CONTAMINACIN MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS VENDIDOS EN LA VA PBLICA EN CIUDADES DE AMRICA LATINA Y CARACTERSTICAS SOCIO-ECONMICAS DE SUS VENDEDORES Y CONSUMIDORES

Organizacin Panamericana de la Salud Oficina Sanitaria Panamericana . Oficina Subregional de la Organizacin Mundial de la Salud

Instituto Panamericano de Proteccin de Alimentos y Zoonosis Programa de Salud Pblica Veterinaria

COMITE EDITORIAL

Dr. Claudio R. Almeida Mdico Veterinario Asesor Regional Programa de Salud Pblica Veterinaria Organizacin Panamericana de la Salud Washington, DC - USA Dra. Dulce Maria T. Schuch Mdico Veterinario Laboratorio de Referencia Animal Ministrio da Agricultura e do Abastecimento Porto Alegre, RS - Brasil Dra. Dilma Scala Gelli Microbilogo de Alimentos Instituto Adolfo Lutz Secretaria de Sade do Estado de So Paulo So Paulo, SP - Brasil Dr. Juan A. Cullar Mdico Veterinario Consultor Instituto Panamericano de Proteccin de Alimentos y Zoonosis Programa de Salud Pblica Veterinaria Organizacin Panamericana de la Salud Martnez, Pcia. de Buenos Aires - Argentina Dra. Ana V. Diez Mdico School of Public Health The Johns Hopkins University Baltimore, MD - USA Dr. Jos A. Escamilla Mdico School of Public Health The Johns Hopkins University Baltimore, MD - USA

TABLA DE CONTENIDO

Prlogo .....................................................................................................................................5 1. RESUMEN ...........................................................................................................................6 2. INTRODUCCION ...............................................................................................................7 3. REVISIN DE LA LITERATURA ...................................................................................9 4. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 27 5. MATERIAL Y METODOS.............................................................................................. 28 6. RESULTADOS Y DISCUSIN...................................................................................... 36 7. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 65 Referencias Bibliogrficas .................................................................................................. 67 ANEXOS................................................................................................................................ 77
Anexo 2 ................................................................................................................................. 78 Anexo 3 ................................................................................................................................. 81 Anexo 4 ................................................................................................................................. 85 Anexo 5 ................................................................................................................................. 87 Anexo 6 ............................................................................................................................... 113 Anexo 7 ............................................................................................................................... 117

Agradecimientos La Organizacin Panamericana de la Salud desea expresar su agradecimiento a todas las personas y entidades que prestaron su colaboracin decidida a este estudio y en especial: C A las autoridades nacionales y locales de salud en las ciudades participantes, por su apoyo en la fase operativa del estudio. A las entidades no gubernamentales que apoyaron el desarrollo del estudio. Al Banco Interamericano de Desarrollo (BID), por su valioso aporte financiero a travs del Convenio BID/OPS ATN/TF-3879-RE, para apoyo al control y prevencin de la epidemia de clera. Al Instituto Adolfo Lutz, por sus servicios como laboratorio de referencia para el estudio. A los vendedores y consumidores de alimentos en va publica de las ciudades participantes en el estudio. Al personal de campo que colabor en la realizacin de encuestas y recoleccin de muestras. Al cuerpo de analistas de los laboratorios de microbiologa de alimentos mencionados enseguida: Instituto Nacional de Laboratorios de Salud - La Paz, Bolivia Universidad AJorge Tadeo Lozano@ - Santaf de Bogot, Colombia Jorge Lozano Departamento de Laboratorios del Municipio de Quito, Ecuador Instituto de Nutricin, Alimentacin y Control de Calidad de Alimentos - Lima, Per Instituto Dominicano de Tecnologa Industrial - Santo Domingo, Repblica Dominicana Laboratorio Unificado de Control de Alimentos y Medicamentos Ciudad de Guatemala, Guatemala Laboratorio Nacional de Salud Pblica - Ciudad de Mxico, Mxico. Laboratorio Estatal de Salud Pblica del Estado de Sinaloa - Culiacn, Mxico.

Prlogo
Pocas manifestaciones de la vida moderna en nuestras ciudades de Amrica Latina han tenido tanta repercusin en el diario vivir de su poblacin y han sido objeto de tanta polmica como la venta de alimentos en las vas pblicas. Un aspecto indiscutible en relacin con la venta callejera de alimentos, es el riesgo potencial de causar enfermedad en la poblacin por las dificultades que entraa su preparacin y venta en condiciones de inocuidad, frente a lo cual la epidemia de clera que afect a nuestra Regin, acrecent la crisis de confianza en cuanto a la calidad de estos alimentos. Considerando que una oportunidad de investigar la eventual prevalencia de clera en los alimentos callejeros en ciudades de Amrica Latina, podra facilitar el conocimiento de la situacin de los mismos respecto de su contaminacin por otros patgenos reconocidos en alimentos, la Organizacin Panamericana de la Salud, en colaboracin con sus Estados Miembros, decidi la realizacin del presente estudio. Con sus resultados, esperamos brindar un aporte al conocimiento resultados, cientfico no solo los aspectos puramente biolgicos relacionados con la calidad sanitaria de alimentos vendidos en las vas pblicas, sino aquellos de orden social y econmico que puedan contribuir a una mejor formulacin de las acciones de intervencin tendientes a corregir la problemtica de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Adems, se espera que la metodologa analtica, estandarizada para la bsqueda e identificacin de los microorganismos estudiados y el programa de garanta de calidad que se prepar especialmente para el estudio, sean tiles en la conduccin futura de trabajos similares. George A. O. Alleyne Director

1. RESUMEN
Se evalu la contaminacin microbiana de los alimentos vendidos en la va pblica de La Paz-Bolivia, Santaf de Bogot-Colombia, Quito-Ecuador, Lima-Per, Santo DomingoRepblica Dominicana, Ciudad de Guatemala-Guatemala, Ciudad de Mxico y CuliacnMxico. Fueron analizadas 2433 muestras para investigar la existencia de Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Clostridium perfringens en nmero prximo del necesario para producir enfermedad, adems de la presencia de Salmonella y Escherichia coli O157:H7 en 25 g de muestra. El conteo de organismos coliformes fecales fue tambin incluido, como indicador de contaminacin de origen fecal. Se seleccionaron los alimentos listos para servir de mayor consumo en cada ciudad, agrupandose en alimentos a base de carnes, frutas y verduras, granos y cereales, dulces, productos lcteos, jugos naturales, helados y pescados y mariscos. Las determinaciones se realizaron bajo control de calidad, despus de la capacitacin in situ del personal de los laboratorios colaboradores, en las metodologas seleccionadas para la evaluacin microbiolgica. Adems, en cada ciudad se encuest a 300 vendedores y igual nmero de consumidores, a fin de permitir conocer aspectos sanitarios de los locales y caractersticas socio-econmicas de vendedores y consumidores. Entre los microorganismos estudiados, el S. aureus demostr un riesgo porcentualmente mayor de contaminar los alimentos, registrndose su presencia en 8,42%, con variacin entre las ciudades y entre los grupos de alimentos. El B. cereus estuvo presente en 7,89% y el C. perfringens en 5,07%, en tanto que el V. cholerae no se encontr presente en ninguna de las muestras, en nmero suficiente para producir la enfermedad. Se demostr la presencia de Salmonella en 0,95% de las muestras y se confirm la presencia de E. coli O157:H7 en una muestra, como primer hallazgo de este patgeno emergente en alimentos callejeros. Las condiciones higinicas deficientes en que se expenden estos productos y los hbitos de vendedores y consumidores sugieren un riesgo evidente de las ventas de alimentos en las calles para causar enfermedades transmitidas por alimentos en la regin y demanda intensa accin de las autoridades y la comunidad para prevenirlas.

2. INTRODUCCION
Las dificultades econmicas que enfrentan los pases del Tercer Mundo conllevan un deterioro de las condiciones socioeconmicas en las poblaciones de bajos ingresos y de las que habitan en las reas rurales, promoviendo un creciente movimiento migratorio hacia los centros urbanos. La limitada oferta de trabajo de los centros urbanos junto a la falta de capacitacin calificada y las necesidades de supervivencia, lleva a estas poblaciones a buscar alternativas para la obtencin de ingresos econmicos, una de las cuales encuentran en el comercio informal, incluida la venta de alimentos. Esta actividad, al tiempo que satisface la necesidad de obtencin de comidas rpidas de bajo costo junto al lugar de trabajo, especialmente por la poblacin de ms bajos ingresos, presenta beneficio adicional de satisfacer tradiciones de consumo de alimentos tpicos y una alternativa para derivar el sustento a miles de personas (1, 2). As mismo esta actividad es una caracterstica importante del estilo de vida en la mayora de los pases de Amrica Latina y constituye un factor socio-econmico importante que moviliza gran cantidad de recursos y emplea cantidades considerables de personas, ayudando a disminuir los niveles de pobreza y marginalidad. A pesar de las ventajas conocidas del comercio informal de alimentos, durante la elaboracin pueden ocurrir riesgos para la salud de la poblacin toda vez que en la mayora de los casos, los alimentos son preparados por personas sin la capacitacin para su adecuada manipulacin que lo hacen en condiciones precarias de higiene. La escasa calidad nutritiva de los alimentos, los bajos valores protecos de la dieta, y la insuficiente disponibilidad de alimentos para la poblacin son factores predisponentes a cuadros diarricos agudos originados por las Enfermedades Transmitidas por los Alimentos ETA (3) que estn relacionados con altas tasas de mortalidad infantil, baja productividad en el trabajo y disminucin de la capacidad de aprendizaje. A pesar de no existir informacin adecuada sobre el papel que desempean los alimentos vendidos en la va pblica en relacin con la incidencia de las ETA en los pases de Amrica Latina, se considera que las comunidades que tienen malas condiciones de higiene y habitan reas climticas con predominio de altas temperaturas, estn bajo un mayor riesgo de contraer algunas enfermedades como la salmonelosis (3). Estudios realizados en Amrica Latina han revelado que gran porcentaje de los vendedores ambulantes no cuentan con un sistema de abastecimiento de agua de buena calidad, ni en cantidad suficiente para las necesidades diarias, siendo comn la reutilizacin del agua para el lavado de utensilios (4), las manos y las superficies de trabajo entre otras, situacin que la convierte en fuente de contaminacin al facilitar la proliferacin de microorganismos.

La no aplicacin de buenas prcticas higinicas por parte de quienes preparan y manipulan alimentos, que en algunos casos pueden ser portadores asintomticos de microorganismos patgenos (5) o que pueden llevarlos del medio ambiente al alimento, aumenta el riesgo de contraer enfermedades. La deficiente calidad higinica de las materias primas frecuentemente utilizadas en la preparacin de estos alimentos y su inadecuada conservacin (tiempo/temperatura de almacenamiento) aumentan an ms el riesgo de que se produzcan ETA (5). Al evaluar la calidad microbiolgica de alimentos vendidos en vas pblicas, es necesario tomar en consideracin factores como la calidad higinica de las materias primas utilizadas en su preparacin, practicas de manipulacin inadecuada que permiten la contaminacin cruzada, volumen de comercializacin de los mismos y nmero de personas que los consumen diariamente. Adems, los factores requeridos por los microorganismos responsables de brotes de ETA para su multiplicacin o para la produccin de toxinas tales como temperatura, uso de un substrato rico en elementos nutritivos, actividad acuosa (aw), pH, potencial redox (Eh), grado de salinidad, etc. (3, 6), se hallan presentes en los alimentos preparados y comercializados en esas condiciones. As, pues, es de suponer que estos alimentos son potencialmente causas importantes de enfermedades gastrointestinales y otras de mayor gravedad. Teniendo en cuenta el distinto rol que los alimentos comercializados en la va pblica juegan en diferentes ciudades de Amrica Latina, fueron elegidas las ciudades de Santo Domingo-Repblica Dominicana, Ciudad de Mxico y Culiacn-Mxico, Ciudad de Guatemala-Guatemala, Santaf de Bogot-Colombia, Quito-Ecuador, Lima-Per y La PazBolivia, como representantes de las ciudades en donde la venta callejera de alimentos es importante desde el punto de vista socio-econmico y cultural.

3.

REVISIN DE LA LITERATURA

Para la evaluacin del riesgo para los consumidores de alimentos comercializados en la va pblica se han considerado los microorganismos de mayor prevalencia en diversas regiones del mundo y los que han emergido o re-emergido como patgenos importantes en los ltimos aos. Por este motivo, se ha investigado la presencia o cuantificado el nmero de clulas del Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Salmonella, organismos coliformes de origen fecal y Escherichia coli O157:H7. 3.1 Vibrio cholerae A raz de las epidemias de clera que aparecieron en varios pases de Amrica Latina a partir de 1991, este microorganismo comenz a tener una importancia inusitada como patgeno potencial en algunos alimentos y los primeros estudios realizados en algunos de los pases afectados, revelaron la posibilidad de transmitir la enfermedad a la poblacin por el consumo de comidas, especialmente aquellas vendidas en va pblica. El V. cholerae se caracteriza como un bastonete recto o curvo, Gram negativo, oxidasa y catalasa positivas, no esporulado, que fermenta la glucosa sin produccin de gas, con crecimiento no dependiente de la presencia de Na+, mvil por flagelo polar (3), aerbico facultativo y que muestra crecimiento exuberante en condiciones de alcalinidad (7). El hbitat natural del vibrin colrico es el ambiente acutico, estuarios y aguas dulces de clima templado (3). El V. cholerae serogrupo O1 es el microorganismo responsable de las epidemias de clera (6). Este serogrupo se divide en tres serotipos: Ogawa, Inaba e Hikojima (8). Esos serotipos pueden pertenecer al biovar clsico, que produce una enfermedad muy grave, o al biovar El Tor, responsable de la mayora de los casos de clera en el mundo y que se caracteriza por producir infecciones de menor severidad (3). El clera presenta un perodo de incubacin de 6 h a 5 d y se caracteriza por causar diarrea de severidad variable (segn el biotipo), heces acuosas (aspecto de agua de arroz), y puede conllevar a perdidas de lquidos en volmenes de ms de 1 litro/h. En los casos ms graves, la perdida masiva de fluidos y electrlitos puede llevar al choque hipovolmico, acidosis metablica, colapso circulatorio (8) y muerte en 16 a 18 h, si no se hace rehidratacin oportuna (5). Las tasas de mortalidad varan del 0%, en las regiones ms desarrolladas, al 30% en las naciones menos desarrolladas, en donde el diagnstico y tratamiento pueden tardar (3). La va fecal-oral es la principal para la transmisin del V. cholerae (7, 9), en especial por la ingestin de agua contaminada por heces de portadores humanos (4, 7, 10) y

por alimentos contaminados que juegan un importante rol en la difusin del clera (3, 8). Personas enfermas y convalecientes de clera eliminan por las heces un gran nmero de V. cholerae, contribuyendo a la diseminacin de la enfermedad (7). La ingestin de dosis de 108 UFC de V. cholerae por personas con acidez estomacal normal y de 104 UFC por personas con acidez gstrica neutralizada, es suficiente para producir el cuadro colrico (11). Cepas de V. cholerae pertenecientes a serogrupos diferentes del O1, que no aglutinan frente al suero anti-O1, se denominan "V. cholerae no O1" o "V. cholerae no aglutinante" (NAG) (3, 6, 7, 9) y pueden causar enfermedad diarrica no epidmica semejante al clera (10, 12). Los vibriones no O1 solo por casualidad producen la toxina colrica y la enfermedad correspondiente (13). Con base en varios autores, se han elaborado (3) un listado de los factores de patogenicidad de los serogrupos O1 y "no O1" del V. cholerae, los cuales se relacionan con la produccin de toxinas: una de esas toxinas, la "Clera Toxina" (CT), es una potente enterotoxina capaz de causar diarrea con la administracin oral de una dosis de solamente 5 Fg; las dems son toxinas que producen tanto las cepas de V. cholerae O1 CT-positivas como las CT-negativas (distinta naturaleza antignica, receptores y mecanismo de accin diferentes de la CT), y que recibieron la denominacin genrica de "nuevas toxinas colricas" (NCT); la hemolisina (NAGrTDH) que producen las cepas de V. cholerae no O1; la toxina termoestable similar a la toxina termoestable de la E. coli enterotoxigenica (NAG-ST); una toxina con funcin inhibidora del canal de sodio, similar a la tetrodotoxina que producen los vibrios mutantes CT-negativos; y una toxina similar a la Shiga toxina de la Shigella dysenteriae. Algunos grupos de alimentos pueden venir contaminados con esa bacteria desde su origen, si se tiene en cuenta que su presencia ha de considerarse normal en determinados ambientes acuticos, lo mismo puede suceder con verduras y otras legumbres en cuyo cultivo se utilizan heces como fertilizante o aguas residuales para su regado (7), o pueden aun contaminarse durante la preparacin y/o manipulacin por portadores con hbitos higinicos deficientes. Casi todos los alimentos, incluidos los platos rpidos para consumo, pueden ser contaminados o recontaminados por contacto con el agua, por contaminacin cruzada en el ambiente de su manipulacin a travs del flujo de productos crudos simultneamente con productos cocidos, aderezos de platos rpidos, una manipulacin inadecuada, superficies de trabajo y utensilios, entre otros. Las observaciones sobre la capacidad de multiplicacin rpida del V. cholerae a temperatura ambiente en productos tales como las ensaladas de legumbres cocidas, con o sin mayonesa y condimentos similares, arroz con carne, pescado cocido y/o marinado con jugo de limn (cebiche) y masas alimenticias preparadas (4), indican

que los alimentos inapropiadamente manipulados y conservados pueden presentar un grave riesgo para la salud de los consumidores. Considerando el corto tiempo de generacin del V. cholerae y la caracterizacin del alimento como de alto riesgo (factores intrnsecos que favorecen la multiplicacin de este microorganismo, tales como el pH neutro a alcalino, presencia de protenas y otros elementos nutritivos, agua qumicamente disponible, etc. (3, 6), el mantenimiento de temperaturas favorables por un perodo de tiempo prolongado y compatible con la multiplicacin, resulta en que el alimento pueda transmitir el clera, pues el nmero final de clulas puede ser suficiente para infectar y desencadenar los sntomas de la enfermedad en el consumidor (5). Por eso, se recomend la bsqueda del V. cholerae en todos los tipos de alimentos comercializados en la va pblica de las ciudades seleccionadas, con excepcin para los alimentos cidos sin protenas. 3.2 Staphylococcus aureus Otro microorganismo que ha sido considerado de gran importancia para el estudio es el S. aureus, debido a su potencial para ocasionar intoxinacin en el consumidor mediante ingestin de alimentos que presenten la enterotoxina estafiloccica preformada (14). El hombre es el principal reservorio del S. aureus, el cual se puede encontrar en las fosas nasales de donde se propaga directa o indirectamente a la piel y heridas (15), pudiendo ser encontrado en la garganta y piel de personas sanas (16). Se encuentra comnmente en la garganta, la piel y conducto intestinal, contaminando fcilmente el ambiente (6). El S. aureus se caracteriza por ser un coco Gram positivo que puede ser encontrado en el suelo, agua y aire, teniendo como mejores reservorios al hombre y animales (16), y crece en forma de racimos, es anaerbico facultativo, no esporulado, capaz de sobrevivir por largos perodos en objetos inanimados secos (fmites), relativamente resistente al calor y altas concentraciones salinas y lipdicas (15). Algunos serotipos pueden producir enterotoxinas (17). Las enterotoxinas producidas por S. aureus son protenas de peso molecular entre 28.000 e 35.000 daltons, imunologicamente distintas, con caractersticas de resistencia al calor y de hidrosolubilidad. Las toxinas se denominan A, B, C1, C2, C3, D, E y TST (Toxic Shock Toxin). De ellas, solamente la TST no est relacionada a intoxicaciones alimentarias, mientras las toxinas A y D son las que, con ms frecuencia se asocian (3). Las temperaturas de crecimiento se sitan entre los 7EC y los 47,8EC, con la temperatura ptima de 37oC, y la formacin de enterotoxinas ocurre a temperaturas entre 10EC y 46EC , con una temperatura ptima para su produccin en la franja de

los 40 a 45EC (3). La multiplicacin y produccin de toxinas en este rango de temperaturas depende de la calidad del substrato, la temperatura del alimento, su actividad acuosa, la concentracin salina, el pH del alimento, etc.(6). La mayora de las cepas de Staphylococcus crece en la franja de pH 4,5 a 9,3, y el valor de pH ms adecuado para la produccin de toxina se sita en la franja de neutralidad (16). El S. aureus es el patgeno relacionado a ETA que posee la capacidad de crecer en el ms amplio rango de aw (0,83 a 0,99) en condiciones aerobicas y cuando las dems condiciones se aproximan al ptimo. La produccin de enterotoxina es posible a partir de una aw de 0,86, siendo la ptima 0,99 (18). El calentamiento es el mtodo ms efectivo para eliminar S. aureus de los alimentos (16) por lo cual los alimentos cocidos, cuando se recontaminan con ste patgeno mediante una manipulacin inadecuada, facilitan su multiplicacin, especialmente debido a la escasa competencia microbiana que resulta de la coccin (17). Sin embargo, el calentamiento no elimina las toxinas pre-formadas en las materias primas (3, 6). La manipulacin inadecuada de los alimentos por parte de los portadores, o por personas con heridas en los brazos y las manos, constituye la principal fuente de contaminacin de los alimentos con el S. aureus (17). Cuando se hallan presentes en los alimentos nmeros mayores de 104 clulas de S. aureus por gramo, se pueden producir cantidades suficientes de enterotoxina (200 ng) de forma que desencadenen intoxinacin en los consumidores (6). La toxina puede ser identificada cuando nmeros iguales o mayores que 106 estn o estuvieron presentes en el alimento; y que durante brotes de intoxinacin estafiloccica se ha verificado que cantidades inferiores a 1 Fg de toxina A (la ms comn en brotes de intoxinacin estafiloccica) han sido ingeridas por las personas que enfermaron (14). Los alimentos producidos o manipulados de forma inapropiada, y almacenados en temperaturas superiores a 28EC, por 2 a 4 h pueden presentar cantidades de enterotoxina suficiente para producir brotes de intoxinacin por estafilococos (19). D. S. Gelli (Instituto Adolfo Lutz, comunicacin personal, 9 de febrero de 1996) observ que en ms del 95% de los brotes de esta etiologa ocurridos en una ciudad de la Regin, la contaminacin del alimento ocurri despus de la coccin, dado que la bacteria se encontr en nmeros mayores y raras veces iguales a la dosis infectante. Esa experiencia se refiere a los alimentos elaborados en cocinas industriales y a los alimentos servidos en reuniones en grupo tales como fiestas y clubes. Los alimentos contaminados fueron principalmente productos de confitera,

dulces y bocadillos. La intoxinacin estafiloccica se caracteriza por la aparicin de nauseas, vmito y diarrea (menos frecuente) (3) muchas veces acompaadas de dolor abdominal, dolor de cabeza y contracciones musculares luego de 1 a 6 h despus de la ingestin de alimentos contaminados por S. aureus (16). En las regiones en las que el clera es endmico, la aparicin de la sintomatologa de la intoxinacin por estafilococos (diarrea y vmitos, sin fiebre) puede confundirse con un cuadro colrico. Los mtodos diagnsticos que se utilizan con ms frecuencia estn basados en la verificacin de la capacidad del S. aureus para producir varias enzimas, como la catalasa, la coagulasa, la lipasa, la lecitinasa la DNAsa y la termonucleasa (19). El criterio ms difundido, ampliamente utilizado y aceptado para el diagnstico de S. aureus en laboratorios clnicos, se basa en su habilidad para coagular el plasma. Algunas cepas de S. lugdunensis y especies asociadas al rea de la salud animal como el S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi (20, 21, 22) tambin son responsables de reacciones de coagulasa y/o factor de coagulacin positivos y por este motivo se recomiendan pruebas diferenciales adicionales (16, 19).

Caractersticas bioqumicas de algunas especies de Staphylococcus

Microorganismo

Coagulasa

Factor de coagulacin

Termonucleasa

Manitol

Maltosa

Hemlisis

S. aureus S. epidermidis S. intermedius S. hyicus S. delphini S. schleiferi S. lugdunensis

Pos Neg Pos +/Pos Neg Neg

Pos Neg +/Neg Neg Pos Pos t

Pos Neg Pos Pos Neg Pos Neg

Pos Neg +/- t Neg Pos t Neg Neg

Pos Pos d+ t Neg Pos Neg Pos

Pos +/- t +/Neg Pos Pos t Pos t

Pos Neg +/d+ t

= 90% o ms son positivas = 90% o ms son negativas = 11 a 89% son positivas = 90% o ms son dbilmente positivas = reaccin tarda

Fuente: Bergdoll, 1989 (16) y Kloos y Labbe, 1991 (23)

Para involucrar o no a un alimento en un brote de intoxinacin es necesario la verificacin de la presencia de enterotoxinas, lo que puede ser hecho directamente en el alimento a travs de los mtodos de Casman y Bennett (24), el de Reiser, Conaway and Bergdoll (24), o a travs de la verificacin de la capacidad de produccin de toxinas por cultivos de S. aureus, aislados de alimentos implicados, por mtodos de AMicroslide Gel Double Diffusion@, AReverse Passive Latex Agglutination Assay@(RPLA) o por AEnzyme Linked InmunoSorbent Assay@(ELISA) (14). Teniendo en cuenta que la condicin usual de comercializacin en la va pblica de los alimentos crnicos, mezclados o no con granos y cereales, dulces y productos de confitera, productos lcteos, helados, pescados y mariscos, propician el desarrollo del S. aureus, como tambin la produccin de toxina, se recomend proceder a su bsqueda y conteo en los mismos. 3.3 Bacillus cereus El B. cereus se ha encontrado responsable por 1% a 23% de los brotes de ETA reportados, en los cuales la enfermedad puede presentarse clnicamente en las

formas de sndrome diarrico o emtico (25). El B. cereus es un microorganismo que se halla ampliamente distribuido en el medio ambiente, pudiendo ser encontrado en suelo, polvo, vegetacin, cereales y derivados de cereales, alimentos, aguas naturales, leche, productos lcteos y condimentos. Se presenta en forma de bastonetes grandes, Gram positivo, mvil, capaz de formar esporas bastante resistentes al calor y ha sido asociado con brotes de intoxinacin alimentaria (3, 25). Las temperaturas mnimas de multiplicacin de las clulas vegetativas de B. cereus se sitan alrededor de los 10EC (variantes psicrotroficas inician su crecimiento alrededor de 4 - 5EC), con lmites mximos de 50EC, estando la temperatura ptima alrededor de 28EC a 35EC (24). Su crecimiento es posible en la gama de pH comprendida entre 4,9 a 9,3 (6). Las temperaturas mnima, ptima y mxima para el inicio de la germinacin de esporas de B. cereus en condiciones de laboratorio fueron estudiadas (26) encontrndose los siguientes valores: -1EC, 30EC e 59EC, respectivamente. En estudios hechos con arroz cocido (27), esporas de B. cereus presentaron un tiempo de generacin de 26 a 57 min cuando fue mantenido en temperatura prxima a 30EC. Los mismos autores demostraron aun que el desarrollo fue mas intenso en arroz cocido que en caldo de soya tripticasa, cuando se realizaba la incubacin en temperatura inferior a 15oC. El crecimiento de B. cereus en arroz cocido puede verse favorecido por la adicin de protenas al plato (28). La alta resistencia trmica de las esporas de B. cereus han sido motivo de preocupacin por parte de la industria de alimentos, y muchos investigadores se han ocupado en estudiarla. Algunos autores (29) aislaron de sopa enlatada con deficiencias en su proceso trmico, dos cepas de B. cereus cuyas esporas mostraron valores D95oC de 256,7 y 5122,3 min. Tambin se demostraron (30) la accin de proteccin ejercida por materiales lipidicos contra el efecto del calor sobre esporas de B. cereus sometindolas a 95EC y 121EC suspendidos en fosfato tampn, aceite de oliva y aceite de soya, observando valores D95oC de 13 min (para fosfato tampn), D121oC de 17 a 30 min en aceite de oliva y soja. Este estudio concluy que los cidos grasos libres pueden tener un efecto estabilizador sobre las esporas de B. cereus. Los alimentos que sufrieron cocimiento y que son enfriados lentamente o que son mantenidos a temperaturas entre 30EC y 50EC, en caso de contener esporas de B. cereus, permitirn la germinacin de estas y la multiplicacin del microorganismo con la subsecuente produccin de toxinas, situacin que comnmente puede ser observada con platos de arroz cocido que son dejados enfriar a temperatura ambiente (31). Por eso, siempre se recomienda que el arroz cocido se enfre con

rapidez (hasta menos de 15oC) y que no se los deje en temperatura ambiente por ms de 2 h despus de la coccin (25). Los factores de virulencia del B. cereus estn relacionados con la produccin de varias toxinas extra celulares (31), entre ellas una toxina diarrica termolbil que es inactivada en 5 min a 56EC y una toxina termoestable de accin emtica que se mantiene inalterada despus de 1 h a 120oC (32). La toxina diarrica es producida por la forma vegetativa en la fase de multiplicacin exponencial y la toxina emtica es producida en la fase de esporulacin (3). El sndrome diarrico presenta un perodo de incubacin de 8 a 16 h, con duracin de 20 a 36 h (31) y generalmente est asociado al consumo de alimentos de composicin protica, vegetales, salsas y pudines (25) contaminados con aproximadamente 106 UFC/g (33). El sndrome ocasionado por la toxina emtica reviste mayor gravedad que el de la toxina diarrica, presentando un perodo de incubacin variable entre 1 y 6 h y generalmente se asocia con el consumo de arroz frito, cocido o de otros alimentos con alto contenido de almidn; el nmero de clulas que se necesita para desencadenar la sintomatologa se cifra alrededor de los 109 UFC/g de alimento (6). Considerando que la temperatura ambiente permite la multiplicacin del microorganismo, los alimentos mal cocinados a base de cereales, o recontaminados y mantenidos a temperaturas inadecuadas, constituyen un riesgo potencial para la salud de los consumidores (3). En el presente estudio se recomend el muestreo de dulces, productos lcteos, granos, cereales y los alimentos que tuvieron uno o ms de ellos en su composicin. 3.4 Clostridium perfringens El C. perfringens es un microorganismo anaerbico, inmvil, que forma esporas de variada resistencia al calor, tiene como hbitat normal el suelo y puede producir cuatro tipos de exotoxinas termolbiles (alfa, beta, psilon e iota) (34). En funcin de eso, el C. perfringens se clasifica como del tipo A, B, C, D o E (3). Las enterotoxinas se liberan en el intestino durante la esporulacin (25). Los alimentos crnicos crudos o cocidos son los ms comnmente involucrados en brotes por esta etiologa (34), especialmente aquellos sometidos a coccin, posterior enfriamiento y luego recalentados a temperaturas insuficientes para eliminar el C. perfringens (31). Todos los casos de intoxicacin alimentaria por C. perfringens estudiados hasta el momento han sido producidos por la toxina del tipo A (6), excepto los raros casos de enteritis necrotica causados por el consumo repetido de gran cantidad de carne de cerdo contaminada con C. perfringens tipo C que produce una beta-toxina tripsina-

sensible. Esta ltima sndrome se caracteriza por altas tasas de ataque y de mortalidad (40%), la cual normalmente ocurre por perforacin intestinal, dolores abdominales intensos, diarrea sanguinolenta, vomito y choque (31). Por lo general, las manifestaciones clnicas de la intoxicacin por C. perfringens tipo A ocurren entre 8 y 24 h pudiendo llegar hasta 72 h (31) despus de la ingestin del alimento contaminado y se caracterizan por un dolor abdominal intenso (agudo) acompaado de diarrea intensa (34, 35). El nmero de clulas necesarias para desencadenar la sintomatologa de la intoxicacin se halla comprendido entre niveles prximos al 105 o ms por gramo de alimento (6). Por lo general, la toxina no se forma previamente en el alimento, siendo liberada in vivo al nivel de intestino (36), y son necesarias 8 a 10 mg de toxina para desencadenar la enfermedad (37). Basado en diversos autores, se relata (34) que la toxina se forma en pH entre 6,0 y 8,0, aw entre 0,98 y 0,99, y temperaturas entre 35 y 40EC. Como la toxina del C. perfringens se forma durante la fase de esporulacin, y esta se da despus de la ingestin del alimento contaminado, a nivel de intestino delgado, las temperaturas de esporulacin se aproximan a la temperatura corporal del hombre. Las clulas vegetativas de C. perfringens pierden rpidamente su viabilidad en temperaturas de congelacin (38), pero las esporas no demuestran la misma sensibilidad que la forma vegetativa en bajas temperaturas (34). Las temperaturas mxima y mnima que permiten la multiplicacin de este microorganismo son, respectivamente, de 20EC y 50EC, siendo la faja que se sita entre los 43 y 45oC la ms apropiada. El tiempo de generacin a 45EC, en condiciones ptimas, es de 7 min (6). La temperatura mnima que permite el crecimiento de C. perfringens es de 12EC, el valor mnimo de aw es de 0,93 y los valores mas adecuados de pH se sitan entre 6 y 7 (38). El microorganismo no crece en pH inferior a 5 ni superior a 8,3 (34). La aw mnima para el crecimiento de C. perfringens a partir de su forma esporulada es de 0,95 (38). Se ha observado, en ensayos hechos con carne molida y una mezcla de cepas de C. perfringens, el tiempo de generacin a 41oC fue de 13 min, en cuanto que a 45oC, fue de 31 min (34). El potencial redox del medio que permite el crecimiento de C. perfringens se encuentra entre los lmites +216 a -230 (38). La forma esporulada de las distintas cepas de C. perfringens presenta una gran

variacin en cuanto a su termoresistencia, resistiendo a la temperatura de 100oC desde 0,3 min y 20 min (38) hasta algunas horas (3). En laboratorio, la forma vegetativa se inactiva a 60oC, pero en los alimentos la temperatura de inactivacin presenta grandes variaciones, debido a su composicin (34). La coccin inadecuada, la aparicin frecuente de cepas resistentes al calor y el tiempo prolongado normalmente ocurrido para la refrigeracin completa de los trozos mayores de carne, junto con descuidos en cuanto a la temperatura de almacenamiento, permiten la germinacin de endosporas y la multiplicacin bacteriana a niveles peligrosos para la salud pblica (35). Los alimentos a base de carne, preparados con antelacin, ocasionan con frecuencia brotes producidos por C. perfringens, razn por la cual se han incluido en este estudio. 3.5 Salmonella A partir del cambio en su taxonoma (39), el genero Salmonella pasa a constituirse de solamente dos especies. Una de esas especies es la Salmonella enterica, con las subespecies S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae y S. enterica subsp. indica. La otra especie es la Salmonella bongori. Adems, la denominacin de los serovares de Salmonella tambin han cambiado (40), con la caracterizacin de 28 nuevos serovares (41) reconocidos en 1991 por el Centro Colaborador de la OMS para Referencia e Investigacin en Salmonella. En funcin de la convencin establecida en la nueva nomenclatura , en todas la citaciones sobre el microorganismo, debe de escribirse el nombre del serovar en letras comunes con la primera letra mayscula. As, por ejemplo, el microorganismo conocido hasta entonces como Salmonella typhimurium, pasa a denominarse Salmonella serovar Thyphimurium, o solamente Salmonella Thyphimurium, sin necesidad de indicarse que se trata de la subespecie enterica. De otra parte, los serovares de las dems subespecies y la Salmonella bongori, pasan a designarse por su frmula antignica (40). Los miembros del gnero Salmonella son agentes causantes de infeccin intestinal en seres humanos y animales que invaden la mucosa intestinal y se multiplican en la lamina propia y ganglios linfticos mesentricos (42) e inducen la secrecin de lquidos por mecanismos aun no bien conocidos (43). El hbitat principal de los microorganismos de este gnero es el conducto intestinal del ser humano, de los animales domsticos, de los pjaros, de los reptiles (3) y, ocasionalmente, de los insectos (6). Debido a que es una bacteria de origen intestinal, es excretada por las heces que contaminan el ambiente y las aguas. Cuando las aguas contaminadas o los alimentos contaminados son ingeridos por el ser humano o por los animales, el microorganismo vuelve al sistema digestivo donde se multiplica y ser nuevamente eliminado a travs de las heces, continuando el ciclo

(6). Los insectos y roedores tambin participan en la diseminacin ambiental de estos microorganismos. Se sabe que, adems de la caracterstica de invasividad, la patogenia de la Salmonella est relacionada con la produccin de enterotoxinas y una citotoxina. Las enterotoxinas producidas por Salmonella actan aumentando la permeabilidad vascular (3). Una de ellas es termoestable y de accin rpida y la otra termolbil de accin ms lenta (44). La Salmonella produce por lo menos una citotoxina que acta como inhibidora en la sntesis proteica y es parcialmente responsable por la lesin de las clulas epiteliales en la mucosa intestinal, lo que se verific a travs de la infeccin experimental de conejos sanos con el microorganismo (45). Con base en diversas investigaciones, se puede afirmar que el 54% a 98% de las salmonelas son enteropatogenicas y que las salmonelas generalmente producen enterotoxina y citotoxina (42). Como resultado de la accin de esta ltima, se expone la fibronectina (glicoproteina) subepitelial en la cual la Salmonella se adhiere, constituyendose en nuevo mecanismo de adherencia de la Salmonella al tejido intestinal (46). Entre los agentes de ETA, el gnero Salmonella es uno de los principales causantes de casos mortales por razn de las complicaciones surgidas entre los pacientes afectados. La tasa de mortalidad se sita alrededor del 4,1% (6) y los huevos (3, 47), carnes y productos crnicos derivados son los alimentos que ms comnmente transmiten la Salmonella al hombre (6). La dosis infectante es variable, segn el serovar, alimento envuelto y especie de Salmonella (especies adaptadas al hombre poseen dosis infectantes menores que las no adaptadas) (3); en general, el nmero de clulas necesarias para desencadenar la sintomatologa (nusea, vmitos, dolores abdominales, cefaleas, escalofros y diarreas) oscila entre 103 y 106 UFC/g de alimento para algunas especies (3), y entre 109 y 1011 para otras (6). Sin embargo, otros autores (42) relatan haber constatado, a travs de estudios epidemiolgicos, que la Salmonella Thyphimurium fagotipo 10 puede presentar dosis infectante de solamente una clula. Cerca de 5% de las personas que sufren la enfermedad siguen siendo portadoras por tiempo considerable (3, 6) y pasan a ejercer un importante papel en la diseminacin del agente, especialmente si participan en la cadena de produccin y comercializacin de alimentos (5). Tanto los portadores asintomaticos de Salmonella, que pueden eliminar cerca de 101 a 108 salmonelas/g de heces hasta 6 meses (48), como los manipuladores de utensilios utilizados durante la preparacin y comercializacin de alimentos pueden ser el vehiculo para el acceso de Salmonella a los alimentos (49).

La Salmonella puede crecer en el rango de pH entre 4,5 a 9,0, estando el optimo entre 6,5 a 7,5. El pH 4,00 tiene accin bactericida para el microorganismo, situandose en 4,05 el valor mnimo de pH en el cual se observ algn crecimiento (6). Los efectos de pH extremos son afectados por otros factores como naturaleza del acidulante, temperatura, aerobicidad, contenido nutritivo y serovar en cuestin (6, 42). Su crecimiento es inhibido a 3% - 4% de sal. Su multiplicacin puede ocurrir entre 7EC y 47EC, actividad acuosa mayor a 0,94 y pH entre 4 y 8, siendo 37oC su temperatura optima de crecimiento (50). En el laboratorio, generalmente las temperaturas mnimas de crecimiento son mayores en caldo que en medios slidos y la habilidad de crecer en bajas temperaturas est relacionada con el tipo de alimento y el serovar (38). Las temperaturas ms bajas de multiplicacin corresponden a los serovares Salmonella Bredeney, Salmonella Typhimurium, Salmonella Agona (40), Salmonella Senftenberg y Salmonella Hadar (51). No obstante que las tasas de crecimiento de Salmonella sean bajas en temperaturas por debajo de 10EC, el problema se torna significativo donde las condiciones de refrigeracin son inadecuadas debido a su capacidad de multiplicacin en bajas temperaturas (3). Estudios desarrollados en ratas que fueron sometidas a dieta hipoproteica (52) demostraron que esto puede promover la aparicin de defectos inmunolgicos mltiples, los cuales pueden contribuir al aumento en la susceptibilidad a la infeccin por Salmonella. As, personas que viven en locales con malas condiciones higinicas, en climas calientes, donde existe el hbito de comer alimentos de origen animal crudos, personas con dietas hipoproteicas, con edades extremas (muy jvenes o ancianos) y portadores de enfermedades crnicas, son ms predispuestas a la salmonelosis. La refrigeracin adecuada es el medio ms seguro de prevencin del crecimiento de Salmonella en alimentos y tambin los alimentos mantenidos por encima de 60EC ofrecen buen margen de seguridad para la inhibicin efectiva de su crecimiento (42). Se puede evitar la multiplicacin de Salmonella en carne de pavo cocinada si se la mantiene a temperaturas superiores a 55E C. Los alimentos con actividad acuosa elevada cuando son calentados a 74EC tambin se convierten en libres de Salmonella (50). Hay interaccin entre la resistencia trmica y el pH del alimento para diferentes serovares (3). Algunos autores (53) verificaron que ocurre aumento de resistencia al calor con la diminucin de la actividad acuosa y conforme a la concentracin lipidica del alimento. Estos autores (50) encontraron aun que en chocolate el valor D70 para cepas de Salmonella Senftenberg fue de 6 a 8 h y de 12 a 18 h para cepas de Salmonella

Typhimurium. Considerando la gravedad de la infeccin por Salmonella y la caracterstica de ser un agente etiolgico ampliamente diseminado, que puede ocasionar epidemias como el V. cholerae, y que tambin tiene la caracterstica de multiplicarse a la temperatura ambiente (50), es preocupante el hecho de que las condiciones de preparacin y comercializacin de alimentos en la va pblica pueden permitir el acceso y multiplicacin de Salmonella en los alimentos. El anlisis de alimentos en busca de Salmonella se caracteriza por procedimientos de enriquecimiento diferentes de aquellos utilizados en los laboratorios clnicos debido al bajo nmero de este microorganismo y a las condiciones fisiolgicas de la clula bacteriana derivadas del proceso tecnolgico o de preparacin sufrido por el alimento (54), seguidos de enriquecimiento selectivo con diferentes niveles de selectividad (55), de procedimientos de aislamiento y confirmacin bioqumica (43, 54, 56) y serologica (57). Teniendo en consideracin que la literatura cientfica registra brotes de ETA por Salmonella involucrando a la mayora de los alimentos, se recomend buscar la presencia de este microorganismo en todas las muestras analizadas. 3.6 Organismos coliformes fecales El grupo coliformes fecales es formado por los coliformes capaces de crecer y fermentar la lactosa en temperaturas elevadas (44,5EC - 45,5EC), lo que incluye por lo menos, miembros de los gneros Escherichia, Enterobacter y Klebsiella (58). El hbitat primario de los organismos coliformes fecales y de la E. coli es el conducto intestinal de los animales de sangre caliente, entre ellos el ser humano, y por este motivo se utilizan como indicadores de higiene y de la incidencia de contacto directo o indirecto de los alimentos con materia fecal (6) . El grupo de coliformes es formado por bastonetes Gram-negativos, no esporulados, anaerobios facultativos, capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a 35EC en hasta 48 h (55). Un bajo porcentaje de cepas de E.coli, por mutacin, puede tener perdida la capacidad de fermentar la lactosa, o lo hace tan lentamente al punto de no ser detectada dentro de los periodos normales de incubacin utilizados (3). Por esto la prueba de produccin de indol a partir de triptofano en alta temperatura es una prueba utilizada paralelamente a la fermentacin de la lactosa que ofrece resultados ms confiables, pues cerca de 99% de las E. coli son indol positivas (59). La presencia de coliformes de origen fecal en alimentos indica que existe el riesgo de que tambin hayan llegado al alimento otros patgenos entricos (60) como la Salmonella, Shigella y otros. Los coliformes de origen fecal, as como los patgenos entricos, son de transmisin fecal-oral y, por eso, se utilizan como microorganismos

indicadores. Miembros del genero Enterobacter y Klebsiella pneumoniae habitan el tracto gastrointestinal del hombre y animales, microorganismos del genero Enterobacter se pueden encontrar tambin en el suelo, alcantarillas, agua, plantas, vegetales y alimentos de origen animal. Raramente Enterobacter spp es reportado como patgeno entrico, y Klebsiella puede ser tambin aislada en ambientes no asociados con la contaminacin fecal (61). Algunos investigadores sugieren que la E. coli sea utilizada como microorganismo indicador de la contaminacin fecal, ya que microorganismos del genero Klebsiella estn ms ampliamente distribuidos de lo que se imaginaba (58). El agua, alimentos de origen animal y vegetales son vehculos frecuentes de E. coli, y es importante el papel que desempean los manipuladores de alimentos en las patologas por esta etiologa, especialmente en zonas endmicas de diarrea (3). Considerando las exigencias para el crecimiento de los coliformes fecales y especialmente de E. coli, tales como temperatura entre 7EC y 48EC (ptimo de 37EC), pH entre 4,4 y 9,0, aw>0,95 y en concentraciones de hasta 6% de cloruro de sodio y las condiciones de manipulacin y mantenimiento de los alimentos durante la preparacin y comercializacin en la va pblica, los tipos de alimentos comercializados por vendedores ambulantes pueden hallarse contaminados por coliformes fecales, se recomend que todas las muestras recolectadas para el estudio se analizaran para verificacin del NMP de coliformes fecales . 3.7 Escheroichia coli O157:H7 La E. coli O157:H7 es un microorganismo emergente, es decir que viene produciendo enfermedad en humanos a un ritmo creciente en los ltimos 20 aos y amenaza aumentar en el futuro prximo (62). Se trata de una variedad rara de E. coli, tambin llamada de E. coli enterohemorrgica (EHEC), que es capaz de producir en el hombre enfermedad aguda no febril, inicialmente caracterizada por dolores abdominales severos, acompaadas de nausea y vomito y seguidas de diarrea acuosa, que pasa a francamente sanguinolenta en corto tiempo (3, 63, 64). La enfermedad es causada por la produccin de grandes cantidades de una o ms toxinas producidas in vivo (64, 65) y que hasta el momento ha sido investigada y aislada con mayor frecuencia en los pases desarrollados, siendo el serovar O157:H7 el ms comnmente aislado en los Estados Unidos, Canad e Inglaterra (64) y el serogrupo O26 particularmente aislado en los dems pases desarrollados (43). La transmisin zoontica del microorganismo puede ocurrir (66) ya que los bovinos

sirven de reservrio principal para la E. coli O157:H7. Otras especies de animales como porcinos, ovinos y algunas aves y pjaros tambin pueden servir de reservorio (3). Estudiando la distribucin de la E. coli O157:H7 en los rganos intestinales de gallinas, algunos autores (67) observaron que ocurre colonizacin predominantemente en el ciego y colon, siendo la E. coli O157:H7 excretada en las heces por ms de 90 d. Una de las caractersticas de patogenicidad presentada por este serovar de E. coli es la produccin de grandes cantidades de una o dos citotoxinas (SLT I e SLT II) (39). Estas citotoxinas fueron denominadas Verotoxinas (VT) o "Shiga-like" toxinas (SLT), por su semejanza con la Shiga toxina producida por la Shigella dysenteriae (64, 68, 69), en estructura, funcin, sitios de ligacin y funciones enzimticas utilizadas. La SLT I y la Shiga-toxina son neutralizadas por el antisuero anti-Shiga (6). Otra caracterstica de patogenicidad es la presencia de un gene altamente homlogo al gene de adherencia de la E. coli enteropatogenica (EPEC), con funcin similar al EHEC (43). Este gene est relacionado a las lesiones producidas en las clulas epiteliales de la mucosa debidas a ntima adherencia de algunas cepas verotoxigenicas de E. coli (70). La enfermedad producida, colitis hemorrgica, puede colocar en riesgo la vida del paciente (43). En algunos brotes ocurridos la tasa de mortalidad observada fue de 36%, en tanto que en otros no ocurrieron muertes (3). En algunos grupos de edad, especialmente entre los muy jvenes, la E. coli O157:H7 conduce al desarrollo del sndrome hemoltico-urmico (HUS), que se caracteriza por anemia hemoltica microangiopatica y falla renal (3, 64, 71) pudiendo llevar a la perdida permanente de la funcin de este rgano (64). Las personas de edad avanzada pueden presentar prpura trombocitopnica trombtica (TTP), menos comn, que cursa con fiebre, sntomas neurolgicos y lesin renal crnica, lo que es una extensin del HUS (3) y en este caso la mortalidad puede alcanzar tasas de hasta 50% (64, 65). La evolucin de la enfermedad hasta causar el HUS o la purpura trombocitopnica trombtica (TTP), parece estar relacionada con la absorcin sistmica de "Shiga-like" toxina, posiblemente asociada a una endotoxina (43). Un nmero limitado de serovares de E. coli forman el grupo de las E.coli enterohemorrgicas (43). Estos serovares, O157:H7, O26:H11 (3), O4:NM, O45:H2, O111:NM y el O145:NM (64) no son invasivos para las clulas intestinales y no producen las clsicas enterotoxinas termolbiles y termoestables de las E. coli (72), si bien producen lesin en la mucosa del colon por accin de una o de las dos toxinas (43). Los serogrupos O5, O6, O8, O22, O113 y O128 estaran incluidos como

serogrupos asociados con diarreas o el HUS (68, 73). Algunos autores (74, 75), estudiando alimentos de origen animal detectaron la presencia de diferentes serogrupos de E. coli verotoxigenicos . Los factores intrnsecos y extrnsecos que actan sobre el crecimiento de E. coli son comunes a la E. coli O157:H7. Las clulas de E. coli O157:H7 son resistentes a temperaturas de refrigeracin y congelacin, y se destruyen solamente cuando sometidas a temperaturas superiores a 71oC (76). El microorganismo tiene como caractersticas bioqumicas diferenciales las siguientes: no es capaz de fermentar el sorbitol o lo hace lentamente, no crece en las temperaturas utilizadas para diferenciar E. coli de los dems coliformes (44,5EC - 45,5EC) y no produce beta-glucuronidasa (3). La mayora de los brotes provocados por E. coli O157:H7 han sido atribuidos al consumo de productos de carne bovina mal cocidos (77), aunque tambin se han incriminado algunas veces otros tipos de alimentos tales como emparedados mantenidos sin refrigeracin, legumbres y carne de pavo, probablemente contaminados por carne de res. Otros alimentos, como frutas, ensaladas de vegetales, yogur, alimentos cidos (pH<4,6) y agua tambin pueden vehiculizar la infeccin (78). La capacidad de supervivencia de la E. coli O157:H7 en pH cido ha sido estudiada por algunos investigadores. Ensayos realizados con mayonesas industrializadas, con pH entre 3,6 y 3,9, mantenidas a temperaturas de 5oC y 20oC (79), concluyeron que la E. coli O157:H7 tiene la capacidad de sobrevivir ms tiempo a 5oC (34 a 55 d) que a 20oC (8 a 21 d). Tambin se observaron (80) que el microorganismo se mantiene bien en mayonesa y en salsas a base de mayonesa a 7oC y a 25oC y por lo tanto esos, y probablemente otros alimentos cidos pueden participar en la transmisin del microorganismo. Los mismos autores (80) verificaron que la E. coli O157:H7 se mantiene viable en alimentos cidos por 35 d, si son conservados en refrigeracin. La investigacin de un brote consecutivo a la ingestin de jugo fermentado de manzanas (81), demostr que la E. coli O157:H7 puede sobrevivir en medios de cultivo con pH 2,0. La sospecha de que las manzanas se haban contaminado externamente con heces bovinas y la resistencia del microorganismo a bajos valores de pH, justificaron la incriminacin del jugo fermentado de manzana como alimento responsable por el brote. Otros autores (82) reportan que tambin legumbres pueden constituirse en vehculo en la transmisin de la E. coli O157:H7. Los mismos autores (82) informan que una partida de papas, que probablemente se contaminaron con heces bovinas, ha vehiculizado el microorganismo y causado un brote que involucro a por lo menos 24 personas adultas, causando la muerte de una de ellas. Si bien la va fecal-oral es la ms importante, la transmisin persona-persona tambin

puede ocurrir, cuando se utiliza practicas higinicas inadecuadas (78). La experiencia obtenida en el estudio de brotes ocurridos en Canad y Estados Unidos (64), sugiere que la dosis infectante sea bastante baja. E. coli O157:H7 es un emergente de grande impacto sanitario, social, poltico y econmico (83, 84) porque produce en el hombre un cuadro diarreico sanguinolento grave pudiendo llevar a la muerte (3, 43, 72) porque la comunidad cientfica aun no tiene las respuestas definitivas respecto de su naturaleza, comportamiento y causas de su emergencia como patgeno humano (76) y porque su presencia en la carne no se evidencia por alteraciones organolpticas aparentes, imposibilitando la inmediata toma de medidas sanitarias adecuadas (84, 85). Considerando que el diagnstico clnico de la enfermedad puede ser dificultado por la falta de familiaridad de los mdicos con la enfermedad emergente (77) y considerando que la E.coli O157:H7 no puede ser detectada por los mtodos tradicionalmente usados para aislamiento de patgenos entricos (47), se hace necesario evaluar su prevalencia en los alimentos vendidos en la va pblica. Teniendo en cuenta la posibilidad de contaminacin cruzada durante la preparacin de los alimentos en la va pblica, y el bajo nmero de clulas que se necesitan para producir la enfermedad, 10 clulas o menos (86), todos los alimentos revisten inters para la investigacin. Se reconoce que los microorganismos arriba citados no son los nicos indicados para la evaluacin higinica de los alimentos ni tampoco los nicos que ocasionan las ETA. Por razones relacionadas con la capacidad analtica de los laboratorios participantes, tampoco se incluyeron otros patgenos emergentes, a pesar de la importancia de stos en la actualidad. 3.8 Aspectos inmunolgicos y epidemiolgicos El desarrollo de una enfermedad y el aparecimiento de sus sntomas clnicos en el hombre no son dependientes nicamente de la presencia de los patgenos en el organismo ni de sus mecanismos patognicos. Es necesario que ocurra la interaccin sinrgica de varios factores para que se manifieste el sndrome de la enfermedad. Estos factores pueden estar asociados a los agentes patgenos o a las personas, aisladamente o relacionarse a una comunidad que comparte una o mas caractersticas predisponientes a la enfermedad como sean los grupos etareos, anormalidades fisiolgicas como, por ejemplo, supresin o comprometimiento temporario de los mecanismos de inmunidad (3, 87, 88, 89). El hombre sano cuenta con varios mecanismos de proteccin contra agresiones del medio ambiente. Dos de eses mecanismos juegan un rol fundamental en la proteccin de la salud: las barreras no especficas, como la acidez estomacal, las

secreciones qumicas de la membrana mucosa del intestino y de otros rganos del cuerpo humano, juegan un papel fundamental para impedir o dificultar que el agente invasor (microorganismo) llegue, an viable, al sitio en lo cual desempear sus funciones patognicas; por otro lado, el organismo tambin cuenta con barreras especficas, como las que actan selectivamente sobre agentes patgenos y sus toxinas, tratando de neutralizar su accin nociva. Las barreras especficas entran en funcionamiento cuando los agentes invasores logran sobrepasar las barreras no especficas y alcanzan sitios internos del organismo. Esas barreras se constituyen en la respuesta del sistema inmunolgico, con la produccin de anticuerpos y/o inmunoglobulinas, como respuesta al estmulo de un antgeno especfico (87). La dinmica de interaccin de los agentes invasores con el organismo de los individuos, permite consideraciones de orden epidemiolgica (87, 88, 89). La epidemiologia valora factores como la naturaleza, el comportamiento, la diseminacin y otros aspectos de una enfermedad, incluyendo las formas para el control de la diseminacin de los agentes patognicos, y las condiciones de inmunizacin y defensa de los individuos y de la comunidad expuestos al agente (88, 89). La mayora de los microorganismos seleccionados para el presente estudio son ampliamente diseminados en el medio ambiente, en los alimentos y en la poblacin de todos los pases de la Regin. Sin embargo, la exposicin a eses agentes no es igual en todas la regiones, en razn de las distintas acciones de salud pblica que se toman cada una de ellas, lo que puede incluir inmunizacion a travs de vacunacin, medidas de prevencin y control de diseminacin de patgenos, acciones para mejorar la calidad de vida a travs de medidas de saneamiento ambiental, mejores condiciones de nutricin, entre otras. Esas acciones de salud pblica son factores importantes en la determinacin del grado de exposicin de la poblacin de diferentes locales o regiones (3, 87, 88, 89). La exposicin diaria y constante a los agentes patgenos causadores de ETA es, sin duda, un factor de riesgo epidemiolgico. De otra parte, la convivencia permanente con sintomatologa leve de ETA, como sean las diarreas leves, puede llevar a una conceptuacin de condicin de normalidad, considerndose, por ejemplo, que la diarrea solo es sntoma de enfermedad, se acompaada de otros sntomas que dificulten las actividades diarias. Adems, la inmunidad que se adquiere naturalmente por el contacto constante con pequeas dosis del agente infeccioso o toxignico, puede influenciar los datos sobre riesgos de ocurrencia de ETA, porque los estados endmicos tienden a producir un Aequilibrio@ en la poblacin y, tambin porque la respuesta a una encuesta como la que se realiz en el presente estudio, puede no reflejar la real condicin del individuo, que considera diarrea y/o vmitos con criterios menos rgidos que los de un diagnostico clnico, ya que eses sntomas, por comunes, pueden considerarse condicin normal (87, 88, 89). Otros ndices, como la tasa de mortalidad infantil pueden, por otro lado, indicar con mayor seguridad los riesgos reales a que se exponen los consumidores de alimentos

callejeros. De manera resumida, se puede afirmar que en situaciones de endemia ocurre una Aseleccin natural@ de los individuos ms resistentes durante la primera infancia. La ocurrencia de diarrea infantil refleja, adems de la diseminacin de patgenos entricos, la posible resistencia adquirida por la poblacin adulta. La incidencia de ETA entre turistas y visitantes de otras reas en donde las acciones bsicas de salud son ms efectivas, es otro ejemplo de la existencia del riesgo de enfermarse a travs del consumo de alimentos callejeros, y de la ocurrencia de la enfermedad no asociada con un estado de equilibrio endmico. Hasta el 50% de los visitantes se enferman despus de consumir alimentos en donde la diseminacin de agentes patgenos por esta va es expresiva (3, 87, 89). La diarrea de los viajeros es mundialmente reconocida como enfermedad asociada al consumo de alimentos (89).

4.

OBJETIVOS
El objetivo principal del presente estudio fue la investigacin y cuantificacin del nmero de clulas viables del V. cholerae en los alimentos de mayor consumo en las ciudades mencionadas, habida cuenta la epidemia que ha afectado a la Regin y tambin los microorganismos de mayor prevalencia en la mayora de las regiones del mundo (S. aureus, B. cereus, C. perfringens, Salmonella). Adems, se busc identificar entre los alimentos comercializados en la va pblica, los que con mayor frecuencia se presentan contaminados con nmeros iguales o mayores de dosis infectantes para cada organismo, a fin de determinar el riesgo de contraer una ETA como consecuencia de su consumo. Teniendo en cuenta la gran importancia que se viene concediendo a la enfermedad causada por la E. coli O157:H7, la bsqueda de este microorganismo tambin ha sido incluida. Esa decisin tuvo la ventaja de permitir la implantacin de la metodologa analtica en los laboratorios involucrados en el estudio y la capacitacin de los analistas en la identificacin de ese microorganismo emergente. Se intent tambin obtener informacin sobre las caractersticas higinicas de los puntos de comercializacin de alimentos y las condiciones socio-econmicas de las personas que participan en la elaboracin y comercializacin, por la importancia que tienen estos aspectos para un anlisis conjunto de la calidad de los alimentos en relacin a los manipuladores. Asimismo, se recogi informacin sobre las caractersticas socio-econmicas de los consumidores de alimentos callejeros y sus hbitos de consumo.

5.

MATERIAL Y METODOS
5.1 Etapa preparatoria

Antes de iniciarse la recoleccin de muestras y las entrevistas con los vendedores y consumidores de alimentos en la va pblica, todos los laboratorios participantes en el estudio fueron visitados por expertos de la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS) en microbiologa de alimentos para fines de evaluacin de sus instalaciones, equipo y capacidad tcnica de los analistas. Adems, a fin de colaborar con las autoridades nacionales de salud, y buscando disminuir al mnimo las interferencias externas en los resultados, la OPS suministr todos los reactivos, medios de cultivo y vidriera utilizados. De esa manera, es posible garantizar que todos los laboratorios trabajaron con materiales procedentes del mismo proveedor, misma marca y mismo lote de fabricacin. Al final de su visita de evaluacin a los laboratorios, los expertos dejaron cultivos estndar de los microorganismos a investigar durante el estudio, para identificacin por los analistas. El resultado de ese ejercicio fu evaluado por el laboratorio de referencia y en conjunto con el resultado de la evaluacin Ain situ@, ha orientado los expertos en la programacin de dos talleres de capacitacin que se realizaron en las instalaciones del Laboratorio Nacional de Salud Pblica, en la ciudad de Mxico y en el laboratorio del Instituto Nacional de Nutricin, Alimentacin y Control de Calidad de Alimentos en Lima-Per. Los talleres contaron con la asistencia de por lo menos un analista de cada laboratorio participante y, durante su desarrollo fueron revisados todos los mtodos analticos y otros puntos pendientes de mayor discusin, adems de haberse buscado familiarizar a los analistas con un programa de garanta de calidad analtica desarrollado especialmente para el estudio (Anexo 5). 5.2 Plan de muestreo Se estableci como meta en cada una de las ocho ciudades seleccionadas recoger 300 muestras representativas de la venta ambulante de alimentos. El nmero de muestras se estableci tomando como base el modelo estadstico de probabilidades conocido como distribucin binomial (90, 91). Este modelo es apropiado para el caso en que la poblacin que nos interesa est integrada por un nmero muy grande de individuos. As, pues, para tener una probabilidad del 95% de detectar microorganismos, cuando estos estn presentes en 1% de los alimentos muestreados, basta con investigar 299 muestras. Las muestras de los alimentos fueron recolectadas por personal previamente capacitado, para lo cual se utiliz una ficha con informacin sobre la muestra, el vendedor/manipulador y el puesto de venta del alimento (Anexo 2). En cada ciudad se seleccionaron al azar 10 reas de recoleccin de muestras, con

ayuda de una tabla de nmeros aleatorios (92) y, en cada rea se busc recolectar 30 muestras, dndose prioridad a los alimentos de mayor riesgo de transmitir ETA, teniendo en cuenta el volumen comercializado, el nmero de consumidores atendidos en una jornada de trabajo y las condiciones higinicas de preparacin. Siempre que fue posible, las muestras de alimentos se recolectaron en las horas de mayor actividad. Habida cuenta que la venta de alimentos en las vas pblicas en las localidades seleccionadas se caracteriza por el expendio de comidas listas para el consumo, la gran mayora de estas estn compuestas por varios ingredientes, por lo cual, para efectos de la clasificacin por tipo de alimento, se tom en cuenta el ingrediente de mayor riesgo en su composicin, sin desconocimiento del riesgo potencial de los dems. En forma simultanea con la recoleccin de muestras, se propuso entrevistar 300 consumidores, entre los que atendan a los puestos de venta seleccionados, para lo cual se utiliz una ficha de entrevista apropiada (Anexo 3). Con esta parte del estudio se busc conocer algunas caractersticas demogrficas y socio-econmicas de esos consumidores y estimar la cantidad de personas expuestas al riesgo de enfermar por el consumo de ese tipo de alimentos. 5.3 Metodologa de anlisis estadstico de los datos Los datos obtenidos se ingresaron a una base de datos utilizando el programa Epi Info versin 6.02 (93). El anlisis estadstico se realiz utilizando el paquete estadstico SAS (Statistical Applications Software) versin 6.04 (94).

5.3.1

Anlisis exploratorio y descriptivo Inicialmente se realiz un anlisis descriptivo de los resultados de cada uno de los componentes de la encuesta: la encuesta a vendedores/manipuladores, el anlisis microbiolgico y la encuesta a consumidores. Se elaboraron cuadros y grficos a fin de describir la distribucin de las variables en cada una de las ciudades. Se utilizaron pruebas de ji cuadrado (2, para proporciones) y anlisis de varianza (para medias) a fin de determinar si las diferencias entre las ciudades eran estadsticamente significativas. La descripcin de los resultados del anlisis microbiolgico tambin se realiz estratificada por tipo de alimento. A fin de controlar potenciales factores de confusin, se estimaron proporciones ajustadas por el mtodo directo utilizando la poblacin combinada de las ocho ciudades como estndar.

5.3.2

Variables asociadas a la presencia de sntomas gastrointestinales entre los consumidores A fin de explorar asociaciones entre la contaminacin bacteriana en los alimentos muestreados y la existencia de sntomas gastrointestinales entre los consumidores, se elaboraron grficos relacionando ambas variables en las ocho ciudades. Adems, se investig la relacin entre caractersticas del consumo de alimentos en la va pblica y la ocurrencia de sntomas gastrointestinales en los consumidores. Para ello se estimaron las razones de posibilidades (odds ratios) de tener sntomas gastrointestinales asociados a distintas variables. Estas razones de posibilidades se ajustaron mediante regresin logstica respecto a posibles variables de confusin.

5.3.3

Relacin entre caractersticas de los vendedores y de los puestos de venta y la contaminacin bacteriana Se estimaron razones de posibilidades (odds ratios) de contaminacin bacteriana por distintos microorganismos asociadas a diversas caractersticas de los vendedores y de los puestos. A fin de eliminar el posible efecto de confusin de ciudad, las razones de posibilidades se ajustaron por ciudades mediante regresin logstica.

5.4

Procedimientos generales en el laboratorio La metodologa analtica ha sido uniforme en todos los laboratorios participantes, de acuerdo con los procedimientos descritos ms adelante ( 5.5). Las muestras identificadas en los laboratorios participantes como sospechosas, fueron remitidas para fines de confirmacin y pruebas complementaras, al Instituto Adolfo Lutz (IAL), de la Secretara de Salud del Estado de So Paulo - Brasil, seleccionado como laboratorio de referencia para el presente estudio, teniendo en cuenta su condicin de Centro Colaborador Conjunto FAO/OMS para el Monitoreo de la Contaminacin de los Alimentos. Hay que registrarse el hecho de que las muestras de las ciudades de Mxico, DF y Culiacn, tambin ubicada en Mxico no se han enviado al IAL debido a que el Laboratorio Nacional de Salud Pblica de Mxico es parte de un programa de garanta de calidad con los Estados Unidos de Amrica y Canad. Adems de prestar los servicios de referencia para el estudio, el IAL suministr a todos los laboratorios participantes, cultivos estndar y antisueros polivalentes.

La cantidad mnima de muestra que se ha recogido ha sido de 100 g o 100 ml. Para alimentos mixtos, todos sus componentes integraron la muestra en la proporcin aproximada original del alimento ofrecido a la venta. Se han utilizado instrumentos estriles solamente en los casos en que el vendedor no dispona de sus propios instrumentos. Siempre que fue posible, se busc reproducir exactamente las condiciones reales y habituales de distribucin del producto en el punto de venta (24, 95). En seguida, las muestras se acondicionaron en recipientes del propio vendedor utilizados en su punto de venta, ya que quizs el recipiente utilizado tambin pudiera ser una fuente de contaminacin. Las muestras han sido entonces acondicionadas e identificadas debidamente (95). En los casos en que el vendedor no dispona de recipiente para servir o acondicionar los alimentos, se utilizaron bolsas plsticas de primer uso o recipientes estriles. El transporte de las muestras al laboratorio se realiz respetando las condiciones usuales de conservacin del alimento, de la forma ms semejante posible. En el caso de transporte rpido (mximo de una hora), el alimento se acondicion en embalaje isotrmico sin incluir hielo, teniendo cuidado de no mezclar alimentos calientes con alimentos fros en el mismo embalaje isotrmico. En casos de que el tiempo de transporte fue superior a una hora, se utilizaron embalajes isotrmicos especficos para cada grupo de alimentos. Las muestras se identificaron individualmente, mediante una etiqueta o medio anlogo, unida o pegada al embalaje. Despus de recibidas en el laboratorio, las muestras fueron mantenidas en refrigeracin hasta el momento del anlisis, en general por un perodo de tiempo no superior a una hora. Todo el material utilizado se identific debidamente, incluida la fecha de iniciacin del anlisis. Los analistas recibieron instrucciones claras para asegurar siempre la perfecta homogeneizacin de las muestras y de las diluciones (24). Adems, se recomend a los analistas seleccionar diluciones que ofrecieron, en medios slidos, recuentos entre: S. aureus: 5 y 150 colonias B. cereus: 5 y 50 colonias C. perfringens: 5 y 50 colonias Para los fines del presente estudio, se consider como riesgo la presencia de los microorganismos siguientes, en los nmeros indicados:

V. cholerae: S. aureus: B. cereus: C. perfringens: $103/g Salmonella: E. coli O157:H7:

$103/g $102/g $103/g presencia en 25 g presencia en 25 g

Para evaluar la calidad higinica de los alimentos, se ha utilizado como indicador la presencia de organismos coliformes de origen fecal en una concentracin de 3 o ms coliformes por g o ml de alimento. 5.5 Metodologa analtica Los mtodos analticos microbiolgicos, de confirmacin bioqumica, serolgicos y de verificacin de la toxigenicidad de los cultivos aislados de los alimentos estudiados se han basado en las publicaciones de la Asociacin Americana de Salud Pblica (24), Administracin de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos de Amrica (96), Laboratorio Nacional de Referencia Animal de Brasil (55), Sociedad Americana de Microbiologa (97), Microbiologa Clnica y Patognica (98) y Patgenos Transmitidos por los Alimentos (3). La metodologa utilizada en todos los laboratorios participantes fue estandarizada segn se describe enseguida. Los procedimientos de evaluacin y garanta de la calidad analtica, tambin estandarizados y adoptados por todos los laboratorios involucrados, se encuentran descritos en el Anexo 5. El mtodo analtico utilizado para la deteccin de V. cholerae visaba detectar nmeros mayores que 103 clulas/25 g de alimento. Para eso, se incub dos series de dilucin (10-3 a 10-5) a 35EC y la otra a 42EC durante 6 a 8 h. Despus de la incubacin, se transfiri la superficie de stos a placas de agar de TCBS y a otros tubos que contenan 10 ml de APA. Se incub las placas de agar de TCBS a 35EC durante 24 a 30 h y los tubos de APA a las mismas temperaturas de origen durante 18 h; luego, se transfiri la superficie de los mismos a placas de agar de TCBS, incubando a 35EC durante 24 a 30 h. A partir de las placas de agar de TCBS, se aisl en T1N1 de 3 a 5 colonias sacarosa -positivas (o negativas) planas, de 2 a 3 mm de dimetro y se incub a 35EC durante 18 a 24 h. Los cultivos que se mostraron puros en T1N1 fueron sometidos a la prueba de oxidasa. Los cultivos oxidasa-positivos se repic a agar nutritivo en plano inclinado, y se incub durante 18 a 24 h a 35EC. En seguida se someti estos

cultivos a la prueba de antisuero polivalente. Para el recuento de S. aureus se sembr sobre la superficie seca de agar de Baird Parker 0,1 ml de cada dilucin seleccionada y se incub las placas invertidas a 35EC durante 30 a 48 h. Se cont todas las colonias tpicas y atpicas (grisceas o negras brillantes sin halo o solo con uno de los halos), seleccionandose 5 colonias tpicas y 5 colonias atpicas que se sembr en tubos que contenan 5 ml de caldo de BHI, los que se incub durante una noche a 35EC. A partir del caldo de BHI, se prepar un frotis en coloracin de Gram para verificar la presencia de cocos Gram-positivos y se realiz las pruebas de investigacin de la presencia de coagulasa y la fermentacin aerobica de la maltosa. Los cultivos identificados como S. aureus ( coagulasa y fermentacin aerobica de la maltosa positivos) se repic a agar nutritivo. El recuento de B. cereus se hizo con la utilizacin del agar cereus. Se incub las placas invertidas a 30EC durante 18 a 24 h. Se seleccion de 5 a 7 colonias tpicas, repicandoselos a tubos con agar nutritivo en plano inclinado. Se incub los tubos a 30EC durante 18 a 24 h. En seguida se prepar un frotis el cual se colore con el mtodo de coloracin de esporos, verificando la presencia de bastoncillos cortos con extremidades rectas y la presencia de esporas centrales o paracentrales. A partir de los cultivos puros en agar nutritivo, se realiz las pruebas de verificacin de -hemolisina en agar de sangre de ovino, de motilidad y reduccin de nitrato y de licuefaccin de la gelatina. Los cultivos que se comportaron como B. cereus se repic a agar nutritivo. Para el recuento de C. perfringens, partindose de la dilucin inicial en agua peptonada al 0,1%, se efectu diluciones decimales en serie y se sembr en agar de SPS (en profundidad 1 ml de las diluciones seleccionadas). Despus de solidificado y colocado sobre base de 5 ml o ms del mismo medio se incub las placas invertidas, en anaerobiosis, durante 18 a 24 h a 46EC. Se repic de 5 a 7 colonias sospechosas a tubos que contenan medio de tioglicolato y se incub durante 4 h al bao mara a 46EC o durante una noche a 35EC. Despus de la incubacin, se prepar un frotis a fin de verificar la presencia de bastoncillos Gram-positivos de extremidades rectas. Partiendo de cultivos puros en medio de tioglicolato, se realiz las pruebas de motilidad de nitrato, lactosa-gelatina y prueba de fermentacin tempestuosa (storm-test). Los cultivos que se comportaron como C. perfringens se mantuvieron en agar nutritivo.

La investigacin de Salmonella se realiz a partir de la homogeneizacin de 25 g de la muestra con 225 ml de agua peptonada amortiguada (buffer) al 1% e incubacin a 35EC durante una noche. El cultivo previamente enriquecido se transfiri a tubos que contenan el caldo de Rappaport Vassiliadis para enriquecimiento selectivo y se incub a 42EC durante una noche. El aislamiento se realiz sobre una superficie seca de agar SS y de agar verde brillante, a la que se haya aadido 1 ml de la solucin de novobiocina al 4%, por litro del medio, despus de incubar a 35EC durante una noche. Se aisl las colonias sospechosas en agar nutritivo en plano inclinado, las cuales se repic en tubos con caldo de urea y se incub durante una noche a 35EC. A partir del agar nutritivo, se repic los cultivos urea-negativos a agar de TSI y LIA incubandoselos a 35EC durante 24 h. Los cultivos que se comportaron como Salmonella se mantuvieron en agar nutritivo. La verificacin del NMP de organismos coliformes de origen fecal se hizo a partir de la siembra de 3 series de 3 tubos con 1 ml de las diluciones de 10-1 a 10-3 o de 10-2 a 10-4, segn el tipo de alimento, en caldo de EC con tubos de Durhan invertidos, los cuales se incub durante 3 h a 35EC y despus durante una noche al bao mara a 45,5EC. Partiendo de tubos positivos para la produccin de gas en el caldo de EC, se sembr tubos con caldo de triptona para la verificacin de la produccin de indol a 45EC durante 18 a 24 h. Para llegar al resultado final se consult las tablas de NMP (Anexo 7). La presencia de E. coli O157:H7 se investig a partir de la homogeneizacin de 25 g de la muestra con 225 ml de agua peptonada amortiguada al 1% que, despus de una incubacin a 35oC durante 6 h, se repic para la superficie de agar de Mac Conkey Sorbitol, incubandose otra vez a 35oC durante 24 h. Se aisl de 3 a 5 colonias sorbitol negativas y las cuales se repic a tubos con caldo de EC, con caldo urea y a dos tubos con 10 ml de agar de motilidad, aadindose a uno de ellos una gota de antisuero H7. Los tubos de caldo de EC se incub al bao mara a 45,5EC, y los tubos con caldo urea y con agar de motilidad a 35EC durante 24 h. Los cultivos que presentaron motilidad positiva en el agar de motilidad y negativa en el agar de motilidad al que se ha aadido antisuero H7, reaccin negativa en el caldo urea y crecimiento negativo en el caldo EC a 45,5EC, se consider presuntamente como E. coli O157:H7 y se repic a agar nutritivo. 5.6 Confirmacin de los resultados Los cultivos puros obtenidos de las muestras que se revelaron, durante el

proceso analtico, como sospechosas de contener uno o ms de los microorganismos objeto del presente estudio se transplantaron en agar nutritivo y se enviaron al IAL para identificacin complementara y averiguacin de toxigenicidad. Las pruebas realizadas en el laboratorio de referencia fueron las siguientes: C C Vibrio cholerae: pruebas complementaras de confirmacin (7). Staphylococcus aureus: identificacin de las toxinas tipo A, B, C y D por RPLA (Reverse Passive Latex Aglutination) (14). Bacillus cereus: identificacin de las toxinas diarrica y emtica por RPLA (3). Clostridium perfringens: identificacin de la toxina tipo A (3, 35, 36). Salmonella: identificacin serologica (57). Escherichia coli: identificacin de cepas patognicas y de E. coli O157:H7 (58, 99).

C C C

5.7

Estimacin del nmero de consumidores expuestos al riesgo de enfermar A fin de poder estimarse el nmero de consumidores expuestos al riesgo de enfermarse a travs del consumo de alimentos en la va pblica, se verific cada ficha de recoleccin de las muestras que presentaron contaminacin en niveles iguales o superiores al establecido en 5.4. Teniendo en cuenta que una porcin de alimento contena alrededor de 300 g(ml), se tom la informacin sobre el volumen en gramos (mililitros) del alimento vendido en el da de la recoleccin de la muestra (Anexo 2, 1.3) y se dividi por 300. As, se lleg al nmero de consumidores que, en el da de la recoleccin de la muestra, estuvieron potencialmente expuestos a adquirir ETA a travs del alimento contaminado. Si bien se reconoce que hay muchas variables que hacen con que la flora microbiana de los alimentos callejeros presente cambios peridicos, incluyendo la temperatura de preparacin y/o de mantenimiento, la temperatura ambiente, las condiciones higinicas del(los) manipulador(es), etc., se ha supuesto que esas condiciones son similares durante todo el ao. Adems, se consider que los puestos de venta funcionan por lo menos 5 das por semana durante las 52 semanas del ao. As, las estimaciones del nmero de consumidores expuestos a enfermar se basan en las siguientes suposiciones:

C C C C

que las condiciones de preparacin y expendio son constantes a lo largo del tiempo; que los puestos funcionan 5 d/semana durante las 52 semanas del ao; que la muestra analizada es representativa de todo el alimento muestreado; que cada consumidor consume una porcin de 300 g(ml).

Se utiliz, para cada microorganismo, en cada una de las 8 ciudades, la frmula siguiente: Consumidores expuestos al riesgo de enfermarse = (3 personas que consumieron el alimento contaminado) 260*
*

260 = das estimados de funcionamiento durante el ao.

Esto ha permitido estimar el riesgo a que los consumidores de las ciudades estudiadas estuvieron expuestos a enfermarse por S. aureus, B. cereus, C. perfringens o Salmonella, a travs del consumo de alimentos expendidos en la va pblica.

6.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Los resultados de este estudio se presentan en varios cuadros (1 - 19) y figuras (1 28) que aparecen en el Anexo 1. En total se encuestaron 2342 vendedores/manipuladores y 2134 consumidores y se analizaron 2433 muestras de alimentos. 6.1 Anlisis exploratorio y descriptivo 6.1.1 Encuesta a vendedores/manipuladores El Cuadro 1 y las Figuras 1 - 5 presentan la informacin referente a caractersticas de los vendedores ambulantes en las ocho ciudades estudiadas. En cinco de las ciudades (La Paz, Santaf de Bogot, Quito, Lima y Ciudad de Guatemala) se observ que el expendio de alimentos en la va publica es un oficio con alta participacin del sexo femenino. As, en La Paz casi el 90% de los vendedores fueron mujeres, mientras que en Quito y Lima, este porcentaje super el 80%. Eso reafirma observaciones anteriores (1, 2) acerca de la importancia de la venta callejera de alimentos como actividad que, en el caso de la mujer, es una alternativa para contribuir en el ingreso familiar, trasladando a la calle un oficio que ha venido desempeando tradicionalmente en el hogar y contribuyendo a superar el deterioro del nivel del ingreso familiar, a consecuencia de la cada real de los

salarios en la regin, observada en los ltimos 10 aos (100). Hay que destacar la situacin aparentemente inversa que se ha observado en Santo Domingo, Ciudad de Mxico y Culiacn. En esas ciudades los vendedores resultaron ser en su mayora del sexo masculino. En Culiacn ms de 80% de los vendedores eran hombres. En general, no se observaron grandes diferencias en la distribucin por edad de los vendedores ambulantes en las ocho ciudades. En todas ellas la mayora de los vendedores tenan entre 26 y 60 aos de edad. Dentro de este grupo etreo, en siete de las ocho ciudades hubo mayor porcentaje de vendedores en el grupo de 26 a 40 aos que en el grupo de 41 a 60 aos. La nica excepcin se dio en la ciudad de Lima, donde casi el 50% de los vendedores tenan ms de 40 aos. La informacin obtenida permite a su vez constatar que, en por lo menos tres de las ciudades (Santo Domingo, Ciudad de Mxico y Culiacn), la actividad de venta de alimentos en las calles es desempeada por hombres en edad productiva mxima, fenmenos todos estos que revelan la importancia de la actividad en la economa informal de los pases. En cuando a nivel educacional, ingresos y cursos de capacitacin, se observa que en todas las ciudades, ms del 50% de los vendedores de alimentos callejeros tienen por lo menos educacin secundaria, lo que habla en general de una escolaridad con potencial para conocer o asimilar los hbitos correctos de manipulacin de alimentos. De otra parte, si bien se han identificado vendedores con instruccin universitaria en todas las ciudades encuestadas, la situacin en Culiacn merece un comentario a parte ya que en esa ciudad ms del 27% de ellos manifestaron tener ese nivel educativo. Eso podra indicar que las personas en esa condicin, no cuentan en esa ciudad con mejores alternativas de trabajo, sobre todo cuando la informacin indica que los ingresos mensuales de ms del 75% de los vendedores es de menos de 3 salarios mnimos, situacin que reafirma otra de las bondades atribuida a la venta callejera de alimentos cual es la de contribuir para atenuar la desocupacin en las ciudades (2). En lo que se refiere a ingresos provenientes de la actividad de vender alimentos en la calle, la informacin obtenida indica dos grupos de ciudades en situacin diferente. As, mientras en Santaf de Bogot, Lima, Ciudad de Mxico y Culiacn, el ingreso mensual de la gran mayora (>75%) de los vendedores no alcanza a los 3 salarios mnimos, en La Paz, Quito, Santo Domingo y Ciudad de Guatemala la mayora de los vendedores tienen un ingreso de por lo menos 4 salarios mnimos. En Ciudad de Guatemala, el 42% de los vendedores refirieron recibir ms de 10 salarios mnimos.

En casi todas las ciudades, con excepcin de Ciudad de Guatemala y Culiacn, ms del 50% de los vendedores nunca recibieron cursos de capacitacin relacionados con el manejo higinico de alimentos. Si bien estos porcentajes pueden considerarse una cobertura insuficiente, conviene hacer notar que las actividades de los diversos proyectos de cooperacin en este campo, desarrollados por agencias como FAO, OPS/OMS y otras que han dedicado considerables recursos humanos y financieros, quizs no han sido proseguidas con efecto multiplicador por los pases, adems que la frecuente rotacin de oficio entre el comerciante informal, puede determinar que sea imposible mantener una cobertura alta con actividades tradicionales de capacitacin. Es posible que la situacin de Culiacn, en donde ms del 54% de los vendedores declararon poseer capacitacin, est relacionada con el elevado grado de instruccin universitaria (>27%) o el nfasis que en ocasiones asignan las autoridades sanitarias a la capacitacin en reas de turismo. Los Cuadros 2 y 3 y las Figuras 6 - 12 muestran caractersticas de los puestos de venta por ciudad. La importancia de la venta callejera de alimentos como actividad familiar queda reflejada en los resultados contenidos en el Cuadro 2 y en la Figura 6, en los cuales se observa que vender alimentos en la calle es, por lo menos en las ciudades observadas, una actividad predominantemente familiar. En la mayora de las 8 ciudades encuestadas, por lo menos el 65% de los puestos de venta son atendidos por una o dos personas (Figura 7). Debido al potencial que tienen los alimentos callejeros de transmitir ETA, es importante valorar el nmero de consumidores que son atendidos en estos puestos en una jornada de trabajo (Figura 8). La informacin obtenida muestra que mientras en La Paz, Lima, Ciudad de Mxico y Culiacn la mayora (>50%) de los puestos de venta atienden entre 10 y 30 consumidores al da, en Santaf de Bogot, Quito, Santo Domingo y Ciudad de Guatemala la mayora de los puestos (>60%) atiende a ms de 30 consumidores por da. Tambin se observa que la gran mayora (>70%) de los puestos de venta funciona entre 5 y 12 h por da (Figura 9). La situacin en Santaf de Bogot y Santo Domingo merece registro especial, ya que en esas ciudades, ms del 14% de los puestos funcionan ms de 12 h por da. Las condiciones de saneamiento bsico de los puestos, se resumen en el Cuadro 3 y en las Figuras 10 y 11, en los cuales los resultados muestran que en cinco de las ciudades (Santaf de Bogot, Quito, Lima, Ciudad de Guatemala y Culiacn), por lo menos el 85% de los

puestos de venta de alimentos cuenta con acceso al agua, si bien esto no significa que el agua provenga de una conexin a la red de acueducto, pues una gran proporcin de los puestos de venta son mviles o cuentan con instalaciones precarias, ni tampoco que el agua atienda a patrones aceptables de potabilidad. Sin embargo, ms preocupante es la situacin verificada en La Paz y Ciudad de Mxico, donde cerca del 30% de los puestos carece de acceso al agua o en Santo Domingo, donde casi el 85% de los puestos carece de este insumo indispensable. La Figura 10 muestra las fuentes de abasto de agua por ciudad. Entre los vendedores que tienen acceso al agua, la gran mayora de ellos la aquella proveniente de la red publica o le agrega cloro en el puesto. Esto quizs se pueda atribuir a la cooperacin tcnica dedicada por agencias que como la OPS y el Banco Interamericano de Desarrollo (BID) quienes a raz de la epidemia del clera en la Regin, han destinado importantes recursos tcnicos y financieros para mejorar la calidad del agua y transferir tecnologa con soluciones simples para la clorinacin de pequeos volmenes de agua, adems de capacitar a la comunidad para la adecuada utilizacin de este recurso. Esto contrasta con lo observado en Ciudad de Guatemala donde, si bien la mayora de los puestos cuenta con acceso al agua, ms de un tercio la utiliza sin ningn tipo de tratamiento, convirtindola en un peligro potencial, considerando el importante rol de ese insumo en la vehiculizacin de ETA. De otra parte, al observarse la informacin sobre las facilidades para eliminacin de aguas servidas, se verifica que en siete de las ocho ciudades menos del 40% de los locales cuentan con esos servicios. En algunas ciudades, como es el caso de Quito, Lima, Santo Domingo y Ciudad de Guatemala, el porcentaje llega a menos del 20%, lo que sin duda, constituye en un gran riesgo de contaminacin del ambiente, incluidos los alimentos que se expenden en los propios locales. El carcter mvil o la localizacin temporaria de muchos de los puestos, determina que muy pocos de ellos cuenten con acceso a servicios sanitarios en las cercanas. El mayor porcentaje de puestos con estos servicios se verific en La Paz, llegando solo al 33% (Figura 11). La falta de ese servicio indispensable determina que en muchos casos, vendedores y consumidores deban satisfacer sus necesidades fisiolgicas en la va publica, otro factor que contribuye a contaminar el ambiente en donde de prepara y expenden los alimentos y al menoscabo en la higiene de los manipuladores.

Con excepcin de Lima y Santo Domingo, en las restantes ciudades ms de dos tercios de los vendedores cuentan con facilidades para recolectar y eliminar las basuras. En Lima, la situacin se muestra especialmente preocupante, si se tiene en cuenta que menos del 10% de los vendedores cuentan con ese requisito indispensable para el mantenimiento de la condiciones de salubridad del ambiente, en tanto que en Santo Domingo este porcentaje lleg al 29%. Respecto al origen de las materias primas para la preparacin de los alimentos, ms del 75% de los vendedores de Santaf de Bogot, Ciudad de Mxico y Culiacn las adquieren de un mismo proveedor, situacin bien distinta de la observada en La Paz y Ciudad de Guatemala donde las materias primas son suministradas por varios proveedores en ms del 70% de los casos. Por otro lado, en casi todas las ciudades, parece ser el propio vendedor quien prepara los alimentos a comercializarse posteriormente. La nica ciudad en donde la adquisicin de alimentos preparados por terceros llama la atencin en trminos de porcentaje es Santaf de Bogot, donde esa prctica alcanza el 35% de los puestos. Una proporcin importante de los vendedores de La Paz, Quito y Culiacn, prepara los alimentos en el hogar. Simultneamente, ms del 70% de los vendedores de La Paz, Lima, Santo Domingo, Ciudad de Guatemala y Ciudad de Mxico, manifestaron preparar alimentos en el local de expendio. El comercio de alimentos en las calles parece ser una actividad diversificada, que tiene como caracterstica la venta de alimentos tanto preparados en el hogar como otros que se preparan en cocinas improvisadas en los locales de venta y finalmente un tercer grupo de alimentos adquiridos de terceros ya listos para consumo. En cinco ciudades (Santaf de Bogot, Quito, Santo Domingo, Ciudad de Mxico y Culiacn) ms del 65% de los vendedores, informaron que cuentan con facilidades para recalentar o enfriar los alimentos. Este tipo de instalaciones puede servir tanto para disminuir como para incrementar el riesgo de multiplicacin microbiana en los alimentos, ya que ms del 50% de los vendedores no cuentan con cursos de capacitacin en buenas practicas de manipulacin de alimentos lo cual hara suponer que no conocen las temperaturas criticas para el desarrollo microbiano. La informacin respecto a la reutilizacin de los alimentos sobrantes (Figura 12) muestra que en la Ciudad de Guatemala y en Culiacn,

(donde el porcentaje de vendedores con curso de capacitacin sobrepasa el 50%) menos del 35% de los vendedores aprovechan los sobrantes, en tanto que en todas las otras ciudades participantes ms del 55% de los vendedores refirieron reutilizar alimentos, porcentaje que result cercano al 85% en La Paz y Lima.

6.1.2

Resultados de los anlisis microbiolgicos Si bien se reconoce que la dosis infectante de los microorganismos investigados son, en general, 1 a 2 log mayores (3, 6, 11, 33, 42) que la dosis considerada de riesgo en el presente estudio, las condiciones higinicas de los puestos de venta, la temperatura de mantenimiento de los alimentos y el tiempo medio en que los mismos quedan en exposicin en una jornada normal, han determinado la utilizacin de nmeros ms bajos. Los Cuadros 4 al 10 y las Figuras 13 y 14 presentan un resumen de las caractersticas de las muestras de alimentos analizadas, el porcentaje de muestras positivas por tipo de alimento, la contaminacin por los distintos microorganismos estudiados y las caractersticas de las muestras por microorganismo y por ciudad estudiada. Se recolectaron un total de 2433 muestras. En algunas ciudades el nmero de muestras analizadas fue superior a las 300 muestras planeadas. Debido a las diferencias en el riesgo de contaminacin microbiolgica que presentan los diferentes grupos de alimentos estudiados (crnicos, frutas y verduras, granos y cereales, dulces, productos lcteos, jugos naturales, helados y pescados y mariscos), no se buscaron todos los microorganismos en todos los tipos de alimentos. Este hecho, sumado a diferencias en la distribucin proporcional de alimentos por ciudad, ha determinado que el nmero de muestras para la bsqueda de los diferentes microorganismos haya mostrado variaciones sustanciales entre unas ciudades y otras. El Cuadro 4 muestra que si bien los alimentos que contenan carne en su composicin fueron mayora en seis de las ocho ciudades, su participacin porcentual fue destacada en Santaf de Bogot (>50%). En algunas ciudades tambin se destacaron otros tipos de alimentos entre los ms muestreados, como por ejemplo los lcteos en La Paz, los granos y cereales en Lima y Quito, los pescados y mariscos en Quito, Lima y Culiacn y las frutas, verduras y jugos naturales en La Paz, Ciudad de Mxico y Culiacn. Eso muestra la variedad de alimentos que se expenden en las calles de la Regin, y explica la aparente disparidad entre el nmero de muestras que se analiz para cada uno de los microorganismos encuestados.

6.1.2.1 Vibrio cholerae Teniendo en cuenta la epidemia de clera que ha afect a la mayora de los pases de la Regin a partir de 1991, y considerando hallazgos anteriores (101), se busc V. cholerae en todas las muestras en condicin de anlisis, con excepcin de las muestras recolectadas en la ciudad de Santo Domingo, ya que la Repblica Dominicana se mantiene libre de la enfermedad. En total, se analizaron 2089 muestras, sin haber demostrado en ninguna de ellas la presencia del microorganismo en cantidades >103 UFC/g de alimento (Cuadro 4). 6.1.2.2 Staphylococcus aureus La observacin de la informacin sobre la contaminacin de los alimentos callejeros por S. aureus, indica que este microorganismo ofrece un riesgo porcentualmente mayor que los dems involucrados en el estudio. As, entre las 1630 muestras analizadas, se verific que este microorganismo estuvo presente, en dosis de por lo menos 103 UFC/g, en ms del 25% de los alimentos comercializados en Ciudad de Guatemala y en 16% de los alimentos vendidos en La Paz, decreciendo hasta valores cercanos a los 7% en Quito y Lima, 5,5% en Santaf de Bogot y poco ms del 2% en las dems ciudades (Cuadro 4). Con relacin a los tipos de alimentos analizados, se encontr el S. aureus en aproximadamente 20% en los dulces, 10% en granos y cereales, productos lcteos y pescados y derivados, y alrededor de 5% en los productos crnicos (Cuadro 5). Merece especial mencin el hecho de que no se busc S. aureus en muestras de frutas y verduras, tomando en consideracin que esos alimentos no ofrecen riesgo potencial de producir ETA por ese microorganismo. Como se puede observar en el Cuadro 6, las diferencias por ciudad no se modificaron sustancialmente luego de ajustar por tipo de alimento. 6.1.2.3 Bacillus cereus El B. cereus se investig en 1631 muestras de los alimentos callejeros a base de carnes, granos y cereales, dulces y productos lcteos de las 8 ciudades. En Culiacn, alrededor del 32% de las muestras estaban contaminadas con ese microorganismo. La contaminacin estuvo alrededor del 8% en Lima y Guatemala, entre 4 y 5% en Ciudad de Mxico y

Santaf de Bogot y cerca del 2% en las dems ciudades (Cuadro 4). Es de destacar que la mayor cantidad de muestras positivas se observ en los productos a base de carnes (15%). Tambin merece mencin el hecho de que en su mayora, se trataban de platos compuestos en los cuales los cereales hacan parte de su composicin. Adems, se encontraron muestras positivas en los granos y cereales (4,4%), dulces (3,6%) y productos lcteos (2,6%) (Cuadro 5). Como puede observarse en el Cuadro 6, las diferencias por ciudad no se modificaron sustancialmente luego de ajustar por tipo de alimento. 6.1.2.4 Clostridium perfringens La bsqueda de C. perfringens se hizo sobre 805 muestras de alimentos callejeros que contenan carne en su composicin. La observacin de la informacin presentada en el Cuadro 4 nos indica que la contaminacin por ese microorganismo est presente en las muestras de todas las ciudades en porcentajes que oscilaron entre el 3,6% en Lima, hasta el 9,3% en La Paz, situndose alrededor del 4% en las dems ciudades. Estos porcentajes no se modificaron sustancialmente al ajustar por tipo de alimentos (Cuadro 6). En La Paz hubo que modificar la metodologa analtica adoptada en los dems laboratorios, en consecuencia de limitaciones en el equipo de incubacin. As, la etapa de incubacin en condiciones de anaerobiosis se realiz a 35 - 37oC por 48 h. 6.1.2.5 Salmonella La reconocida capacidad de las salmonelas para contaminar diversos tipos de alimentos, ha sido el factor determinante de la bsqueda de ese microorganismo en la totalidad (2388) de las muestras recolectadas y que se presentaron en condiciones de anlisis. La informacin que se presenta en los cuadros 4 y 5 permite observar que la mayor ocurrencia de Salmonella se encontr en los alimentos comercializados en las calles de Culiacn (3,7%). Tambin contenan el microorganismo alimentos de La Paz y Ciudad de Guatemala (1,3%), Santaf de Bogot y Lima (0,7%) y Ciudad de Mxico (0,3%), mientras en Quito y Santo Domingo ninguna muestra analizada revel estar contaminada por este microorganismo. El anlisis de la contaminacin desde el punto de vista de los tipos de alimentos, se verifica que son los alimentos a base de carne los que presentan el mayor riesgo (1,7%) de contener Salmonella, seguidos de las frutas y verduras

(1,5%), los pescados y mariscos (1,0%) y los jugos naturales (0,2%) (Cuadro 5). Como se observa en el Cuadro 6, las diferencias por ciudad no se modificaron sustancialmente al ajustar por tipo de alimento. 6.1.2.6 Organismos coliformes fecales Varios autores (6, 58, 60, 61) recomiendan la bsqueda de esos microorganismos en los alimentos, como indicacin de su contaminacin directa o indirecta por heces humanas o de otros animales de sangre caliente. Su hallazgo en los alimentos indica que otros patgenos entricos, como Salmonella, Shigella y otros (incluyendo cepas patognicas de E. coli), pueden estar presentes, mismo que no se hayan identificado en la muestra. El Cuadro 7 y Figura 15 muestran que la contaminacin de origen fecal de los alimentos en las ciudades estudiadas vari entre el 9,4% en Santo Domingo y el 56,7% en Culiacn. En cuanto e la contaminacin por tipo de alimento (Cuadro 8), los porcentajes ms altos de contaminacin se encontraron en los pescados y mariscos (47,4%), productos crnicos (39,4%) y granos y cereales (35,3%). Es importante destacar que incluso luego de ajustar por tipo de alimentos, un porcentaje considerable de los alimentos estaban contaminados por coliformes de origen fecal, sugiriendo la posibilidad de contaminacin por otros microorganismos, incluyendo los patgenos. Adems, esto indica que los alimentos son manipulados y/o mantenidos en condiciones favorables a la supervivencia y desarrollo de esta flora indeseable. As, los datos ajustados muestran que el 53,8% de los alimentos en Culiacn, 49,8% en Lima, 33,2% en Ciudad de Mxico, 27,9% en La Paz, 24,5% en Quito, 22,6% en Ciudad de Guatemala, 15,4% en Santaf de Bogot y 13,9% en Santo Domingo, son potencialmente riesgosos. Esta es una informacin muy importante, desde el punto de vista de salud pblica, teniendo en cuenta el origen de este grupo bacteriano indicador. La relacin de la E. coli no patognica con los dems patgenos de transmisin fecal-oral tiene que ver con la presencia de esos patgenos en la poblacin humana y animal y la contaminacin de materias primas, adems de las condiciones de manipulacin y conservacin de los alimentos en las calles, entre otras.

6.1.2.7 Escherichia coli O157:H7 Si bien se reconoce que los mayores riesgos de ETA por el consumo de alimentos en la calle se concentran en la enfermedad causada por microorganismos como S. aureus, C. perfringens, B. cereus y Salmonella, la gran importancia que viene adquiriendo la E. coli O157:H7 en los pases desarrollados, despert nuestro inters por investigar su presencia en los alimentos expendidos en vas pblicas. Esto determin la bsqueda de ese microorganismo emergente en 2389 muestras de alimentos pertenecientes a los 8 grupos arriba citados, en todas las ciudades estudiadas. Solo una muestra, perteneciente a una fruta comercializada en la va publica de la Ciudad de Guatemala (papaya pelada), dio como resultado la presencia de ese microorganismo. La presencia de E. coli O157:H7 en un alimento de venta callejera sugiere que el mismo est diseminado de manera significativa en el medio ambiente. Por eso, y teniendo aun en consideracin la gravedad de la enfermedad producida por este patgeno, es que se considera este nico caso como muy importante. 6.1.3 Encuesta a consumidores La informacin para conocer caractersticas demogrficas y socioeconmicas de los consumidores, est basada en las entrevistas a cerca de 300 consumidores en la mayora de las ciudades. En la Ciudad de Guatemala sin embargo, solo pudo encuestarse a 239 y en la Ciudad de Mxico a 273, en tanto que en La Paz, los resultados estn basados en alrededor de 120 encuestas aplicadas. El Cuadro 11 y las Figuras 16 - 20 muestran algunas caractersticas demogrficas y socioeconmicas de los consumidores encuestados. Puede observarse que, si bien la distribucin de los consumidores por sexo, vara de ciudad en ciudad, en todas ellas predominan los hombres entre las personas que consumen alimentos en la va pblica, siendo ms notoria su participacin en ciudades como Lima (tan solo un 19.5% de mujeres), Santo Domingo y Santaf de Bogot, en las cuales ms de un 70% de los consumidores son del sexo masculino. A su vez, se observa que un alto porcentaje de los consumidores se encuentran en edades econmicamente activas; as en todas las ciudades entre el 40 y el 50% de los consumidores tiene entre 26 y 40

aos, porcentaje que es incluso mayor en Lima, donde cerca del 80% de los consumidores pertenece a este grupo etreo, datos que sugieren que la venta callejera puede ser una fuente importante de alimentos para la poblacin econmicamente activa. El perfil ocupacional de los consumidores nos muestra que quienes con mayor frecuencia hacen uso de las comidas en la va publica son obreros y oficinistas. Entre los encuestados, la proporcin de estos dos grupos de poblacin es cercana a las tres cuartas partes en la mayora de las ciudades y llega al 78% en Ciudad de Guatemala, 77% en Quito, 73% en Ciudad de Mxico y 71% en Santaf de Bogot; de los dos grupos, el de obreros reviste especial importancia como consumidor: en Santaf de Bogot, Quito, Lima, Santo Domingo y Ciudad de Guatemala, ms del 50% de los entrevistados son obreros y en las ciudades restantes constituyen en todos los casos ms del 30% de la muestra. Los profesionales tienen una participacin relativamente importante como consumidores en Quito (22%), Ciudad de Mxico (18%) y Santo Domingo (16%). Resulta manifiesto que son las personas de menores ingresos las que hacen mayor utilizacin de las ventas callejeras; as en Culiacn, el porcentaje de consumidores con ingresos de menos de 3 salarios mnimos llega a un 96%, en Lima al 95%, en Santaf de Bogot al 79%, en Ciudad de Mxico al 71%. Solo se registr un porcentaje relativamente alto de consumidores con ingresos superiores a 3 salarios mnimos en La Paz y Ciudad de Guatemala. Los resultados acerca del nivel educativo de los consumidores, indican un alto porcentaje de consumidores (cerca del 80% en la mayora de las ciudades) con estudios primarios y secundarios, mientras que la proporcin de personas con formacin universitaria tiene una participacin destacada tan solo en Santaf de Bogot (20%), Ciudad de Mxico (25%) y Culiacn (40%), ciudad esta ltima de gran importancia turstica lo cual podra explicar en parte el consumo de alimentos por un porcentaje relativamente alto de personas con ese nivel de educacin. Por su parte, solo Ciudad de Guatemala registra un importante porcentaje de analfabetos ( 22%) entre los consumidores, situacin que posiblemente tenga repercusin en los hbitos y actitudes de los encuestados frente al consumo de alimentos y a su percepcin de los conceptos relacionados con la higiene de los mismos. Hay que tener en cuenta que Guatemala es un de los pases de la regin con ndices ms altos de analfabetismo en su poblacin (100). El Cuadro 12 y las Figuras 21 - 24 muestran algunas caractersticas

del consumo de alimentos en la va publica. En general, la mayora de los encuestados refiri que consume alimentos en la va publica una o dos veces por da. La nica excepcin fue Santaf de Bogot, donde el 50% refiri consumirlos ms de tres veces por da. En relacin al sitio de consumo del alimento, se encontr que la mayora de encuestados consume la comida en el local de venta, siendo la nica excepcin la Ciudad de Guatemala, donde solo el 55% refiri consumir en el puesto de venta. Excepto en el caso de Lima, entre el 15 y el 30% de los encuestados refiri que lleva comida al hogar. En Lima, solo el 1,5% refiri llevar comida al hogar. El nmero de personas que consumen esta comida en el hogar fue muy variable de ciudad en ciudad. As, en Ciudad de Mxico, casi el 70% de los encuestados que llevan comidas callejeras al hogar refieren su consumo por una persona, en tanto que en Culiacn, ms del 25% manifestaron que la comida era consumida por ms de tres personas. Junto a los resultados presentados para vendedores, estos resultados sugieren que tanto entre consumidores como vendedores existe potencial para recibir cursos de capacitacin y/o informacin sobre manipulacin higinica de alimentos. Las cifras obtenidas con estas variables, son un indicador de la contribucin de la venta de alimentos en la va publica a la seguridad alimentaria de grupos poblacionales que en razn de sus actividades y estilo de vida acuden a este tipo de comercio durante su jornada diaria, y lo hacen tambin por habito y para satisfacer su gusto por determinados tipos de comida vendida en la calle. El porcentaje de encuestados que refiri diarrea en los ltimos cinco das vari de ciudad en ciudad, desde un valor mximo de 9,7% en Ciudad de Mxico, hasta un mnimo de 1,1% en Lima. El porcentaje con antecedentes de vmitos en los ltimos cinco das oscil entre el 0,6 % (en Ciudad de Guatemala) y el 5,2 % (en Santaf de Bogot) (Cuadro 13A). Como puede observarse en el cuadro siguiente, los patrones observados no se modificaron sustancialmente luego de ajustar las tasas por edad, sexo, ingreso y escolaridad de los consumidores (Cuadro 13B). El resultado de la observacin de sntomas gastrointestinales en las ocho ciudades se muestran en la Figura 16. 6.2 Variables asociadas a la ocurrencia de sntomas gastrointestinales entre los consumidores 6.2.1 Relacin entre ocurrencia de diarrea y vmitos entre los consumidores y tasa de contaminacin de los alimentos

muestreados Debido a que se carece de informacin especfica sobre la contaminacin de los alimentos consumidos por cada consumidor encuestado, la investigacin de la relacin entre contaminacin de alimentos y sntomas gastrointestinales debi limitarse a investigar asociaciones ecolgicas entre contaminacin y la ocurrencia de sntomas en cada una de las ciudades. Como muestran las Figuras 25 - 28, no se observaron asociaciones entre la tasa de contaminacin y la ocurrencia de sntomas para ninguno de los microorganismos investigados. Asimismo, diversos factores psicolgicos y culturales pueden haber reducido la validez de la informacin sobre sntomas gastrointestinales obtenida en las encuestas a consumidores. Adems, es importante considerar que la encuesta se realiz entre consumidores asiduos, lo que tambin lleva a suponer que los mismos hayan desarrollado algn factor de proteccin contra las patogenias que pueden causar los microorganismos estudiados. La literatura cientfica registra varias investigaciones (102 - 106) en donde se ha comprobado el poder inmunognico de algunos microorganismos como E. coli enterotoxigenico, Salmonella y Shigella flexneri, entre otros. Esto tambin puede relacionarse con el hecho de que los turistas que consumen alimentos en la calle sean siempre mas afectados por sntomas grastrointestinales que la poblacin local. Finalmente, hay que considerarse que la frecuencia de aislamiento de los microorganismos en los alimentos estudiados, indica la existencia de una condicin endmica, con las connotaciones sealadas anteriormente en 3.8.

6.2.2

Relacin entre caractersticas del consumo callejeros y sntomas gastrointestinales

de

alimentos

Los Cuadros 14 y 15 muestran la razn de posibilidades (odds ratio) de haber tenido diarrea o de haber tenido vmitos segn la frecuencia de consumo de alimentos callejeros y el sitio de consumo. No se observ ninguna relacin entre las posibilidades (odds) de tener diarrea y la frecuencia de consumo de alimentos en la va pblica (Cuadro 14). Una vez ajustado por ingreso y educacin, el riesgo de padecer diarrea se encontr ligeramente elevado en quienes dijeron haber consumido los alimentos en el sitio de venta en comparacin con quienes dijeron no hacerlo; este incremento no fue estadsticamente significativo (los intervalos de confianza del 95% sobre la razn de posibilidades (odds ratio) incluyeron el valor 1.0). Las posibilidades (odds) de haber padecido vmitos en los ltimos 5 das aumentaron a medida que aument la frecuencia del consumo de alimentos en la va pblica, aunque los intervalos de confianza del 95% para la razn de posibilidades siempre incluyeron al valor 1.0 (Cuadro 15) y la tendencia de incremento en la ocurrencia de vmitos al incrementarse la frecuencia de consumo no fue estadsticamente significativa. Estas asociaciones persistieron luego de ajustar por ingreso y educacin. No se observ ninguna relacin entre haber padecido vmitos y el sitio de consumo de los alimentos. 6.3 Relacin entre caractersticas de los vendedores y de los puestos y la contaminacin bacteriana Los Cuadros 16-19 muestran razones de posibilidades (odds ratios) de contaminacin por distintos microorganismos luego de ajustar por ciudad. La Ciudad de Guatemala se excluy de estos anlisis ya que no fue posible aparear los resultados de los anlisis microbiolgicos en las muestras de alimentos con las encuestas a vendedores. No se observaron asociaciones claras entre el sexo o la edad de los vendedores y las posibilidades (odds) de contaminacin. Tampoco hubo un patrn claro en cuanto a la relacin entre la educacin y el ingreso de los vendedores y las posibilidades de contaminacin. Para S. aureus, B. cereus y coliformes de origen fecal, las posibilidades de contaminacin fueron menores en los vendedores de menor ingreso y educacin, pero estas diferencias fueron estadsticamente significativas en muy pocos casos (en la gran mayora, los intervalos de confianza del 95% incluyeron el valor 1.0). Por el contrario, la contaminacin por C. perfringens pareci estar aumentada en los vendedores de menores ingreso y educacin, pero las diferencias en ningn caso fueron estadsticamente significativas (P <0.05). No hubo asociaciones claras entre

las posibilidades de contaminacin y la asistencia a cursos de manipulacin de alimentos por parte de los vendedores. En este sentido, es importante evaluar el contenido de los cursos recibidos y la aplicacin de las medidas higinicas por parte de los vendedores. Tambin es posible que el riesgo de transmisin de ETA a travs del consumo de esos alimentos solamente presentar disminucin importante cuando la educacin de los vendedores/manipuladores se complemente con programas apropiados de informacin a los consumidores. En general tampoco hubo asociaciones claras entre el nmero de personas que trabajan en el local, el nmero de personas que se atienden por da, las horas que atienden por da, o el ser una actividad familiar y las posibilidades de contaminacin. Las nicas excepciones fueron la contaminacin por C. perfringens, que se encontr significativamente aumentada el locales que no refirieron ser una actividad familiar (P <0.05) y la contaminacin por coliformes de origen fecal, que aument significativamente a medida que aument el nmero de empleados en el local y el nmero de comensales. El uso de agua sin tratar estuvo asociado a incrementos en las posibilidades (odds) de contaminacin de los alimentos para todos los grmenes, aunque estos incrementos no fueron estadsticamente significativos. El uso de agua clorada estuvo incluso asociado a incrementos estadsticamente significativos en las posibilidades de contaminacin por S. aureus. La escasa cantidad de puestos sin acceso a agua hace difcil la interpretacin de las razones de posibilidades correspondientes a esta categora. No hubo asociaciones claras entre el riesgo de contaminacin y la presencia de sistemas de eliminacin de aguas o basuras o la existencia de letrinas en la proximidad se los puestos. Tampoco hubo asociaciones claras entre las posibilidades de contaminacin y el sitio de preparacin de alimentos, la presencia de instalaciones para calentar o enfriarlos, o el aprovechamiento de alimentos sobrantes. El adquirir los alimentos de ms de un proveedor tampoco se relacion claramente con las posibilidades (odds) de contaminacin. 6.4 Evaluacin de las muestras positivas y del riesgo de enfermarse Adems del anlisis microbiolgico de los alimentos, se evaluaron individualmente todas las fichas de recoleccin de las muestras de alimentos que presentaron dosis infectante de S. aureus, B. cereus y/o C. perfringens, o presencia de Salmonella o E. coli O157:H7 (Anexo 2). En la evaluacin se consideraron su composicin, temperatura en el momento de recoleccin de la muestra, condiciones en que se lo mantena en el puesto de venta y volumen expendido en una jornada de trabajo. Tambin se revis la informacin referente al vendedor y al puesto de venta como horas de funcionamiento, aspectos higinicos del puesto, nmero promedio de consumidores atendidos, etc. Toda esa informacin complementara se

recolect de las fichas individuales de recoleccin de muestras, y es la base de muchos de los comentarios que se hacen a continuacin. 6.4.1 Vibrio cholerae Si bien los resultados relativos a la bsqueda de dosis infectante de V. cholerae son coincidentes con el descenso de la curva epidmica del clera en las ciudades encuestadas, eso no se debe de interpretar como ausencia de riesgo, ya que en otras oportunidades (101) se aisl el microorganismo de varios tipos de alimento callejero. Los programas desarrollados por las agencias de cooperacin tcnica, asociados a programas nacionales de educacin y el fortalecimiento de la vigilancia epidemiolgica por cierto contribuyeron a la reduccin del riesgo presentado por los alimentos callejeros en la transmisin del clera. Sin embargo, hay que tener presente que las condiciones en que se manipulan y comercializan esos alimentos en la va publica, en donde la contaminacin cruzada es una amenaza permanente, el substrato nutritivo ofrecido por los alimentos mismos y la temperatura ambiente en las ciudades estudiadas, son todos ellos elementos muy favorables a la contaminacin de los alimentos por el V. cholerae y su rpida multiplicacin, pudiendo alcanzar la dosis infectante en muy poco tiempo. 6.4.2 Staphylococcus aureus Las muestras positivas para S. aureus halladas en La Paz pertenecan mayormente a los alimentos clasificados como pescados y mariscos, dulces y productos lcteos. La mayor concentracin de muestras positivas en los dos ltimos tipos de alimentos confirma la informacin de que los dulces, especialmente los que contienen crema, y los alimentos a base de leche, ofrecen substrato de excelente calidad para el desarrollo del S. aureus, adems de constituir en un indicador importante sobre la manipulacin y/o el origen de la leche utilizada en la preparacin de cremas y productos lcteos destinados al expendio en las calles. La contaminacin observada en los pescados puede estar asociada al exceso de manipuleo durante la preparacin de eses platillos. Las muestras positivas sugieren que el nmero de manipuladores de alimentos callejeros que son portadores del microorganismo puede ser alto y que o bien la temperatura de coccin de esos alimentos no es suficiente para inactivar el S. aureus o la recontaminacin posterior a la coccin es muy alta. Esta ltima hiptesis parece ser ms probable, por lo menos en el caso de un platillo de pescado frito con maz y papas en donde se ha verificado, adems de la existencia de

S. aureus en cantidades suficientes para causar la intoxinacin, la presencia de Salmonella y un conteo elevado de organismos coliformes fecales. Teniendo en consideracin el nmero promedio de consumidores que acudan a esos puestos, se estima en 700/da la cantidad de personas en riesgo de adquirir ETA por S. aureus, en esa ciudad. La situacin observada en Santaf de Bogot, en donde la mayora de las 13 muestras positivas provenan de alimentos a base de leche o carne, puede indicar la utilizacin de leche no pasteurizada para la elaboracin de los alimentos lcteos destinados al expendio en la va pblica. Esta es una situacin que ocurre en muchas ciudades de la Regin, y que puede ser responsable de un nmero considerable de ETA causadas por el S. aureus, ya que no es poco frecuente que la leche se obtenga de animales enfermos (mastitis) y as contengan el microorganismo. Es de destacar que muchas de las muestras positivas provenan de alimentos que se han preparado en el hogar del vendedor o se adquirieron listos de proveedores. Esto sugiere que el tiempo, adems de temperaturas adecuadas, es importante para el desarrollo del microorganismo en el alimento y la consecuente produccin de toxinas. Con relacin a las toxinas, hay que registrar que el IAL ha identificado en las muestras positivas las toxinas A, C y D. Se estima en 520/da el nmero de consumidores expuestos al riesgo de adquirir ETA a travs de la ingestin de alimentos contaminados por S. aureus. De las 16 muestras positivas en Quito, casi todas pertenecan a un alimento conocido como Aencebollado@, que es un platillo a base de pescado, cebolla y condimentos. Casi siempre los vendedores lo preparan en su hogar o lo adquieren de un proveedor, ya listo para el consumo, y lo mantienen a temperaturas alrededor de 42 al 45oC, en el local del expendio. En general, esas muestras provenan de puestos que se clasificaron como Asucios@. Los dueos de los puestos declararon que alrededor de 50 personas al da acudan para consumir esos alimentos. Se estima en 800/da, el nmero de consumidores expuestos al riesgo de enfermarse a travs del consumo de esos productos. En Lima, donde la gran mayora de los vendedores aprovecha los alimentos sobrantes del da en su prxima jornada de trabajo, la ocurrencia de S. aureus tambin ha sido importante. Adems, la jornada diaria es de casi 8 h, en promedio, lo que vale decir que los alimentos se mantienen expuestos al ambiente (situacin constatada en la mayora de los puestos), por tiempo suficiente para que ocurra el desarrollo microbiano hasta niveles infectantes. Teniendo en

consideracin la informacin obtenida sobre el nmero de consumidores que acudan a los puestos en donde se constat muestras contaminadas por ese microorganismo, se estima alrededor de 700 personas/da estn expuestas al riesgo de enfermarse por consumir alimentos callejeros contaminados con toxina estafiloccica. Si bien en Santo Domingo solamente 3 muestras contenan dosis infectantes de S. aureus, el hecho de que todas ellas provenan de alimentos que son, en general, sometidos a altas temperaturas de preparacin (pollo frito, pescado frito y carne de cerdo frita) se constituye en fuerte indicacin de recontaminacin, lo que significa que los manipuladores carecen de buenos hbitos higinicos y que esos alimentos se manipulan de manera descuidada y que son mantenidos en condiciones inadecuadas de conservacin. La ausencia de otro tipo de contaminacin en esas muestras es otro indicador de contaminacin posterior al proceso trmico. Teniendo en cuenta que los vendedores de esos alimentos han declarado servir esos alimentos a cerca de 90 consumidores, se estima que por lo menos ese nmero de personas, pueden enfermarse cada da, a travs del consumo de esos alimentos. La Ciudad de Guatemala ha sido el lugar que present el mayor porcentaje de muestras positivas para S. aureus. Teniendo en cuenta que en es ciudad ms del 50% de los vendedores han sido capacitados en buenas practicas de manipulacin de alimentos, se tiene un indicativo de que la capacitacin del vendedor no es suficiente para producir cambios en la higiene de los alimentos callejeros, si no se complementa esta accin con informacin adecuada a los consumidores, a fin de permitir la identificacin de los vendedores capacitados, dndose preferencia a los productos expendidos por ellos. Entre los alimentos contaminados se puede observar productos crudos o cocinados, vegetales, crnicos y lcteos, o sea, todos los tipos de alimentos. Eso es ms una indicacin que este tipo de contaminacin est estrechamente relacionado a la manipulacin deficiente de los alimentos. Una caracterstica de Ciudad de Guatemala es el gran nmero de personas que acuden a las ventas callejeras de alimentos. Con base en el nmero de consumidores que se sirvieron de los alimentos que presentaron positividad para S. aureus, se estima que alrededor de 1550 consumidores se exponen, todos los das, al riesgo de consumir alimentos callejeros contaminados, desarrollando una ETA por esa causa. En Ciudad de Mxico, la situacin se present de manera semejante a Santo Domingo, con pocas muestras contaminadas con la dosis

infectante del S. aureus. Casi todas ellas fueron de tacos con carne, y una fue de ostillones. Los alimentos correspondientes se mantenan a temperaturas alrededor de los 25oC. Teniendo en cuenta que los vendedores declararon servir esos alimentos a alrededor de 40 consumidores al da, se estima que por lo menos 120 personas estuvieron expuestas al riesgo de enfermarse por S. aureus en esa ciudad. El pequeo nmero de muestras positivas para S. aureus en los alimentos callejeros de Culiacn parece indicar una influencia positiva del nivel de educacin de los vendedores (ms de 27% de ellos tienen nivel universitario), en especial si se tiene en cuenta que la contaminacin por ese microorganismo es, en general, proveniente, de la recontaminacin decurrente de manipulacin inadecuada. Sin embargo, si se considera que esa es una ciudad en donde el turismo es una importante fuente de ingresos, no se puede dejar de considerar que las muestras positivas se pueden traducir en un riesgo de que alrededor de 250 personas estn expuestas a contraer una intoxinacin por toxina estafiloccica, todos los das. 6.4.3 Bacillus cereus Teniendo en cuenta el nmero de muestras positivas en La Paz (solamente 3 muestras), se puede estimar que cerca de 100 personas/da se exponen al riesgo de enfermarse a travs del consumo de alimentos callejeros contaminados por B. cereus. Las muestras de alimentos de Santaf de Bogot que presentaron niveles $103 UFC/g, pertenecan a los productos crnicos, granos y cereales o productos lcteos. Sin embargo, en todos los casos se trataban de alimentos que requieren un alto nivel de manipuleo. As, los platillos Alechona@, Achorizo de arepa@ y Aarepa de mazorca@, adems de populares pertenecen a ese grupo. En el momento del muestreo, se observ que la temperatura de esos alimentos estaba entre 24 y 28oC. Segn la informacin de los vendedores, la cantidad de estos alimentos vendidos en una jornada de trabajo es suficiente para alimentar a cerca de 300 consumidores, estimndose que ese es el nmero de personas expuestas al riesgo de contraer ETA por la ingestin de alimentos contaminados por dosis infectante de B. cereus. Si bien en Quito solo 3 muestras estuvieron contaminadas con B. cereus en niveles capases de desencadenar ETA, la cantidad de los alimentos correspondientes expendidos en una jornada de trabajo es suficiente para atender a unos 300 consumidores. Los alimentos

contaminados se mantenan a temperatura tibia (43 - 48oC) que los vendedores consideraron Acaliente@. En Lima, los alimentos de los cuales se recolectaron las muestras positivas se mantenan en general a temperatura ambiente, lo cual es crtico para el buen desarrollo del B. cereus. Esas temperaturas son apropiadas para la germinacin de las esporas de ese microorganismo con el posterior desarrollo y produccin de sus toxinas. El IAL ha demostrado la produccin de toxina diarrica por los microorganismos aislados en esa ciudad. Considerando que el alimento contaminado por B. cereus se ha servido a cerca de 400 consumidores, se considera que ese es el nmero de personas en riesgo diario de enfermarse. La nica muestra de Santo Domingo que present la presencia del microorganismo, en los niveles considerados como capases de producir ETA, perteneca a un helado preparado con leche y zumo de fruta. Teniendo en cuenta que la temperatura de mantenimiento de ese alimento (0oC en el momento de la recoleccin) no es apropiada al desarrollo microbiano, ni a la produccin de toxinas, se presume que la contaminacin viene desde la preparacin, en donde las condiciones higinicas deben de ser precarias. En ese caso, hay que considerar que el vendedor adquiri el helado de un proveedor y por lo tanto, la contaminacin debe de haber ocurrido en esta etapa. Si se considera solamente las personas que consumieron el helado de ese vendedor, se puede estimar que por lo menos 50 consumidores han estado expuestos al riesgo de adquirir ETA por B. cereus a travs del consumo de alimentos en la va pblica de Santo Domingo. En Ciudad de Guatemala, si bien entre las muestras positivas se encontraron una clasificada como Adulce@, otra como alimento Acrnico@ y otra como Agranos y cereales@, todas contenan cereales en su composicin. Los alimentos en cuestin se mantenan a temperaturas que variaban entre los 20oC y los 37 oC. Merece destacar el hecho que todos los vendedores involucrados recibieron cursos de capacitacin, y sus puestos de venta tenan una apariencia Alimpia@. Se estima que ms de 150 personas pueden consumir esos alimentos durante una jornada de funcionamiento de los puestos. En la Ciudad de Mxico, en donde se encontraron 2 muestras positivas para B. cereus, las muestras positivas tambin provenan de alimentos que contenan cereales en su composicin. Adems de presentar una dosis bastante elevada de B. cereus ($106 UFC/g) los Atacos@ tambin presentaron conteo elevado de organismos coliformes fecales, lo que es un fuerte indicativo de que eses

alimentos se elaboraron en condiciones precarias de higiene. Si bien los puestos de venta se consideraron Alimpios@ por el encuestador, se sabe que parte de este alimento (las tortillas) se elaboran, en general en otras partes, en donde las condiciones higinicas del ambiente y del manipulador son bastante precarias. A esto hay que agregar el tiempo transcurrido entre la preparacin de la masa de harina de maz y la preparacin y coccin de los tacos. Este tiempo parece ser suficiente para que el microorganismo, cuando presente, se desarrolle al punto de alcanzar niveles que pueden significar riesgo al consumidor. Adems, la temperatura y el tiempo de coccin parecen ser insuficientes para destruir los microorganismos. Por el contrario, las temperaturas de mantenimiento y coccin parecen favorecer el desarrollo de la toxina diarrica, producida por el B. cereus durante la fase de desarrollo exponencial y de la toxina emtica, que el microorganismo secreta al esporularse. Si bien el nmero de consumidores en riesgo directo de enfermarse a travs del consumo de tacos provenientes de los puestos que presentaron muestras contaminadas se estima en cerca de 200/da, hay que considerar que ese nmero debe multiplicarse muchas veces, si se tiene en cuenta la popularidad de este alimento en la venta callejera en la Ciudad de Mxico. En Culiacn ms de 33% de las muestras en donde se busc B. cereus, revelaron cantidades suficientes por gramo de alimento para provocar ETA. Todas las muestras positivas fueron de Atacos@ con distintos tipos de relleno. Si se estima que en cada uno de los puntos de venta se sirven cerca de 50 consumidores por da (numero muy conservador en una ciudad turstica), se puede estimar en 2350 el nmero de personas expuestas a contraer intoxinacin alimentaria a travs de la ingestin de Atacos@ contaminados por B. cereus. 6.4.4 Clostridium perfringens De las 9 muestras positivas en La Paz ms del 70% se mantenan en temperatura ambiente (18oC - 20oC) en los puestos de venta. Teniendo en cuenta que 85% de los vendedores aprovechan alimentos sobrantes y el volumen comercializado en los puestos de origen de las muestras positivas, se estima que entre 250 y 300 consumidores de alimentos estn en riesgo de adquirir ETA por C. perfringens en esa ciudad, cada da. En Santaf de Bogot, se observ que los alimentos de donde provenan las muestras que fueron positivas para el C. perfringens eran de alimentos que se preparan en el hogar, o que se adquieren de proveedores listos para consumirse. Estos productos se mantienen a

temperatura ambiente ("18oC) y sufren un breve recalentamiento, nunca superior a los 50 oC, antes del consumo. Este es un procedimiento que favorece la multiplicacin del C. perfringens. Teniendo en cuenta el volumen de alimento expendido, se estima que por lo menos 150 personas se exponen, todos los das, al riesgo de contraer ETA producida por C. perfringens, en esa ciudad. Entre las muestras positivas encontradas en Quito, todas pertenecientes a cepa productora de enterotoxina del tipo A, la cantidad de clulas de C. perfringens lleg a sobrepasar los 105/g. En general, los alimentos se prepararon en el hogar del vendedor, y se mantenan a temperatura de 32 a 48oC, en el momento de la recoleccin de la muestra o a temperatura ambiente ("18oC). El nico caso de alimento que se preparaba en el local del expendio, correspondi a la muestra con el nmero ms bajo de microorganismos. Todas las muestras positivas provenan de puestos considerados Alimpios@. Se estima que alrededor de 350 consumidores estuvieron expuestos al riesgo de contraer una ETA en esa ciudad, por da. En Lima las 4 muestras que estuvieron contaminadas con dosis infectante del C. perfringens provenan de puestos considerados Asucios@, lo que se ve confirmado por el alto nmero de organismos coliformes fecales presentes en las mismas muestras. Todos los alimentos de los cuales se recogieron las muestras positivas, se mantenan a temperatura ambiente o ligeramente tibia (25 al 40oC), bastante apropiada para la multiplicacin de microorganismos. Teniendo en cuenta el nmero de consumidores que concurren a esos puestos y que ms del 83% de los vendedores aprovechan los alimentos sobrantes, estn dadas todas las condiciones para estimarse que alrededor de 100 consumidores se exponen al riesgo de adquirir ETA debido al C. perfringens, cada da. En Santo Domingo, el alimento que present niveles infectantes de ese microorganismo se mantena a una temperatura mxima de 31oC, segn fue verificado en el momento de la recoleccin. Se verific que muchos consumidores acudan al local de expendio en donde se identific el C. perfringens. Por eso, se estima en 60 el nmero de consumidores en riesgo de adquirir ETA por C. perfringens en Santo Domingo. La situacin verificada en Ciudad de Guatemala no difiere mucho de las anteriores. Todos los alimentos contaminados se mantenan a temperaturas que variaban de 20oC a 37oC y varios de ellos presentaron multicontaminacin. Cabe registrar que Ciudad de

Guatemala es una de las ciudades, entre las participantes de ese estudio, con mayor nmero de vendedores con curso de manipulacin de alimentos. Teniendo en cuenta el nmero promedio de consumidores que atienden a los puestos que presentaron muestras de alimentos contaminadas con C. perfringens, se estima que alrededor de 250 consumidores estuvieron en riesgo de contraer ETA por ese microorganismo, por da. En la Ciudad de Mxico, los alimentos contaminados con ese microorganismo se mantenan, en general a temperaturas de 24 a 28oC. Sin embargo, hay que destacar el caso de un alimento, que estaba a 90oC en el momento de la recoleccin de la muestra. Teniendo en cuenta que esa es una temperatura que sobrepasa la temperatura de inactivacin de las clulas vegetativas, se estima que los esporos de C. perfringens presentes en ese alimento resistieron la temperatura y se desarrollaron posteriormente. Se estima que alrededor de 150 consumidores corren el riesgo de enfermarse a travs de la ingestin de alimentos contaminados por C. perfringens, por da. En Culiacn se observ que todas las muestras contaminadas provinieron de un mismo tipo de producto (tacos) con relleno a base de carnes. Esta es una caracterstica an ms interesante, si se tiene en cuenta que en esa ciudad los mismos alimentos tambin presentaron contaminacin bastante elevada por B. cereus y por Salmonella. La temperatura de mantenimiento del relleno para los tacos estuvo, en general, en el rango de 44 a 47oC, ideal para el desarrollo de microorganismos patgenos como el C. perfringens, E. coli, algunos serovares de Salmonella, etc. En esa ciudad, se estima en cerca de 350/da, el nmero de consumidores expuestos al riesgo de presentar ETA por esa causa. 6.4.5 Salmonella En La Paz, de las 4 muestras contaminadas por Salmonella, e fueron de verduras frescas. Eso tiene importancia, en la medida que se sabe que la utilizacin de aguas negras para el riego de plantaciones es una practica comn en muchos pases de la Regin. As, el hallazgo de Salmonella puede ser un indicador de contaminacin de esas verduras por heces. Teniendo en cuenta el numero de personas que consumieron el alimento contaminado en el da de recoleccin de las muestras, se estima que alrededor de 90 consumidores/da estuvieron expuestos al riesgo de contraer ETA a travs de alimentos expendidos en la calle de La Paz.

De las 2 muestras positivas para Salmonella en Santaf de Bogot, una se clasific como Salmonella Infantis y se aisl del alimento conocido como Arellena@. Este es un tipo se alimento a base de carne que requiere manipulacin intensa durante su preparacin y que se mantena en el puesto de venta a temperatura cercana a los 32oC. La otra muestra positiva se identific como Salmonella Sandiego y se aisl de un Aemparedado de jamn y queso@ que se mantena a 14oC. Si se considera que la cantidad de esos alimentos expendidos en una jornada de funcionamiento de esos puestos es suficiente para alimentar a unos 100 personas, se estima que por lo menos igual nmero de consumidores estn en riesgo de adquirir salmonelosis a travs de la ingestin de alimentos callejeros en esa ciudad. En Lima se encontraron 2 muestras positivas para Salmonella (Salmonella Albani y Salmonella Typhimurium 05+). Las dos muestras fueron de Acebiche@, alimento tpico compuesto de trozos de pescado crudo al cual se adiciona jugo de limn, cebolla y otros temperos. Es de suponer que el pH de este alimento es siempre inferior a 4,0, que es el valor por debajo del cual se destruye el microorganismo. La presencia de Salmonella en ese alimento de gran consumo en Lima, sugiere que el pH no es lo suficientemente bajo como para garantizar su inocuidad. Considerndose que los vendedores de cada un de los puestos deben haber servido el alimento a 60 consumidores, se estima en 120 el nmero de personas en riesgo de adquirir ETA, por da. En Ciudad de Guatemala fu posible confirmar la presencia de Salmonella en 4 muestras. Las cepas se identificaron como Salmonella Paratyphi B, un serovar que est altamente adaptado al hombre. Los alimentos contaminados pertenecan al grupo de las frutas y vegetales (3 muestras) y jugos naturales (1 muestra). Eso puede significar que ese serovar de la Salmonella circula en el ambiente de venta de alimentos en esa ciudad y que es probable que el nmero de portadores de ese microorganismo sea elevado y/o que se utilicen aguas negras para irrigacin de los cultivos. Teniendo en cuenta la cantidad de alimento expendida durante un da de funcionamiento del puesto, se estima que por lo menos 240 consumidores/da pueden enfermarse a travs de su consumo. En la Ciudad de Mxico, el vendedor del alimento que present contaminacin por Salmonella, declar que en general mantiene sus Atacos@ a temperatura ambiente hasta el momento de la venta, cuando el mismo se calienta. El proceso de Acalentamiento@ del producto que se tom como muestra fue suficiente para llevar la temperatura a los 25oC. Si bien el puesto del cual se recolect la

muestra positiva atenda alrededor de 30 consumidores por da, hay que considerar la gran importancia de los Atacos@ en la alimentacin callejera en esa ciudad. As, se considera, en una estimacin conservadora, que por lo menos 10 veces ms consumidores estn expuestos, todos los das, al riesgo de enfermarse por esta causa, a travs de los alimentos que se expenden en la calle. Todas las muestras positivas en Culiacn (11) fueron de Atacos@. Ese tipo de alimento, quizs el ms comn y apreciado en las calles de esa ciudad, est compuesto por tres ingredientes bsicos: tortilla de maz, relleno a base de carne, pollo o menudencias y salsa de verduras. Teniendo en consideracin que la tortilla no parece ofrecer ambiente apropiado para el desarrollo de ese microorganismo, que el relleno siempre es cocinado por largo tiempo y, por lo tanto, el binomio temperatura/tiempo asegura la inactivacin de microorganismos que estuviesen presentes en los ingredientes, restan dos hiptesis para justificar una contaminacin tan importante como esa: (1) que uno o ms de los componentes de la salsa (lechuga, cilantro, aj, etc.) provenga de cultivos irrigados con aguas negras, o (2) que los manipuladores de esos alimentos sean portadores de Salmonella y que estn contaminando los alimentos a travs de procedimientos inadecuados en la manipulacin. Considerndose que el alimento contaminado se ofreci al consumo de por lo menos 660 personas en el da de recoleccin de las muestras, se estima que ese sea el nmero de consumidores expuestos a adquirir ETA por esa causa. 6.4.6 Escherichia coli O157:H7 La nica muestra que se logr confirmar para ese microorganismo en todo el estudio, ha sido una muestra de papaya pelada y picada, proveniente de la venta de alimento en las calles de la Ciudad de Guatemala. La capacidad de la E. coli O157:H7 sobrevivir en pH cido ha sido comprobada por diversos autores (79, 80, 81). Teniendo en cuenta que la papaya madura presenta un pH de alrededor de 5,4, se puede afirmar que este alimento ofrece condiciones adecuadas al mantenimiento y hasta para la multiplicacin del microorganismo. Los mismos autores informan que la E. coli puede desarrollarse a bajas temperaturas (4 a 5oC). Otros autores (107) verificaron que la multiplicacin de la E. coli O157:H7 ha sido inhibida en ensaladas de zanahorias. Sin embargo, lo mismo no ha ocurrido en relacin a ensaladas de lechuga o de pepino, cuando eran mantenidas a temperaturas entre 12oC y 21 oC. La capacidad de supervivencia y

desarrollo presentada por la E. coli O157:H7 en papaya, se ha comprobado en estudios desarrollados en laboratorio por DMT Schuch y MA Bechtel (Laboratorio de Referencia Animal-Porto Alegre, RS - Brasil, comunicacin personal, 12 de abril de 1996). Estos investigadores contaminaron trozos de papaya con 25 UFC de E. coli O157:H7/g y se los mantuvieron a 30oC. Los conteos realizados despus de 1,5 h, 3,5 h y 24 h revelaron que las clulas que se inocul inicialmente pasaron respectivamente a 101 UFC/g, 314 UFC/g y 1,5 x 107/g. Esa observacin indica que la papaya ofrece condiciones favorables a la supervivencia y multiplicacin del microorganismo. La contaminacin de ese alimento se ha dado, muy probablemente, por manipulacin inadecuada, a travs de contacto directo o indirecto con carne bovina contaminada o con heces de ganado vacuno. Vale destacar que las autoridades sanitarias de los Estados Unidos de Amrica (76) recomiendan el lavado cuidadoso de frutas y vegetales antes de su apertura para consumo, con utilizacin de esponja vegetal bajo el agua corriente, como medida para evitar la contaminacin de la parte interna de esos alimentos. En el caso especfico de la muestra que se encontr positiva en Ciudad de Guatemala, se observ que la cantidad comercializada en una jornada de trabajo es suficiente para alimentar de 30 a 50 consumidores. Esto permite estimar que por lo menos 30 consumidores estuvieron expuestos al riesgo de adquirir la enfermedad conocida como HUS. Si bien esta ha sido la nica muestra positiva para E. coli O157:H7, ese hallazgo se constituye en una prueba, probablemente la primera conocida, del papel que los alimentos callejeros pueden jugar en la transmisin de ETA debidas a microorganismos emergentes. Adems, si se tiene en cuenta la gran cantidad de cultivos (alrededor de 200) enviados IAL para confirmacin y an considerndose que los laboratorios participantes enviaron para confirmacin solamente uno de los 5 cultivos aislados a partir del agar de MacConkey-Sorbitol, se puede sospechar que algunas otras, entre las colonias que no fueron seleccionadas para confirmacin, pueden haber sido tambin E. coli O157:H7. 6.4.7 Estimacin del riesgo anual en cada ciudad Tomndose las estimaciones de riesgo diario, hechas en cada una de las 8 ciudades estudiadas, para cada microorganismo, se ha llegado a los valores que se presenta en la tabla siguiente:

6. Resultados y Discusin

Nmero anual de consumidores expuestos al riesgo de adquirir ETA por S. aureus, B. cereus, C. perfringens y Salmonella, debido a la ingestin de alimentos vendidos en la va pblica* S. aureus La Paz Bogot Quito Lima Sto.Domingo Guatemala Mxico Culiacn Total 182,000 135 200 208,000 182,000 23,400 403,000 31,200 65,000 1,229,800 B. cereus 26,000 78,000 78,000 104,000 13,000 39,000 52,000 611,000 1,001,000 C. perfring. 78,000 39,000 91,000 26,000 15,600 65,000 39,000 91,000 444,600 Salmonella 23,400 26,000 --31,200 --62,400 7,800 171,600 275,600 Total 309,400 278,200 377,000 343,200 52,000 569,400 130,000 938,600 2,997,800

En algunos casos, los valores pueden estar sobreestimados, en razn de la multicontaminacin de algunas muestras y de la resistencia presentada por algunos individuos a patgenos especficos.

7.

CONCLUSIONES

Los resultados del anlisis microbiolgico permiten concluir que es evidente el riesgo de los alimentos callejeros de estar contaminados con los patgenos transmitidos por alimentos, no obstante que la prevalencia de dosis infectantes en los diferentes grupos de alimentos y para los microorganismos investigados son aparentemente bajas. As mismo, es palpable la deficiencia que presenta el expendio de ese tipo de comidas en lo que refiere a infraestructura sanitaria de los puestos de venta, los hbitos higinicos de los manipuladores y las actitudes de los consumidores frente a estos aspectos, que llevan a pensar en un riesgo real mucho mayor del estimado en este estudio. En efecto, el hecho de expresarse como positividad solo la existencia de dosis infectantes, no se excluye la presencia de patgenos transmitidos por alimentos en las muestras, que si bien no pudieran alcanzar dosis infectantes en el momento de la recoleccin de las muestras, lo pueden hacer en el curso de su posterior mantenimiento en condiciones de temperatura y tiempo que segn revela este mismo estudio, son adecuadas para la supervivencia y proliferacin de microorganismos, lo cual puede reforzar el potencial de los alimentos callejeros para transmitir enfermedades. Un hecho que llama la atencin es la influencia que puede tener en la calidad sanitaria de los productos as expendidos, la variada gama de posibilidades en cuanto a adquisicin de materias primas y lugar de procesamiento de los alimentos. En particular es visible el porcentaje apreciable de vendedores que preparan los alimentos en sus mismos hogares, frente al escaso porcentaje de quienes lo adquieren listo de un proveedor, lo cual plantea dificultades para el control por parte de los organismos responsables por la dispersin que es de suponer en los lugares de preparacin y revela una situacin de poco conocimiento sobre las condiciones de procesamiento y formulacin de productos, lo cual sugiere la necesidad de asignar prioridades en este sentido en los programas de control de este tipo de alimentos. Los indicadores de tipo social y econmico que resultan del presente estudio, confirman que la venta callejera de alimentos es mantenida por una dinmica de oferta y demanda donde los protagonistas muestran notable identidad en su perfil sociocultural, lo cual sugiere la necesidad de profundizar en el conocimiento principalmente del consumidor y dirigir hacia este los mayores esfuerzos para cambiar su actitud y su percepcin frente al significado de la inocuidad de las comidas que consume y que se profundice tambin en el estudio y divulgacin de las ETA, especialmente las causadas por patgenos emergentes, que pueden tener una importancia an no evaluada en los alimentos vendidos en las calles.

Finalmente, al observar el cuadro que se presenta en 6.47, se puede verificar que se ha estimado en casi 3 millones, el nmero anual de personas que se exponen al riesgo de adquirir ETA a travs del consumo de alimentos en las vas pblicas de las ocho ciudades estudiadas. Si se considera que los mencionados ncleos urbanos tienen una poblacin total estimada en 20 millones de habitantes (100), se concluye que cerca del 15% de esas personas se encuentra en riesgo de enfermarse, lo que hace con que esos alimentos se constituyan en un grave problema de salud pblica, mereciendo atencin inmediata de las autoridades de salud de cada una de esas ciudades.

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ANEXOS

Anexo 2
FICHA DE RECOLECCIN DE MUESTRAS Ficha no Fecha / /
o

1.

Identificacin de la muestra 1.1. 1.2. 1.3. Alimento recolectado_______________ Temperatura en el momento de recoleccin ( Volumen vendido por da______kg C)

Hora_________

2.

Identificacin del vendedor/manipulador 2.1. 2.3. Edad________ Nivel educacional Analfabeto ( ) Primaria ( ) Secundaria ( ) Universitaria ( ) 2.4. Ha recibido algn curso de manipulacin de alimentos? Si ( ) No ( ) 2.5. Nivel de ingresos en salarios mnimos del pas <1 1a3 3a5 5 a 10 > 10 ( ( ( ( ( ) ) ) ) ) 2.2. Sexo________

3.

Identificacin del local de venta 3.1. Numero de personas que trabajan en el local 1( ) 3.2. 2( ) 3( ) 4 o ms ( )

Se trata de una actividad familiar? Si ( ) No ( )

3.3.

Numero promedio de personas que comen en el local, por da

< 10 ( ) 30 - 50 ( ) 3.4.

10 - 20 ( ) ms de 50

20 - 30 ( ) ( )

Caractersticas del local 3.4.1. Abastecimiento de agua Red pblica Agua clorinada ( ) Agua sin tratar ( ) Sin agua 3.4.2. Disposicin de aguas servidas Si ( ) No ( )

( )

( )

3.4.3. Disposicin de basura Si ( ) No ( )

3.4.4. Disponibilidad de letrina Si ( ) No ( )

3.4.5. Aspecto general (limpieza y aseo) Limpio ( ) Sucio ( ) 3.5. Condiciones operacionales 3.5.1. Se adquiere las materias primas siempre del mismo proveedor? Si ( ) No ( ) 3.5.2. Se prepara el alimento en la casa del vendedor? Si ( ) No ( ) 3.5.3. Se compra el alimento listo de un proveedor? Si ( ) No ( ) 3.5.4. Se prepara el alimento el local de venta? Si ( ) No ( ) 3.5.5. Hay facilidades para recalentar o enfriar los alimentos en el local de venta? Si ( ) No ( )

3.5.6. Numero de horas de funcionamiento por da ________horas 3.5.7. Se aprovechan los alimentos sobrantes? Si ( ) No ( )

Anexo 3
FICHA DE ENTREVISTA PARA CONSUMIDORES DE ALIMENTOS CALLEJEROS Ficha no Fecha / / Edad:_________ Sexo:__________

Ocupacin:

Obrero ( ) Estudiante

Oficinista ( ) ( ) Hogar Analfabeto Secundaria ( ) ( )

Profesional ( ) ( ) Comerciante Primaria Universitaria ( ) ( )

( )

Nivel de Educacin:

Ingresos Mensuales (en salarios mnimos del pas): <1 ( ) 1a3 ( ) 3a5 ( ) 5 a 10 ( ) > 10 ( ) 1. Cuantas veces en el da consume alimentos en la calle? 1( ) 1.1. 2( ) 3( ) ms de 3 ( )

Come Ud. en el local de venta? Si ( ) No ( )

1.2.

Se lleva Ud. la comida a casa? Si ( ) No ( ) 1.2.1. Cuantas personas consumen este alimento en la casa? 1( ) 2( ) 3( ) ms de 3 ( )

2.

Ha tenido Ud. diarrea en los ltimos cinco das?

(considerar diarrea como evacuacin de heces liquidas 3 o mas veces en 24 horas)

3.

Si ( ) No ( ) Ha tenido Ud. vmito en los ltimos cinco das?

Si ( ) No ( ) 4. Si la respuesta es positiva para 2 y/o 3 qu hizo Ud.? 4.1. 4.2. 4.3. Se esper que pasaran naturalmente ( )

Tom medicamento por cuenta propia ( ) Busc atencin mdica ( )

5.

Si la respuesta es positiva para 2 y/o 3 )Ha tenido que faltar al trabajo (escuela)? Si ( ) No ( )

Anexo 4
RESULTADO DE ANLISIS

Laboratorio_______________________________________________________________Numero_________ Ciudad___________________________________________________________________Fecha__________ Alimento______________________________________________________ Fecha y hora de recepcin en el laboratorio: Fecha_______Hora_________ Responsable de la toma en la calle_________________________________ Fecha de conclusin del anlisis:___________ Observaciones sobre la muestra: ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ____________________ RESULTADOS Vibrio cholerae /g o ml ____________________________

No de UFC de Staphylococcus aureus /g o ml ____________________________ No de UFC de Bacillus cereus /g o ml ____________________________

No de UFC de Clostridium perfringens /g o ml ____________________________ Bsqueda de Escherichia coli O157:H7 /25 g o 25 ml ___________________ Bsqueda de Salmonella spp /25 g o 25 ml NMP de coliformes fecales /g o ml ____________________________ ____________________________

OBSERVACIONES

1.

Control de la calidad de los medios de cultivo__________________________

2. 3.

Determinacin de la temperatura del equipo trmico_____________________ Metodologa utilizada (considerando el determinado en el protocolo del estudio) 3.1. Sin modificaciones ( ) 3.2. Con modificaciones ( ) (especificar en el verso) 3.3. Otra metodologa ( ) (especificar en el verso)

Anexo 5
Programa de Garanta de Calidad Analtica

El producto de cualquier laboratorio analtico es el resultado del anlisis (1). Para que realmente cumplan su finalidad de auxiliar en la decisin sobre el destino o la calidad sanitaria de un producto o alimento, los resultados analticos deben estar garantizados por un programa amplio de Garanta de Calidad (2). El conjunto de tcnicas operacionales planeadas y adoptadas para monitorear todas las fases crticas del proceso de obtencin del producto y la adopcin de procedimientos que procuren la eliminacin de causas de rendimientos no satisfactorios es conocido como Control de Calidad (3). La garanta de calidad requiere una evaluacin continua y sistemtica de los factores que pueden afectar el programa de control de calidad previamente establecido (4). Segn algunos autores (5), la calidad analtica es determinada por procedimientos y actitudes adoptados por todas las personas envueltas en la cadena de obtencin del resultado, en todas las etapas en el laboratorio, lo que cubre desde los responsables por la colecta, remesa y transporte de muestras, hasta la elaboracin final del resultado del anlisis. La base principal de la calidad es el conocimiento (3). Para la implantacin de un programa de evaluacin y garanta de calidad analtica es necesario que las personas estn suficientemente entrenadas y capacitadas en sus reas tcnicas especficas (4) y consecuentemente, con base de conocimiento necesaria y discernimiento para que puedan detectar fallas en el proceso o cuando un mal rendimiento es obtenido y decidir sobre acciones a ser adoptadas (1, 4). Los beneficios obtenidos por la implantacin del programa de garanta de calidad son innmeros y comprenden:

C C

La credibilidad que se da a la informacin generada por el laboratorio (6); La mejora en el desempeo del laboratorio como un todo; el establecimiento de procedimientos uniformes realizados por diferentes personas, haciendo los resultados comparables en el mismo laboratorio (7); La garanta de que todo el equipo, medios, reactivos y otros materiales ofrecen una respuesta adecuada para cada caso (5, 8, 9, 10); El aseguramiento de que las lecturas realizadas durante el proceso analtico son correctas y confiables (4, 8); El aseguramiento de la eliminacin del riesgo sanitario por el control en la eliminacin de materiales contaminados y de procedimientos de bioseguridad (11, 12); El aseguramiento del uso de equipo de seguridad apropiado y la adopcin de medidas para la proteccin de las personas y del ambiente de trabajo (5); El aseguramiento del uso de buenas tcnicas analticas y de laboratorio, con la consecuente disminucin de improvisaciones (4, 6); Prevencin de la contaminacin cruzada de la muestra en anlisis (5) y proteccin del personal contra infecciones adquiridas y del ambiente contra contaminacin (12); Disminucin de la escala de variacin de los resultados obtenidos dentro de los laboratorios y entre uno y otro (7, 13); Generacin de informacin sobre la aptitud de cada especialista participante en los anlisis a fin de permitir verificarse las necesidades de capacitacin (4, 5, 7, 8, 13); Determinacin de la uniformidad de los procedimientos de control analtico realizados por diferentes personas en el mismo laboratorio o en otro, con el fin de que los resultados obtenidos en los diversos laboratorios sean comparables (7); Reconocimiento de errores, cuando ocurren, permitiendo la toma de decisin basada en hechos y datos concretos (8), la inmediata correccin de fallas impidiendo que la informacin incorrecta salga del laboratorio (5);

Prevencin en origen, de los problemas, evitandose que el mismo problema vuelva a ocurrir por la misma causa (3); Desarrollo de mejores desempeos en esquemas de control intra e interlaboratorio (13) y suministro de informacin sobre el desempeo de cada miembro envuelto en los anlisis, permitiendo el diagnstico de la situacin (4). Etapas Un programa de garanta de calidad analtica exige los pasos siguientes :

1.

Determinar y formalizar los objetivos y exigencias que especifiquen la precisin requerida, incluso la seleccin de procedimientos de manipulacin de muestras y metodologas cuya utilizacin se prev (2, 5, 7); Seleccionar personal idneo para realizar el trabajo de microbiologa con el fin de mantener el nivel de calidad deseable (2, 6, 8), y actividades permanentes de capacitacin y motivacin del personal (17); Suministrar el equipo y las instalaciones necesarios para ejecutar las tareas (2, 5); Establecer mtodos de vigilancia y mantenimiento de registros y protocolos para verificar la precisin y coherencia del trabajo del laboratorio (5, 7); Establecer procedimientos para la adopcin de medidas correctivas cuando se determine que la calidad es inaceptable (7, 14). Control de calidad intralaboratorial 2.1 Ambiente El ambiente de trabajo debe estar exento de polvo, en lo posible. La localizacin del equipo se debe optimizar en funcin del flujo de trabajo. Los bancos y mesas de trabajo se deben limpiar y desinfectar por lo menos dos veces al da. El piso del sector de microbiologa no debe barrerse nunca, sino ms bien limpiarse con un pao humedecido en una solucin desinfectante /detergente, usando dos baldes para tener siempre uno con solucin desinfectante/detergente limpia y otro con agua y solucin desinfectante para enjuagar el pao. Las dependencias del sector de microbiologa de los alimentos se deben

C C

2.

limpiar, como mnimo, una vez al da. Cuando se derrame material contaminante, hay que cubrir el rea con solucin desinfectante (compuestos yodados, cloro, formol al 4% u otro desinfectante probado y aprobado en los testes de verificacin de eficiencia) y esperar por lo menos 30 min. Luego se debe hacer la limpieza normal, utilizandose guantes de proteccin. Es preciso hacer un control semanal del ambiente, exponiendo placas con agar no selectivo durante 15 min (15), por lo menos en dos puntos diferentes prximos al lugar de manipulacin microbiolgica o en dos puntos (al frente y atrs) del equipo de flujo laminar, cuando se utilice. Incubar a 35oC por hasta 96 h y registrar las lecturas (16). El Cuadro 1 presenta un resumen de las medidas que se debe adoptar y el Cuadro 2 es un modelo de ficha para registro de los controles a realizarse. 2.2 Equipo El equipo se debe mantener libre de polvo, a travs de limpieza regular con un pao remojado en solucin desinfectante y manejarse de acuerdo con las especificaciones suministradas por el fabricante y se habr de consultar el manual correspondiente siempre que sea necesario (13). Se debe consultar el Cuadro 3 para el control regular del equipo de uso ms comn. Se deben mantener actualizados los registros ordinarios de control del equipo. Las lecturas diarias de la temperatura de las estufas bacteriolgicas (hechas por la maana y por la tarde) se deben registrar en forma de grficos similares al que aparece en el Cuadro 4. Los potencimetros deben de calibrase por lo menos una vez al da con la utilizacin de soluciones estandardizada de pH 4,0 y 7,0 o 7,0 y 10,0. El electrodo debe mantenerse en solucin 3M de KCl durante la noche y fines de semana. En los das de funcionamiento del laboratorio el electrodo debe mantenerse inmerso en una solucin 0,1M de KCl, acidificada al pH 4,0 con HCl. Los resultados de la calibracin se debe de registrar en formularios similares al que aparece en el Cuadro 5. Por lo menos una vez por semana, se debe de comparar las lecturas de otro potencimetro, tomando las medidas correctivas necesarias siempre que se note diferencia superior a 0,05 unidades. 2.3 Reactivos Todos los reactivos deben llevar una etiqueta en la que se habrn de indicar el nombre de la prueba a la cual se destinan, la fecha de preparacin, la fecha de

vencimiento del reactivo preparado, el nombre de la persona que lo prepar y los cuidados especiales de manipulacin y mantenimiento, cuando proceda (5). Despus de la preparacin, hay que probar estos productos con medios y microorganismos apropiados para comprobar si su reactividad es correcta. Se deben mantener registros de la preparacin y las pruebas de reactividad (9, 10) en una ficha similar a la que aparece en el Cuadro 6. En el trabajo ordinario, se debe probar todo reactivo cada vez que se use, con cultivos de control positivos y negativos (9, 16) (Cuadro 7). 2.4 Cristalera La cristalera se debe lavar con detergente y agua caliente. Cuando sea necesario (por ejemplo, cuando se le adhieren residuos de grasa), hay que remojarla en solucin sulfocrmica (para ello se disuelven 100 g de K2Cr2O7 en 600 ml de agua destilada, se agregan 400 ml de concentrado comercial de H2SO4 y se lo mantiene enfriado mientras se agrega el cido). Luego se lava normalmente (16). Evitar el contacto con la piel, ojos y mucosas. Siempre que se trabaje con eta solucin, se debe de usar guantes y delatantes protectores. Cada quince das hay que determinar si han quedado residuos alcalinos agregando algunas gotas de azul de bromotimol en proporcin de 0,04 g/l. Este indicador cambia el color de amarillo a azul verdoso en valores de pH de 6,5 a 7,3 (2). Algunos autores (13) recomiendan el uso de una solucin de bromosulphtalena (BSP) para ese control. Despus de lavar y secar la cristalera, se debe acondicionar debidamente y esterilizar a 170oC por 2 h (calor seco) (5). La esterilidad de la cristalera debe examinarse rutinariamente (2), de acuerdo con las indicaciones siguientes: C Placas de Petri: virtase agar no selectivo en varias placas recolectadas al azar. Djese solidificar e incbese en un medio aerobio o anaerobio o de ambas clases (30oC durante 72 h); Frascos o bolsas de recoleccin de muestras: agrguese caldo

nutritivo, tioglicolato o BHI. Enjuguese e incbese a 30oC por 72 h; C Tubos, frascos de Erlenmeyer y otros: agrguese caldo BHI y tioglicolato y obsrvese el crecimiento despus de la incubacin a 30oC por 72 h; Pipetas: retrese el diluyente estril con pipeta y simbrese en caldo BHI y tioglicolato y obsrvese la turbiedad despus de la incubacin a 30oC durante 72 h.

Cuando se compruebe que el material no es estril, hay que desecharlo y corregir las fallas. Es preciso mantener registros de los resultados del control de la cristalera y de las medidas correctivas tomadas para subsanar las fallas. Despus del proceso de esterilizacin, la vidriera debe ser almacenada en local protegido del polvo y utilizada dentro de un mximo 3 semanas (13).

2.5

Medios de cultivo El desempeo de los medios de cultivo depende de su composicin, forma de preparacin, temperaturas sufridas, condiciones de manutencin, pH final, etc. Se necesita una evaluacin sistemtica de los medios adquiridos en forma deshidratada o de los preparados en el laboratorio con ingredientes bsicos (16). Los medios deshidratados, los reactivos y los ingredientes se deben guardar en un lugar fresco, donde estn protegidos de la luz y la humedad. Es preciso mantenerlos refrigerados o en un frasco oscuro cuando as se indique en la etiqueta. Se necesita verificar la fecha de vencimiento (2). Hay que descartar los medios y reactivos hidratados o que hayan cambiado de color. Los colorantes deben guardarse en frascos oscuros o protegidos de la accin de la luz con papel metlico u otro similar. Para ajustar el pH de los medios de cultivo no se deben emplear nunca cidos ni bases flacos. Normalmente se usa HCl o NaOH en bajas concentraciones. Los principales puntos crticos en la preparacin de los medios de cultivo son

la pesada del material, la alteracin de los medios deshidratados por causa de hidratacin o exposicin a la luz solar o la humedad, la destilacin o deionizacin del agua (debe de ser reciente), la presencia de residuos de detergente o de otras sustancias qumicas o biolgicas en la cristalera, la mezcla y disolucin de los ingredientes, la observacin estricta de las temperaturas y tiempo de preparacin y esterilizacin, la correccin adecuada del pH y la correcta adicin de suplementos. Todos los medios de cultivo selectivos utilizados durante el trabajo ordinario debe ir acompaada de un control positivo (microorganismo que se desea recuperar) y otro negativo (microorganismo que se desea inhibir total o parcialmente). Los medios no selectivos deben ir acompaados de un control positivo (9, 10). Una porcin (1 a 5% de lotes pequenos y por lo menos 10 unidades tomadas al azar de lotes grandes) de los medios preparados en el laboratorio debe ser testada en cuanto a la eficiencia de la esterilizacin a travs de la incubacin a temperaturas adecuadas por 48 h (13). El Cuadro 8 indica el control positivo y negativo de los medios de cultivo selectivos para anlisis de V. cholerae, S. aureus, B. cereus, C. perfringens, Salmonella, E.coli O157:H7 y organismos coliformes fecales. Se debe evaluar la calidad de los nuevas partidas de medios adquiridos por el laboratorio, verificando su productividad y selectividad. Los medios preparados con ingredientes bsicos deben sufrir evaluacin de la calidad en cada preparacin.

2.5.1

Medios slidos Algunos autores han desarrollado un mtodo (18) que permite evaluar la susceptibilidad de los medios slidos selectivos y no selectivos a la colonizacin por un microorganismo deseado y la resistencia a la colonizacin por microorganismos indeseados, que se denomina Mtodo Ecomtrico y que est basado en los siguientes procedimientos: C Preprense cultivos frescos de las cepas deseadas e indeseadas, en fase estacionaria, en caldo BHI.

Preprense placas de Petri con el medio de ensayo. El medio no debe tener menos de 4 mm de espesor. De la misma forma, preprense placas con el medio de referencia. Squense en posicin invertida en una estufa a 45oC por cerca de 30 min. Divdanse las placas en cuadrantes, segn la Figura 1, y mrquense de una forma conveniente. Empleando los cultivos deseados e indeseados hechos en caldo BHI y una asa calibrada de 1 l, trazar sobre la superficie del medio 5 estras paralelas en cada cuadrante y una estra central, de forma progresiva, sin recargar ni torcer el asa. Hgase lo mismo con el medio de referencia. Incbense las placas en posicin invertida por el tiempo necesario y a la temperatura apropiada para el microorganismo en cuestin.

2.5.1.1 Indice de crecimiento absoluto (ICA) Se asigna un valor de 0,2 (precisin del mtodo) a cada estra. Ese valor se multiplica por el nmero de estras en las cuales se observa crecimiento. Por ejemplo, si hay crecimiento en las cinco estras de un mismo cuadrante, el valor es 1 (uno); si se produce crecimiento completo en las cinco estras de los cuatro cuadrantes y en la estra central (valor 1), el ndice de crecimiento absoluto (ICA) es igual a 5. El ICA ser igual al nmero del cuadrante cuando todas las estras de ste y de los cuadrantes anteriores muestren un crecimiento completo, mientras no se observe crecimiento en ninguna estra del cuadrante siguiente. Cuando aproximadamente la mitad de las estras de

un cuadrante muestren crecimiento completo o casi completo, el ICA ser igual al nmero del cuadrante menos 0,5. Para la realizacin de una evaluacin mas estricta, se debe de utilizar en esta etapa, cultivos en fase estacionaria diludos a 1:10 o 1:100, con el mismo procedimiento que se describe anteriormente. Calclese el ICA con la suma de los valores obtenidos. 2.5.1.2 Indice de crecimiento relativo (ICR) El ICR de una cepa es la comparacin entre el ICA en un medio de estudio (ICAME) y el ICA en el medio de referencia (ICAMR) o, ICR = ICAME/ICAMR. 2.5.1.3 Criterio de evaluacin para el estudio Los medios de cultivo slidos se evalan segn su productividad y selectividad: C Se considera que un medio presenta una productividad aceptable cuando el ICA de todas las cepas en un medio de cultivo no selectivo sea por lo menos igual a 3,5. Respecto a la selectividad, solo se debe utilizar medios en los cuales el ICA de las cepas no deseadas en los medios selectivos no sea superior a 2. El ICA de las cepas deseadas no debe ser inferior a 3.

2.5.2

Medios lquidos selectivos y no selectivos (19) Este es un mtodo general para evaluar el ndice de crecimiento en medios de cultivo lquidos selectivos y no selectivos. Para el control de los medios selectivos puede ser conveniente agregar una muestra comparable al material objeto de anlisis.

Distribyanse 10 ml del caldo de referencia y del caldo a testar en tubos con tapa de rosca. Esterilcense en autoclave segn las especificaciones del fabricante. Preprense los cultivos de los microorganismos especficos para los medios objeto de estudio, en fase estacionaria. En seguida, simbrense los caldos, por duplicado, con 0,1 ml del cultivo de cada microorganismo objeto de estudio, que contengan aproximadamente 105 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. Por lo general, este nmero se obtiene diluyendo el cultivo en fase estacionaria a 1:10,000. Retrense 0,1 ml del caldo de anlisis y colquense en una placa de Petri con la superficie seca, que contenga agar no selectivo. Distribyase con ayuda de un bastn tipo "hockey". Reptase el procedimiento sobre otra placa de Petri sembrando 0,1 ml del caldo de referencia. Incbense los caldos y las placas de Petri en condiciones especficas para los medios y microorganismos objeto de estudio. En diversos intervalos, retrese una parte de cada caldo con una pipeta o una micropipeta. En caso necesario, dilyase y distribyase sobre las placas de Petri que contengan el mismo medio empleado en el punto anterior. Es posible evaluar los resultados mediante observacin directa o registrar el recuento en funcin del tiempo en un grfico. Se debe analizar cada lote de caldo selectivo adquirido por el laboratorio para verificar el nmero mnimo de clulas del microorganismo deseado que permite detectar. Para ello, se verifica el desempeo del medio con una mezcla de cultivos deseados e indeseados. 2.5.2.1 Evaluacin del desempeo del caldo selectivo con una mezcla de cultivos deseados e indeseados Este mtodo se desarroll para controlar los medios selectivos de enriquecimiento de Salmonella. Cuando se utiliza con ese fin, se debe usar como cepa deseada una cepa standard de Salmonella Typhimurium. Preprense las placas de Petri con agar de tripticase y

soya u otro agar no selectivo. Con un cultivo de la cepa deseada en fase estacionaria, preprense diluciones decimales consecutivas (de 10-1 a 10-10) en solucin salina peptonada (NaCl 8,5 g, Peptona 1,0 g, agua destilada 1000,0 ml, pH: 7,0 a 7,2) o agua peptonada al 0,1% . Al mismo tiempo, preprense cultivos de las cepas patrn no deseadas, para el caso de se estar testando medios selectivos para Salmonella, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter aerogenes, en fase estacionaria y de otros microorganismos interferentes. Preprese una mezcla que contenga 1 ml de cada uno de los microorganismos no deseados y dilyase a 10-1 en solucin salina peptonada o agua peptonada al 0,1%. Dilyase el microorganismo deseado de 10-1 a 10-10 en solucin salina peptonada o agua peptonada al 0,1%. Estmese el nmero de UFC/ml del microorganismo deseado con un recuento en una superficie de agar de tripticase y soya (u otro medio no selectivo). En paralelo, el recuento se debe hacer tambin sobre una superficie de agar selectivo. Seleccinese la mxima dilucin de cada una de las preparadas que permita hacer el recuento (30 - 300 colonias). La comparacin de los resultados obtenidos en el conteo en medios slidos no selectivos y selectivos, ofrece informacin sobre las perdidas que se puede esperar en relacin al numero de clulas recuperadas en medio selectivo, debido a la accin de factores impeditivos y/o selectivos sobre la cepa deseada. Determnese la capacidad que tiene el caldo de enriquecimiento selectivo de recuperar pequeos nmeros del microorganismo deseado, sembrando 1 ml de cada dilucin de dicho microorganismo en 10 ml

de ese caldo. Incbese a la temperatura ptima por un perodo de 18 a 24 h y aplquese despus en estras sobre la superficie de agar de tripticase y soya u otro medio no selectivo y sobre la superficie de un medio selectivo. Obsrvense las placas y calclese el nmero de microorganismos necesarios para activar el desarrollo en el caldo de enriquecimiento selectivo. Para determinar la capacidad que tiene el caldo de enriquecimiento selectivo de recuperar pequeos nmeros del microorganismo deseado a partir de una mezcla de cepas, trasldese 1 ml de cada una de las diluciones del microorganismo deseado en solucin salina peptonada, en tubos separados, que contengan 10 ml de caldo de enriquecimiento y 0,02 ml de la dilucin a 10-1 de la mezcla de cepas indeseables. Incbese a la temperatura apropiada por un perodo de 18 a 24 h y aplquese luego en estras sobre placas de agar selectivo. Despus de la incubacin, obsrvense las colonias de la cepa deseada, seleccionandose las colonias sospechosas para confirmacin. Para mas facil entendimiento las etapas descritas arriba se presentan en el Cuadro 9. Regstrense los resultados, incluso la mxima dilucin que permita aislar el microorganismo deseado aparte o en conjunto con los indeseados. 2.5.2.2 Criterio de evaluacin As como los medios slidos, los medios lquidos de cultivo deben evaluarse segn su productividad y selectividad: C Productividad: el caldo de cultivo selectivo debe permitir el desarrollo de un cultivo puro de la cepa

deseada con un inculo de 20 clulas o menos. Al colocar el microorganismo en placas de agar selectivo y no selectivo se puede manifestar cualquier interaccin de los medios lquidos con los slidos. C Selectividad: el desarrollo de las cepas deseadas en los caldos de enriquecimiento que contienen microorganismos competidores (no deseables) se debe detectar utilizando la mxima dilucin que permita el desarrollo del cultivo puro.

3.

Evaluacin de la calidad interlaboratorial (garanta de calidad) Se debe de identificar los laboratorios y cada analista a travs de cdigos y en los informes de evaluacin del control entre laboratorios debe de constar solamente estos cdigos y no los nombres de las personas ni de los laboratorios. Muestras ciegas de cultivos de uno o ms microorganismos en un medio slido, deben de ser analizadas y identificadas por todos los analistas. Tambin es importante la verificacin de que todos los analistas pueden analizar un alimento que se contamin anteriormente con diferentes cantidades de UFC/g de los diversos microorganismos, y cuantificar el S. aureus, E. coli, C. perfringens, B. cereus y organismos coliformes fecales, ademas de investigar la presencia de Salmonella y V. cholerae 01, E. coli O157:H7. Referencias Bibliogrficas

1.

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2.

3.

4.

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6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

Manual de Avaliao e Garantia da Qualidade - Resduos Biolgicos. Brasilia, DF. 1989:74p. 15. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. Richardson GH. Ed. 15th ed. American Public Health Association. Washington, DC. 1985. Repblica Federativa do Brasil, Ministrio da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrria, Laboratrio Nacional de Referencia Animal. Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica para Alimentos. Braslia, DF. 1992. Blumental TK. Management and Motivation in Quality Assurance: The Human Element in Proficiency. In: Quality Assurance for Analytical Laboratories. Royal Society of Chemistry. Parkany M. Ed. Special publication No. 130. 1994:56-59. Mossel DAA, Bonants-Van Larrhoven TMG, Ligtenberg-Merkus AMT, Wedler MEB. Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds and yeasts: an attempt at standardisation on the international level. J Appl Bacteriol. 1983;54:313-327. International Journal of Food Microbiology. Testing Methods for use in Quality Assurance of Culture Media, 1987; Appendix (I)5: 291-296.

16.

17.

18.

19.

Cuadro 1. Procedimientos de limpieza y control ambiental del laboratorio de microbiologa LOCAL Bancos y Mesas de trabajo PROCEDIMIENTO Limpieza con pao humedecido en solucin desinfectante aprobada FRECUENCI A Por lo menos dos veces al da OBSERVACION ES Limpieza y desinfeccin antes del incio y al final de la jornada de trabajo Nunca barrer el laboratorio de microbiologa Mantener registros de las lecturas en formulario apropiado

Pisos

Limpiar con pao humedecido en solucin desinfectante aprobada, utilizando dos baldes Antes del inicio de los trabajos exponer placas con agar sangre o agar cerebro corazn* y placas con agar batata glicosado o agar Sabouraud** en por lo menos dos puntos. Dejar por 15 min. Incubar a 35EC 96 h. Exponer placas con agar sangre o agar cerebro corazn* y placas con agar batata glicosado o agar Sabouraud** en por lo menos dos puntos prximos al rea de trabajo. Dejar por 15 min. Incubar a 35EC hasta por 96 h. Cubrir el rea inmediatamente con solucin desinfectante aprobada. Dejar por 30 min. Usando guantes, limpiar con algodn o papel absorbente descartando en recipiente con desinfectante. Despus lavar el rea normalmente

Al mnimo, una vez al da

Cabinas de Flujo Laminar

Semanal

Monitoreo microbiolgico del ambiente cuando se trabaja en bancos con mechero

Semanal

Mantener registro de las lecturas en formulario apropiado

Areas contaminadas accidentalmente por derramamiento de cultivos

Siempre que sea necesario

Mantener registros de todos los accidentes

* **

Despus de 96 horas. A 25oC por 5 das.

Cuadro 2. Registros de los controles ambientales (cabinas de flujo laminar y bancos)

Fecha Medidas

Medio empleado

Tiempo exposicin

Resultados adoptadas

___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___

___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___ ___________________________________________________________________________ ___

Cuadro 3. Control de equipo

Equipo Bao mara Bao mara/colifecal es Cabina de flujo laminar

Procedimiento Registro de temperatura Registro de temperatura Medir la velocidad del aire

Frecuen. Diaria Diaria

Lm. de tol. " 1 EC " 0,2 EC

Observaciones Limpieza semanal. Cambiar el agua Limpieza mensual. Cambiar el agua

Trimestra l

50 pies/min. " 5 pies/min. 1) Cambiar o limpiar los filtros cada 3 meses.

2) Exponer diariamente placas de agar sangre durante 10 minutos.

Incubar y observar la presencia de colonias. Si hubiera ms de dos colonias, tomar medidas correctivas.

3) Cada 15 das limpiar las lmparas ultravioletas con pao suave y hmedo. Incubadoras Registro de temperatura Registro de temperatura Maana y Tarde Diaria Temperatura apropiada Utilizar termmetros de temperaturas mxima y m-nima. Anotar la temperatura al menos dos veces al da.

Hornos

1)

Limpiarlos

mensualmente

2) Utilizar esporas B. subtilis var. niger para control mensual. Termmetros Balanza Verificacin Verificacin con peso patrn Calibracin con tampones Anual Diaria 0,00 Utilizar por lo menos 2 pesos patrones

Medidor de pH

Diaria

0,05 unid. de pH 1) Calibrar diariamente con dos patrones (pH 4,0 y 7,0 o 7,0 y 10,0)

2) Comparar semanalmente con lecturas de patrones en otro medidor de pH. Cuando la diferencia fuere > 0,05 unidades, solicitar la revisin de los aparatos. Jarra de anaerobiosis Autoclave Uso de indicador Control de temperatura Cada ciclo de uso Cada ciclo de uso 1) Con cintas para autoclaves, una vez al da Reactivar el catalizador a 160EC, 2 horas despus de 10 utilizaciones de las jarras.

Control de eficiencia biolgica

Trimestra l

2) Por lo menos una vez en la semana. Se posible, todos los dias.

3) Cambiar el agua y limpiar a cada uso.

1) Utilizar esporas de B. stearothermophilus. Fuente: Manual de mtodos de anlise microbiolgica para alimentos (16)

Cuadro 5. Registro de calibracin de potencimetros Fecha No del aparato calibracin del pH

Tampn de

Observaciones

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Cuadro 6. Registros a efectuar durante la preparacin y esterilizacin de medios de cultivo

Fecha

Medio Tiempo/Temperatura

Marca/lote

pH

Volumen preparado de operacin de autoclave

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Cuadro 7. Evaluacin y control de reactivos

PRUEBA Oxidasa

REACTIVO Tetrametil-p-fenilenodiamina dihidrocloreto Plasma de conejo oxalatado o con EDTA Alfanaftilamina + Ac. Sulfanilico Reactivo de Kovacs

CONTROL POSITIVO V.cholerae P.aeruginosa S.aureus

CONTROL NEGATIVO E.coli Salmonella

Coagulasa

S.epidermidis S.capitis L.innocua

Reduccion de Nitrato

B.cereus E.coli E.coli

Produccin de Indol

E.aerogenes

Cuadro 8.

Evaluacin y control de medios de cultivo

MEDIO

MICROORGANISMOS DE CONTROL (C+) (C-) V. cholerae E. coli V. cholerae E. coli V. cholerae S. aureus S. aureus S. epidermidis S.aureus E. coli S. aureus S. capitis B. cereus S. aureus (C+) (C-) (C+) (C-) (C+) (C-) (C+) (C-) (C+) (C-) (C+) (C-)

RESULTADO ESPERADO CONTROL POSITIVO Colonias amarillas, planas de 2 a 3 mm de diametro Turbiedad con o sin pelcula en la superficie Colonias lisas, translucidas de 1 a 3 mm de dimetro Colonias negras con halos de lecitinasa y lipolisis Crecimiento Colonias amarillas sobre fondo amarillo Colonias azul turquesa de "5mm rodeada por halo opaco Crecimiento con licuefaccin del medio

RESULTADO ESPERADO CONTROL NEGATIVO Crecimiento inhibido con colonias translucidas Turbiedad Colonias emblanquecidas Colonias negras o grisceas sin halo de lecitinasa y lipolisis

AGAR TCBS APA T1N1 BAIRD-PARKER

CALDO BHI AGAR FERM. AEROBICA MALTOSA AGAR B. cereus MEDIO DE GELATINA

Colonia blancas sobre fondo purpura Crecimiento inhibido

B. cereus (C+) P. aeruginosa (C+) S. aureus (C-) E. coli (C-) B. cereus (C+ para motilidad y NO3) K. pneumoniae (Cpara motilidad) L. innocua (C- para NO3) C. perfringens E. coli C. perfringens C. perfringens S. typhimurium C. perfringens (C+) (C-) (C+) (C+) (C-)

Crecimiento sin licuefaccin del medio

MEDIO MOTILIDAD NITRATO

Motilidad: crecimiento por todo el medio. NO3: reaccin positiva cuando el reactivo de nitrato (alfanaftilamina + ac. sulfanilico) es adicionado Colonias negras con o sin produccin de gas Crecimiento exuberante Licuefaccin de la gelatina y fermentacin de la lactosa Coagulacin de la leche con abundante produccin

Crecimiento apenas en la linea de siembra NO3: reaccin negativa cuando el reactivo de nitrato (alfanaftilamina + ac. sulfanilico) es adicionado. Crecimiento inhibido

AGAR SPS MEDIO TIOGLICOLATO MEDIO. LACTOSAGELATINA MEDIO LECHE CON

Sin licuefaccin de la gelatina ni fermentacin de la lactosa

HIERRO CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS AGAR VERDE BRILLANTE AGAR SS CALDO UREA AGAR TSI S. typhimurium (C+) E. coli (C-) S. typhimurium (C+) E. coli (C-) S. typhimurium (C+) E. coli (C-) S. typhimurium P. mirabilis (C+) (C-)

de gas Buen crecimiento Crecimiento parcial o totalmente inhibido Colonias amarillas

Colonias rosadas translucidas sobre medio rojo Colonias incoloras con centro negro Medio sin alteracin de color Base cido con gas y con H2S y bisel alcalino o sin alteracin Base y bisel purpura con H2S Crecimiento con formacin de gas a 45EC Aparecimiento de anillo rojo en la superficie del caldo despus de la adicin del reactivo de Kovacs Colonias incoloras

Colonias rosadas Medio de coloracin rosada fuerte Base y bisel cidos con gas sin H2S Base cida y bisel purpura sin H2S Crecimiento sin formacin de gas a 45EC Reaccin negativa despus de la adicin del reactivo de Kovacs

S. typhimurium (C+) E. coli (C-) S. typhimurium (C+) E. coli (C-) E. coli E. aerogenes E. coli E. aerogenes (C+) (C-) (C+) (C-)

AGAR LIA CALDO EC CALDO TRIPTONA

AGAR MaCCONKEY SORBITOL

E. coli O157:H7 (C+) E. coli (C-)

Colonias de color rosado intenso

Anexo 6
Composicin y mtodo de preparacin de los medios de cultivo no disponibles en forma deshidratada 1. MEDIOS DE CULTIVO 1.1. Agua peptonada alcalina (APA) Peptona NaCl 10,0 g 10,0 g

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada/desionizada y ajustar el pH a 8,8 - 9,0 con NaOH. Distribuir porciones de 225 ml en frascos y, en tubos, porciones de 10 ml. Esterilizar a 121EC durante 15 minutos. 1.2. Agua peptonada al 1% amortiguada (buffer) Peptona de carne NaCl NaHPO4 KH2PO4 10,0 g 5,0 g 9,0 g 5,0 g

Disolver los componentes en un litro de agua destilada/desionizada y ajustar el pH a 7,2 " 0,2. Distribuir 225 ml en frascos Erlenmeyer y esterilizar a 121EC durante 15 minutos. 1.3. Agua peptonada al 0,1% 18 Peptona de carne Agua destilada/desionizada 1,0 g 1000,0 ml

Disolver la peptona en agua, ajustar el pH a 7,0 " 0,2. Distribuir 10 ml en tubos y esterilizar a 121EC durante 15 minutos. 1.4. T1N1 Triptona NaCl Agar-agar 10,0 g 10,0 g 20,0 g

Suspender los componentes en el agua, calentando hasta que la disolucin est concluida. Ajustar el pH a 7,2 " 0,2. Distribuir porciones de 100 o 200 ml en frascos apropiados y esterilizar a 121EC durante 15 minutos.

1.5.

Agar para fermentacin aerbica de la maltosa (AFM) Proteosa de peptona Extracto de carne NaCl Prpura de bromocresol Agar-agar 10,0 g 1,0 g 5,0 g 0,02 g 15,0 g

Contaminacin Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Va Pblica en Ciudades de Amrica Latina

Aditivo: Solucin al 10% de maltosa esterilizada por filtracin. Suspender los componentes en un litro de agua destilada/desionizada y calentar hasta que quede concluida la disolucin. Ajustar el pH a 6,8 " 0,2 y distribuir en 100 ml en frascos. Esterilizar a 121EC durante 15 minutos. Antes de su uso, disolver el agar y dejar al bao Mara hasta que alcance la temperatura de 45 a 49EC. Despus, aadir a cada 100 ml del medio, 20 ml de la solucin de maltosa estril. 1.6. Agar motilidad nitrato Peptona de carne KNO3 Extracto de carne Agar-agar 5,0 g 1,5 g 3,0 g 3,0 g

Suspender los componentes en un litro de agua destilada/desionizada y calentar hasta que la disolucin quede concluida. Ajustar el pH a 7,2 " 0,2 y distribuir en tubos. Esterilizar a 121EC durante 15 minutos. 1.7. Medio de leche con hierro (storm-test) Leche en polvo Sulfato ferroso 7.H2O Agua destilada/desionizada 100,0 g 1,0 g 1000,0 ml

Disolver la leche en polvo en 950 ml de agua destilada/desionizada. Por separado, disolver el sulfato ferroso en 50 ml de agua y mezclarlo lentamente con la leche. Tratar en autoclave a 118EC durante 12 minutos. Preparar inmediatamente antes de utilizarlo. 1.8. Medio de lactosa-gelatina Triptosa 15,0 g Extracto de levadura 10,0 g Lactosa 10,0 g Rojo fenol 0,05 g Gelatina 120,0 g Agua destilada/desionizada 1000,0 ml Suspender los componentes en el agua y calentar hasta que la disolucin quede concluida. Ajustar el pH a 7,5 " 0,2 y distribuir 5 ml en tubos. Esterilizar a 121EC durante 10 minutos.

2.

REACTIVOS Y SOLUCIONES

Contaminacin Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Va Pblica en Ciudades de Amrica Latina

2.1.

Solucin de telurito de potasio al 3,5% Telurito de potasio Agua destilada 3,5 g qsp 100,0 ml

2.2.

Sulfato de polimixina B, solucin al 1% Sulfato de polimixina B Agua destilada 0,1 g qsp 100,0 ml

2.3.

cido actico 5 N cido actico glacial Agua destilada 28,75 ml 71,25 ml

2.4.

Alfanaftilamina, solucin al 0,5% Alfanaftilamina cido actico 5 N 0,5 g qsp 100,0 ml

2.5.

cido sulfanlico, solucin al 0,8% cido sulfanlico cido actico 5 N 0,8 g qsp 100,0 ml

2.6.

cido clorhdrico 1 N cido clorhdrico humeante Agua destilada 36,5 ml qsp 1000,0 ml

2.7.

Novobiocina, solucin al 4% Novobiocina Agua destilada 4,0 g qsp 100,0 ml

2.8.

Reactivo de Kovacs (Indol) Para-dimetilamino-benzaldehdo Alcohol amlico 75,0 ml cido clorhdrico concentrado 5,0 g 25,0 ml

Disolver 5,0 g de p-dimetilamino-benzaldehdo en 75 ml de alcohol amlico. Calentar a 60EC durante 5 minutos. Aadir 25 ml de HCl (33-35%). Debe aparecer un color rojo. Dejar reposar hasta que el color cambie a amarillo (6-7 horas). Mantener el reactivo en un frasco oscuro, bajo refrigeracin. 2.9. Reactivo para oxidasa

Contaminacin Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Va Pblica en Ciudades de Amrica Latina

Tetrametil-p-fenilenodiamina dihidrocloruro Agua destilada 5,0 ml

50,0 mg

Disolver el polvo en agua destilada. Almacenar durante un mximo de una semana a 4EC, en un frasco oscuro. 2.10. Alcohol yodado Solucin A Yoduro de potasio Yodo metlico Agua destilada Alcohol 96E 2,5 g 6,0 g 10,0 ml qsp 100,0 ml

Diluir el yoduro de potasio en agua. Aadir el yodo metlico y, por ltimo, el alcohol 96E. Solucin B (alcohol 70E) Alcohol 96E Agua destilada Preparacin final: Solucin A Solucin B 20,0 ml 980,0 ml 729,0 ml 271,0 ml

Contaminacin Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Va Pblica en Ciudades de Amrica Latina

Anexo 7
Determinacin del nmero ms probable (NMP) James T. Peeler y Foster D. McClure

Existen diversos mtodos para calcular el nmero de bacterias en una muestra determinada. Los tres que se usan con mayor frecuencia son el recuento microscpico directo, el recuento en placa de agar y la determinacin del nmero ms probable (NMP). En el recuento microscpico directo se toman en cuenta los microorganismos viables y los no viables, mientras que en el recuento en placa de agar y en la determinacin del NMP solo se consideran los viables. La primera estimacin precisa del nmero de bacterias viables fue dada a conocer por McCrady (14). En una de las primeras aplicaciones de esta tcnica (4) se compar el nmero de bacterias observadas mediante el empleo de medios de cultivo slidos y lquidos y el clculo de Bacillus coli en el agua (13). Halvorson y Ziegler (10-12) publicaron una serie de artculos sobre los fundamentos estadsticos del NMP en bacteriologa. Eisenhart y Wilson (9) y Cochran (5) han publicado una revisin general de dichos fundamentos. Woodward (18) recomend que deba limitarse el uso de las tablas de NMP. Actualmente, dos libros sobre mtodos de la Asociacin Estadounidense de Salud Pblica (APHA) (1, 2) emplean tablas abreviadas de NMP preparadas por deMan (6-8). El NMP es una estimacin de la densidad de los micoorganismos viables en una muestra. Para hacer este clculo, la muestra debe diluirse de tal manera que una muestra ms diluida d por resultado un nmero menor de tubos positivos, lo cual se manifiesta por la presencia de gas o de multiplicacin microbiana. Para obtener el NMP, se aplica a los resultados la teora de la probabilidad, de conformidad con los siguientes supuestos. 1) La muestra contiene una distribucin al azar de las bacterias. Ello significa que la probabilidad de encontrar un microorganismo en una parte de la muestra es la misma que la de encontrar un microorganismo en cualquier otra parte. 2) Las bacterias existen como entidades, no como grupos o conglomerados, y no se repelen entre s. 3) El microorganismo o microorganismos presentes en la muestra se multiplicarn en el medio de cultivo al ser incubado este. 4) Existen condiciones apropiadas para la multiplicacin; en otras palabras, se proporciona el medio de cultivo adecuado y se mantiene la temperatura de incubacin correcta. El nmero de diluciones que se preparan debe basarse en la poblacin prevista en la muestra. Los resultados ms fidedignos se obtienen cuando todos los tubos de la dilucin ms baja son positivos (es decir, presentan multiplicacin microbiana) y todos los tubos de la dilucin ms alta son negativos (o sea, no presentan multiplicacin microbiana). Si se prev un elevado recuento microbiano, la mezcla habr de diluirse hasta el punto en que pueda obtenerse el NMP. Las diluciones de diez veces son las ms sencillas de efectuar, y el inculo frecuentemente se usa en series de NMP de 3, 5 o 10 tubos; es posible calcular el NMP con otro tipo de diluciones. Los lmites de confianza del NMP se estrechan a medida que aumenta el nmero de tubos inoculados para cada dilucin. En el caso de poblaciones de elevada densidad, el NMP no es tan preciso como el recuento directo en placa y un valor de NMP calculado representa una estimacin de la densidad de la

poblacin, no un recuento directo de los microorganismos vivos. El NMP resulta de particular utilidad para las concentraciones reducidas de microorganismos (#10/g), especialmente en leche, agua y alimentos en los que los pequeos pedazos de alimento pueden confundir el recuento exacto de colonias. La eleccin adecuada de los medios de cultivo puede proporcionar resultados preliminares de algunas caractersticas bioqumicas, y el empleo de medios selectivos puede ofrecer estimaciones de una poblacin mixta. A. Tablas de NMP y lmites de confianza del 95% Las tablas 1 a 3 presentan los clculos de deMan (6-8) de los valores estadsticamente probables del NMP y los correspondientes lmites de confianza del 95% para pruebas con 3, 5 y 10 tubos. Las combinaciones que no figuran en las tablas tienen muy pocas probabilidades de presentarse. Si los resultados no corresponden con los de la tabla, hay que repetir la prueba con la muestra original. Si esto ltimo no es posible, el NMP puede obtenerse (combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5 (3); tambin puede utilizarse una ecuacin de la seccin B para obtener una aproximacin de combinaciones del NMP. Puede programarse una computadora personal para calcular el NMP y los lmites de confianza (15). Los intervalos de confianza del 95% se interpretan del modo siguiente. Si el analista supone que el nmero verdadero de microorganismos se encuentra entre los lmites, entonces su suposicin resultar correcta 95% de las veces. Los NMP tabulados representan un intervalo, no un valor absoluto. Cuando se preparan ms de tres diluciones de una muestra, el NMP debe determinarse a partir nicamente de tres diluciones consecutivas (cuando se usan las tablas 1 a 3). En primer lugar, para todas las diluciones en las que todos los tubos resultaron positivos, seleccione la dilucin ms alta (que contiene el menor volumen de la muestra) y luego utilice las dos diluciones ms altas que le siguen (volmenes ms pequeos) (A y B de las tablas 6 y 7). Cuando ninguna de las diluciones sometidas a prueba da todos los tubos positivos, seleccione (si es posible) las tres primeras diluciones consecutivas (volmenes de muestra) cuya dilucin de en medio haya dado al resultado positivo (C de las tablas 6 y 7). El ejemplo D ilustra el clculo del NMP cuando se produce un resultado positivo en una dilucin ms alta (volumen de muestra ms pequeo) que las tres seleccionadas. En este caso, aumente el nmero de tubos positivos en la mxima dilucin, sin pasar de 3 o 5. Cuando todos los tubos sean positivos, exprese el NMP como mayor que la dilucin multiplicado por el NMP que resulta de la combinacin 3-3-2 o 5-5-4, segn corresponda (ejemplo E). Lea de manera semejante los valores para 10 tubos de la tabla 3. A menudo es necesario calcular el NMP a partir de volmenes de la muestra inicial distintos de los enumerados en los cuadros 1 a 5. Si el mayor volumen de muestra usado para la referencia de la tabla es 0,01 g, multiplique por 10 el ndice que aparece en la tabla. De esta manera, los resultados de una determinacin del NMP en cinco tubos en los que son positivas tres porciones de 0,01 g, dos porciones de 0,001 g y una porcin de 0,0001 g (3-2-1) corresponden al valor 17 en la tabla 2, lo que multiplicado por 10 arroja 170 como el NMP/g verdadero para la muestra. De modo anlogo, si la porcin mayor usada para la referencia de la tabla es 1 g en vez de 0,1g, divdase por 10 el NMP obtenido de la tabla. As, el resultado de una determinacin del NMP en tres tubos para Salmonella que indica como positivas tres porciones de 1 g y una de 0,1 g, y en la que no es positiva ninguna de las porciones de 0,01 g (3-1-0), corresponde al nmero 43 en la tabla 1, que dividido por 10 arroja 4,3 como NMP/g presunto de la muestra.

Un mtodo alternativo para calcular el NMP/g se sirve de la siguiente frmula (14): [(NMP/g obtenido de la tabla)] - 100) x factor de dilucin del tubo de en medio = NMP/g. Para obtener el NMP/100 g, multiplquese por 100. B. NMP aproximado y lmites de confianza del 95% A causa de la complejidad que entraa calcular efectivamente los NMP y los lmites de confianza, para determinar el NMP a menudo se emplean las tablas publicadas. Generalmente, dichas tablas se limitan a 3, 5 o 10 tubos por dilucin. Incluso con el diseo ordinario, los datos irregulares o un accidente de laboratorio pueden ocasionar la prdida de uno o varios resultados de una dilucin. En este ltimo caso, una serie de dilucin de 5, 4, 4 tubos podra arrojar una combinacin positiva de 5-2-0. Thomas (17) ha publicado una frmula sencilla que no requiere repeticin. Los NMP aproximados que se obtienen mediante esta quiz no se correspondan exactamente con los obtenidos segn la teora; aun as, las desviaciones suelen ser pequeas (puede ocurrir que las aproximaciones no sean admisibles para fines reglamentarios). La frmula no se limita al nmero de tubos y diluciones empleados y puede aplicarse a todo tipo de pruebas. La aproximacin se obtiene mediante la siguiente ecuacin: MPN/g = P/(N T)1/2 donde P es el nmero de tubos positivos, N es la cantidad total de la muestra (g) en todos los tubos negativos y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos. Por ejemplo, considrese la serie de dilucin al doble que aparece en seguida: Muestra (g) 8 4 2 1 0,5 0,25 No. de tubos No. de tubos positivos 5 5 5 5 5 5 5 4 2 0 1 0

El nmero de tubos positivos es P = (5 + 4 + 2 + 1) = 12; N = [(8 x 0) + (4 + 1) + (2 x 3) + (1 x 5) + (0,5 x 4) + (0,25 x 5)] = 18,25; y T = 5 (8 + 4 + 2 + 1 + 0,5 + 0,25) = 78,75. NMP/g = 12/[(18,25) (78,75)]1/2 = 0,32/g o 32/100 g Las estimaciones de los lmites de confianza del 95% (5) pueden obtenerse de los antilogaritmos de base 10 de la siguiente ecuacin: log (NMP/g) " 1,08 [(log a) /n)]1/2 en la que a es la razn de dilucin y n es el nmero de tubos por dilucin. Esta expresin da por

sentado que la razn de dilucin es distinta de 1 a 10 (por ej., 1 a 2). Para una razn de 1 a 10, la cantidad " debe ser (1,16) (n)1/2 para lograr la mejor estimacin. Si el nmero de tubos por dilucin (ni ) es desigual (por ej., por un accidente de laboratorio en una dilucin), en la ecuacin anterior n se sustituye por la media armnica (nH) del nmero de tubos por dilucin (ni ) para la dilucin k. La media armnica se define como nH = k/3(1/ni ) y k es el nmero de diluciones. Por ejemplo, supngase que tres diluciones dieron como resultado un ni de 5, 4, 4; en este caso, nH = 3/ [(1/5) + (1/4) + (1/4)]1/2 = 3/0,70 = 4,3. Para el anterior ejemplo con n = 5, los lmites de confianza del 95% aproximados se obtienen del modo siguiente: log 0,32 " (1,08) [(log 2)/5]1/2 = -0,495 " 0,265 de este modo, el lmite inferior es el antilog (-0,76) = 0,17/g o 17/100 g, y el lmite superior es el antilog (-0,23) = 0,59 59/100 g. Por comparacin, si se emplean las tablas de deMan (7), el NMP sera 0,31/g con lmites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.

Referencias Bibliogrficas

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18.

Tabla 1. Seleccin de NMP y estimaciones de los lmites de confianza del 95% (7) para tubos de fermentacin con tres tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a No. de tubos positivos Lmites de confianza del 95% 0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 0 0 0 <3 0 1 0 3+ <1 17 1 0 0 4 <1 21 1 0 1 7+ 2 27 1 1 0 7 2 28 1 2 0 11+ 4 35 2 0 0 9 2 38 2 0 1 14+ 5 48 2 1 0 15 5 50 2 2 0 21 8 60 3 0 0 23 9 130 3 0 1 39 10 180 3 1 0 43 10 210 3 1 1 75 20 280 3 2 0 93 30 380 3 2 1 150 50 500 3 2 2 210+ 80 640 3 3 0 240 90 1400 3 3 1 460 100 2400 3 3 2 1100 300 4800 3 3 3 >1100
a

Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de ms (+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signo de ms (+). Las combinaciones de tubos positivos que no aparecen en esta tabla se presentan en menos de 1% de las pruebas, y su aparicin frecuente indica que las tcnicas son deficientes o que no se estn cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimacin del NMP. Las estimaciones del NMP para combinaciones que no figuran aqu pueden obtenerse mediante las frmulas de Thomas (15) o por extrapolacin a la siguiente combinacin ms alta de las mostradas aqu; por ejemplo, un resultado de 2-02 tendra un NMP de aproximadamente 20, que es el NMP para un resultado de 2-1-1, ms probable. Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 2. Seleccin de NMP y estimaciones de los lmites de confianza del 95% (7) para pruebas en tubos de fermentacin con 5 tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a No. de tubos positivos Lmites de confianza del 95% 0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 0 0 0 <2 0 0 1 2+ <1 10 0 1 0 2 <1 10 1 0 0 2 <1 11 1 0 1 4+ 1 15 1 1 0 4 1 15 1 2 0 6+ 2 18 2 0 0 4 1 17 2 0 1 7+ 2 20 2 1 0 7 2 21 2 1 1 9+ 3 25 2 2 0 9 3 25 3 0 0 8 3 24 3 0 1 11 4 29 3 1 0 11 4 30 3 1 1 14+ 6 35 3 2 0 14 6 35 3 2 1 17+ 7 40 3 3 0 17+ 7 41 4 0 0 13 5 38 4 0 1 17 7 45 4 1 0 17 7 46 4 1 1 21 9 55 4 2 0 22 9 56 4 2 1 26+ 12 65 4 3 0 27 12 67 4 3 1 33+ 15 77 4 4 0 34+ 16 80 5 0 0 23 9 68 5 0 1 31 13 110 5 1 0 33 14 120 5 1 1 46 20 150 5 1 2 63+ 22 180 5 2 0 49 21 170

Tabla 2. (Continuacin) No. de tubos positivos Lmites de confianza del 95% 0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 5 2 1 70 30 210 5 2 2 90+ 40 250 5 3 0 79 30 250 5 3 1 110 40 300 5 3 2 140 60 360 5 4 0 130 50 390 5 4 1 170 70 480 5 4 2 220 100 580 5 4 3 280+ 120 690 5 4 4 350+ 160 820 5 5 0 240 100 940 5 5 1 350 100 1300 5 5 2 540 220 2000 5 5 3 920 300 2900 5 5 4 1600 600 5300 5 5 5 >1600 a Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de ms (+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signo de ms (+). Los resultados que no aparecen en esta tabla se presentan en menos de 1% de las pruebas, y su aparicin frecuente indica que las tcnicas son deficientes o que no se estn cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimacin del NMP. Las estimaciones del NMP para combinaciones que no figuran aqu pueden obtenerse mediante las frmulas de Thomas (15) o por extrapolacin a la siguiente combinacin ms alta de las mostradas aqu; por ejemplo, un resultado de 4-0-2 tendra un NMP de aproximadamente 21, que es el NMP para un resultado de 4-1-1, ms probable.
b

Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 3. Seleccin de NMP y estimaciones de los lmites de confianza del 95% (7) para pruebas de tubos de fermentacin con 10 tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a No. de tubos positivos Lmites de confianza de 95% -0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 0 0 0 <1 0 0 1 1+ <1 5 0 1 0 1 <1 5 0 2 0 2+ <1 7 1 0 0 1 <1 5 1 0 1 2+ <1 7 1 1 0 2 <1 7 1 2 0 3+ 1 8 2 0 0 2 <1 7 2 0 1 3+ 1 9 2 1 0 3 1 9 2 1 1 4+ 1 10 2 2 0 4 2 10 2 3 0 5+ 2 12 3 0 0 3 1 9 3 0 1 4 2 11 3 1 0 4 2 11 3 1 1 5+ 2 13 3 2 0 5 2 13 3 2 1 6+ 3 14 3 3 0 6+ 3 14 4 0 0 4 2 12 4 0 1 6 2 13 4 1 0 6 2 14 4 1 1 7 3 15 4 2 0 7 3 15 4 2 1 8 4 17 4 3 0 8 4 17 4 4 0 9+ 5 19 5 0 0 6 2 15 5 0 1 7 3 16 5 1 0 7 3 17 5 1 1 9 4 18 5 2 0 9 4 18 5 2 1 10+ 5 20 5 3 0 10 5 20 5 3 1 11+ 6 22 5 4 0 11+ 6 22 6 0 0 8 3 18 6 0 1 9 4 20 6 1 0 9 4 20 6 1 1 11 5 22

Tabla 3. (Continuacin) No. de tubos positivos Lmites de confianza de 95% 0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 6 2 0 11 5 22 6 2 1 12 6 24 6 3 0 12 6 25 6 3 1 14+ 7 27 6 4 0 14+ 7 27 6 5 0 15+ 8 29 7 0 0 10 5 22 7 0 1 12 6 24 7 0 2 13+ 7 27 7 1 0 12 6 25 7 1 1 13 7 27 7 1 2 15+ 8 30 7 2 0 13 7 27 7 2 1 15 8 30 7 2 2 17+ 9 32 7 3 0 15 8 30 7 3 1 17 9 33 7 4 0 17 9 33 7 4 1 19+ 10 36 7 5 0 19+ 10 36 8 0 0 13 6 28 8 0 1 15 7 31 8 0 2 17+ 8 34 8 1 0 15 7 31 8 1 1 17 9 34 8 1 2 19+ 10 36 8 2 0 17 9 35 8 2 1 19 10 38 8 2 2 21+ 12 42 8 3 0 19 10 39 8 3 1 21 12 42 8 3 2 24+ 13 46 8 4 0 22 12 43 8 4 1 24 13 46 8 5 0 24 13 47 8 5 1 27+ 15 51 8 6 0 27+ 15 52 9 0 0 17 8 37 9 0 1 19 10 41 9 0 2 22+ 11 46 9 1 0 19 10 42 9 1 1 22 11 47

Tabla 3. (Continuacin) No. de tubos positivos Lmites de confianza de 95% ------------ 0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 9 1 2 25+ 13 52 9 2 0 22 12 47 9 2 1 25 13 53 9 2 2 28+ 18 58 9 3 0 25 13 54 9 3 1 29 15 60 9 3 2 32+ 18 66 9 4 0 29 16 61 9 4 1 33 18 67 9 4 2 37+ 20 74 9 5 0 33 18 69 9 5 1 37 20 76 9 5 2 42+ 23 83 9 6 0 38 21 77 9 6 1 43+ 24 85 9 7 0 44+ 24 87 10 0 0 23 12 58 10 0 1 27 14 67 10 0 2 31+ 16 77 10 1 0 27 14 69 10 1 1 32 17 79 10 1 2 38 20 92 10 2 0 33 17 83 10 2 1 39 20 96 10 2 2 50 20 110 10 2 3 50+ 30 120 10 3 0 40 20 100 10 3 1 50 20 120 10 3 2 60+ 30 130 10 3 3 70+ 30 150 10 4 0 50 30 120 10 4 1 60 30 140 10 4 2 70 30 160 10 4 3 80+ 40 170 10 5 0 60 30 150 10 5 1 70 70 170 10 5 2 90 40 190 10 5 3 100 50 210 10 6 0 80 40 180 10 6 1 90 50 200 10 6 2 110 50 230 10 6 3 120 60 250 10 6 4 140+ 70 270

Tabla 3. (Continuacin) No. de tubos positivos Lmites de confianza de 95% 0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 10 7 0 100 50 220 10 7 1 120 60 250 10 7 2 140 70 280 10 7 3 150 80 310 10 7 4 170+ 90 340 10 8 0 130 60 280 10 8 1 150 80 320 10 8 2 170 90 360 10 8 3 200 100 400 10 8 4 220 120 440 10 8 5 250+ 140 480 10 9 0 170 90 380 10 9 1 200 100 430 10 9 2 230 120 490 10 9 3 260 140 560 10 9 4 300 160 640 10 9 5 350 180 720 10 9 6 400+ 210 820 10 10 0 240 120 610 10 10 1 290 150 750 10 10 2 350 170 910 10 10 3 400 200 1100 10 10 4 500 300 1400 10 10 5 700 300 1700 10 10 6 900 400 2100 10 10 7 1120 600 2700 10 10 8 1160 800 3700 10 10 9 2300 1100 6000 10 10 10 >2300
a

Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de ms (+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signo de ms (+). Las combinaciones de tubos positivos que no aparecen en esta tabla se presentan en menos de 1% de las pruebas, y su aparicin frecuente indica que las tcnicas son deficientes o que no se estn cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimacin del NMP. Las estimaciones del NMP para combinaciones que no figuran aqu pueden obtenerse mediante las frmulas de Thomas (15) o por extrapolacin a la siguiente combinacin ms alta de las mostradas; por ejemplo, un resultado de 7-0-3 tendra un NMP de aproximadamente 15, que es el NMP para un resultado de 7-2-1, ms probable. Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 4. Nmeros ms probables (NMP) por 1 g de muestra, utilizando tres tubos con sendas porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g Tubos positivos Tubos positivos ---------------------------------------------------------------------- 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0 0 0 <3 2 0 0 9,1 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6,1 2 1 1 20 0 1 2 9,2 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6,2 2 2 0 21 0 2 1 9,3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9,4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3,6 3 0 0 23 1 0 1 7,2 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7,3 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 >1100

Tabla 5. Nmeros ms probables por 100 ml de muestra, planteando 5 porciones en 3 diluciones en serie geomtrica Nmero de tubos positivos Nmero de tubos positivos Nmero de tubos positivos ----------------------------------- 10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1 ml0,1ml NMP 10 ml 1 ml 0,1ml NMP - 0 0 0 2 0 0 4,5 4 0 0 13 0 0 1 1,8 2 0 1 6,8 4 0 1 17 0 0 2 3,6 2 0 2 9,1 4 0 2 21 0 0 3 5,4 2 0 3 12 4 0 3 25 0 0 4 7,2 2 0 4 14 4 0 4 30 0 0 5 9 2 0 5 16 4 0 5 36 0 1 0 1,8 2 1 0 6,8 4 1 0 17 0 1 1 3,6 2 1 1 9,2 4 1 1 21 0 1 2 5,5 2 1 2 12 4 1 2 26 0 1 3 7,3 2 1 3 14 4 1 3 31 0 1 4 9,1 2 1 4 17 4 1 4 36 0 1 5 11 2 1 5 19 4 1 5 42 0 2 0 3,7 2 2 0 9,3 4 2 0 22 0 2 1 5,5 2 2 1 12 4 2 1 26 0 2 2 7,4 2 2 2 14 4 2 2 31 0 2 3 9,2 2 2 3 17 4 2 3 38 0 2 4 11 2 2 4 19 4 2 4 44 0 2 5 13 2 2 5 22 4 2 5 50 0 3 0 5,6 2 3 0 12 4 3 0 27 0 3 1 7,4 2 3 1 14 4 3 1 33 0 3 2 9,3 2 3 2 17 4 3 2 39 0 3 3 11 2 3 3 19 4 3 3 45 0 3 4 13 2 3 4 22 4 3 4 52 0 3 5 15 2 3 5 25 4 3 5 59 0 4 0 7,5 2 4 0 15 4 4 0 34 0 4 1 9,4 2 4 1 17 4 4 1 40 0 4 2 11 2 4 2 20 4 4 2 47 0 4 3 13 2 4 3 23 4 4 3 54 0 4 4 15 2 4 4 25 4 4 4 62 0 4 5 17 2 4 5 28 4 4 5 69 0 5 0 9,4 2 5 0 17 4 5 0 41 0 5 1 11 2 5 1 20 4 5 1 48 0 5 2 13 2 5 2 23 4 5 2 56 0 5 3 15 2 5 3 26 4 5 3 64 0 5 4 17 2 5 4 29 4 5 4 72 0 5 5 19 2 5 5 32 4 5 5 81

Tabla 5. (Continuacin) Nmero de tubos positivos Nmero de tubos positivos Nmero de tubos positivos 10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1 ml0,1ml NMP 10 ml 1 ml 0,1ml NMP 1 0 0 2 3 0 0 7,8 5 0 0 23 1 0 1 4 3 0 1 11 5 0 1 31 1 0 2 6 3 0 2 13 5 0 2 43 1 0 3 8 3 0 3 16 5 0 3 58 1 0 4 10 3 0 4 20 5 0 4 76 1 0 5 12 3 0 5 23 5 0 5 95 1 1 0 4 3 1 0 11 5 1 0 33 1 1 1 6,1 3 1 1 14 5 1 1 46 1 1 2 8,1 3 1 2 17 5 1 2 64 1 1 3 10 3 1 3 20 5 1 3 84 1 1 4 12 3 1 4 23 5 1 4 110 1 1 5 14 3 1 5 27 5 1 5 130 1 2 0 6,1 3 2 0 14 5 2 0 49 1 2 1 8,2 3 2 1 17 5 2 1 70 1 2 2 10 3 2 2 20 5 2 2 95 1 2 3 12 3 2 3 24 5 2 3 120 1 2 4 15 3 2 4 27 5 2 4 150 1 2 5 17 3 2 5 31 5 2 5 180 1 3 0 8,3 3 3 0 17 5 3 0 79 1 3 1 10 3 3 1 21 5 3 1 110 1 3 2 13 3 3 2 24 5 3 2 140 1 3 3 15 3 3 3 28 5 3 3 180 1 3 4 17 3 3 4 31 5 3 4 210 1 3 5 19 3 3 5 35 5 3 5 250 1 4 0 11 3 4 0 21 5 4 0 130 1 4 1 13 3 4 1 24 5 4 1 170 1 4 2 15 3 4 2 28 5 4 2 220 1 4 3 17 3 4 3 32 5 4 3 280 1 4 4 19 3 4 4 36 5 4 4 350 1 4 5 22 3 4 5 40 5 4 5 430 1 5 0 13 3 5 0 25 5 5 0 240 1 5 1 15 3 5 1 29 5 5 1 350 1 5 2 17 3 5 2 32 5 5 2 540 1 5 3 19 3 5 3 37 5 5 3 920 1 5 4 22 3 5 4 41 5 5 4 1600 1 5 5 24 3 5 5 45 5 5 5

Tabla 6. Ejemplos de determinacin de estimaciones del NMP: serie de tres tubos con 1 g (ml) de muestra cada uno Cantidad de muestra (g o ml)a Valores positivos NPM estimado Ejemplo 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001notificados /g o mlb A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 B C D E 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 1/3 2/3 3/3 2/3 0/3 2/3 3/3 0/3 0/3 1/3 3/3 3-2-0 0-1-0 3-2-2 3-3-3 9300 30 2100 >110000

a Numerador/denominador = nmero de tubos positivos/nmero de tubos inoculados.

b

Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o ml.

Tabla 7. Ejemplos de determinacin de estimaciones del NMP: serie de cinco tubos con 1 g (ml) de muestra cada uno a Cantidad de muestra (g o ml) Valores positivos NPM estimado Ejemplo 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001notificados /g o mlb

A B C D E

5/5 5/5 0/5 5/5 5/5

5/5 5/5 0/5 5/5 5/5

2/5 5/5 1/5 3/5 5/5

0/5 2/5 0/5 2/5 5/5

0/5 0/5 0/5 1/5 5/5

5-2-0 5-2-0 0-1-0 5-3-2 5-5-5

490 4900 20 1400 > 160000

a Numerador/denominador = nmero de tubos positivos/nmero de tubos inoculados. b Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o ml.

Anexo 7
Determinacin del nmero mas probable (NMP)1 James T. Peeler y Foster D. McClure

Existen diversos mtodos para calcular el nmero de bacterias en una muestra determinada. Los tres que se usan con mayor frecuencia son el recuento microscpico directo, el recuento en placa de agar y la determinacin del nmero ms probable (NMP). En el recuento microscpico directo se toman en cuenta los microorganismos viables y los no viables, mientras que en el recuento en placa de agar y en la determinacin del NMP solo se consideran los viables. La primera estimacin precisa del nmero de bacterias viables fue dada a conocer por McCrady (14). En una de las primeras aplicaciones de esta tcnica (4) se compar el nmero de bacterias observadas mediante el empleo de medios de cultivo slidos y lquidos y el clculo de Bacillus coli en el agua (13). Halvorson y Ziegler (10-12) publicaron una serie de artculos sobre los fundamentos estadsticos del NMP en bacteriologa. Eisenhart y Wilson (9) y Cochran (5) han publicado una revisin general de dichos fundamentos. Woodward (18) recomend que deba limitarse el uso de las tablas de NMP. Actualmente, dos libros sobre mtodos de la Asociacin Estadounidense de Salud Pblica (APHA) (1, 2) emplean tablas abreviadas de NMP preparadas por deMan (6-8). El NMP es una estimacin de la densidad de los micoorganismos viables en una muestra. Para hacer este clculo, la muestra debe diluirse de tal manera que una muestra ms diluida d por resultado un nmero menor de tubos positivos, lo cual se manifiesta por la presencia de gas o de multiplicacin microbiana. Para obtener el NMP, se aplica a los resultados la teora de la probabilidad, de conformidad con los siguientes supuestos. 1) La muestra contiene una distribucin al azar de las bacterias. Ello significa que la probabilidad de encontrar un microorganismo en una parte de la muestra es la misma que la de encontrar un microorganismo en cualquier otra parte. 2) Las bacterias existen como entidades, no como grupos o conglomerados, y no se repelen entre s. 3) El microorganismo o microorganismos presentes en la muestra se multiplicarn en el medio de cultivo al ser incubado este. 4) Existen condiciones apropiadas para la multiplicacin; en otras palabras, se proporciona el medio de cultivo adecuado y se mantiene la temperatura de incubacin correcta. El nmero de diluciones que se preparan debe basarse en la poblacin prevista en la muestra. Los resultados ms fidedignos se obtienen cuando todos los tubos de la dilucin ms baja son
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Association of Official Analytical Chemists. FDA Bacteriological Analytical Manual, 7th ed. AOAC, Arlington, VA. 1992.

positivos (es decir, presentan multiplicacin microbiana) y todos los tubos de la dilucin ms alta son negativos (o sea, no presentan multiplicacin microbiana). Si se prev un elevado recuento microbiano, la mezcla habr de diluirse hasta el punto en que pueda obtenerse el NMP. Las diluciones de diez veces son las ms sencillas de efectuar, y el inculo frecuentemente se usa en series de NMP de 3, 5 o 10 tubos; es posible calcular el NMP con otro tipo de diluciones. Los lmites de confianza del NMP se estrechan a medida que aumenta el nmero de tubos inoculados para cada dilucin. En el caso de poblaciones de elevada densidad, el NMP no es tan preciso como el recuento directo en placa y un valor de NMP calculado representa una estimacin de la densidad de la poblacin, no un recuento directo de los microorganismos vivos. El NMP resulta de particular utilidad para las concentraciones reducidas de microorganismos (#10/g), especialmente en leche, agua y alimentos en los que los pequeos pedazos de alimento pueden confundir el recuento exacto de colonias. La eleccin adecuada de los medios de cultivo puede proporcionar resultados preliminares de algunas caractersticas bioqumicas, y el empleo de medios selectivos puede ofrecer estimaciones de una poblacin mixta. A. Tablas de NMP y lmites de confianza del 95% Las tablas 1 a 3 presentan los clculos de deMan (6-8) de los valores estadsticamente probables del NMP y los correspondientes lmites de confianza del 95% para pruebas con 3, 5 y 10 tubos. Las combinaciones que no figuran en las tablas tienen muy pocas probabilidades de presentarse. Si los resultados no corresponden con los de la tabla, hay que repetir la prueba con la muestra original. Si esto ltimo no es posible, el NMP puede obtenerse (combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5 (3); tambin puede utilizarse una ecuacin de la seccin B para obtener una aproximacin de combinaciones del NMP. Puede programarse una computadora personal para calcular el NMP y los lmites de confianza (15). Los intervalos de confianza del 95% se interpretan del modo siguiente. Si el analista supone que el nmero verdadero de microorganismos se encuentra entre los lmites, entonces su suposicin resultar correcta 95% de las veces. Los NMP tabulados representan un intervalo, no un valor absoluto. Cuando se preparan ms de tres diluciones de una muestra, el NMP debe determinarse a partir nicamente de tres diluciones consecutivas (cuando se usan las tablas 1 a 3). En primer lugar, para todas las diluciones en las que todos los tubos resultaron positivos, seleccione la dilucin ms alta (que contiene el menor volumen de la muestra) y luego utilice las dos diluciones ms altas que le siguen (volmenes ms pequeos) (A y B de las tablas 6 y 7). Cuando ninguna de las diluciones sometidas a prueba da todos los tubos positivos, seleccione (si es posible) las tres primeras diluciones consecutivas (volmenes de muestra) cuya dilucin de en medio haya dado al resultado positivo (C de las tablas 6 y 7). El ejemplo D ilustra el clculo

del NMP cuando se produce un resultado positivo en una dilucin ms alta (volumen de muestra ms pequeo) que las tres seleccionadas. En este caso, aumente el nmero de tubos positivos en la mxima dilucin, sin pasar de 3 o 5. Cuando todos los tubos sean positivos, exprese el NMP como mayor que la dilucin multiplicado por el NMP que resulta de la combinacin 3-3-2 o 5-5-4, segn corresponda (ejemplo E). Lea de manera semejante los valores para 10 tubos de la tabla 3. A menudo es necesario calcular el NMP a partir de volmenes de la muestra inicial distintos de los enumerados en los cuadros 1 a 5. Si el mayor volumen de muestra usado para la referencia de la tabla es 0,01 g, multiplique por 10 el ndice que aparece en la tabla. De esta manera, los resultados de una determinacin del NMP en cinco tubos en los que son positivas tres porciones de 0,01 g, dos porciones de 0,001 g y una porcin de 0,0001 g (3-2-1) corresponden al valor 17 en la tabla 2, lo que multiplicado por 10 arroja 170 como el NMP/g verdadero para la muestra. De modo anlogo, si la porcin mayor usada para la referencia de la tabla es 1 g en vez de 0,1g, divdase por 10 el NMP obtenido de la tabla. As, el resultado de una determinacin del NMP en tres tubos para Salmonella que indica como positivas tres porciones de 1 g y una de 0,1 g, y en la que no es positiva ninguna de las porciones de 0,01 g (3-1-0), corresponde al nmero 43 en la tabla 1, que dividido por 10 arroja 4,3 como NMP/g presunto de la muestra. Un mtodo alternativo para calcular el NMP/g se sirve de la siguiente frmula (14): [(NMP/g obtenido de la tabla)] - 100) x factor de dilucin del tubo de en medio = NMP/g. Para obtener el NMP/100 g, multiplquese por 100. B. NMP aproximado y lmites de confianza del 95% A causa de la complejidad que entraa calcular efectivamente los NMP y los lmites de confianza, para determinar el NMP a menudo se emplean las tablas publicadas. Generalmente, dichas tablas se limitan a 3, 5 o 10 tubos por dilucin. Incluso con el diseo ordinario, los datos irregulares o un accidente de laboratorio pueden ocasionar la prdida de uno o varios resultados de una dilucin. En este ltimo caso, una serie de dilucin de 5, 4, 4 tubos podra arrojar una combinacin positiva de 5-2-0. Thomas (17) ha publicado una frmula sencilla que no requiere repeticin. Los NMP aproximados que se obtienen mediante esta quiz no se correspondan exactamente con los obtenidos segn la teora; aun as, las desviaciones suelen ser pequeas (puede ocurrir que las aproximaciones no sean admisibles para fines reglamentarios). La frmula no se limita al nmero de tubos y diluciones empleados y puede aplicarse a todo tipo de pruebas. La aproximacin se obtiene mediante la siguiente ecuacin:

MPN/g = P/(N T)1/2 donde P es el nmero de tubos positivos, N es la cantidad total de la muestra (g) en todos los tubos negativos y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos. Por ejemplo, considrese la serie de dilucin al doble que aparece en seguida: Muestra (g) 8 4 2 1 0,5 0,25 No. de tubos No. de tubos positivos 5 5 5 5 5 5 5 4 2 0 1 0

El nmero de tubos positivos es P = (5 + 4 + 2 + 1) = 12; N = [(8 x 0) + (4 + 1) + (2 x 3) + (1 x 5) + (0,5 x 4) + (0,25 x 5)] = 18,25; y T = 5 (8 + 4 + 2 + 1 + 0,5 + 0,25) = 78,75. NMP/g = 12/[(18,25) (78,75)]1/2 = 0,32/g o 32/100 g Las estimaciones de los lmites de confianza del 95% (5) pueden obtenerse de los antilogaritmos de base 10 de la siguiente ecuacin: log (NMP/g) " 1,08 [(log a) /n)]1/2 en la que a es la razn de dilucin y n es el nmero de tubos por dilucin. Esta expresin da por sentado que la razn de dilucin es distinta de 1 a 10 (por ej., 1 a 2). Para una razn de 1 a 10, la cantidad " debe ser (1,16) (n)1/2 para lograr la mejor estimacin. Si el nmero de tubos por dilucin (ni) es desigual (por ej., por un accidente de laboratorio en una dilucin), en la ecuacin anterior n se sustituye por la media armnica (nH) del nmero de tubos por dilucin (ni) para la dilucin k. La media armnica se define como nH = k/3(1/ni) y k es el nmero de diluciones. Por ejemplo, supngase que tres diluciones dieron como resultado un ni de 5, 4, 4; en este caso, n4 = 3/ [(1/5) + (1/4) + (1/4)]1/2 = 3/0,70 = 4,3. Para el anterior ejemplo con n = 5, los lmites de confianza del 95% aproximados se obtienen del modo siguiente: log 0,32 " (1,08) [(log 2)/5]1/2 = -0,495 " 0,265

de este modo, el lmite inferior es el antilog (-0,76) = 0,17/g o 17/100 g, y el lmite superior es el antilog (-0,23) = 0,59 59/100 g. Por comparacin, si se emplean las tablas de deMan (7), el NMP sera 0,31/g con lmites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.

Referencias Bibliogrficas

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16.

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Tabla 1. Seleccin de NMP y estimaciones de los lmites de confianza del 95% (7) para tubos de fermentacin con tres tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a

No. de tubos positivos 0,1 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

a

Lmites de confianza del 95% 0,001 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 3 NMP/g(ml)b <3 3+ 4 7+ 7 11+ 9 14+ 15 21 23 39 43 75 93 150 210+ 240 460 1100 >1100 Inferior <1 <1 2 2 4 2 5 5 8 9 10 10 20 30 50 80 90 100 300 Superior 17 21 27 28 35 38 48 50 60 130 180 210 280 380 500 640 1400 2400 4800 -

0,01 0 1 0 0 1 2 0 0 1 2 0 0 1 1 2 2 2 3 3 3 3

Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de ms (+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signo de ms (+). Las combinaciones de tubos positivos que no aparecen en esta tabla se presentan en menos de 1% de las pruebas, y su aparicin frecuente indica que las tcnicas son deficientes o que no se estn cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimacin del NMP. Las estimaciones del NMP para combinaciones que no figuran aqu pueden obtenerse mediante las frmulas de Thomas (15) o por extrapolacin a la siguiente combinacin ms alta de las mostradas aqu; por ejemplo, un resultado de 2-0-2 tendra un NMP de aproximadamente 20, que es el NMP para un resultado de 2-1-1, ms probable. Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 2. Seleccin de NMP y estimaciones de los lmites de confianza del 95% (7) para pruebas en tubos de fermentacin con 5 tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a No. de tubos positivos 0,1 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0,01 0 0 1 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 1 2 2 3 3 4 0 0 1 1 1 2 0,001 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 2 0 Lmites de confianza del 95% NMP/g(ml)b <2 2+ 2 2 4+ 4 6+ 4 7+ 7 9+ 9 8 11 11 14+ 14 17+ 17+ 13 17 17 21 22 26+ 27 33+ 34+ 23 31 33 46 63+ 49 Inferior <1 <1 <1 1 1 2 1 2 2 3 3 3 4 4 6 6 7 7 5 7 7 9 9 12 12 15 16 9 13 14 20 22 21 Superior 10 10 11 15 15 18 17 20 21 25 25 24 29 30 35 35 40 41 38 45 46 55 56 65 67 77 80 68 110 120 150 180 170

Tabla 2. (Continuacin)

No. de tubos positivos 0,1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0,01 2 2 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0,001 1 2 0 1 2 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5

Lmites de confianza del 95% NMP/g(ml)b 70 90+ 79 110 140 130 170 220 280+ 350+ 240 350 540 920 1600 <1600 Inferior 30 40 30 40 60 50 70 100 120 160 100 100 220 300 600 Superior 210 250 250 300 360 390 480 580 690 820 940 1300 2000 2900 5300 -

Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de ms (+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signo de ms (+). Los resultados que no aparecen en esta tabla se presentan en menos de 1% de las pruebas, y su aparicin frecuente indica que las tcnicas son deficientes o que no se estn cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimacin del NMP. Las estimaciones del NMP para combinaciones que no figuran aqu pueden obtenerse mediante las frmulas de Thomas (15) o por extrapolacin a la siguiente combinacin ms alta de las mostradas aqu; por ejemplo, un resultado de 40-2 tendra un NMP de aproximadamente 21, que es el NMP para un resultado de 4-1-1, ms probable. Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 3.

Seleccin de NMP y estimaciones de los lmites de confianza del 95% (7) para pruebas de tubos de fermentacin con 10 tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a No. de tubos positivos 0,1 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 0,01 0 0 1 2 0 0 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 1 2 2 3 4 0 0 1 1 2 2 3 3 4 0 0 1 1 0,001 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 Lmites de confianza del 95% NMP/g(ml)b <1 1+ 1 2+ 1 2+ 2 3+ 2 3+ 3 4+ 4 5+ 3 4 4 5+ 5 6+ 6+ 4 6 6 7 7 8 8 0+ 6 7 7 9 9 10+ 10 11+ 11+ 8 9 9 11 Inferior <1 <1 <1 <1 <1 <1 1 <1 1 1 1 2 2 1 2 2 2 2 3 3 2 2 2 3 3 4 4 5 2 3 3 4 4 5 5 6 6 3 4 4 5 Superior 5 5 7 5 7 7 8 7 9 9 10 10 12 9 11 11 13 13 14 14 12 13 14 15 15 17 17 19 15 16 17 18 18 20 20 22 22 18 20 20 22

Tabla 3. (Continuacin) No. de tubos positivos 0,1 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 0,01 2 2 3 3 4 5 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 6 0 0 0 1 1 0,001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 Lmites de confianza del 95% NMP/g(ml)b 11 12 12 14+ 14+ 15+ 10 12 13+ 12 13 15+ 13 15 17+ 15 17 17 19+ 19+ 13 15 17+ 15 17 19+ 17 19 21+ 19 21 24+ 22 24 24 27+ 27+ 17 19 22+ 19 22 Inferior 5 6 6 7 7 8 5 6 7 6 7 8 7 8 9 8 9 9 10 10 6 7 8 7 9 10 9 10 12 10 12 13 12 13 13 15 15 8 10 11 10 11 Superior 22 24 25 27 27 29 22 24 27 25 27 30 27 30 32 30 33 33 36 36 28 31 34 31 34 36 35 38 42 39 42 46 43 46 47 51 52 37 41 46 42 47

Tabla 3. (Continuacin) No. de tubos positivos 0,1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 0,01 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 7 0 0 0 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6 6 0,001 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 4 Lmites de confianza del 95% NMP/g(ml)b 25+ 22 25 28+ 25 29 32+ 29 33 37+ 33 37 42+ 38 43+ 44+ 23 27 31+ 27 32 38 33 39 50 50+ 40 50 60+ 70+ 50 60 70 80+ 60 70 90 100 80 90 110 120 140+ Inferior 13 12 13 18 13 15 18 16 18 20 18 20 23 21 24 24 12 14 16 14 17 20 17 20 20 30 20 20 30 30 30 30 30 40 30 70 40 50 40 50 50 60 70 Superior 52 47 53 58 54 60 66 61 67 74 69 76 83 77 85 87 58 67 77 69 79 92 83 96 110 120 100 120 130 150 120 140 160 170 150 170 190 210 180 200 230 250 270

Tabla 3. (Continuacin) No. de tubos positivos 0,1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

a

Lmites de confianza del 95% 0,001 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NMP/g(ml)b 100 120 140 150 170+ 130 150 170 200 220 250+ 170 200 230 260 300 350 400+ 240 290 350 400 500 700 900 1120 1160 2300 2300 Inferior 50 60 70 80 90 60 80 90 100 120 140 90 100 120 140 160 180 210 120 150 170 200 300 300 400 600 800 1100 Superior 220 250 280 310 340 280 320 360 400 440 480 380 430 490 560 640 720 820 610 750 910 1100 1400 1700 2100 2700 3700 6000 -

0,01 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de ms (+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signo de ms (+). las combinaciones de tubos positivos que no aparecen en esta tabla se presntan en menos de 1% de las pruebas, y su aparicin frecuente indica que las tcnicas son deficientes o que no se estn cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimacin del NMP. Las estimaciones del NMP para combinaciones que no figuran aqu pueden obtenerse mediante las frmulas de Thomas (15) o por extrapolacin a la siguiente combinacin ms alta de las mostradas; por ejemplo, un resultado de 7-0-3 tendra un NMP de aproximadamente 15, que es el NMP para un resultado de 7-2-1, ms probable. Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 4. Nmeros ms probables (NMP) por 1 g de muestra, utilizando tres tubos con sendas porciones de 0,1, 0,001 y 0,001g

No. de tubos positivos 0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,01 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 01 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 0,001 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 NMP <3 3 6 9 3 6,1 9,2 12 6,2 9,3 12 16 9,4 13 16 19 3,6 7,2 11 15 7,3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29

No. de tubos positivos 0,1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0,01 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0,001 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 NMP 9,1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100

Tabla 5 Numeros ms probables por 100 ml de muestra, planteando 5 porciones en diluciones en serie geomtrica

Nmero de tubos positivos 10 ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 ml 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0,1ml 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 NMP 1,8 3,6 5,4 7,2 9,0 1,8 3,6 5,5 7,3 9,1 11,0 3,7 5,5 7,4 9,2 11,0 13,0 5,6 7,4 9,3 11,0 13,0 15,0 7,5 9,4 11,0 13,0 15,0 17,0 9,4 11,0 13,0 15,0 17,0 19,0

Nmero de tubos positivos 10 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 ml 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0,1ml 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 NMP 4,5 6,8 9,1 12,0 14,0 16,0 6,8 9,2 12,0 14,0 17,0 19,0 9,3 12,0 14,0 17,0 19,0 22,0 12,0 14,0 17,0 19,0 22,0 25,0 15,0 17,0 20,0 23,0 25,0 28,0 17,0 20,0 23,0 26,0 29,0 32,0

Nmero de tubos positivos 10 ml 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1ml 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0,1ml 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 NMP 13,0 17,0 21,0 25,0 30,0 36,0 17,0 21,0 26,0 31,0 36,0 42,0 22,0 26,0 31,0 38,0 44,0 50,0 27,0 33,0 39,0 45,0 52,0 59,0 34,0 40,0 47,0 54,0 62,0 69,0 41,0 48,0 56,0 64,0 72,0 81,0

Tabla 5 (Continuacin)

Nmero de tubos positivos 10 ml 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0,1ml 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 NMP 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 4,0 6,1 8,1 10,0 12,0 14,0 6,1 8,2 10,0 12,0 15,0 17,0 8,3 10,0 13,0 15,0 17,0 19,0 11,0 13,0 15,0 17,0 19,0 22,0 13,0 15,0 17,0 19,0 22,0 24,0

Nmero de tubos positivos 10 ml 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 ml 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0,1ml 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 NMP 7,8 11,0 13,0 16,0 20,0 23,0 11,0 14,0 17,0 20,0 23,0 27,0 14,0 17,0 20,0 24,0 27,0 31,0 17,0 21,0 24,0 28,0 31,0 35,0 21,0 24,0 28,0 32,0 36,0 40,0 25,0 29,0 32,0 37,0 41,0 45,0

Nmero de tubos positivos 10 ml 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1ml 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 0,1ml 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 NMP 23 31 43 58 76 95 33 46 64 84 110 130 49 70 95 120 150 180 79 110 140 180 210 250 130 170 220 280 350 430 240 350 540 920 1600 -

Tabla 6. Ejemplos de determinacin de estimaciones del NMP: serie de tres tubos con 1 g (ml) de muestra cada uno

Cantidad de muestra (g o ml)a

Valores positivos notificados 0,00001 0/3 0/3 0/3 1/3 3/3 3-2-0 3-2-0 0-1-0 3-2-2 3-3-3

NPM estimado/g o mlb

Ejemplo A B C D E

0,1 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3

0,01 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3

0,001 2/3 3/3 1/3 2/3 3/3

0,0001 0/3 2/3 0/3 2/3 3/3

930 9300 30 2100 >110000

Numerador/denominador = nmero de tubos positivos/nmero de tubos inoculados Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o ml.

Tabla 7 Ejemplos de determinacin de estimaciones del NMP: serie de cinco tubos con 1 g (ml) de muestra cada uno

Cantidad de muestra (g o ml)a

Valores positivos notificados 0,00001 0/5 0/5 0/5 1/5 5/5 5-2-0 5-2-0 0-1-0 5-3-2 5-5-5

NPM estimado/g o mlb

Ejemplo A B C D E

0,1 5/5 5/5 0/5 5/5 5/5

0,01 5/5 5/5 0/5 5/5 5/5

0,001 2/5 5/5 1/5 3/5 5/5

0,0001 0/5 2/5 0/5 2/5 5/5

490 4900 20 1400 >160000

Numerador/denominador = nmero de tubos positivos/nmero de tubos inoculados Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o ml

a. BRASIL. LABORATRIO NACIONAL DE REFERENCIA ANIMAL/MINISTRIO DA AGRICULTURA DO ABASTECIMENTO E DA REFORMA AGRARIA. 1992. Manual de Mtodos de Analise Microbiolgica para Alimentos. Braslia, DF. Association of Official Analytical Chemists. FDA Bacteriological Analytical Manual, 7th ed. AOAC, Arlington, VA. 1992.