Laboratorio de Bioqumica

Ingeniero de Bioprocesos Facultad de Ciencias Qumicas, UASLP

Manual Elaborado por: Dra. Mariana Salgado Bustamante

Nombre del alumno: ___________________________________

Objetivo General: Desarrollar las habilidades bsicas relacionadas con las tcnicas empleadas para el estudio de las biomolculas, procesos metablicos y mecanismos de obtencin de energa. Misin: Formar estudiantes con las habilidades y los conocimientos necesarios para la aplicacin del anlisis de biomolculas, el metabolismo y procesos fisiolgicos de plantas y organismos animales.

Reglamento: 1.- La prctica dar inicio puntualmente, con una tolerancia de 10 minutos despus, una vez transcurrido este tiempo no se permitir la entrada a ningn estudiante. 2.- Es obligatorio el uso de bata blanca de laboratorio durante las prcticas. Cuando se indique deber usar cubre bocas y guantes. 3.- El alumno debe realizar la prctica en orden y deber seguir indicaciones. 4.- No se permite fumar ni el consumo de alimentos o bebidas durante el desarrollo de la prctica. 5.- No se permite ausentarse durante la prctica. 6.- Es obligatorio que el alumno lea la prctica antes de la sesin de laboratorio. 7.- Los alumnos debern limpiar su mesa de trabajo antes y despus de la prctica.

Evaluacin y Acreditacin El programa de teora deber cursarse simultneamente con el laboratorio. Se requiere el 100% de la asistencia a las sesiones prcticas incluyendo las sesiones de discusin. El reporte del alumno consistir en un trabajo escrito que incluir una serie de preguntas donde se examinarn los conocimientos adquiridos y se pedir al alumno que describa sus propias conclusiones del tema adems de una discusin bien documentada acerca de preguntas especificadas por el instructor. El conjunto del desempeo del alumno durante el desarrollo de la prctica, el reporte escrito y la sesin de discusin del tema, constituirn un 20% de la calificacin del curso.

MEDIDAS EN CASO DE ACCIDENTES

INGESTIN DE SUSTANCIAS CORROSIVAS: 1. Evaluar el estado inicial de la persona accidentada y revisar signos vitales. 2. Informarse sobre la sustancia que ingiri. 3. Llevar a la persona al Centro de Salud Universitario e informar al doctor sobre el accidente. QUEMADURAS EN OJOS Y PIEL POR SUSTANCIAS CORROSIVAS 1.- Enjuagar con agua fra la zona accidentada. 2. Buscar en la etiqueta del producto sobre la atencin mdica necesaria. 3. Trasladar a la persona al centro de salud para que sea revisada por el mdico. LESIONES OCASIONADAS POR OBJETOS PUNZOCORTANTES. 1. Evaluar la severidad de la lesin, ver si existe dao en rganos o tejidos. 2. Revisar si el objeto aun se encuentra en el lugar de la lesin y si es posible retirarlo sin causar ms dao. 3. Enjuagar con agua potable fra. 4. Si el sangrado no es abundante aplicar presin intentando frenar la hemorragia. 5. Si el sangrado es abundante, trasladar al paciente para recibir atencin mdica.

TEMA I. Protenas y enzimas Cintica enzimtica Introduccin. La cintica enzimtica o enzimologa, se encarga de estudiar los cambios en la velocidad de las reacciones enzimticas en funcin de diversos factores, como son la concentracin del sustrato, la concentracin de la enzima, el pH, la temperatura y el tiempo de reaccin. El anlisis de estos factores permite conocer la naturaleza de la reaccin enzimtica, como: el orden en que los sustratos y productos se alejan de la enzima y la clase de complejos enzima-sustrato y enzima-producto que se forman. De las constantes cinticas puede deducirse la concentracin intracelular de sustratos y productos, as como la direccin fisiolgica de la reaccin. La cintica de una reaccin puede tambin indicar la forma en que la actividad de la enzima se regula "in vivo".

Sesin 1. Efecto de la concentracin de sustrato y de enzima sobre la velocidad de una reaccin enzimtica. Cuando la reaccin enzimtica se lleva a cabo en presencia de diferentes concentraciones de sustrato, permaneciendo constante la concentracin de la enzima y los factores fisicoqumicos principales, la velocidad de la reaccin aumenta en forma directamente proporcional a la concentracin de sustrato hasta que se alcanza una velocidad mxima (Vmax). Al llegar a la V max cualquier aumento en la concentracin del sustrato no cambia la velocidad de la reaccin debido a que las enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgnicos, tienen un punto de saturacin de sus sitios activos con el sustrato. La concentracin de sustrato requerida para alcanzar la mitad de la Vmax corresponde a una constante caracterstica de cada enzima denominada Km, o constante de Michaelis Menten (fig.1). La afinidad de la enzima por su sustrato vara en forma inversa con el valor de Km, siempre y cuando la velocidad del cambio del complejo enzima-sustrato a producto sea despreciable. En cualquier situacin experimental la Vmax depende de la cantidad de enzima presente.

Figura 1. Representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten. Si realizara un experimento con 1 mol de enzima, la actividad resultante sera el nmero de recambio. En los casos en que la enzima contiene ms de un sitio activo por molcula, se corrige el nmero de recambio para obtener el recambio por mol de sitio activo de enzima. Los nmeros de recambio son de gran valor para comparar la actividad de la misma enzima en diferentes tejidos o tambin las isoenzimas (isoforma proteica) de una misma enzima. En esta prctica se analizar la reaccin enzimtica de la enzima ureasa, la cual cataliza la hidrlisis de urea y su conversin a carbonato de amonio. Tiene una actividad ptima a 50 C y a un pH de 7.2. Para medir la velocidad relativa de la reaccin catalizada por la ureasa, se cuantificar la cantidad de carbonato de amonio formado mediante titulacin con HCl. La reaccin del carbonato de amonio con el HCl origina la formacin de cloruro de amonio. Ya que la urea que se utilizar en el experimento puede hidrolizarse de manera espontnea por efecto de la manipulacin, el tiempo y la temperatura, se incluir un blanco sin enzima para determinar la urea hidrolizada inespecficamente. Cuestionario Pre-laboratorio. 1. Escriba la frmula matemtica de la ecuacin de Michaelis-Menten. Explique el significado de las variables y las constantes. 2. Escriba la reaccin qumica que cataliza la ureasa con frmulas desarrolladas. 4. Escriba la definicin del nmero de recambio.

Objetivo. Estudiar el efecto del incremento gradual en la concentracin de sustrato y la concentracin de la enzima sobre la velocidad de una reaccin enzimtica. Materiales y mtodos. Reactivos. Solucin de urea 0.25 M; indicador rojo de metilo 0.04%; solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.2; solucin de HCl 0.1 N.

Material biolgico. Extracto de harina de soya.

Mtodo experimental parte I. 1. Prepare una serie de tubos como sigue: Tubo Blanco 1 2 3 4 5 Urea 0.25 M (ml) 1.5 0.1 0.2 0.4 1.0 1.5 Amortiguador pH 7.2 (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agua (ml) 0.5 1.8 1.7 1.5 0.9 0.4 Pre-incubacin (5 min) 50C 50C 50C 50C 50C 50C Ureasa (ml) ----0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

2. 3. 4.

Una vez que ha adicionado la enzima incube a 50 C durante 30 min. Enfre los tubos pasndolos a un bao de hielo. Tome una alcuota de 1 ml de cada uno de los tubos empleando un matraz diferente por cada reaccin.

5. 6.

Aada 2 ml de agua destilada y unas gotas de rojo de metilo al 0.04 %. Titule en fro cada uno de los matraces con HCl 0.01 N hasta obtener una coloracin canela.

7.

Reste al volumen utilizado en la titulacin de cada matraz, el volumen gastado en el tubo blanco.

Mtodo experimental parte II. 1. Prepare una serie de tubos como sigue: Tubo Blanco 1 2 3 4 5 Urea 0.25 M (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Amortiguador pH 7.2 (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agua (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 ----Pre-incubacin (5 min) 50C 50C 50C 50C 50C 50C Ureasa (ml) ----0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

2. Una vez que ha adicionado la enzima incube a 50C durante 30 min. 3. Detenga la reaccin colocando los tubos en bao de hielo. 4. Titule tal como lo hizo para la variacin de sustrato, restando el volumen gastado en el tubo blanco. Reporte. 1. Complete los siguientes cuadros de datos experimentales: Tubo Blanco 1 2 3 4 5 Volumen de urea (ml) Volumen de HCl (ml) Volumen corregido de HCl (ml)

Tubo Blanco 1 2 3 4

Volumen de ureasa (ml)

Volumen de HCl (ml)

Volumen corregido de HCl (ml)

2. Con los datos de los cuadros de resultados calcule: moles de sustrato y moles de producto formado por accin de la ureasa en cada caso. 3. Elabore una grfica de moles de producto vs. moles de sustrato y otra grfica de moles de producto vs. Volumen de enzima (ml). 4. Escriba las conclusiones personales acerca de la sesin de laboratorio.

TEMA I. Protenas y enzimas Cintica enzimtica

Efecto de factores fisicoqumicos sobre la velocidad de una reaccin enzimtica. La estructura proteica y su conformacin determinan la actividad, por lo tanto, cualquier factor fsico y qumico, que altere la estructura y conformacin de las enzimas, tiene como consecuencia una alteracin en su actividad.

Sesin 2. Efecto de la temperatura, pH y tiempo de reaccin sobre la velocidad de las reacciones enzimticas. Las enzimas muestran fragilidad trmica, es decir que tienen una temperatura ptima en la cual presentan su actividad mxima. En general, el intervalo de temperatura adecuada para que se lleven a cabo las reacciones enzimticas es estrecho, entre 30C y 40C y an pequeos cambios tienen una considerable influencia sobre la actividad. Para la mayora de las enzimas la regin de inactivacin trmica est prxima a la temperatura ptima. La actividad enzimtica tambin est relacionada con el estado inico de la molcula, ya que las cadenas polipeptdicas contienen grupos que pueden ionizarse por efecto del pH. Las enzimas tienen un pH ptimo, el cual depende de su naturaleza qumica, es decir de su estructura primaria. La actividad cataltica de las enzimas puede expresarse como actividad especfica. Durante un procedimiento de purificacin de una enzima se espera que la actividad especfica sea mxima cuando toda la protena de la muestra es enzima. Cuestionario Pre-laboratorio. 1. Escriba la definicin de actividad especfica de las enzimas. 3. Describa cmo afectan los factores fisicoqumicos la actividad enzimtica, explique cada uno. Objetivo. Analizar el efecto de algunos factores fisicoqumicos como son la temperatura, el pH y el tiempo de reaccin, sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.

Materiales y mtodos. Reactivos Solucin de urea 0.25 M; Indicador rojo de metilo 0.04%; Solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.2; Solucin de HCl 0.1 N. Material biolgico: extracto de harina de soya.

Mtodo experimental I. Variacin de temperatura. 1. Prepare una serie de tubos como sigue: Urea Tubo 0.25 M (ml) Blanco 1 2 3 4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Amortiguador pH 7.2 (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agua (ml) 0.5 0.4 0.4 0.4 0.4 PreIncubacin (5 min) 50C 0C T. ambiente 50C 95C Ureasa (ml) ----0.1 0.1 0.1 0.1 Incubacin (30 min) 50C 0C T. ambiente 50C 95C

2. 3.

Detenga la reaccin colocando los tubos en hielo. Titule como lo hizo en la prctica de la variacin de sustrato, restando el volumen gastado en el tubo blanco.

Mtodo experimental II. Variacin de pH. 1. Prepare una serie de tubos como sigue Tubos blanco B1 B2 B3 B4 B5 Urea 0.25 M (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0.5 ml pH 5 0.5 ml pH 6 0.5 ml pH 7.2 0.5 ml pH 8.0 0.5 ml pH 8.5 Amortiguador Agua (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Preincubacin (5 min) 50C 50C 50C 50C 50C Ureasa (ml) ----------------------Incubacin 30 min 50C 50C 50C 50C 50C

Tubos Problema P1 P2 P3 P4 P5

Urea 0.25 M (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0.5 ml pH 5 0.5 ml pH 6 0.5 ml pH 7.2 0.5 ml pH 8.0 0.5 ml pH 8.5 Amortiguador

Agua (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Preincubacin (5 min) 50C 50C 50C 50C 50C

Ureasa (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Incubacin 30 min 50C 50C 50C 50C 50C

2.

Titule como en los experimentos anteriores, restando el volumen gastado en los tubos blanco. Para el tubo 1 (pH 5) titule usando como indicador anaranjado de metilo.

Mtodo experimental III. Variacin de tiempo. 1. Prepare una serie de tubos como sigue: Tubo Blanco 1 Urea 0.25 M (ml) 2.0 2.0 Amortiguador pH 7.2 (ml) 0.5 0.5 Agua (ml) 1.0 0.9 Preincubacin (5 min) 50C 50C Ureasa (ml) ----0.1

2.

Una vez que se aada la enzima a ambos tubos incube a 50C y tome una alcuota de 1 ml de cada tubo, a los 10, 20 y 30 minutos.

Reporte. 1. Complete los siguientes cuadros de datos experimentales: Tubo Blanco 1 2 3 4 Temperatura (C) Volumen de HCl (ml) Volumen corregido de HCl (ml)

Tubo B1 B2 B3 B4 B5 P1 P2 P3 P4 P5

pH

Volumen de HCl (ml)

Volumen corregido de HCl (ml)

Tubo

Tiempo de reaccin (min) 10

Volumen de HCl (ml)

Volumen corregido de HCl (ml)

Blanco

20 30 10

20 30

2. Con los datos anteriores calcule los moles de producto obtenidos por accin de la ureasa y elabore la grfica de: moles de producto Vs. Temperatura y moles de producto Vs. pH y moles de producto vs. tiempo. 3. Qu sucede cuando las enzimas se encuentran a temperaturas superiores a los 50C? 4. Cules son las unidades en las que se reporta la actividad enzimtica? 5. Escriba sus conclusiones acerca de los resultados de stos experimentos.

TEMA II. Metabolismo de carbohidratos y lpidos

Introduccin. Los carbohidratos son las molculas orgnicas ms abundantes de la naturaleza. Tienen una gran variedad de funciones, entre ellas, la provisin de una fraccin significativa de la energa en la mayora de los organismos, almacenamiento de energa en el cuerpo y como componentes de la membrana celular que median algunas formas de comunicacin intercelular. Los monosacridos pueden clasificarse segn el nmero de tomos de carbono que contienen. Los carbohidratos con un aldehdo como grupo funcional ms oxidado se denominan aldosas, mientras que los que tienen el grupo ceto como grupo funcional ms oxidado se denominan cetosas. Los disacridos contienen dos unidades de monosacridos, los oligosacridos de tres hasta aproximadamente 10 unidades, y los polisacridos de 10 a varios centenares de unidades de azcar. Sesin 3. Digestin de carbohidratos. Los principales sitios de digestin de los carbohidratos de la dieta son la boca y la luz intestinal. Esta digestin es rpida y generalmente se ha completado cuando el contenido del estmago alcanza la unin del duodeno con el yeyuno. Las enzimas necesarias para degradar la mayora de los carbohidratos de la dieta son principalmente endoglucosidasas, (hidrolizan oligosacridos y polisacridos) y disacaridasas. La hidrlisis de los enlaces glucosdicos es catalizada por una familia de glucosidasas que degradan los hidratos de carbono a sus componentes. Estas enzimas suelen ser especficas para la estructura y la configuracin del residuo glucosilo que se va a eliminar, as como para el tipo de enlace que se va a romper.

Cuestionario Pre-laboratorio. 1. Escriba la diferencia entre la estructura del almidn y el glucgeno. 2. Explique qu tipos de enlace escinde la - amilasa y qu productos se obtienen de su accin. 3. Describa los productos que se obtienen por accin de la sacarasa.

Objetivo.

Comprobar la hidrlisis del almidn por accin de la -amilasa salival y la amilasa pancretica, as como estudiar la hidrlisis de la sacarosa por accin de la sacarasa. Materiales y mtodos. Reactivos. Almidn al 1 %; NaCl al 1 %; HCl 0.1M; amortiguador de fosfatos pH 6.8; lugol; sacarosa al 1 %, amortiguador de fosfatos pH 5.8; Na2CO3 1 M; reactivo de Benedict. Material biolgico. Saliva, solucin de extracto pancretico comercia; solucin acuosa de levadura.

Mtodo experimental para cuantificar la actividad de la amilasa salival. 1. 2. Prepare un tubo de ensaye con 5 ml de almidn al 1 %. Aada 1 ml de NaCl al 1 % y 2 ml de amortiguador de fosfatos pH 6.8 e incube a 37 C. 3. Dos minutos despus aada al tubo 10 gotas de saliva, siga manteniendo el tubo a 37 C durante todo el experimento. 4. Despus cada 2 minutos transfiera una gota del contenido del tubo a una placa excavada (agite regularmente cada minuto), aada una gota de HCl 0.1 M y una gota de lugol. Aparecer un precipitado color azul marino. 5. Repita esta operacin hasta que desaparezca el precipitado.

Mtodo experimental para cuantificar la actividad de la amilasa pancretica. 1. 2. 3. 4. 5. Coloque en un tubo de ensaye 5 ml de solucin de almidn 1 %. Agregue 2 ml de amortiguador de fosfatos pH 8.0. Incube en bao de agua a 37 C durante 5 min. Aada 2 ml de extracto pancretico y contine la incubacin durante 30 min. Despus de la incubacin divida la solucin en dos partes y con la primera efecte la prueba de lugol. 6. Con la segunda parte realice la prueba de Benedict.

Actividad de la sacarasa. Los procesos digestivos finales se llevan acabo en el revestimiento de la mucosa del yeyuno superior, disminuyendo a medida que se progresa hacia el intestino delgado.

En este proceso participan varias disacaridasas y oligosacaridasas. Por ejemplo, la isomaltasa, maltasa, lactasa y sacarasa. Mtodo experimental. 1. 2. 3. Prepare un tubo de ensaye con 0.5 ml de solucin enzimtica. Adale 0.5 ml de sacarosa al 1 %. A continuacin agregue 0.5 ml de amortiguador de fosfatos pH 5.8, mezcle y repose la solucin 30 min a temperatura ambiente. 4. Neutralice con Na2CO3 1 M y efecte la prueba de Benedict.

Nota: Los residuos generados en esta prctica pueden ser eliminados en el drenaje.

Reporte. 1. Describa sus observaciones de la actividad de la amilasa salival. Indique el tiempo requerido para la desaparicin del almidn. 2. Escriba las principales enzimas contiene el extracto pancretico. 3. Explique por qu la prueba de benedict antes de la accin de la sacarasa era negativa y despus de la hidrlisis es positiva. 4. Escriba sus conclusiones.

TEMA II. Metabolismo de carbohidratos y lpidos

Sesin 4. Metabolismo de carbohidratos en hgado y msculo. Introduccin. Los principales depsitos de glucgeno del organismo se encuentran en el msculo esqueltico y en el hgado, aunque la mayora de las dems clulas almacenan pequeas cantidades de glucgeno para su propio uso. La funcin de glucgeno del msculo es servir como reserva de combustible para la sntesis de trifosfato de adenosina (ATP) durante la contraccin muscular. La del glocgeno heptico es mantener la concentracin de glucosa en sangre, en particular durante las primeras etapas del ayuno. El (14). Las reservas hepticas de glucgeno aumentan durante un estado posprandial y se agotan durante el ayuno. El glucgeno muscular no se ve afectado por perodos cortos de ayuno (unos pocos das) y slo disminuye moderadamente en el ayuno prolongado (semanas). El glucgeno muscular se sintetiza para restaurar las reservas musculares una vez han sido agotadas. Por ejemplo tras un ejercicio extenuante. La ruta degradativa que moviliza el glucgeno almacenado en el hgado y el msculo esqueltico no es la inversa de las reacciones sintticas, sino que precisa un conjunto distinto de enzimas citoslicas. Cuando se degrada el glucgeno, el producto principal es la glucosa 1-fosfato, que se obtiene al romper los enlaces glucosdicos (14). Adems, se libera glucosa libre a partir de cada residuo glucosilo unido por un enlace (16). Todos Los tejidos utilizan la ruta glucoltica para degradar la glucosa con el fin de proporcionar energa y productos intermedios para otras rutas metablicas. La gluclisis constituye el ncleo central del metabolismo de los hidratos de carbono porque prcticamente todos los azcares pueden convertirse en ltima instancia en glucosa. La gluclisis aerobia prepara el camino para la descarboxilacin oxidativa del piruvato a aceil-CoA, un combustible principal del ciclo del cido ctrico. La alternativa es la reduccin del piruvato a lactato a medida que el NADH se oxida a NAD+. Esta conversin de glucosa a lactato se denomina gluclisis anaerobia porque puede producirse sin la participacin de oxigeno. glucgeno es un homopolisacarido de cadena ramificada formado exclusivamente a partir de -D-glucosa. El enlace glucosdico principal es un enlace

Objetivo. Comprender las diferencias en el metabolismo de los carbohidratos en el hgado y en el msculo. Reactivos. MgCl2 al 10 %; almidn al 2 % en amortiguador de fosfatos pH 7.4; lugol; fenoftalena; NaOH 0.05 N; cido tricloroactico al 4 %; Kit comercial para la determinacin de glucosa oxidasa. Material biolgico Hgado y msculo de conejo. Mtodo experimental. 1. 2. 3. Sacrifique un conejo anestesindolo con cloroformo. Extraiga hgado, y msculo de las patas traseras. Homogenice el msculo y el hgado con 300 ml y 200 ml de agua destilada helada, respectivamente. 4. Centrifugue a 3500 rpm durante 5 min, separe sobrenadante en otro tubo y mantenga en refrigeracin. 5. 6. Prepare dos matraz etiquete uno como hgado y otro como msculo. Aada al matraz correspondiente 15 ml de extracto de hgado y 15 ml de extracto de msculo. 7. 8. Agregue a los dos matraz 0.5 ml de MgCl2 al 10 % y 10 ml de almidn al 2 %. Mezcle e inmediatamente tome muestras de cada matraz (tiempo cero), para realizar las pruebas de almidn, cido lctico y glucosa. 9. Incube los dos matraz a 37 C en bao de agua durante toda la prctica. Agtelos cada 3 min. 10. Realice la determinacin de almidn, cido lctico y glucosa en cada matraz a los 30 y 60 min. Determinacin de almidn. 1. 2. Tome una gota del contenido de cada matraz y psela a una placa excavada. Aada una gota de cido clorhdrico 0.1 M y una gota de lugol. La aparicin de un precipitado azul marino indica la presencia de almidn. Determinacin de cido lctico 1. Filtre 4 ml de cada muestra por separado (moje primero el papel filtro con agua destilada). 2. Coloque 3 ml del filtrado en un matraz y etiqutelo.

3. 4.

Aada dos gotas de fenolftalena. Titule con NaOH 0.05 N.

Determinacin de glucosa por el mtodo de glucosa oxidasa. 1. Transfiera 2 ml del extracto de hgado y msculo a dos tubos diferentes, por separado. 2. Adales 4 ml de cido tricloroactico al 4 % a cada tubo. Mezcle fuertemente y filtre. El filtrado contiene glucosa libre. 3. Prepare una serie de tubos como se describe a continuacin.

Tubo Blanco Estndar Problema

Agua destilada (l) 20

Sol'n estndar (l)

Sol'n problema (l)

Reactivo de color (ml) 2.0

20 20

2.0 2.0

4.

Deje reposar a temperatura ambiente durante 20 min o incube a 37 C durante 10 min.

5. 6.

Determinar la densidad ptica a 520 nm, ajustando a 0 con el tubo blanco. Complete la siguiente tabla con sus datos.

Tejido

Tiempo (min) 0

Almidn

Ac. lctico (Vol. NaOH 0.05 N)

Glucosa (absorbancia)

Hgado

30 60 0

Msculo

30 60

Reporte. 1. Explique por qu es necesario el tratamiento con cido tricloroactico. 2. Calcule a la concentracin de cido lctico y glucosa en cada muestra, y complete la siguiente tabla: Tejido Tiempo (min) 0 Hgado 30 60 0 Msculo 30 60 cido lctico (N) Glucosa (mg/dl)

3. Escriba sus conclusiones.

TEMA II. Metabolismo de carbohidratos y lpidos

Sesin 5. Digestin de lpidos. Introduccin. Aproximadamente el 90 % de los lpidos de la dieta son triglicridos, el resto est constituido por esteres de colesterol, esteroles vegetales y diversos fosfolpidos. La digestin de los lpidos se inicia en el estmago mediante una lipasa cida estable que se origina en las glndulas de la parte posterior de la lengua, esta lipasa hidroliza a los triacilglicridos que se encuentran en la superficie de las gotas de grasa de los alimentos. Las molculas de triacilglicridos, especialmente las que contienen cidos grasos de cadena corta o media, constituyen la diana principal de esta enzima. Los cidos grasos de cadena corta son absorbidos en el estmago. El contenido del estmago es vaciado al intestino delgado desencadenndose la secrecin de la hormona

colescistoquinina por la mucosa intestinal, esta hormona a su vez induce la secrecin del contenido pancretico y de la vescula biliar. La accin combinada de las sales biliares y las enzimas pancreticas (lipasa pancretica, fosfolipasa A2, colesterol esterasa) ocurren en forma simultnea dando como producto final: 2-monoacilglicridos, glicerol, colesterol, lisofosfoglicridos y cidos grasos libres. Objetivo. Comprender la accin de la lipasa pancretica sobre la digestin de las grasas y la influencia que tiene la bilis sobre esta actividad. Actividad de la lipasa pancretica. Las molculas de triacilglicridos son demasiado grandes para ser absorbidas eficazmente por las clulas mucosas de las vellosidades intestinales; por esta razn acta una esterasa, la lipasa pancretica, que elimina con preferencia los cidos grasos esterificados en los carbono 1 y 3. Los productos principales de la hidrlisis constituyen una mezcla de 1,2-diacilglicerol, 2,3-diacilglicerol, 2-monoacilglicerol y cidos grasos libres. Reactivos. Emulsin de grasa conteniendo rojo de fenol como indicador. Material biolgico: Solucin de extracto pancretico comercial.

Mtodo experimental. 1. 2. 3. Prepare un tubo de ensaye con 3 ml de extracto pancretico. Aada 6 ml de emulsin de grasa e incube a 37 C durante 20 min. De ser necesario, contine incubando hasta la decoloracin total de la solucin del tubo. Nota: Los residuos generados pueden ser eliminados en el drenaje. Influencia de la bilis sobre la tensin superficial. La bilis consta de una mezcla acuosa de compuestos orgnicos (sale y/o cidos biliares, fosfatidilcolina, colesterol y lecitina) e inorgnicos; puede pasar directamente del hgado, donde se sintetiza, al duodeno a travs del conducto biliar comn, o bien puede almacenarse en la vescula biliar cuando no se necesita inmediatamente para la digestin. La secrecin de la bilis es regulada por la hormona colecistocinina, en respuesta a la presencia de triacilglicridos de la dieta en el intestino delgado. Los cidos biliares poseen a la vez una cara polar y una apolar y pueden actuar como agentes emulsionantes en el intestino, contribuyendo a la preparacin de los triglicridos de la dieta para que puedan ser degradados por las enzimas digestivas pancreticas. Reactivos. Azufre en polvo. Material biolgico: Solucin acuosa de bilis. Mtodo experimental. 1. Prepare dos tubos de ensaye: Tubo # 1, coloque 5 ml de solucin de bilis diluida 1:3. Tubo # 2, agregue 5 ml de agua. 2. Espolvoree un poco de azufre en polvo sobre la superficie de los tubos.

Nota: Los residuos generados pueden ser eliminados en el drenaje. Influencia de las sales biliares sobre la actividad de la lipasa. Antes de abandonar el hgado, los cidos biliares se conjugan con una molcula de glicina o de taurina para formar las sales biliares. Por su naturaleza ms anfiptica, las sales biliares son detergentes ms eficientes que los cidos biliares. El proceso crucial de emulsin de los lpidos del alimento tiene lugar en el duodeno y se lleva a cabo mediante el uso de las propiedades detergentes de las sales biliares y el proceso mecnico de mezcla por peristaltismo. La superficie hidrfoba de la molcula de la sal biliar se asocia con el triacilglicerol y varios complejos de este tipo se agregan para formar una micela. La superficie polar de las sales biliares queda hacia fuera, permitiendo a la micela asociarse con la lipasa pancretica. La accin de esta enzima libera los cidos

grasos para que se asocien en micelas mucho ms pequeas que pueden absorberse a travs de la mucosa intestinal. Reactivos. Extracto pancretico; emulsin de grasa sin indicador; fenolftalena; NaOH 0.05 N. Material biolgico: Solucin acuosa neutra de bilis. Mtodo experimental. 1. Prepare dos tubos de ensaye, a cada uno agregue 5 ml de emulsin de grasa y 2 ml de extracto pancretico. 2. 3. Incbelos en bao de agua a 37 C. Inmediatamente aada lo siguiente: Tubo # 1; 1 ml de solucin de bilis neutralizada. Tubo # 2; 1 ml de agua destilada. 4. Agite y continu la incubacin por 1 h ms, teniendo cuidado de agitar los tubos cada 5 min durante este tiempo. 5. Retire los tubos de la incubacin y aada a cada tubo 5 gotas de fenolftalena y titule con NaOH 0.05 N hasta la aparicin de una coloracin rosa. Nota: Los residuos generados pueden ser eliminados en el drenaje. Reporte. 1. Anote de manera clara las observaciones de los experimentos 2. Qu componentes de la bilis forman micelas con los lpidos? 3. Explique a que se deben las diferencias entre los tubos con bilis y sin bilis. 4. Escriba los resultados del volumen gastado de NaOH en los diferentes experimentos, basndose en los datos que tiene, calcule los moles de cidos grasos que contiene cada tubo; explique sus resultados. 5. Escriba la frmula qumica de un 1, palmitil, 2, olel, 3 fosfatidilserina. Seale los productos que se obtendran por accin de: a) fosfolipasa A1 b) fosfolipasa A2 c) fosfolipasa C d) fosfolipasa D 6. Escriba de manera clara las conclusiones de la prctica.

TEMA II. Metabolismo de carbohidratos y lpidos

Sesin 6. Influencia de la dieta en los niveles de colesterol sanguneo. Introduccin. El colesterol es un compuesto hidrfobo, que consta de cuatro anillos hidrocarbonados condensados (A, B, C y D denominados ncleo esteroideo) y presenta una cadena hidrocarbonada ramificada de 8 carbonos unida al C-17 del anillo D. En los seres humanos, la sntesis del colesterol se lleva a cabo en todos los tejidos, sin embargo, el hgado, el intestino, la corteza suprarrenal y las gnadas son los principales rganos que producen y contribuyen a la reserva de colesterol del organismo. Una alta ingesta de grasas en la dieta aumenta los niveles de los lpidos en el plasma, en especial el colesterol. De esta manera, la existencia sostenida de niveles elevados de colesterol-LDL, incrementa el riesgo de sufrir eventos cardiovasculares (principalmente infarto de miocardio). En contraste, el colesterol presente en las

lipoprotenas de alta densidad (HDL) y que resulta del transporte de colesterol de los
tejidos perifricos al hgado, ejerce un papel protector. Se ha definido clnicamente que, los niveles de colesterol plasmtico total es decir, la suma del colesterol presente en todas las clases de lipoprotenas son:

Niveles de colesterol en sangre menores a 200 mg/dl: es la concentracin deseable para la poblacin general sin riesgo de enfermedades cardiovasculares.

Niveles de colesterol en sangre entre 200 y 239 mg/dl: existe un riesgo intermedio en la poblacin general, que puede resultar muy importante para personas con otros factores de riesgo como diabetes mellitus.

Niveles de colesterol en sangre con valores superiores a 240 mg/dl: alto riesgo cardiovascular y se recomienda iniciar un cambio en el estilo de vida, sobre todo en la dieta y se recomienda el ejercicio fsico.

Objetivo. Comprender la influencia de las grasas de la dieta sobre los niveles de colesterol sanguneo. Reactivos. Kit comercial para la determinacin de colesterol. Material biolgico. Ratas; alimento rico en grasas (tocino, chorizo y chicharrn).

Mtodo experimental. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Alimente a dos ratas con una dieta rica en grasas, durante los tres das previos a la prctica. La rata denominada control, se mantendr en ayuno durante 24 h previas a la prctica. Al inicio de la prctica, anestesiar las tres ratas con ter y extraer 5 ml de sangre por va intracardiaca. Recolecte la sangre en un tubo centrifuga. Deje coagular la sangre y centrifugue a 2500 rpm durante 10 min para la obtencin del suero. Transfiera cuidadosamente el suero a un tubo limpio empleando una pipeta pasteur evitando resuspender el coagulo. Prepare 3 tubos de ensaye como se describe a continuacin: Tubo Blanco Estndar Problema 4. 5. Reactivo color 2 ml 2 ml 2 ml Agua destilada 20 l --------Estndar ----20.0 l ----Muestra (suero o plasma) --------20 l

Mezcle e incube a 37 C durante 10 min. Determinar la densidad ptica a 520 nm, ajustando a 0 con el tubo blanco. Complete la siguiente tabla: Tubo Estndar Problema 1 Problema 2 Absorbancia

Nota: Los residuos generados en esta prctica pueden ser eliminados en el drenaje.

Reporte. 1. Escriba 3 factores que pueden aumentar y tres que disminuyen los niveles de colesterol en sangre. 2. Mencione las cifras normales de colesterol en sangre. 3. Cules son las lipoprotenas que transportan el colesterol del hgado a los tejidos perifricos? 4. Cules son las lipoprotenas que transportan el colesterol de los tejidos perifricos al hgado? 5. Escriba la frmula de tres compuestos son sintetizados a partir del colesterol 6. Cmo se elimina el colesterol en los humanos? 7. Qu enzima es responsable de la regulacin de la biosntesis del colesterol? 8. Calcule la concentracin de colesterol en mg/dl en cada muestra. 9. Escriba sus conclusiones.

TEMA III. Metabolismo de aminocidos y cidos nucleicos.

Sesin 7. Reacciones de Transaminacin. Introduccin. La presencia del grupo -amino protege a los aminocidos eficazmente contra la degradacin oxidativa. La eliminacin del grupo -amino es esencial para la generacin de energa a partir de cualquier aminocido, y es una etapa obligatoria en el catabolismo de todos los aminocidos. Una vez eliminado, su nitrgeno puede incorporarse en otros compuestos o puede excretarse y los esqueletos carbonados se metabolizarn. La primera etapa del catabolismo de la mayora de los aminocidos es la transferencia de su grupo -amino a un compuesto aceptor: el -cetoglutarato. Los productos son un -cetocido (derivado del aminocido original) y el glutamato. Esta transferencia de grupos amino desde un esqueleto de carbono a otro est catalizada por una familia de enzimas denominadas aminotransferasas (antes denominadas

transaminasas). Las aminotransferasas se nombran en funcin del compuesto dador especfico de grupos amino, pues el aceptor del grupo amino es por lo general el -cetoglutarato. Las reacciones ms importantes de la aminotransferasa son catalizadas por la alanina aminotransferasa anteriormente (ALT) y la aspartato aminotransferasa (TGP) y (AST), denominadas

glutamato-piruvato

transaminasa

glutamato-oxalacetato

transaminasa (TGO), respectivamente. Las reacciones catalizadas por las aminotransferasas son reversibles y todas requieren de fosfato de piridoxal (un derivado de la vitamina B6) como coenzima, la cual est unida covalentemente al grupo -amino de un residuo de la lisina especfico situado en el sitio activo de la enzima. Las aminotransferasas actan transfiriendo el grupo amino de un aminocido al piridoxal de la coenzima para generar fosfato de piridoxamina. La forma piridoxamina de la coenzima reacciona despus con un -cetocido para formar un aminocido, al mismo tiempo que regenera la forma aldehdo original de la coenzima. Objetivo. Determinar la actividad enzimtica de las aminotransferasas: alanina

aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST), extradas de tejido heptico de rata.

Determinacin de la actividad enzimtica de la ALT Y AST. La ALT esta presente en muchos tejidos, cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al cetoglutarato, a partir del cual se forma piruvato y glutamato. Durante el catabolismo de aminocidos, la AST transfiere grupos amino del aspartato al cetoglutarato, formando glutamato y oxalacetato. Ambas reacciones son reversibles.

Nota: Se indicar el mtodo que se utilizara para la determinacin.

Mtodo colorimtrico Reactivos. Amortiguador de fosfatos pH 7.4, Kit comercial para determinar la actividad de las aminotransferasas. NaOH 0.4 N; Material biolgico: Hgado de rata. Mtodo experimental. 1. 2. Sacrifique una rata y extraiga el hgado. Pese el hgado y homogenice aadiendo el volumen correspondiente de amortiguador de fosfato de pH 7.4 (10 ml por cada gramo de peso). 3. 4. 5. Deje reposar 5 min, para que sedimente el tejido y mantenga en refrigeracin. Prepare una dilucin 1:20 del sobrenadante con agua destilada. Prepare 6 tubos de ensaye y proceda como se describe a continuacin:

Tubo

Sustrato (ml)

Sol. Estndar (ml)

Incubar 37C

Dil 1:20 sobrenadante (ml) ALT

Mezclar e incubar 37C

Reactivo de color* (ml)

Agua destilada (ml)

Blanco Estndar Problema

0.5 0.5 0.5

----0.1 -----

5 min 5 min 5 min AST

--------0.1

30 min 30 min 30 min

0.5 0.5 0.5

0.1 ---------

Blanco Estndar Problema

0.5 0.5 0.5

----0.1 -----

5 min 5 min 5 min 0.1

30 min 30 min 30 min

0.5 0.5 0.5

0.1 ---------

* 2,4-Nitrofenilhidrazina

6. 7.

Mezclar y reposar 20 minutos a temperatura ambiente. A continuacin pare la reaccin aadiendo a cada tubo 5.0 ml. de NaOH 0.4 N, reposar 5 min. Se desarrollara un complejo color caf.

8.

Determine la densidad ptica a 546 nm ajustando a 0 con el tubo blanco correspondiente.

9.

Complete la siguiente tabla:

Tubo ALT Estndar Problema AST Estndar Problema

Absorbancia

Mtodo ultravioleta (coeficiente de extincin molar). Reactivos. Amortiguador de fosfatos pH 7.4, Kit comercial para determinar la actividad de las aminotransferasas; material biolgico: Hgado de rata. Mtodo experimental. 1. 2. Sacrifique una rata y extraiga el hgado. Pese el hgado y homogenice aadiendo el volumen correspondiente de amortiguador de fosfato de pH 7.4 (10 ml por cada 1 g de peso). 3. 4. 5. Deje reposar el homogenizado durante 5 min. Prepare una dilucin 1:20 del sobrenadante con agua destilada. Prepare 2 tubos de ensaye como se describe a continuacin:

Tubo

Sustrato (ml)* AST

Dil 1:20 sobrenadante (ml)

Problema

0.5 ALT

0.1

Problema

0.5

0.1

6. 7.

Determine la densidad ptica a 340 nm ajustando a 0 con aire a diferentes tiempos. Complete la siguiente tabla: Absorbancia

Tiempo (min)

Absorbancia ALT

0 1 2 3 4 Promedio AST 0 1 2 3 4 Promedio

---------

---------

Reporte. 1. Escribe con formulas la reaccin de la aminotransferasa con -cetoglutarato como receptor del grupo amino, debe incluir la participacin del fosfato de piridoxal. 2. Cules son los valores normales de ALT y AST en suero humano? 3. Escriba tres razones clnicas por las cuales se cuantifica ALT y AST. 4. Con los datos obtenidos, calcule la concentracin de enzimas en U/l. 5. Escriba sus conclusiones.

TEMA IV. Bioenergtica Sesin 9. Reacciones de oxidacin de cadena respiratoria. Introduccin. Apartir de la membrana interna mitocondrial pueden ser aislados cinco complejos enzimticos denominados I, II, III, IV y V. Los complejos I-IV contienen parte de la cadena de transporte de electrones, mientras que el complejo V cataliza la sntesis de ATP por lo que no es propiamente un componente de la cadena de transporte de electrones. Cada complejo acepta o dona electrones a portadores de electrones relativamente mviles, como la coenzima Q y el citocromo c. Cada portador de la cadena de transporte de electrones puede recibir electrones de un donador de electrones y puede donarlos posteriormente al siguiente portador de la cadena. Por ltimo, los electrones se combinan con oxgeno y protones para formar agua Esta necesidad de oxgeno convierte al proceso de transporte de electrones en una cadena respiratoria, la cual da cuenta de la mayor porcin del uso de oxgeno por parte del organismo. Existen dentro del proceso dos componentes que no forman parte estructural de los complejos, sin embargo desempean un papel predominante en la transferencia de electrones, estos componentes son la Coenzima Q y el citocromo c. Reacciones de la cadena de transporte de electrones. Con la excepcin de la coenzima Q, todos los miembros de esta cadena son protenas, que pueden funcionar como enzimas, como es el caso de las dehidrogenasas; pueden contener hierro como parte de un centro hierro-azufre; pueden estar coordinadas con un anillo de porfirina como en los citrocomos o pueden contener cobre, como en el caso de complejo IV que contiene citocromo a y citocromo a3. Cuestionario Pre-laboratorio. 1. Dibuje un esquema sencillo donde muestre la estructura de la mitocondria y los principales complejos que participan en las reacciones de la cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa.

Objetivo. Comprender el mecanismo de obtencin de energa que opera a nivel celular como resultado del transporte de electrones por medio de deshidrogenasas nicotin y flavin dependientes. Succinato deshidrogenasa. Es una protena integral de la membrana mitocondrial interna que interviene en el

ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de electrones y contiene FAD (flavinadenosin-dinucletido) unido covalentemente. Cataliza la oxidacin del succinato a fumarato donde se transfieren primeramente dos electrones y dos protones al FAD, formndose el FADH2. Materiales y mtodos. Reactivos. Amortiguador de fosfatos pH 7.4; Succinato al 0.1 % en amortiguador de pH 7.4; malonato al 0.1 % en amortiguador de pH 7.4; neotetrazolium 0.3 %; aceite. Material biolgico: Corazn de conejo. Mtodo experimental. 1. Sacrifique un conejo y extraiga el corazn. 2. Pese el corazn y homogenice aadiendo amortiguador de fosfato de pH 7.4 (10 ml por cada 1 g de peso). 3. Deje reposar en refrigeracin durante 24 h. 4. Centrifugue a 3500 rpm durante 5 min, separe el sobrenadante en otro tubo y mantenga en refrigeracin. Compruebe la actividad enzimtica, prepare 3 tubos de la siguiente manera:

Tubo 1 2 3

Neotetrazolium (ml) 0.5 0.5 0.5

Succinato 1 % (ml) 0.5 0.5 0.5

Enzima (ml) 1.0 1.0 -----

Malonato 1 % (ml) ----0.5

Agua destilada (ml) 0.5 ----2.5

5. Agite los tubos y aada 1 ml de aceite a cada uno. 6. Deje reposar una hora.

Citrocomo oxidasa. La citocromo oxidasa cataliza la reduccin del oxigeno molecular, el cual es el ltimo de fuerza reductora transferida a travs de los componentes de la cadena respiratoria. Materiales y mtodos. Reactivos. Amortiguador de fosfatos pH 7.4; KCN al 0.1%; p-fenilendiamina al 0.3%. Material biolgico: Corazn de conejo Mtodo experimental. 1. 2. Utilice el extracto enzimtico de corazn. Para comprobar la actividad enzimtica, prepare 3 tubos de la siguiente forma:

Tubo 1 2 3 3.

P-fenilendiamina 0.3 % (ml) 0.5 0.5 0.5

Enzima (ml) 1.0 1.0 -----

KCN 0.5 % (ml) ----0.5 -----

Agua destilada (ml) 0.5 ----1.5

Agite los tubos, deje reposar por media hora a temperatura ambiente.

Fosforilacin oxidativa. La transferencia de electrones a travs de la cadena de electrones esta favorecida energticamente por que el NADH es un dador de electrones potente y el oxgeno molecular es un vido aceptor de electrones. Sin embargo, es importante considerar que el flujo de electrones de NADH hacia el oxgeno no provoca directamente la sntesis de ATP, aunque es responsable de proveer fosforilacin se lleve a cabo. La hiptesis quimiosmotica (tambin conocida como hiptesis de Mitchell) explica como se utiliza la energa libre generada por el transporte de electrones a travs de la cadena de transporte de electrones para producir ATP a partir de ADP y Pi. ATP sintetasa. las condiciones para que le proceso de

El complejo enzimtico ATP sintetasa (complejo V) forma ATP usando la energa del gradiente de protones generado por la cadena de transporte de electrones. Este complejo tambin se denomina F1/F0 ATPasa debido a que la porcin F1 de la enzima aislada posee una subunidad responsable de la hidrlisis de ATP a ADP y Pi, energa necesaria para realizar de manera eficiente el flujo de protones que impulsa la rotacin de F0 y provoca cambios conformacionales en el dominio extramembranario F1 que activa a su vez la principal funcin de del complejo y que consiste en estimular la actividad cataltica, lo que da como resultado la sntesis de ATP a partir de ADP + Pi. Materiales y mtodos. Reactivos. Sacarosa 0.25 M; fosfato cido de potasio 0.5 mM; molibdato de amonio al 4 %; H2SO4 7.5 M; sulfato ferroso 2.5 mM; tris HCl 20 mM a pH 7.4; ATP 0.05 mM; cido tricloroactico al 9 %. Material biolgico: Hgado de rata. Mtodo experimental. 1. 2. Sacrifique una rata y extraiga el hgado. Pese el hgado y homogenice aadiendo sacarosa 0.25 M (5 ml por cada 1 g de peso) 3. Centrifugue a 3500 rpm durante 5 min, separe sobrenadante en otro tubo y mantenga en refrigeracin. 4. Rotule como ATPasa.

Actividad hidroltica de la ATPasa. La forma aislada del complejo V (ATPasa), posee la caracterstica de que adems de su funcin predominante que es la biosntesis de ATP, la enzima purificada presenta en la porcin F1, la actividad enzimtica responsable de la hidrlisis de ATP a ADP y Pi. Esta actividad de ATP hidrolasa, aporta la energa necesaria para que el complejo realice de manera eficiente el flujo de protones.

Mtodo experimental. 1.

Prepare 3 tubos como se describe a continuacin:

Tris HCl 20 mM pH 7.4 (l) 150 ATP 0.05 mM (l) ----ATPasa (ml) 1 Agua destilada (l) 350

Tubo 1

2 3

150 150

100 -----

1 -----

250 1250

2. 3. 4. 5. 6.

Incube a 37 C durante 30 min. Aada 2 ml de cido tricloroactico al 9 % a cada tubo. Centrifugue a 3000 rpm durante 10 min. Tome una alcuota de 0.5 ml del sobrenadante de cada uno de los tubos. Prepare una serie de tubos como se describe a continuacin: Sobrenadante (ml) 0.5 0.5 0.5 Molibdato de amonio 4% (ml) 0.5 0.5 0.5 Agua destilada (ml) 3.1 3.1 3.1 H2SO4 7.5N (ml) 0.5 0.5 0.5 Sulfato ferroso 2.5 mM (ml) 0.4 0.4 0.4

Tubo 1 2 3 7. 8. 9.

Mantenga a temperatura ambiente durante 5 min. Observe y anote los cambios producidos. Determine la densidad ptica a 690 nm ajustando a 0 con el tubo blanco de la curva de calibracin de fsforo inorgnico.

Curva patrn de fsforo inorgnico. 1. Prepare una serie de tubos como se describe a continuacin: Fosfato cido Tubo de potasio 0.5 mM (ml) Blanco 1 2 3 4 2. 3. ----0.5 1.0 1.5 2.0 Deje reposar durante 5 min. Determine la densidad ptica a 690 nm ajustando a 0 con el tubo blanco correspondiente. Agua destilada (ml) 3.6 3.1 2.6 2.1 1.6 Molibdato de amonio 4% (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 H2SO4 7.5 N (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sulfato ferroso 2.5 mM (ml) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Reporte. 1. Explique para que se aade el aceite a las muestras. 2. Anote las observaciones de los experimentos 3. Elabore la curva de los estndares de fsforo inorgnico, graficando absorbancia vs concentracin. 4. Interpole en la curva, la absorbancia obtenida en los experimentos de la actividad hidroltica de la ATPasa y obtenga las concentraciones. 4. Escriba sus conclusiones.

TEMA IV. Bioenergtica

Sesin 10. Aislamiento y cuantificacin de clorofila. Introduccin. Todas las clulas animales y vegetales son impulsadas por la energa almacenada en los enlaces qumicos de las molculas orgnicas, que pueden captar del ambiente. Los compuestos orgnicos aportan los esqueletos carbonados para la biosntesis y la energa metablica que impulsa todos los procesos celulares. Prcticamente todos los materiales orgnicos son producidos por organismos fotosintticos, las cianobacterias tienen requerimientos nutricionales mnimos, usan los electrones del agua y la energa de la luz solar para convertir el CO2 atmosfrico en compuestos orgnicos, mediante un proceso denominado fijacin del carbono. Durante la reaccin de hidrlisis del agua liberan oxgeno a la atmsfera que es empleado por los organismos aerobios para la fosforilacin oxidativa. La aparicin de las cianobacterias, durante la evolucin permiti el desarrollo de los organismos aerobios. En las plantas y en las algas, la fotosntesis se lleva a cabo en un rganulo intracelular especializado, el cloroplasto, los productos inmediatos de la fotosntesis son NADH y ATP, son utilizados para producir molculas orgnicas. En las plantas, entre los compuestos orgnicos producidos incluyen un azcar de bajo peso molecular, comnmente sacarosa, el cual es empleado como fuente de carbono por organismos no fotosintticos.

El cloroplasto es el principal miembro de la familia de los plastidios, todas las clulas que conforman a las plantas tienen plastidios. Los plastidios no solo son lugares en los que se lleva a cabo la fotosntesis y la deposicin de materiales de reserva. Las plantas han utilizado estos orgnulos para la compartimentacin de su metabolismo intermediario. La sntesis de las bases nitrogenadas: purinas y pirimidinas, la mayora de los aminocidos y de todos los cidos grasos tiene lugar en los plastidios, en contraste con las clulas animales en los cuales todos estos procesos suceden en citosol.

Los cloroplastos realizan sus interconversiones energticas mediante mecanismos quimiosmticos, tal como lo hacen las mitocondrias y su organizacin se basa en los mismos principios. Tienen una membrana externa permeable, una membrana interna menos permeable y un estrecho espacio intermembranal. La captacin de energa solar es la clave de la fotosntesis y es posible debido a la presencia de fotorreceptores, la

principal molcula que tiene esta funcin en los cloroplastos de las plantas verdes es la clorofila, un tetrapirrol sustituido. Los cuatro tomos de nitrgeno de los pirroles estn coordinados con un tomo de magnesio, a diferencia de los pirroles tipo hemo, el anillo pirrol se encuentra reducido y contiene una molcula de fitol, un alcohol de 20 carbonos hidrofbico y esterificado en una cadena lateral acdica. Son capaces de llevar a cabo la captacin de energa solar debido a la red alternante de enlaces dobles y sencillos, son polienos.

Tienen poder de absorcin fuerte en la regin visible del espectro electromagntico, precisamente en la regin donde la energa solar es mxima sobre la tierra. La energa de la luz excita un electrn hacia un nivel energtico superior, la energa es transmitida a una molcula aceptor, este proceso conduce a que la molcula que dona el electrn tenga ahora carga positiva y la molcula que lo acept ahora posea carga negativa, proceso denominado separacin de cargas fotoinducido.

La fotosntesis en las plantas verdes est mediado por dos tipos de complejos sensibles a la luz unidos a membrana: fotosistema I (PS I) y fotosistema II (PS II).

El fotosistema I esta formado por 13 cadenas polipeptdicas, 60 molculas de clorofila, una quinona (vitamina K1) y tres complejos 4Fe-4S, con una masa total de 800 Kd. El fotosistema II es un poco menos complejo, con 10 cadenas polipeptdicas, 30 molculas de clorofila, un in hierro no hemo y cuatro iones manganeso. Una de las principales aplicaciones de la bioqumica es el estudio de los compuestos fotosintticos de las plantas, como son las clorofilas. El aislamiento, purificacin son los

primeros pasos para su anlisis, por lo tanto, correctas metodologas de extraccin deben ser comprendidas por estudiantes de bioqumica que desean comprender la fotosntesis. Objetivo: Aislar la clorofila de plantas verdes y comprobar su extraccin obteniendo el espectro de absorcin en el espectrofotmetro. Reactivos: Acetona, benceno Hojas de plantas verdes

Protocolo experimental: 3. 4. 5. Preparar 50 ml de una solucin de acetona al 80% en agua destilada. Cortar las hojas verdes en pequeos trozos y pesar alrededor de 0.1 g Colocar 0.1 g de la muestra de las hojas y agregar poco a poco, acetona al 80%,

puede ser de 5 ml en 5 ml triturar la muestra hasta la decoloracin total de las hojas. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Filtrar y vaciar a un matraz de 25 ml, Repita esta operacin al menos 3 veces, hasta la decoloracin total de las hojas. Aforar el matraz a 25 ml con el resto de la acetona 80%. Marcar esta extraccin como mezcla A. Tomar 10 ml de la mezcla A y guardar al resguardo de la luz (en frasco ambar). El resto de la mezcla A, es decir 15 ml se colocan en un embudo de separacin y

se adiciona 15 ml de benceno. Nota: Antes de agitar debe asegurarse que se encuentre la llave en posicin cerrada y deber tener cuidado cuando trabaja con solventes. Use guantes y lentes de seguridad, nunca realice esta operacin sin autorizacin del instructor y sin supervisin. 10. Despus de agitar lo suficiente, deje reposar para que se separen las fases

acetnica, la cual contiene la clorofila, de la fase bencnica que contiene xantofila, carotenos y otros compuestos tipo fenoles. 11. Recuperar las dos fases en recipientes diferentes. Marcando la fase acetnica

como mezcla B, es la que contiene la clorofila. 12. B. Realizar un barrido de absorbancia desde 420 nm hasta 750 nm de la mezcla A y

Reporte. 1. Explique las diferencias entre los espectros de absorcin entre la mezcla A y B: A)

Debe mencionar los mximos de absorcin de cada muestra B) Explique de acuerdo con los componentes qumicos y debe mencionar a que grupos qumicos de cada compuesto se atribuye la absorcin. 2. Dibuje las frmulas qumicas de la clorofila A y B. 3. Escriba sus conclusiones personales acerca de esta prctica.