una bebida alcohlica obtenida de la fermentacin de la panela la cual se elabora a partir de caa de azcar. La produccin de mostos fermentados de diversas fuentes se conoce desde pocas precolombinas en Latinoamrica y desde el siglo XVII se elaboran destilados a partir de la caa de azcar (Gonzlez, 2001).

Sin embargo, la historia de la caa de azcar se remonta mucho antes del descubrimiento. En Venezuela la difusin de la caa de azcar fue un proceso largo y difcil durante los primeros dos siglos de la colonizacin (Rodrguez, J.2005).

La corona espaola intento en el ao 1714, acabar con la produccin del aguardiente, a lo largo de su territorio americano, encontr que sus sbditos, burlaban de alguna manera las leyes establecidas. Ya que la produccin de aguardiente les aportaba un ingreso econmico extra (Rodrguez, J.2005).

En cuanto a la historia de la obtencin de miche en el municipio Rivas Dvila, Bailadores, la produccin de este licor transciende al menos cinco (5) generaciones atrs.

Los habitantes de la localidad y los productores de miche se las ingeniaban para burlar a las autoridades, ya que estas perseguan a los propietarios de alambiques clandestinos. Para el ao de 1883 aproximadamente, los alambiqueros construan sus destiladores lejos del pueblo y de sus casas por seguridad. De una manera extraordinaria, elaboraban fosas subterrneas unas cerca de otras comunicadas por un pequeo tnel en el cual fermentaban la panela en forma espontnea. En la otra fosa tenan el destilador o alambique, cubiertas con tierra, llegando hasta sembrar

rubros agrcolas sobre ellas para engaar a las autoridades. Hoy da una fosa de estas existe aun y es reseada en este trabajo siendo uno de los hallazgos ms sorprendentes de la investigacin hasta el momento.

A travs del tiempo esta tradicin familiar ha pasado de generacin en generacin en las familias que hoy da poseen estos alambiques; de igual manera la forma de produccin no ha variado. Anteriormente se hinojaba ms esta bebida que hoy da, pero en esencia sigue siendo la misma.

La produccin de bebidas alcohlicas ha estado ligada a la mayora de las culturas durante milenios (Garca Garibay et al. 2002).

La fermentacin alcohlica es una de las etapas principales que transforman el mosto o zumo azucarado, en un lquido con un determinado contenido de alcohol etlico. Dura, aproximadamente, una semana a una temperatura de 20 C, y se traduce por una disminucin de la densidad del mosto.

Se entiende por bebida alcohlica aquella bebida en cuya composicin est presente el etanol en forma natural o adquirida y cuya concentracin sea igual o superior al 1% de su volumen/volumen.

Las bebidas alcohlicas se clasifican en dos categoras, las fermentadas y las destiladas. Estas ltimas reciben, su nombre, ya que el alcohol es producto de la destilacin, sin adicin de otra materia adicional (Snchez, L.1998)

El Charanda es una bebida alcohlica mexicana obtenida por la fermentacin de mostos del jugo de la caa de azcar (guarapo) o sus derivados (melado, piloncillo o melaza). Estos jugos proceden de la molienda de la caa de azcar y que en combinacin con cepas de levaduras cultivadas o no, llevan a cabo una fermentacin alcohlica. Por transformaciones bioqumicas y su posterior destilacin, se obtiene esta bebida alcohlica. La rectificacin de este producto se lleva a cabo en alambiques discontinuos que originan los congneres que distinguen al producto (Norma Oficial Mexicana, 2001).

El aguardiente es una bebida alcohlica obtenida por el proceso de destilacin del mosto fermentado de las melazas de la caa, el cual es luego destilado por un proceso continuo o en torre, y diluido con agua de dilucin hasta un rango de 38% -50% alcohol/volumen a 20C.

La destilacin es un proceso que permite separar los componentes voltiles de un fermentado tales como el agua, alcohol etlico y substancias orgnicas, basndose en sus diversos puntos de ebullicin. Esto permite concentrar el alcohol etlico presente en el fermentado y tambin seleccionar las sustancias que se quiere que en l aparezcan. El fermentado se transforma en vapor cuando se aplica calor y luego se enfra para recondensar a lquido. Por otra parte, algunos compuestos como aldehdos, cetonas, furanos y fenoles podran generarse durante los procesos de cocimiento y/o destilacin (Benn, M. y Peppard, L. 1996).

Al destilarse el miche artesanal a partir del mosto fermentado a trmino junto con un conjunto de ramas y/o especias utilizada por los productores, codestilan aceites esenciales de las especies empleadas solubles en alcohol, siendo los responsables del perfil organolptico del aguardiente producido.

Los compuestos voltiles producidos en la fermentacin influyen en la calidad final del producto. As, los steres son constituyentes voltiles responsables del aroma de la bebida (Steger, C., Lambrechts, M. (2000). Los alcoholes superiores no son considerados como un factor de calidad de licores debido a su olor desagradable (Boulton, et al (1995).Los steres etlicos de los cidos orgnicos superiores otorgan a la bebida sabores y olores a fruta y flores con excepcin del acetato de etilo el cual proporciona un aroma a solvente (Rodrguez, R.; MANGAS, J. 1996). Adicionalmente, altas concentraciones de metanol y furfural pueden conferirle propiedades txicas a la bebida (Raposo, M. 1986). Sin embargo la variedad de compuestos organolpticos generados en la fermentacin, no slo dependen del tipo de levadura, tambin depende de la materia prima usada y de las condiciones de fermentacin (Maarse, 1992).

En la elaboracin artesanal del miche, la definicin de los cortes del destilado (cabeza, corazn o cuerpo, y cola) se realiza empricamente, de forma tal que no se garantiza que el producto cumpla con las especificaciones de grado alcohlico, concentracin de metanol, furfural y total de congenricos establecidos en la Norma Venezolana de bebidas alcohlicas, COVENIN 3340, 1997. Al no establecerse un control sistemtico sobre el proceso de destilacin, no se tiene un control sobre el rendimiento del proceso y sobre la calidad de la bebida.

La calidad de una bebida alcohlica no solamente se basa en el cumplimiento de las especificaciones de las normas oficiales vigentes, debido a que tambin se deben considerar algunos factores subjetivos, entre ellos, el ms importante es la aceptacin del consumidor en funcin de las caractersticas sensoriales que percibe, las cuales estn asociadas a la composicin de los productos, ya que la interaccin de los componentes voltiles entre s con los receptores sensoriales del consumidor, producen las sensaciones de aroma y sabor (Te evic, et al 2005). El anlisis de compuestos voltiles en bebidas alcohlicas es un problema analtico complejo, debido a la caracterizacin e interpretacin de su efecto sobre las caractersticas sensoriales finales. Ferreira et al 2002 reportan que se han identificado aproximadamente 800 componentes en vinos mediante tcnicas de deteccin olfatomtrica y cromatografa de gases, de los cuales, se han identificado de 40 a 50 compuestos como los principales agentes responsables de la produccin de aromas.

El anlisis de componentes voltiles en bebidas alcohlicas por cromatografa de gases es complicado debido a que el agua y el etanol representan casi el 98-99% del rea de los picos cromatogrficos, mientras que en el porcentaje restante se encuentra distribuido en ms de un centenar de componentes, lo que dificulta su identificacin y cuantificacin (Snchez-Arreguin, J.A. 2004) Para su anlisis se deben implementar tcnicas de separacin y concentracin de voltiles minoritarios como extraccin lquido-lquido, adsorcin, evaporacin, destilacin, entre otras (Daz-Plaza, et al 2002, Caldeira, et al 2004, Pineiro, et al 2004, Rocha,et al 2004). En todas las tcnicas mencionadas es inherente la complejidad de evaluar cuantitativamente los voltiles minoritarios por su baja presencia y diversidad, as como la dificultad de evaluar las prdidas de cada componente en particular en los procesos de separacin y concentracin.

10. CROMATOGRAFIA DE GASES

La cromatografa es una tcnica que se emplea para separar entre si los componentes de una sustancia. Esta tcnica fue creada por el botnico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llamo a su mtodo cromatografa, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando ter de petrleo, un disolvente no polar, y descubri que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a travs de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza).Tswett utiliz como detector del experimento la simple observacin, ya que los compuestos que separ tenan color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las hojas de las plantas.

A pesar de que el mtodo cromatogrfico prometa simplificar la separacin de sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la dcada de los 30 y principio de los 40 cuando se empez a desarrollar la tcnica teniendo este mtodo diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografa se emplea principalmente para separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier tcnica que se base en los mismos principios. (Rubinson.2001).

La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte superior, rellena de un slido comn donde el eluyente se mueve conducido por su propio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos (fig1).

[pic]

BASE CIENTFICA

En la cromatografa se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida mvil a travs de una fase estacionaria slida o lquida, la separacin de las molculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y esta separacin se puede realizar en funcin de sus cargas, masas, tamaos moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox.

Como resultado hay una gran variedad de tcnicas para llevar a cabo la separacin de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos segn el mecanismo de separacin:

C. de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad.

C. de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin.

C. de exclusin: separa solutos segn el peso molecular.

C. de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica.

Tambin se pueden clasificar segn el estado de la fase mvil en:

C. de gases: la fase mvil es un gas y pueden ser dos sistemas:

C. gas-liquido

C. gas-slido

C. lquida: la fase mvil es un liquido y puede ser:

C. liquido-liquido

C. liquido-slido

C. de exclusin

C. de intercambio inico

Las nicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografa son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria. Dentro de las tcnicas cromatogrficos no se incluyen los mtodos que utilizan campos elctricos para separar molculas cargadas, mtodos que se denominan electro separaciones, electro migraciones o electroforesis.

El proceso cromatogrficos, aparentemente simple, es en realidad una compleja

Unin de fenmenos tales como hidrodinmica, cintica, termodinmica, qumica de superficie y difusin. Hasta la fecha se han propuesto muchas teoras, que incluyen complejos matemticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatogrficos, por citar alguna de estas teoras las ms estudiadas son:

Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge).

Teora Cintica (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer).

Teora Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).

4.10.1 TERMINOLOGA EN CROMATOGRAFA

Segn Skoog 1997:

1. Absorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene esta a formar mezcla o a reaccionar qumicamente con la misma.

2. Adsorbente: fase estacionaria en la Cromatografia de adsorcin y de reparto.

3. Adsorcin: Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la

Superficie de un slido, quedando limitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta retencin superficial puede ser fsica o qumica.

4. Cromatografa en fase inversa: Cromatografa con una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar.

5. Cromatografa en fase normal: Cromatografa con una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar.

6. Disolvente o revelador: Cualquier fase mvil.

7. Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.

8. Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna.

9. Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatografica durante la cromatografa y que retiene algn componente de la muestra, posee una gran rea superficial y puede ser un slido o un lquido dispuesto sobre un slido que acta como soporte.

10. Fase mvil: Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a travs de la columna cromatografica y la fase estacionaria.

11. Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio.

12. Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografa.

13. Soporte: El material slido inerte que en la Cromatografa de reparto sirve para sostener la fase estacionaria lquida en su sitio.

Cromatograma

Adems de observar el resultado final del proceso, se pueden realizar las medidas continuamente para obtener una informacin global del proceso pasando la muestra a travs de un detector instrumental, normalmente los transductores del detector se sitan al final de la columna.

El detector registra los cambios que se producen en alguna propiedad del eluyente que pasa por l, estos cambios son reproducidos y registrados en forma de grfica, sta grfica que recoge la respuesta del detector en funcin del tiempo se denomina cromatograma.

En las graficas se observa la aparicin de una serie de picos a lo largo del tiempo, generalmente la respuesta del detector es linealmente proporcional a la concentracin de analitos en la fase mvil, la forma de cada pico muestra la distribucin de concentracin del componente asociado a dicho pico.

En el cromatograma el eje horizontal corresponde al volumen, o al tiempo equivalente. En la cromatografa moderna es frecuente mantener constante la velocidad de flujo (volumen/tiempo), as mediante esta relacin se puede reflejar el tiempo en el eje horizontal: velocidad de flujo x tiempo = volumen.

4.10.2 CROMATOGRAFA DE GASES. GC

FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BSICOS

La cromatografa en fase gaseosa es un procedimiento para la separacin de compuestos voltiles, que fluyen en una corriente gaseosa a travs de una fase estacionaria fijada a un tubo largo y fino. El gas portador (inerte, por ej., nitrgeno, helio, hidrgeno y argn) transporta una muestra representativa de la sustancia inyectada.

En una separacin se parte de la base, de que cada componente ser disuelto o adsorbido por la fase estacionaria. Los distintos componentes sern retenidos por esta fase con mayor o menor fuerza y alcanzarn correspondientemente el final de la columna, donde se encuentra el detector, despus de un tiempo de flujo de gas portador ms o menos largo.

La cromatografa de gases permite obtener resultados tanto cualitativos como cuantitativos. Se utilizan fundamentalmente estas alternativas de separacin:

1. A mayor disolucin, la separacin de compuestos con estructura qumica similar se consigue utilizando tiempos relativamente largos.

2. A menor disolucin se realiza la separacin rpida de mezclas de compuestos sencillos conocidos.

4.11 INSTRUMENTACIN

Actualmente ms de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen unos 130 modelos distintos de equipos para cromatografa de gases. En las ltimas dcadas, los instrumentos que han aparecido en el mercado presentan muchos cambios y mejoras.

En los aos setenta, se hicieron habituales los integradores electrnicos y los equipos de procesado de datos basados en un ordenador. Los aos ochenta introdujeron la utilizacin de los ordenadores para el control automtico de la mayora de los parmetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, caudales y la inyeccin de la muestra, el desarrollo de instrumentos de muy alto rendimiento a un coste moderado, y tal vez lo ms importante, el desarrollo de las columnas abiertas que son capaces de separar multitud de analitos en un tiempo relativamente corto.

Componentes bsicos

Segn (Skoog 2001)

1) GAS PORTADOR:

El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones:

1. Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria).

2. Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa.

3. Fcilmente disponible y puro.

4. Econmico y adecuado al detector a utilizar.

2) COLUMNAS DE SEPARACION Y FASES ESTACIONARIAS

Si la fase estacionaria es una sustancia slida, esta modalidad de la GC se denomina gas-solidchromatography. Si la fase estacionaria es un lquido no voltil (viscoso) aplicado formando una pelcula dentro de una fina columna, se denomina gas-liquid-chromatography. Dado el elevado nmero de fases lquidas que existen para temperaturas superiores a 400C, la GLC es la ms verstil y seleccionada de las GC. Permite la investigacin de compuestos gaseosos (es decir, de peso molecular relativamente bajo). La cromatografa de gas-lquido se abrevia normalmente como cromatografa de gases debido a su gran aplicacin en todos los campos de la ciencia.

La GC se divide en: a) GC con columnas empaquetadas y b) GC con columnas capilares.

a) El primer caso se trata de columnas convencionales con un dimetro interno (ID) superior a 1mm y longitudes de 2-3m (de vidrio, metal), rellenas de granulados slidos en los que estn embebidas las distintas fases.

b) Las columnas capilares son capilares largos de vidrio o slice (ID: 0.2-0.3mm, longitud: como norma 50m), existen diferentes tipos de capilares.

Debido a la alta resolucin que se consigue al trabajar con columnas capilares, la

GC capilar se suele denominar tambin cromatografa gaseosa de alta resolucin

(HRGC).

3) SISTEMA DE INYECCION MUESTRA

La muestra debe introducirse rpidamente en la columna. Normalmente, los lquidos se introducen en la columna por medio de jeringuillas de inyeccin (jeringuillas de micro litro con un volumen total de 0.5 a 10l) a travs de una membrana de goma (septo) del inyector termostatizado y los componentes se vaporizan; la cantidad inyectada se lee directamente en la escala de la jeringuilla graduada. La cantidad de la muestra a utilizar depende del tipo de columna, de la cantidad de fase estacionaria contenida en la columna o del espesor de la pelcula en el caso de los capilares de pelcula fina, de la solubilidad de los componentes importantes en la fase estacionaria (es decir, de la polaridad de soluto y disolvente) y de la temperatura.

Controlando los cambios de temperatura de la columna (horno) durante el anlisis se puede, alcanzar el intervalo de temperatura Optimo para cada componente o fraccin individual, de manera que para cada componente de la mezcla se obtengan picos claros, en el caso ideal completamente separados.

DETECTORES

El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y la magnitud de la propiedad fsica.

En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico o integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.

Un detector muy utilizado en la analtica general de los alimentos es el detector de ionizacin de llama (FID). En l se mide, registra y amplifica el flujo inico resultante de la ionizacin de las molculas en una llama de hidrgeno (gases de combustin necesarios: hidrgeno y aire comprimido). El FID es un detector de los denominados universales o inespecficos, especialmente adecuados para medidas cuantitativas. Es un detector dependiente del flujo de masa, es decir, la seal es tanto mayor, cuenta ms sustancia se ioniza en la llama en la unidad de tiempo.

En el anlisis de las cantidades traza se utilizan por lo general detectores que presentan una elevada sensibilidad para determinadas sustancias, son los denominados detectores especficos. Tiene especial importancia en el anlisis de residuos y de contaminantes, el detector de captura electrnica (ECD).

El ECD posee la caracterstica de detectar aquellas sustancias que poseen una elevada afinidad electrnica (por ej., los halgenos, aunque tambin otros grupos funcionales de la molcula con afinidad por los electrones). Al contrario que el FID, el ECD mide una reduccin de la seal en lugar de una amplificacin.

11. Anlisis sensorial

La calidad sensorial de un alimento no es una caracterstica propia de este, sino que es el resultado de la interaccin alimento-hombre y se puede definir como la sensacin humana provocada por determinados estmulos procedentes del alimento lo cual depende no slo de la clase e intensidad del estmulo, sino tambin de las condiciones del ser humano. Sobre la base de reconocer que la calidad sensorial depende de las sensaciones humanas, es imprescindible la planificacin correcta de cualquier anlisis sensorial. En todo anlisis de ste tipo, los sentidos humanos son las herramientas para tal fin. Dada la naturaleza subjetiva de las respuestas humanas, se hace necesario establecer determinados principios y procedimientos de trabajo basados en los enfoques, en la experiencia internacional expresada en los libros, artculos para llegar a establecer la calidad de un producto. Necesariamente nos planteamos una pregunta: Qu es calidad? Desde el punto de vista de la qumica analtica de los alimentos, calidad es el conjunto de ndices que determinan el valor de los productos y las materias primas empleadas en su elaboracin. Ahora bien, la connotacin del trmino difiere segn el inters especifico que se tenga. Los mtodos de Anlisis Sensorial o pruebas sensoriales son indispensables en el control de la calidad de alimentos y bebidas, por tal motivo se requiere que las evaluaciones sensoriales se

realicen con una fundamentacin cientfica, asegurndose as la obtencin de resultados objetivos. Para lograr esto se requiere del constante desarrollo de los procedimientos de evaluacin sensorial y la correcta planificacin, diseo y obtencin de la calidad sensorial adecuada . (Torricela, R.G y Huerta Vctor.2008) En contraposicin de los anlisis sensoriales con jueces entrenados y catadores entrenados, existen las pruebas afectivas que son realizadas para evaluar la aceptacin o rechazo de un producto sin implicar un panel entrenado. Como ejemplo de estas pruebas tenemos las Pruebas escalares de tipo afectiva que son las que se utilizan con el propsito de conocer el nivel de agrado o desagrado de un producto, esto es en qu medida el mismo gusta o no. Estas pruebas tienen gran aplicacin prctica, de manera general son fciles de interpretar y los resultados que de ellas se obtienen permiten tomar acciones importantes con relacin a la venta del producto, posibles cambios en su formulacin y cambios en su elaboracin, etc. Dentro de estas escalas encontramos: Las escalas hednicas verbales: recogen una lista de trminos relacionados con el agrado o no del producto por parte del consumidor. Pueden ser de cinco a once puntos variando desde el mximo nivel de gusto al mximo nivel de disgusto y cuenta con un valor medio neutro, a fin de facilitar al juez la localizacin de un punto de indiferencia. En general cuando se emplean muchas descripciones se ha demostrado, que en vez de orientar al consumidor, ms bien le origina confusin, de ah que las ms empleadas sean las escalas bipolares de 7 puntos. Para realizar la prueba pueden presentarse una o varias muestras para que sean evaluadas por separadas segn la naturaleza del estmulo, no obstante se ha comprobado que el juez tiende a hacer comparaciones entre las muestras y sus respuestas estn condicionadas, de ah que si desea tener un criterio de aceptacin totalmente independiente para cada muestra analizada, debe presentarse cada una en sesiones de evaluacin diferentes. Para analizar los datos obtenidos mediante esta prueba, se realiza una conversin de la escala verbal en numrica, esto es, se le asignan valores consecutivos a cada descripcin; dichos valores pueden procesarse posteriormente a travs de un anlisis estadstico, o simplemente llegar a una conclusin de la aceptacin de los productos mediante el valor obtenido al calcular la media aritmtica de la respuesta de los jueces para cada muestra y hacerlo coincidir con el trmino que corresponde con la descripcin verbal.

5. METODOLOGIA

5.1 Aislamiento de levaduras.

Toma de muestras: 2 alcuotas de 1 litro del mosto de panela de caa de azcar sern recolectadas durante el proceso de fermentacin artesanal, directamente de las cubas, las cuales pueden contener de 200 a 250 litros de mosto fermentado sin remocin de la capa de levaduras entre un ciclo fermentativo y el siguiente. Realizndose una fermentacin contina con dichas levaduras.

1.- preparar el medio a partir del mosto fermentado.

Se toma un volumen de 250ml de mosto, se esteriliza; y guarda a temperatura 4C.

En el momento de su utilizacin se le aade maltosa al 20%, para un total de 250ml y se aade agar 2x. Se preparan 20 placas.

En estas placas se lleva a cabo el aislamiento de las levaduras presentes en el mosto fermentativo, previa incubacin a temperatura ambiente en diluciones seriadas del mosto desde 10-1 -10-8. Por la tcnica del agotamiento. Dejar incubar por 48h a temperatura ambiente.

2.- A este medio mosto + maltosa 20% se le agregan sales 1/2x + agar + Etanol a diferentes concentraciones desde 5%, 8%, 12%. Donde se reaislan las levaduras aisladas en el paso anterior. Tomndose tres placas control sin alcohol para cada una de las concentraciones de alcohol a ensayar. Dejar incubar por 48h a temperatura ambiente.

3.- Las muestras sern sembradas por agotamiento en placas de Petri con medio DIFCO (Wickerham et al 1958.) modificado (MDM) para este trabajo. Slido e incubadas a 28C durante 24 horas.

A este medio MDM 2x se le aaden los diferentes azucares, entre ellos Maltosa, Fructosa, Dextrosa, Glucosa, Galactosa, y Sacarosa; a una concentracin de 2x para observar la capacidad de las levaduras de fermentar en dichos azucares. Para esto se utilizaron las cepas reaisladas en presencia de etanol.

4.- Se prepara la fermentacin invertida Durham, tomando los azucares a una concentracin 2x en medio MDM 2x. Se deja la fermentacin por 7 das. Para observar la produccin de CO2.

Tomando al azar dos cepas de las placas etanol 8% la nmero 7 y la nmero 47.Se realiza un pre inoculo con 48h de anterioridad.

Se trabaja con los siguientes volmenes:

|Azcar (5ml) | |Fructosa |Dextrosa |Glucosa |Galactosa |Maltosa |sacarosa | | |

|Pre inoculo cepa (100L) | | | | | |

|Medio MDM (5ml) | | | | | |

| | |

MEDIO DE CULTIVO DIFCO MODIFICADO

Fermentado 1L

CicloHeximida 0.5 g/L

Cloranfenicol 40 mg/L

Fosfato monobsico 1 g

Sulfato de Magnesio 500 g

Cloruro de Sodio 100 g

Cloruro de Calcio 100 g

cido brico 500 g

Sulfato de Cobre 40 g

Ioduro de Potasio 100 g

Sulfato de manganeso 400 g

Molibdato de sodio 200 g

Sulfato de zinc 400 g

Agar 16 g/L

pH final 5.4 despus de la adicin de sulfato de Amonio 5g/L

Biotina 2 g

Pantotenato de Calcio 400 g/L

Acido flico 2 g/L

Inocitol 2 mg

Niacina 400 g

cido p- amino benzoico 200 g

Hidrocloruro de Piridoxina 400 g

Riboflavina 200 g/L

Hidrocloruro de Tiamina 400 g

5.2 IDENTIFICACIN DE LEVADURAS

Para la identificacin de levaduras se empleara el mtodo de tincin Gram, ya que algunas levaduras se comportan como Gram +.

a) Azul de metileno (Tincin positiva). Permite teir el interior celular. Tie microorganismos procariticos (vivos o muertos). Los eucariticos slo se tien si estn muertos. Algunas estructuras, como los corpsculos metacromticos, se tien ms intensamente con este colorante que el resto de la clula.

Procedimiento

1. Extensin: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el asa de siembra.

2. Fijacin: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque.

3. Aadir Azul de metileno y esperar 2 minutos.

4. Lavar con agua

5. Secar.

6. Observar primero con el objetivo 40; luego se aade aceite de inmersin y se observa con el objetivo 100.

b) Tincin de Gram. De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Procedimiento

1. Extensin de la muestra.

2. Fijacin.

3. Cristal violeta 1-2 minutos.

4. Tirar el exceso de colorante (NO lavar con agua!).

5. Aadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (No lavar con agua!)

6. Decolorar con etanol-acetona (20 segundos)

7. Lavar con agua.

8. Aadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto.

9. Lavar con agua.

10. Secar.

11. Observar (100)

5.3 Medida de la turbidez del cultivo.

Se basa en la capacidad de las clulas y partculas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. La turbidez es proporcional al nmero de clulas y puede medirse utilizando un espectrofotmetro. El espectrofotmetro es un aparato que hace pasar la luz a travs de una suspensin celular y detecta la luz no dispersada.

Este instrumento mide la relacin de intensidad entre la luz incidente y la emergente despus de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el n de clulas mayor es la turbidez del cultivo o densidad ptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra. Por tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo, esto es as dentro de ciertos lmites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares y producirse un efecto pantalla de unas clulas sobre otras (en el caso de S. Cerevisiae la relacin entre la DO y la concentracin de clulas es lineal hasta un valor de DO de aproximadamente 0,3). Por tanto, en algunos casos ser necesario diluir la muestra antes de realizar la medida (ej. para hacer una dilucin 1/10 se mezclara 1 ml de cultivo con 9 ml de medio de cultivo o agua). Cuando la dilucin sea alta (mayor de 1/10) conviene hacer diluciones seriadas para reducir el error (ej. para una dilucin 1/50 primero se hace una dilucin 1/10 y despus se hace una dilucin 1/5 de la dilucin 1/10).

Procedimiento

1. Para la determinacin de la curva de crecimiento:

Inocularemos el matraz que contiene el medio de cultivo con un pre inoculo. Mediremos la D.O. a 600 nm y comprobaremos que esta D.O. inicial (to) es aproximadamente de 0.05.

Seguiremos la evolucin de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos durante unas 24 horas. Tomaremos muestras cada dos horas. Y en algunos de estos puntos tendremos que hacer diluciones para medir la D.O.

Representaremos en una grfica los valores de D.O. obtenidos a lo largo del tiempo. La curva obtenida ser la curva de crecimiento del cultivo.

2. Al mismo tiempo haremos una recta patrn usando la cmara de recuento y suspensiones celulares de D.O. conocida. Utilizando esta curva patrn, calcularemos por extrapolacin el n de clulas que corresponden a los valores de D.O. obtenidos en nuestras lecturas al espectrofotmetro y haremos una grfica del n de clulas en funcin del tiempo.

5.4 - Temperatura optima de crecimiento.

a) realizar los preinoculos tomando una cepa al azar de las placas ya aisladas en MDM + Azcar. Y llevar un control del crecimiento a diferentes temperaturas desde 4,10,15,20,23,25,27,29,31,35C.

b) luego graficar los datos obtenidos para cada una de las temperaturas.

5.5 Anlisis sensorial

Se trabajar con un panel no entrenado conformado por 50 individuos, los cuales debern degustar aplicando un anlisis sensorial, en escala hednica a un total de ocho muestras de miche. Utilizando la siguiente metodologa.

Explicar el objetivo de la cata.

Realizar una introduccin acerca del origen y elaboracin del aguardiente.

Para aquellos aromas que pueden ser desconocidos por parte de los participantes; se procede previo al anlisis sensorial a pasar cada uno de ellos por un mesn donde estn unos frascos oscuros de botella de compota tapados; en los cuales se guarda un frotis entre las especies utilizadas para la elaboracin del miche en gaza o algodn.

Desarrollo de la cata en cuatro (4) etapas:

Olfativa

Muestra diluida.

En boca.

Toma de la muestra si lo desea el participante.

Aplicacin de la escala hednica, a travs de la escala de cinco caritas como se muestra en la siguiente figura.

[pic]

Entre cada licor se les har picar queso blanco y quesos maduros; as como chocolate semi amargo y luego agua para limpiar la boca luego de cada muestra.

El rea de aplicacin de la prueba contar con los requisitos mnimos para la realizacin de una cata.

Igualmente se le pedir a cada juez que describa las sensaciones percibidas en cuanto a sabores bsicos: cido, salado, dulce, amargo, umami y las sensaciones de picor y astringencia. Tambin se les pide que traten de identificar los aromas percibidos por ellos. Modificacin parcial a la metodologa propuesta por Torricela y Huerta .2008.

Los resultados de este anlisis sern tratados estadsticamente.

5.6 ANLISIS QUMICOS. DETERMINACION DEL PERFIL DE ALCOHOLES.

Mediante cromatografa de gases se realizara la separacin, identificacin y cuantificacin de los alcoholes presentes en el miche.

1.- toma de muestra.

2.- tratamiento de previo de la muestra. (Filtracin)

3.- dilucin de la muestra.

4.- preservacin de las muestras hasta el momento de la inyeccin e el cromatografo a 4C.

5.- inyeccin de la muestra.

6.- Obtencin del cromatograma. Anlisis cuantitativo y cualitativo.

6.- BIBLIOGRAFIA CITADA.

1) Barnet, J.; Paine, R.; Yarrow, D. 1979. A guide to identifling and classifying yeast. Cambridge university Press.

2) Barnet, J.;Paine, R.; Yarrow, D. 1990.Yeast characteristics and identification. Cambridge. university Press.

3) Benn, M.S.y Peppard, L.T. (1996). Characterization of Tequila Flavor by Instrumental and Sensory Analysis. Journal of Agric. and Food Chemistry 44, 557-56.

4) Boulton, R.B.; Singleton, V.L.; Bisson, L.F.; Kankee, R.E. (1995). Principles and practices of winemaking. New York: Chapman and Hall. 50

5) Caldeira, I., Pereira, M.R., Clmaco, C., Belchior, A. P. y De Sousa, R. B. (2004). Improved method for extraction of aroma compounds in aged brandies and aqueous alcoholic wood extracts using ultrasound. Analytica Chimica Acta 513, 125-134.

6) Cedeo, M. Tequila Production. Critical Rev. Biotech. 1995 15, 1-11.

7) COMISIN VENEZOLANA DE NORMAS INDUSTRIALES (COVENIN) (1997). Bebidas Alcohlicas. Norma 3340.

8) Cuinier, C. 1991. Les levvures seletionnees: interet et utilisation, Vignes et Vins 7:53-57.

9) Delteil, D. 1992. Getione della fermentazione con i lieviti endogici selezionati. Vigne Vini,9:3538.

10) Daz-Plaza, E.M., Reyero, J.R., Pardo, F. Y Salinas, M. R. (2002). Comparison of wine aromas with different tannic content aged in French oak barrels. Analytica Chimica Acta 458, 139-145.

11) Ferreira, V., Ortiz, N., Escudero, A., Lpez, R. Y Cacho, J. (2002). Chemical characterization of the aroma of grenache ros wines. Aroma Extract Dilution Analysis, quantitative determination and sensory reconstitution studies. Journal of Agric. and Food Chemistry 50 (14), 4048-4054.

12) Garcia, M.; Lopez-Mangua, A. 2002. Biotecnologa alimentaria. Editorial Limusa, S.A. de C.V grupo Noriega Editores. Pag 263-267.

13) Geiger E. y Piendl A.; (1975). Tecnologycal factors in the formation of acetolactate and acetohydroxybutyrate during fermentation. Brew Dig. N67, 50-63

14) Gonzlez, Alicia y Valenzuela, Lourdes. Saccharomyces Cerevisiae. Disponible en www.microbiologia.org.mx./ revisado el 22/12/2009.

15) Gonzlez, C. (2001). Noticia histrica sobre el cocuy (Agave cocui) en Falcn. Croizatia. 2(3): 173-186.

16) Kreger Van Rij. 1984. The Yeast: a taxonomyc study. Elsevier Science Publisher. B.V. Amsterdam. 17) Krurtzman, C.; Fell, J. 1998. The yeast. A taxonomic study. 4a Edition. Elsevier Science. B.V. Amsterdam.

18) Lodder, J. 1970. The Yeast, a taxonomic study. Amsterdam. North Holland publishing. 1385pp

19) Maarse, H. Wine, Distilled beverages. In: Volatil compounds in foods and beverages. Marcel Dekker, Inc. The Netherlands 1992,483-580.

20) Melero, R. 1992. Fermentacin controlada y seleccin de levaduras vnicas. Rev. Esp. Cienc. Y tecnol. Aliment 32(4): 379

21) Norma Oficial Mexicana NOM-144-SCFI-2000, Bebidas alcohlicas-CharandaEspecificaciones.

22) Palacios, Llames Hernn. 1956. Fabricacin de alcohol. I edicin. Salvad Editores S.A.

23) Pineiro, Z., Palma, M. y Barroso, C. G. (2004). Determination of terpenoids in wines by solid phase extraction and gas chromatography. Analytica Chimica Acta 513, 209-214.

24) Raposo, M. (1986). Le metanol dans le vins. Lisboa: AGA. Recueil des Mthodes Internationales d Analyse des Vins (1969). O. I. V., AII.

25) Rocha, S. M., Rodrgues, F., Coutinho, P., Delgadillo, I. y Coimbra, M.A. (2004). Volatile composition of Baga red wine assessment of the identification of the would-be impact odorants. Analytica Chimica Acta 513, 257-262.

26) Rodriguez, J.A. 2005. La historia de la caa, azcares, aguardientes y rones en Venezuela. Alfadil Ediciones. 172 pp.

27) Rodrguez, R.; MANGAS, J. (1996). Obtencin de aguardientes de sidra mediante alambique con columna de rectificacin. Alimentaria. 277: 89-93.

28) Rubinson, J.F. Rubinson. (2001). Anlisis Instrumental. Prentice Hall.

29) Snchez-Arreguin, J.A. (2004). Estudio de la Destilacin de mostos fermentados para la elaboracin de mezcal. Tesis de maestra en Ciencias. Instituto Tecnolgico de Celaya. Mxico.

30) Snchez, L. 1998. Manual de elaboracin artesanal del destilado del cocuy. Ediciones CIEPE.

31) Skoog, Douglas A.; F.J. Holle T.A. Nieman. (2001). Principios de Anlisis Instrumental. 5 ed Mc Graw-Hill Interamericana.

32) Skoog, West, Holler. (1997). Qumica Analtica. 6 ed Mc Graw-Hill.

33) Sociedad venezolana de microbiologa. Volumen 23 numero 1.2003.

34) Sarez, L., Iigo, L. 1990. Microbiologia enolgica. Ed. Mundi prensa. Madrid.

35) Steger, C.; Lambrechts, M. (2000). The selection of yeast strains for the production of premium quality South African brandy base products. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 24: 431 440.

36) Te evic, V., Nikicevic, N., Jovanovic, A., Djokovic, D., Vujisic, L., Vuckovic, I. y Bonic, M. (2005). Volatile components from Old Plum Brandies. Food Technology and Biotechnology 43 (4), 367-372.

37) Torricella, R. y Huerta, V. 2008. Anlisis Sensorial aplicado a la restauracin. Editorial Universitaria. Ciudad de La Habana, Cuba.

38) Werner Washburne, M.B., J., Kusic Smither S, J & E.A. Craig. 1989. Yeast h5p70RNA levels cary in response to the physiological satatus of the cell. Journal of bacteriology 171:2680 2688.

NDICE

1.- INTRODUCCION

..2

2.- HIPOTESIS

.3

3.- OBJETIVOS

3.1 GENERAL

.3

3.2 ESPECIFICOS

.3

4.- MARCO TEORICO

4.1 FERMENTACION

.4

4.2 METABOLISMO DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA

..4

4.3 PRODUCTOS DEL METABOLISMO DE LOS

AZUCARES POR LEVADURA

.5

4.4.- ALGUNAS CONSIDERACIONES A TOMAR EN CUENTA EN LA FERMENTACION ALCOHOLICA . 6

4.5.- LEVADURAS

...8

4.6.- AISLAMIENTO DE LEVADURAS

..9

4.7.- CLASIFICACION E IDENTIFICACION DE LEVADURAS

.10

4.8.- SELECCIN DE LEVADURAS

..12

4.9.- AGUARDIENTE

13

4.10.- CROMATOGRAFIA DE GASES

.17

4.10.1.- TERMINOLOGIA EN CROMATOGRAFIA

.19

4.10.2.- CROMATOGRAFIA DE GASES.FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BASICOS ..........................21

4.11.- INSTRUMENTACION

22

4.12.- ANALISIS SENSORIAL

.25

5.- METODOLOGIA

..27

5.1.- AISLAMIENTO DE LEVADURAS

27

5.2.- IDENTIFICACION DE LEVADURAS

.29

5.3.- MEDIDA DE TURBIDEZ DEL CULTIVO

..

31

5.4.- TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO

32

5.5.- ANALISIS SENSORIAL

.32

5.6.- ANALISIS QUIMICOS. DETERMINACION DE ALCOHOLES

..34

6.- BIBLIOGRAFIA

35