ficante da molécula de DNA, responsável
MEDICINA NO SÉCULO XXI
MONOGRAFIA - I
Genética Molecular - Conceitos Gerais
Iuri D. Louro, MD. PhD. & Sandra Galeotti, MS
Introdução
O rápido acúmulo de novos
conhecimentos no campo da Genética e a
crescente ênfase nos aspectos moleculares
envolvidos na etiologia e etologia de
diversas doenças, assim como no desen-
volvimento de novas abordagens terapêu-
ticas e diagnósticas, exige que o médico e
o estudante de Medicina atualizem-se
rapidamente, para acompanhar os desen-
volvimentos da Medicina do século XXI.
Contribuir para que isso aconteça, é nosso
objetivo. Independente da especialidade
de atuação ou interesse do leitor, certos
conhecimentos e conceitos são indis-
pensáveis à compreensão da medicina
contemporânea. Esta primeira monografia
abordará, portanto, os conceitos gerais da
Genética Molecular, com o objetivo de
facilitar a leitura das monografias que se
seguem.
A genética mendeliana ocupou-se
do estudo de características herdadas e do
comportamento de transmissão das mes-
mas, determinando os conceitos de traços
dominantes e recessivos. Mas somente no
início do século XX a Genética Mende-
liana foi redescoberta, estabelecendo-se
assim a idéia de genes como unidades de
herança. A seguir, os vários anos de
pesquisa da molécula de DNA realizados
por Rosalind E. Franklin, no King’s
College, possibilitou a Watson e Crick,
auxiliados por Jerry Donahue, o
desenvolvimento do esboço estrutural, em
1953, de duplo filamento da molécula de
DNA, dispostos em forma helicoidal ou
dupla hélice. A partir de então, o gene
passou a ser visto como um sítio codi-
pela síntese de uma única proteína, dando
origem ao postulado “um gene, uma
enzima”. Dessa forma, os genes passaram
a ser considerados unidades invioláveis
de processamento de informação genética
– exceto pelos casos de mutações oca-
sionais. Acreditava-se também haver uma
quase completa incompatibilidade entre
os genomas de diferentes espécies.
No entanto, o crescente número de
descobertas da Biologia Molecular,
apoiada por novas técnicas e novos
recursos tecnológicos, gradualmente
desafiou esse modelo, através de novas
evidências que não se enquadravam no
postulado vigente: o genoma parecia cada
vez menos estável e menos inviolável. A
descoberta dos transposons, que promo-
vem a recombinação gênica, por Barbara
McClintock, representou um dos princi-
pais desafios à idéia de gene estável. Em
1988, Elizabeth Blackburn e Carol
Greider descobriram a enzima telomerase,
ao mesmo tempo em que outros pesqui-
sadores constataram a impossibilidade de
se estabelecer limites definidos para os
sítios onde um gene termina, devido às
bordas sobrepostas de muitos genes
(sliding edges), aumentando o desafio à
validade do postulado genético clássico.
Os íntrons, segmentos aparen-
temente não codificantes do DNA, que se
acreditava não possuírem nenhuma fun-
ção fisiológica importante, em contra-
posição aos éxons (segmentos codifi-
cantes), também desafiaram o modelo
vigente, revelando-se como agentes
controladores do splicing de éxons no
pré-RNA mensageiro e, possivelmente,
servindo como sítio de amortização
mutacional. Curiosamente e à excessão
da regra, um sítio de transcrição ativa,
identificado no homem e no camun-
dongo como U22, revelou-se como um
gene pelo avesso, pois demonstra
inatividade traducional de seus éxons no
RNA maduro, enquanto seus íntrons
traduzem o transcrito snoRNA, cons-
tituinte do RNA de nucléolos. No caso
do U22, portanto, os éxons são inativos e
os íntrons proces-sados durante o splicing
são codificantes ativos
O postulado “um gene, uma
enzima”, acabou por perder sentido,
frente à descoberta do processo de
splicing ou arranjo alternativo, que
permite a síntese de mais de uma versão
protéica (isoformas de uma mesma
proteína), com funções às vezes com-
plementares e às vezes antagônicas às
demais isoformas. A grande variância na
expressão e intensidade fenotípica da
doença em diferentes portadores de uma
mesma síndrome monogênica, indica o
provável papel da interação gene - meio
ambiente, assim como a participação de
outros genes ou de diferenças poli-
mórficas.
Estes poucos exemplos podem dar
uma idéia das diferenças marcantes entre
a visão da Genética Mendeliana Clássica
e da Genética Molecular. O gene mole-
cular é melhor descrito como um sítio ou
locus transcricional ativo - que atua por
meio da transcrição de produtos sob a
forma de RNA que podem ser traduzidos
em proteínas ou não. Assim como o
conceito da Física Clássica de tempo e
espaço foi mudado pela introdução da
inseparabilidade do continuum tempo-
espacial da Teoria da Relatividade e pelas
descobertas da Física Quântica, a noção
de estrutura e função, uma vez vistas na
Biologia como entidades separadas,
tornaram-se praticamente sinônimos na
visão da Biologia Molecular, podendo ser
expressas como uma unidade estrutura-
função. A noção de que cada proteína ou
enzima possuía uma função específica
única, foi também transformada pela
descoberta de um amplo pleiotropismo e
pela redundância funcional de diversas
enzimas. Em outras palavras, além de
uma certa proteína estar envolvida em
diversas funções diferentes (pleiotro-
pismo), um grande número de proteínas
pode também executar uma mesma
função (redundância).
Descobertas recentes modificaram
também a visão que tínhamos das proteí-
nas, através da constatação da habilidade
de certas proteínas não enzimáticas em
reconhecer sítios específicos no DNA
e/ou em outras proteínas. A identificação
da estrutura modular das proteínas, com
cada módulo constituindo um domínio
diferente e com funções específicas,
facilitou a compreensão da função dos
receptores transmembrana, bem como de
proteínas citoplasmáticas estratégica-
mente localizadas em regiões específicas
do citosol. O citoplasma celular, uma vez
já considerado um “saco amorfo de
enzimas”, revelou-se ao final do século
XX um microambiente altamente estru-
turado de organelas e vias de sinalização,
conduzindo sinais que viajam em direção
ao núcleo, através da mediação de
diversas proteínas amplificadoras de
sinal.
Uma vez pincelado esse pano-
rama, vamos passar a uma revisão dos
conceitos hoje conhecidos através da
Genética e Biologia Moleculares, sob o
enfoque de suas implicações para o
clínico na Medicina do Século XXI.
Genes - Transcrição e Tradução de
Produtos Gênicos
A unidade básica da molécula de
DNA são os nucleotídeos, constituídos
por uma base nitrogenada, um açúcar
(ose) e um grupo fosfato. As bases
nitrogenadas incluem duas purinas –
guanina e adenina (G e A) – e duas
pirimidinas – timina e citosina (T e C) -
que formam pares complementares A-T e
C-G. Na molécula de RNA, a base timina
é substituída por outra base nitrogenada, a
uracila (U). Os dois filamentos da
molécula de DNA são pareados de forma
complementar através de pares de núcleo-
tídeos formados entre os dois filamentos e
ligados por pontes de hidrogênio. Duas
pontes de hidrogênio ligam os pares
adenina-timina (A-T) e três pontes de
hidrogênio ligam os pares citosina-
guanina (C-G).
Os sítios ou loci codificantes da
molécula de DNA constituem os genes,
que são formados por pares de bases (pb)
ou seqüências nucleotídicas, em quanti-
dades que variam de algumas centenas a
milhares de bases (Kb). As regiões
codificantes de um gene são transcritas
para o RNA mensageiro. Elas são
formadas por seqüências de três pares de
base chamadas códons, e constituem os
éxons; enquanto as regiões que são
excisadas durante a transcrição são
chamadas íntrons. Os íntrons ainda são
uma grande incógnita, podendo, em
alguns casos, possuir funções reguladoras
da transcrição ou, como no já citado gene
pelo avesso U22, serem eles próprios as
seqüências codificantes. Por outro lado,
segmentos do DNA que funcionam como
íntrons em um determinado gene podem
agir como éxons em outros genes adja-
centes durante o splicing. Alguns autores
consideram a possibilidade dos íntrons
serem sítios de amortização mutacional,
protegendo assim os genes da maioria das
alterações genéticas. A identificação de
um gene é tarefa difícil e atualmente feita
por algorítimos de computadores. É
necessária a localização de elementos
característicos como um promotor, um
códon iniciador presente no quadro de
leitura, com um códon de término, assim
como sítios doadores e aceptores de
splice. Promotores são regiões do DNA
às quais a enzima polimerase se liga para
iniciar a transcrição gênica.
Quando a expressão de um gene é
ativada, seus éxons são transcritos para
um molde (template) de pré-RNA e este
processo - conhecido como splicing (do
Inglês, to splice = unir pontas soltas) - é
responsável pela eliminação dos íntrons.
No RNAm (RNA mensageiro) ocorre a
substituição das timinas por uracilas
(Figura 1). Este processo acontece no
núcleo celular, sendo a seguir o RNAm
transportado para o citoplasma, onde os
ribossomas processam a tradução do
produto gênico em uma proteína. Cada
códon é traduzido como um aminoácido
específico que fará parte da cadeia poli-
peptídica que está sendo polimerizada.
Muitas proteínas passam por um proces-
samento pós-tradução, com o acréscimo
de outros grupos à molécula, assim como
cortes na sequência de aminoácidos, de
forma a promover sua conformação final
e funcional. Em muitos casos, a forma
final da proteína apresenta propriedades
físicoquímicas bem diferentes do produto
inicialmente traduzido. A transcrição
gênica é realizada no sentido 5’ ! 3’ de
cada filamento de DNA, os quais estão
pareados de forma antiparalela; i.e., um
filamento 5’ ! 3’ está pareado a um
filamento 3’ ! 5’.
Figura 1. Transcrição – Acontece dentro do
núcleo celular
DNA ➜ 5’… AGG TCC TAG TAA ...3’
(sentido da transcrição)
"
Pré-RNA ➜ 3’… TCC AGG ATC ATT …5’
(transcrito de éxons na cadeia molde)
"
RNAm ➜ 5’… AGG UCC UAG UAA …3’
(seqüência de códons prontos para tradução)
As isoformas das proteínas são
geralmente resultantes do splicing alter-
nativo que ocorre durante a transcrição,
mas também podem ser fruto de modifi-
cações pós-tradução. No splicing alterna-
tivo, um evento até hoje observado
apenas em células eucariótas, uma
sequência diferente de códons é formada
no RNAm, determinando a tradução de
uma cadeia polipeptídica alternativa.
A tradução de proteínas é rea-
lizada no citoplasma pelos ribossomas,
que são pequenas organelas concentradas
no retículo endoplasmático rugoso - ou
sob forma de polissomas no citoplasma
das células eucariótas. Ribossomas são
compostos por 2 subunidades de RNA
ribossômico (RNAr), uma pequena e a
outra grande (em humanos, 18S e 28S,
respectivamente) e várias proteínas espe-
cíficas a cada subunidade ribossômico. O
RNA mensageiro é processado através de
um fenda entre as duas subunidades de
RNAr, enquanto o RNA transportador
(RNAt) atua como adaptador, posi-
cionando os aminoácidos em alinhamento
com seus códons correspondentes no
RNAm. O RNAt associa-se ao RNAm
formando um anticódon complementar,
que promove a correta ligação seqüencial
dos aminoácidos, segundo a ordem
estabelecida no RNAm. Tal correspon-
dência entre códons e anticódons é deno-
minada colinearidade. O processo de
tradução é iniciado por um códon
iniciador (AUG) e finalizado por um dos
três códons de terminação (UAG, UAA,
UGA). Além dos códons de iniciação e
terminação da tradução, o RNAm apre-
senta uma sequência líder que antecede o
códon de iniciação e uma sequência final
(trailer sequence) após o códon de
terminação. Uma vez terminada a tradu-
ção do polipeptídeo, a proteína é dês-
ligada do complexo ribossoma/RNAm e
passa a ser processada através de diversos
processos bioquímicos para assumir sua
conformação funcional.
Estados Gênicos, Genes e Pseudogenes
O esforço internacional do
Consórcio Projeto Genoma Humano,
para o seqüenciamento do genoma
humano, levou à diversos desafios e a um
aumento exponencial de novos termos
técnicos, hoje utilizados nos textos cientí-
ficos de Biologia e Medicina. É nosso
objetivo esclarecer o conceito subjacente
a esses novos termos, para facilitar a
leitura da literatura atual e a compreenção
de conferências e seminários. A análise
de elementos promotores de transcrição é
um recurso utilizado na identificação de
novos genes, em associação com a
detecção da presença de códons de ini-
ciação e de terminação in frame, assim
como os sítios doadores e aceptores de
splicing. As seqüências potencialmente
codificadoras encontradas em tal região
são denominadas ORFs (Open Reading
Frames ou quadros de leitura abertos).
Por meio da reação de trans-
criptase reversa e PCR (Polymerization
Chain-Reaction), foi possível criar uma
biblioteca de genes compostos apenas por
éxons, denominados DNAc. O DNAc é o
DNA obtido a partir de RNAm, após a
conversão pela transcriptase reversa. Tal
biblioteca permite o estudo da expressão
gênica, auxilia na identificação de novos
genes e serve como base de dados para o
estudo comparativo da função de novos
genes identificados.
Através da clonagem e sequen-
ciamento das bibliotecas de DNAc é
possivel identificar a sequência de partes
de genes expressos por um grupo celular,
mesmo que muitos dos genes sejam ainda
desconhecidos. Esta idéia inspirou um
projeto do governo americano que gerou
um banco de dados de ESTs (Expressed
Sequence Tags ou rótulos de seqüências
expressas). Existem ESTs derivadas de
populações de células específicas – tais
como um determinado tecido, órgão,
estágio de desenvolvimento embrionário,
tumores e de linhagens celulares. Os
resultados atuais da análise seqüencial do
genoma dividiram os genes em cinco
categorias:
Categoria 1: Genes já identificados
anteriormente e divulgados através da
literatura ou de bancos de dados públicos.
• Subcategoria 1.1: Genes comple-
tamente identificados, com função
definida (i.e., fator de crescimento,
fator transcricional, GAPDH, cinase,
citocinas, etc.).
• Subcategoria 1.2: Genes com identi-
ficação completa em um DNAc,
porém com função desconhecida.
Categoria 2: Novos genes apresentando
semelhanças ao DNAc de qualquer
organismo.
• Subcategoria 2.1: Genes similares ou
apresentando homologia a um outro já
caracterizado de qualquer outro orga-
nismo, com uma identidade na
seqüência de aminoácidos entre 25 e
100%. Esta subcategoria define novos
membros de famílias de genes huma-
nos, bem como ortólogos ou homo-
logos humanos de genes da levedura
Caernorhabditis elegans, camun-
dongo, Droso-phila melanogaster e
de outros organismos.
• Subcategoria 2.2: Genes apresen-
tando semelhanças com uma ORF
hipoteticamente predita em uma
seqüência genômica de um outro
organismo, mas que ainda aguarda
validação experimental.
Categoria 3: Esta categoria reúne os
genes com similaridades com a seqüência
de aminoácidos confinada a uma região
de uma proteína conhecida.
• Subcategoria 3.1: Genes com uma
seqüência de aminoácidos similar a
um domínio funcional de uma
proteína conhecida e que determina
uma função específica, tal como
domínios de imunoglobulinas, SH2,
tirosina, zinc fingers (i.e., proteínas
com dedos de zinco), etc.
• Subcategoria 3.2: Genes com amino-
ácidos semelhantes a domínios de
uma proteína conhecida, porém com a
função de tais domínios ainda desco-
nhecida.
Categoria 4: Novos genes definidos
apenas através de técnicas preditivas de
bioinformática, denominados genes su-
postos ou preditos, sem nenhuma
semelhança com proteínas ou motivos
protéicos conhecidos.
• Subcategoria 4.1: Genes putativos
constituídos por dois ou mais éxons
localizados dentro de uma região com
menos do que 20.000 bases (< 20 Kb)
que demonstram similaridade com
éxons de ESTs. Esta subcategoria
possui maior potencial codificante do
que as categorias seguintes.
• Subcategoria 4.2: Genes supostos que
mostram grande semelhança a ESTs
mas não são preditos pelos programas
de predição de éxons.
• Subcategoria 4.3: Genes supostos
preditos através de padrões con-
sistentes de éxons sem nenhuma
semelhança a ESTs.
Categoria 5: Pseudogenes - Seqüências
que perderam sua capacidade trans-
cricional ou apresentam níveis insigni-
ficantes de transcrição, por razões como:
a), ausência de íntrons b), presença de
códons de terminaçào no interior da ORF;
e c), inserções ou deleções de seqüências
que interrompem a ORF.
Características Gerais do DNA de
Mamíferos
Ao contrário do que se pensava, o
sequenciamento de todo o genoma
mostrou que os genes não se encontram
aleatoreamente distribuídos pelo geno-
ma, mas parecem estar agrupados em
determinados locais. Estes grupos
encontram-se separados por longos
trechos de DNA sem conteúdo gênico.
Ainda mais claro está o agrupamento de
alguns aglomerados de genes perten-
centes à mesma família, como por
exemplo, os genes da família HOX. Os
genes podem ter um número variado de
cópias, desde uma única cópia por
genoma haplóide a milhares de cópias,
dependendo do gene. Por exemplo, genes
codificando RNAr apresentam entre 150 e
200 cópias, enquanto os genes codifi-
cantes de histonas possuem até 1.000
cópias. No entanto, a maioria dos genes
humanos apresenta apenas uma única
cópia em cada alelo.
Várias seqüências altamente
repetidas estão presentes no DNA de
mamíferos, tais como SINES (Short
Interspersed Sequences), LINES (Long
Interspersed Sequences), elementos ALU
(um tipo de SINES), LTR (Long
Terminal Repeats). De fato, essas
seqüências repetidas ocupam aproxi-
madamente 50% do DNA humano e,
quando somadas às seqüências não codi-
ficantes, constituem cerca de 98% da
molécula. Em outras palavras, apenas 2%
do DNA humano codifica produtos
funcionais. Os resultados das pesquisas
do Projeto Genoma Humano, publicadas
em fevereiro de 2001, revelam que as
estimativas anteriores sobre o número de
genes em humanos foi superestimada
(70.000 a 100.000 genes). A estimativa
atual oscila entre 35.000 e 55.000 genes.
Embora nosso DNA seja 1.000
vezes maior do que o DNA da bactéria E.
coli, o DNA humano contém apenas 10
vezes mais genes do que o DNA desta
bactéria. Isto provavelmente se explica
pelo fato de grande parte da molécula
humana não conter genes, mas sim
seqüências repetidas e segmentos não
codificantes, como supra mencionado,
além daquelas que constituem os telo-
meros, nas extremidades de cada
cromossoma. Os telômeros conferem
estabilidade ao cromossoma e protegem o
material genético contra eventuais fusões
cromossômicas aberrantes durante a
replicação do DNA.
Muitas das seqüências repetidas
encontradas no DNA humano são
repetições simples, do tipo ACACACAC
ou CGCGCGCG e supõe-se que sejam
formadas por erros durante a replicação
do DNA. Elas podem ser encontradas nos
centrômeros e telômeros ou espalhadas
pelo genoma. Com excessão dos telo-
meros, cujas seqüências curtas, repetidas
até 10.000 vezes, estabilizam a molécula
de DNA e preservam a integridade de
genes funcionais, as demais repetições
não possuem função conhecida, embora
repetições longas possam ativar ou
desativar genes e causar doenças, como a
LTR denominada L1, envolvida na
inativação de genes em vários tumores.
Repetições moderadas,
geralmente constituídas por fragmentos
de DNA viral e não mais codificantes,
representam cerca de 45% do DNA
humano. Seqüências Retrovirais
Endógenas (SRE ou ERVs –
Endogenous Retroviral Sequences) que
codificam uma enzima transcriptase
reversa funcional também são
encontradas com freqüência. Esta enzima
converte RNA em DNA, permitindo
assim a integração de se-qüências
retrovirais ao genoma humano. Como
exemplo, podemos citar os retransposons,
ERVs, LTRs, e LINES. Alguns
transposons parecem ser herança de
infecções bacterianas, promovendo a
acumulação gradual desses elementos no
DNA, ao longo da evolução dos mamí-
feros, devido a múltiplos episódios infec-
ciosos.
Os elementos ALU são SINES
com um comprimento aproximado de 300
pb e são denominadas ALU por possuí-
rem sítios para a enzima de restrição ALU
em ambas as extremidades. As enzimas
de restrição são endonucleases que reco-
nhecem seqüências palindrômicas (i.e.,
recorrentes) curtas de nucleotídeos e
cortam a fita de DNA geralmente dentro
deste palíndromo. Uma região palindrô-
mica caracteriza-se por uma cadeia
polinucleotídica onde uma seqüência de
bases é seguida por uma série de bases
que permite o pareamento complementar
das duas fitas, quando a nova molécula de
DNA é novamente enrolada. As LTRs
constituem seqüências repetidas em
tandem (i.e., enfileiradas, uma atrás da
outra) nas extremidades do genoma dos
retrovírus e seqüências similares, encon-
tradas no genoma humano – provavel-
mente resultantes da integração de
seqüências virais.
Classificação Funcional de Genes
Uma outra classificação de genes
refere-se às funções por eles desempe-
nhadas. No entanto, diversos genes
apresentam diferentes graus de pleio-
tropia e/ou de redundância funcional. A
pleiotropia diz respeito à observação de
mais de um efeito causado por um dado
produto gênico. Tal efeito pleiotrópico
pode variar em diferentes circunstâncias
do microambiente celular ou pode se
expressar como efeitos diferentes em
diferentes tecidos, indicando, assim, a
especificidade tecidual de cada efeito. A
redundância funcional define a capaci-
dade de produtos derivados de genes
diferentes executarem a mesma função. A
redundância funcional não deve ser
confundida com a homologia gênica.
Genes homólogos são aqueles que
possuem, em diferentes espécies, grande
similaridade entre si, na sequência de
seus nucleotídeos. Por exemplo, os genes
Homeobox, que controlam a embriogê-
nese e são uma seqüência evolucio-
nariamente conservada em vários mamí-
feros, inclusive no homem.
Alguns genes são responsáveis por
funções essenciais à manutenção de quase
todos os tipos celulares, sendo, portanto,
denominados genes zeladores (house-
keeping genes), como por exemplo a
actina gama, o citocromo p450, as
ATPases, a glutationa-S-transferase e a
N-acetil-transferase.
Outra classe de genes, essencial à
preservação da integridade do genoma,
codifica produtos envolvidos na detecção
de alterações no DNA, constituindo o
sistema intra-celular de reparo a danos
ao DNA. O DNA está sujeito a danos
tanto de natureza exógena (mutágenos
químicos ambientais, radiação UVA e
UVB, infecções, inflamações crônicas,
etc.), quanto endógena (metabólitos
genotóxicos resultantes da ação natural
do metabolismo enzimático, deficiências
nutricionais, radicais livres etc).
Os genes de receptores de
membrana codificam dois tipos de
receptores: os receptores catalíticos e os
não-catalíticos. A maioria dos receptores
de membrana não é catalítica, mediando o
sinal químico regulador da atividade de
várias proteínas em uma seqüência de
eventos que termina por produzir um
2+
sinal intracelular como o Ca ou o AMP
cíclico. Os receptores catalíticos são
glicoproteínas transmembranas que pos-
suem uma estrutura protéica modular
complexa, com uma “cauda” que penetra
no citosol. Na superfície, possuem um
sítio de ligação específico para um
determinado ligante extracelular, tal
como um fator de crescimento ou um
hormônio. Na porção imersa no citosol,
apresentam um domínio contendo enzi-
ma, além de outros domínios de ligação
proteína–proteína, que podem servir para
amplificar o sinal. Uma vez que o ligante
ocupe o receptor, pode ocorrer a
dimerização de dois receptores catalí-
ticos, ativando o domínio enzimático e
apresentando sua enzima a outras proteí-
nas alvo, presentes no citosol. A ativação
do receptor desencadeia, portanto, uma
série de respostas intracelulares que são
mediadas por proteínas não catalíticas,
cujo objetivo é a transdução do sinal
para o núcleo celular; i.e., um sítio
específico do DNA a ser ativado. Em
outras palavras, a cascata de sinais
desencadeada por um receptor ativado
visa ou a ativação de um gene (ou de um
aglomerado de genes da mesma família)
no DNA nuclear ou, ainda, a indução do
processo de replicação do DNA –
dependendo do tipo de receptor ativado.
Figura 3. Ação de proteínas modulares de
ligação p-p em receptores catalíticos ativados
Os genes que codificam fatores
transcricionais têm como produto
proteínas necessárias para a iniciação da
transcrição, que não sejam da família das
enzimas polimerase. Os fatores de trans-
crição atuam de diversas formas durante a
iniciação da transcrição, podendo intera-
gir com a RNA polimerase ou com o
complexo iniciador inteiro, ou ainda, com
outras moléculas ativadoras ou com o
próprio DNA. Fatores transcricionais são
classificados de acordo com sua atividade
em três grupos: 1, Fatores Gerais de
Transcrição, 2, Ativadores de Transcrição
e 3, Co-ativadores.
Os Genes Repressores de
Expressão Gênica são codificadores de
uma classe especial de fatores de não-
transcrição. Em vez de estimularem a
transcrição, atuam negativamente, ini-
bindo-a. Alguns fatores de transcrição
podem fazer as duas coisas - estimular ou
inibir - dependendo das circunstâncias ou
da presença de outras determinantes pre-
sentes no microambiente celular.
Por fim, fatores de transcrição
alterados por mutações podem perder a
capacidade estimulatória, ligando-se ao
DNA com eficiência, mas sem executar
sua função indutora de transcrição.
Freqüentemente nestes casos, uma cópia
alterada de um fator de transcrição é
capaz de inibir a função da cópia intacta,
por competir pelo mesmo sítio de ligação.
Os Genes de Fatores de
Crescimento codificam polipeptídeos que
promovem o crescimento celular através
da interação com receptores celulares
específicos e são geralmente produzidos
por genes ativamente expressos em outras
células ou órgãos, sendo por isso
denominados ligantes extra-celulares.
Por exemplo, os hormônios hipofisários,
tal como o hormônio tireotrófico - que
ocupa receptores catalíticos em células da
tireóide, estimulando a proliferação
celular - e o hormônio de crescimento,
responsável pelo crescimento ósseo e pela
síntese protéica em diversos tecidos,
durante a infância e puberdade – além de
atuar na reparação de tecidos, durante
toda a vida do organismo.
Outros exemplos de fatores de
crescimento são: Fator de Crescimento
Epidérmico (Epidermal Growth Factor -
EGF), Fator de Crescimento de Fibro-
blasto (Fibroblast Growth Factor - FGF),
Fator de Crescimento Derivado de
Plaquetas (Plaquette-Derived Growth
Factor - PDGF), Fator de Crescimento
Semelhante à Insulina (Insulin-like
Growth Factor - IGF).
Os assim chamados genes estruturais
codificam a estrutura primária de proteí-
nas de membrana, enzimas, actina do
citoesquelesto, colágeno, elastina e outros
produtos necessários à morfologia
estrutural/funcional de células, tecidos e
órgãos.
Os Genes de Controle do Ciclo
Celular são de duas diferentes classes e
estão envolvidos diretamente no processo
de proliferação celular:
a. Genes Supressores de Tumor: atuam
no controle da divisão celular,
prevenindo a proliferação celular
excessiva, evitando assim a formação
de displasias e tumores. A perda de
função desses genes ou a inibição de
seus produtos por onco-proteínas
mutadas leva à desregulação da
Qualquer gene que venha a causar
morte, quando a perda de heterozigose
ocorre é denominado gene letal. São
também chamados genes letais zigóticos
e podem estar expressos de forma
homozigótica mesmo no décimo ciclo
celular da formação do blastoderma,
proliferação celular, com o conse-
qüente crescimento descontrolado de
células em um dado tecido ou órgão,
o que resultará em displasias e/ou
tumores malignos.
b. Oncogenes: Genes cujos produtos
respondem aos estímulos enviados
por receptores ativados por hormônios
ou por fatores de crescimento -
promovendo o crescimento e a
progressão do ciclo celular em direção
à mitose. São também considerados
oncogenes aqueles cujos produtos
possuem a função de amplificar e
sustentar o estímulo pró-mitótico,
necessário para que uma das fases do
ciclo celular se complete.
Inicialmente, os oncogenes eram
considerados formas mutadas de proto-
oncogenes, mas são atualmente reco-
nhecidos como qualquer gene – mutado
ou não, super expresso ou não – capaz de
induzir a formação de tumores, alterar os
padrões de expressão gênica ou inibir
outros genes de regulação da proliferação.
Essas alterações podem incluir as
seguintes mudanças nos padrões de
expressão gênica: 1, aumento anormal
dos níveis de seus produtos na célula; 2,
a expressão do oncogene em tecidos nos
quais não deveria ser expresso; 3,
aumento do número de cópias do
oncogene (amplificação gênica); 4,
mutações estruturais no próprio
oncogene, causando ganho de função.
como é o caso do gene gap Krupple e do
gene fushi tarazu (ftz).
Os genes associados com a regulação
do ciclo circadiano e outros ciclos bio-
lógicos em muitos organismos são
denominados genes relógio (Clock
Genes). A identificação de um gene
relógio é feita através do estudo de
células em culturas e de embriões que
perderam os ritmos circadianos normais.
A inserção de um gene no DNA dessas
linhagens ou embriões que restaure o
ciclo normal, identifica-o como um gene
relógio
Os genes associados a Sexo (Sex-
linked Genes) são genes localizados nos
cro-mossomas sexuais, X ou Y, com uma
função específica na regulação de outros
genes desses cromossomas, tal como o
gene SRY, encontrado no cromossoma
Y. O produto de SRY é um fator
transcricional de ligação ao DNA com
função crucial no desenvolvimento dos
testículos e na determinação do gênero
masculino. Mutação neste gene dá
origem a fêmeas XY, com disgênese
gonádica.
Elementos Reguladores da Expressão
Gênica
Relembrando, expressão gênica
significa a produção de RNA pelo gene
correspondente. O sítio no DNA ao qual a
enzima RNA-polimerase irá ligar-se para
dar início à transcrição de um deter-
minado produto gênico é denominado
seqüência promotora ou promotor. Tal
região promotora é geralmente de difícil
caracterização, podendo estar localizada
próxima ou distante do gene em questão,
na maioria das vezes a montante do início
da sequência gênica (upstream).
Durante a embriogênese, genes
denominados genes mestres (master
genes) controlam a expressão ordenada de
aglo-merados inteiros de genes e/ou
grupos de genes, que atuam em cascata
em uma determinada via de desen-
volvimento. Geralmente, um grupo de
genes contíguos ou pertencentes à mesma
família, que se encontram organizados em
uma única unidade transcricional, são
ativados pela mesma seqüência regula-
dora. Genes mestres são também
denominados genes selecionadores, pois
“escolhem” entre duas vias embrio-
gênicas de desenvolvimento, através da
repressão e ativação seletiva de grupos de
genes.
Exemplos de genes controlados
pelos genes mestres são os genes HOX,
primeiramente estudados na Drosophila
melanogaster sob o nome de genes
Homeóticos Seletores. Estes genes são
responsáveis pela morfologia de mem-
bros, órgãos, tecidos e pela diferenciação
célular. Genes HOX são encontrados em
todas as espécies animais e guardam uma
alta homologia, ao longo da cadeia
evolutiva. Esta homologia é caracterizada
por uma seqüência de nucleotídeos
altamente conservada em todas as
espécies (peixes, lesmas, Drosophila
melanogaster e mamíferos) conhecida
como homeobox. Genes HOX ocorrem
em aglomerados nos diversos segmentos
do embrião e, quando ativados, guiam o
desenvolvimento morfogenético de um
determinado membro ou órgão. São
também indispensáveis durante a Reno-
vação celular e na manutenção da
diferenciação das células em cada tecido
ao longo da vida do animal, assegurando
a correta diferenciação funcional e
maturação de células recém replicadas, de
acordo com a fisiologia específica do
tecido que constituem.
Os produtos de certos genes
modificam a função de outros genes,
sendo conhecidos como genes modifica-
dores (modifier genes), os quais parecem
ser responsáveis pela variância feno-
típica de certas doenças monogênicas,
tais como a hemofilia, cardiomiopatias,
fibrose cística e displasias. Tal variância
fenotípica não deve ser confundida com a
penetrância de doenças hereditárias.
Enquanto a variância fenotípica descreve
níveis de gravidade da doença, a pene-
trância define o percentual de indivíduos
portadores de uma mutação que manifes-
tam a doença.
Outro elemento regulador da
expressão gênica são os genes amplifi-
cadores (enhancers). Os amplificadores
encon-tram-se em uma posição-cis
(mesmo cromossoma) do gene que
amplificam e aumentam os níveis de
transcrição basal. Ainda mais diver-
sificados que os promotores, os genes
amplificadores podem estar localizados
praticamente em qualquer local do
cromossoma: - acima, abaixo, próximo ou
distante do gene alvo. Quando um gene
recebe influência de outro gene localizado
em outro cromossoma, diz-se que tal
elemento de influência encontra-se em
posição-trans.
Figura 4. Elementos àcima ou a montante
(upstream) e abaixo (downstream) de um dado
gene.
Elemento àcima ⇒ Gene ⇐ Elemento abaixo
5’..!!!……"""""""""…888..3’
Sentido da Transcrição: 5’⇒ 3’
O óperon é um grupo de genes que forma
um conjunto regulador da expressão de
genes estruturais, que foi primeiramente
estudado por Jacob e Monod na bactéria
Escherichia coli. Eles demonstraram que
a produção de lactato ocorre apenas na
presença das enzimas beta-galactose,
lacpermease e transacetilase - o que é
uma exemplo de indução enzimática –
pois a oferta de lactose induz a expressão
dos genes codificadores dessas três
enzimas. O modelo óperon Jacob-Monod
é composto por um gene regulador, uma
região promotora e uma região operadora,
além de pelo menos um gene estrutural
codificador da estrutura primária de uma
enzima. O modelo sugere a presença de
um gene regulador sintetizando um pro-
duto com atividade repressora que se liga
ao operador, impedindo a transcrição de
genes estruturais.
Quando a repressão enzimática
ocorre, o óperon inativa o gene estrutural;
porém, a introdução de uma substância
indutora, como a lactose, que no caso da
E. coli, é o substrato alvo do produto dos
três genes estruturais (enzimas), o locus
do operador (ou óperon) é ativado,
produzindo um RNAm policistrônico,
que leva à síntese das três enzimas
necessárias à metabolização da lactose.
Quando os níveis de lactose baixam, a
expressão do operador é novamente
supressa. Na E. coli, este conjunto
operador foi denominado LAC-Operon.
O RNAm policistrônico é um RNAm
bastante comum em procariotos,
contendo informações para a tradução de
mais de uma proteína, originadas de
transcritos de diferentes genes funcionais
(i.e., genes funcionais = cístrons).
Embora o modelo óperon tenha sido
desenvolvido com base no estudo de
procariotos, a idéia geral foi incorporada
ao processo de diferenciação celular de
células eucariótas, no qual a repressão
seletiva de alguns genes e a indução
alternada da expressão de outros genes
leva ao desenvolvimento embrionário
ordenado.
Famílias de Genes
Famílias gênicas são formadas
por genes que exibem seqüências
nucleotídicas semelhantes. Tais genes
podem derivar de um gene ancestral
comum e ter adquirido suas
características atuais por meio dos
processos de divergência e recombinação
gênicas.
As principais causas de diver-
gência gênica são as mutações espon-
tâneas, que levam à variabilidade genética
entre as espécies e em diferentes
populações de uma mesma espécie. A
divergência gênica pode também resultar
da migração dessas mutações em uma
população, por meio do fluxo genético ou
da transdução de material gênico viral ou
bacteriano no DNA de seus hospedeiros.
A recombinação gênica pode ser
homologa ou não-homóloga (i.e.,
heteróloga), promovendo a migração de
genes nos organismos eucariotos. A
recombinação gênica ocorre nas primeiras
horas da embriogênese entre os alelos
maternos e paternos herdados pelo
embrião.
Exemplos de famílias gênicas são
as histonas, genes HOX, Citocromo P450,
oncogene ras, receptores de proteínas G,
receptores de Fatores de Crescimento,
entre outros.
Em 1999 foi descoberta uma nova
família de genes, primeiramente identi-
ficada em camundongos e posteriormente
em nematódios, plantas, mofo e peixe
zebra, o que indica uma alta conservação
evolucionária. Em camundongos, esta
família de genes denominada MORC,
regula a produção e maturação de
espermatozóides. O papel desempenhado
pelos genes MORC em outras espécies
ainda não está esclarecido.
Genes Envolvidos no Controle do Ciclo
Celular
Os dois principais grupos de
genes envolvidos no controle do ciclo
celular são aqueles que estimulam e os
que inibem o ciclo celular: - os oncogenes
e os genes supressores de tumor, anterior-
mente descritos. Estas duas classes de
genes controlam redes de sinalização
intracelulares e modulam a expressão de
outros genes durante a progressão do
ciclo celular.
Outra família de genes
importantes no controle do ciclo celular
são os Genes de Reparo do DNA que
codificam enzimas que atuam em várias
fases do ciclo celular (G1, S e G2),
interrompendo a transcrição da nova fita
quando encontram adutos químicos, erros
de pareamento de bases, etc, retirando-os
da fita e substituindo-os por seqüências
corretas.
Durante a intérfase (fases G0, G1,
S, G2) as células que não se encontram
em processo proliferativo, permanecem
em G0 (por ex., a maioria dos neurônios),
enquanto as que devem se dividir passam
pelas fases G1, S e G2, entrando a seguir
em mitose. Os tecidos de renovação
rápida permanecem menos tempo em G1
do que os de renovação lenta, ao passo
que as fases S e G2 parecem ter durações
semelhantes, independente da velocidade
proliferativa tecidual.
No final da fase G1, o ciclo é
interrompido para verificação e reparo de
possíveis erros de transcrição ou na
presença de adutos químicos em bases
nucleotídicas, o que é conhecido como
ponto de restrição (R). Uma vez
realizados os reparos necessários, o ciclo
prossegue para a fase S, iniciando a
síntese do DNA. No caso de danos
irreparáveis, a via que induz a apoptose
ou morte celular programada é ativada,
evitando a formação de clones mutados
nas gerações seguintes de células. Ao
final de cada fase, os produtos gênicos
que a regularam são degradados ou
inativados, de forma que, uma vez feita a
transição para a fase seguinte, torna-se
impossível regredir à fase anterior. Uma
vez ultrapassado o ponto de restrição, o
ciclo celular progredirá pelas fases S e G2
em direção à mitose.
No final da fase G2 o ciclo será
novamente pausado para nova verifi-
cação das recém sintetizadas seqüências
que constituirão as novas fitas de DNA,
realização de reparos e nova tomada de
decisão (mitose ou apoptose?), através da
regulação de expressão do gene p21. A
enzima topoisomerase III confere as
seqüências de nucleotídeos recém sinte-
tizadas, elimina as incorretamente
transcritas e permite reparos no ponto de
verificação do final da G2, antes que os
diversos segmentos sintetizados sejam
ligados entre si pela enzima DNA-ligase,
para formar a nova fita de DNA.
Uma vez duplicado o DNA, com
cada fita recém sintetizada e pareada a
uma das duas fitas de DNA parental
complementar (replicação semi-conser-
vadora), o ciclo progride para mitose,
dando origem aos núcleos das duas
células-filhas idênticas, que serão for-
madas através da citocinese (divisão do
citoplasma).
Genes Experimentais
Na busca de soluções terapêuticas
ou de novas estratégias de identificação
de genes, vários genes e cromossomas
modificados foram desenvolvidos, como
ilustram os exemplos a seguir.
Gene Reporter: Genes utilizados em
laboratório para avaliar a expressão de
outros. São geralmente utilizados de uma
maneira artificial. Por exemplo, ao se
clonar o promotor do gene X justaposto
ao gene da beta-galactosidase, pode-se
avaliar a ativação do gene X, sob
diferentes condições - ou até mesmo
durante o desenvolvimento embrionário -
através da presença de cor azul nas
células, gerada pelo “gene reporter” beta-
galactosidase.
Gene Suicida: Uma estratégia tera-
pêutica que visa tornar o tumor mais
vulnerável à quimioterapia, ou a uma
outra droga, como o ganciclovir. Geral-
mente isto é possibilitado pela expressão
de uma enzima específica, não expressa
em mamíferos, ligada a um promotor
ativo nas células tumorais, desta forma
convertendo dentro da célula tumoral um
substrato inofensivo em um molécula
tóxica para a célula. A transfecção de
células tumorais com o gene tirosina-
cinase do vírus Herpes Simplex (HSVtk)
torna-as sensíveis à droga antiviral,
ganciclovir. A expressão do gene HSVtk
na célula tumoral induz a fosforilação do
ganciclovir em monofosfato que, seguida
pela fosforilação mediada por cinases
celulares a trifosfato, leva à inibição da
DNA polimerase em células tumorais em
proliferação, induzindo a apoptose. Um
efeito residual potente persiste, induzindo
também as células adjacentes à apoptose.
Testes realizados em tumores ovarianos
irradiados, demonstraram que o efeito
residual é eficaz. Células expressando
HSVtk foram injetadas na cavidade
peritoneal das pacientes, as quais
receberam a seguir ganciclovir. Através
do efeito residual, as células que sobrevi-
veram à radiação gama foram induzidas à
apoptose. Em camundongos murinos
transgênicos com tumores cerebrais, o
efeito residual induziu a apoptose de 30 a
60% das células tumorais e o efeito
residual levou à remissão completa em
80% dos animais testados.
YAC (Yeast Artificial Chromosome): Um
dos organismos utilizados como modelo
para o estudo do ciclo celular são os
fungos utilizados em fermentos, tal como
o Saccharomyces, pertencente à classe
dos Hemascomycetes. YAC é um
cromossoma artificial de levedura, que
permite a clonagem de fragmentos de
DNA humano nele inseridos de até um
milhão de pb (pares de base). Este
cromossoma auto replicante inclui três
seqüências de DNA e dois sítios de
reconhecimento para enzimas de res-
trição que permitem a replicação e
transmissão do genoma às células filhas.
Essas três seqüências e os sítios de
restrição são descritos abaixo:
• Telômeros – localizados em cada
extremidade do cromossoma, prote-
gendo o DNA contra a degradação
por nucleases;
• Centrômero – o local de ligação do
fuso mitótico que segrega cada cópia
de cromossoma para um polo celular
oposto;
• Seqüências promotoras na origem de
cada forquilha de replicação, que
promovem a replicação de seqüências
específicas de DNA
• Sítio de reconhecimento para duas
enzimas de restrição: EcoRI e BamHI.
Marcadores selecionáveis são também
inseridos, o que permite que as células
que incorporaram o vetor contendo o
fragmento de DNA humano sejam
facilmente isoladas das demais células da
cultura.
A clonagem de DNA humano em YAC
tornou possível a análise de longas
seqüências, tais como as encontradas em
genes humanos. A clonagem de material
genético de mamíferos pode ser também
feita através da inserção dessas seqüên-
cias em plasmídeos bacterianos. Porém, o
plasmídeo não comporta mais do que
10.000 pb, tornando evidente a vantagem
do YAC.
A clonagem de DNA humano em YAC
tem início com a digestão parcial do
DNA pela enzima de restrição EcoRI,
obtendo-se assim fragmentos muito
grandes. Por sua vez, um plasmídeo
bacteriano circular é modificado,
recebendo centrômero e elementos
promotores de replicação, de forma a
permitir a replicação do material a ser
clonado pelas células de levedura. A
seguir, o plasmídeo é digerido pelas
enzimas de restrição EcoRI e BamHI,
recebendo telômeros em cada
extremidade, for-mando assim um
cromossoma linear. O fragmento de
DNA humano é então recombinado com
este cromossoma linear nos sítios de
EcoRI, sendo ambos covalentemente
unidos pela enzima DNA ligase. Desta
forma, um vetor YAC é produzido e pode
ser utilizado para infectar células de
levedura em cultura, produzindo um
número ilimitado de cópias.
Mutações Gênicas, Mutações Cromos-
sômicas e Impressão Epigenética
As mutações gênicas e as recombinações
são as principais fontes de variabilidade
genética, proporcionando a diversidade de
características individuais em cada
espécie, bem como a multiplicidade de
espécies, ao longo da evolução biológica.
A diversidade genética permite a
evolução da espécie, visto que indiví-
duos que herdaram diferentes variações
gênicas respondem diferentemente às
mudanças ambientais, tais como mudan-
ças climáticas, poluição, aumento de
radiação UV, etc. Tais diferenças de
resposta às pressões ambientais favore-
cerão a adaptabilidade e sobrevivência de
certos grupos de indivíduos daquela
mesma espécie em detrimento de outros,
aumentando, porém, a chance de sobre-
vivência da espécie em si. Este é o
conceito moderno de seleção natural.
Mutações podem ocorrer em dois
diferentes níveis: cromossomas ou genes.
As mutações cromossômicas são carac-
terizadas por alterações suficientemente
grandes para serem detectadas pelas
técnicas de citogenética clássica
(cariotipagem), incluindo cópias extras ou
faltantes de um cromossoma; deleção de
fragmentos grandes; translocações;
duplicações e inversões. Quando um
cromossoma perde seu centrômero, não
pode ser copiado para as células-filhas,
causando a perda de todos os alelos
localizados naquele cromossoma. A
presença de uma terceira cópia de um
cromosoma constitui uma trissomia,
como no caso da síndrome de Down
(trissomia do cromossoma 21).
As mutações gênicas são peque-
nas e passam despercebidas durante a
cariotipagem, consistindo de adições,
perdas ou substituições de nucleotídeos.
Mutações em células germinativas (game-
tas) são transmitidas aos descendentes,
enquanto as que ocorrem em células
somáticas podem causar doença ou morte
apenas no próprio indivíduo que as
adquiriu. Portanto, as mutações podem
ser herdadas ou adquiridas (esporádicas).
Além disso, durante a fertilização
ou a embriogênese, mutações de novo
podem ocorrer, principalmente durante a
recombinação gênica, as quais, embora
presentes ao nascimento, não são
encontradas nos genomas materno e
paterno.
A metilação de histonas é um
dos processos de controle da expressão
gênica, denominados controles epige-
néticos, possuindo um papel crucial no
desenvolvimento ordenado do embrião.
Ela é também essencial na diferenciação
celular, mantendo silenciados os genes
que não devem ser expressos em um
determinado tecido. Outro controle
epigenético é a acetilação de histonas,
que induz a expressão de genes da região
acetilada.
O silenciamento de um gene por
metilação ou por desacetilação é
denominado impressão epigenética
(imprinting). Portanto, a impressão epi-
genética anormal de um gene ou a perda
de uma impressão epigenética normal
(Loss Of Imprinting - LOI), podem
ambas causar doença, dependendo do
tecido e das circuntâncias. Um número
crescente de doenças, até hoje atribuído a
mutações hereditárias, tem recentemente
revelado evidências que apontam para a
desregulação de processos de impressão
epigenética. Exemplos são as síndromes
de Prader-Willi (PWS), síndrome de
Angelman (AS), síndrome de Beckwith-
Wiedemann, Tumor de Wilms, mola
hidatiforme, teratoma ovariano completo,
hepatoblastoma e rabdo-miossarcoma.
Mutações gênicas autossômicas
dominantes são as que apresentam um
fenótipo patológico dominante a nível
celular, sendo a causa de diversas doenças
monogênicas. Um caso intrigante é o
câncer hereditário, onde a mutação
autossômica é na maioria das vezes
recessiva a nível celular, mas o fenótipo é
herdado de maneira dominante. A
mutação de um dos alelos parentais é
herdada em todas as células do indivíduo,
mas somente as que sofrem alteração do
segundo alelo desencadearão o processo
de tumorigênese. Contudo, devido ao
fator temporal e ao grande número de
células com uma alteração de base, o
fenótipo "câncer" é herdado de maneira
dominante, visto que estes indivíduos
desenvolvem tumores com freqüência,
geralmente múltiplos e em idade precoce.
Em tumores malignos e benignos
são comuns os rearranjos cromossô-
micos, tais como a translocação, recom-
binações promovidas por transposons,
inversões e deleções, que podem alterar a
taxa de expressão de um gene ou
inibir/abolir a função de sua proteína.
Tipos de Mutações Gênicas
Single Nucleotide Polymorphisms -
(SNPs): mutações de ponto, que ocorrem
em um único nucleotídeo, através da
substituição de uma base. Polimorfismos
em genes envolvidos no biometabolismo
celular são responsáveis pelas variações
individuais na taxa metabólica de res-
posta a medicamentos e pelos diferentes
graus de susceptibilidade a poluentes e
efeitos adversos a medicamentos. SNPs
podem ocorrer das seguintes formas:
• Transição: uma purina (A ou G)
substitui outra purina; ou uma piri-
midina (C ou T) substitui outra
pirimidina;
• Transversão: uma purina substitui
uma pirimidina ou vice-versa;
Assim, a mutação de ponto pode produ-
zir os seguintes resultados:
a) redundância de bases (AA ou GG;
CC ou TT), que leva a uma mutação
silenciosa de mesmo sentido
(samesense);
b) bases diferentes produzindo a subs-
tituição do códon de um aminoácido
por outro, produzem uma mutação
missense ou de sentido errôneo. Se o
novo aminoácido possui proprie-
dades semelhantes ao original (wild
type), a mutação pode ser neutra;
caso contrário, pode originar uma
proteína mutante e modificar o
fenótipo;
c) a mutação de ponto pode originar um
códon de terminação da tradução no
meio do quadro de leitura, causando
uma mutação sem sentido, com a
tradução protéica terminando preco-
cemente e dando assim origem a um
produto truncado.
Mutação por Inserção: adiciona nucleo-
tídeos durante a replicação do DNA, o
que resulta em uma mutação frameshift
ou mudança na matriz ou quadro de
leitura. Por exemplo,
Wild type ou seqüência original:
AGC TTA CCG TTA GCC #
ACg CTT ACC GTT AGC C (mutação)
UAG
Este tipo de mutação pode causar uma
das seguintes alterações: perda de função,
truncagem de leitura, perda de códon de
terminação com possível fusão de duas
proteínas, efeito polar (no caso de grandes
inserções).
Mutação por Deleção: uma parte do
DNA é perdida, causando também
mudança no quadro de leitura, com as
mesmas conseqüências da inserção.
Geralmente, as mutações de ponto e as
inserções podem ser revertidas; as
deleções, porém, não são reversíveis.
Inserção ou Deleção de 3 Nucleotídeos
(ou mais): não modifica o quadro de
leitura, embora a perda de função do
produto traduzido seja comum.
Grandes inserções ou deleções
podem ocorrer e geralmente resultam em
mutações sem sentido, até que um códon
de terminação seja encontrado nas adja-
cências do locus. Grandes inserções
podem também resultar no efeito polar,
onde um gene mutado passa a afetar
outros genes abaixo e costuma ocorrer
com genes operons.
Supressão Intragênica: Ocorre quando
uma segunda mutação mascara a presença
da primeira, sendo, portanto, uma
mutação compensadora, que preserva
desta forma a função da proteína.
Supressão Intergênica: é observada
quando duas proteínas devem interagir e a
mutação em uma delas impede a
interação. A mutação supressora, pode
então ocorrer no gene codificador da
outra proteína, restabelecendo a intera-
tividade dos dois produtos. Pode também
ocorrer entre duas vias biometabólicas
interdependentes. Neste segundo caso,
dois eventos distintos podem ocorrer: 1),
a mutação da segunda via metabólica
pode permitir que a primeira via mutada
passe a ser ignorada; ou 2), a mutação
pode ocorrer em uma via metabólica
alternativa, aumentando a função perdida
na outra, de forma compensatória. Se por
outro lado o locus afetado pela primeira
mutação deu origem a um novo códon de
terminação, o RNA transportador (RNAt)
responsável pelo reconhecimento de
códons durante a tradução, pode sofrer
uma mutação supressora, que lhe permita
não reconhecer o códon de terminação
(originado pela primeira mutação) como
um UAG, permitindo que a tradução
continue. Por exemplo, o RNAt mutado
pode interpretar o códon mutado UAG
como sendo o códon AAG da lisina
originalmente presente, adicionando este
aminoácido.
Além das mutações espontâneas
endó-genas, supra descritas, o genoma
está também sujeito à ação de mutágenos
ambientais, cujos metabólitos se inserem
no DNA sob a forma de adutos químicos,
causando mutações exógenas i.e.,
induzidas por agentes xenobióticos. A
radiação por raios X, por exemplo, causa
quebras cromossômicas que levam a
deleções, enquanto a radiação UV induz a
dimerização de pirimidinas. Quando não
corrigidas, essas alterações levam à
transformação celular e ao câncer. Alguns
mutágenos químicos modificam as
ligações entre as bases, causando ligações
cruzadas entre elas, enquanto outros
inserem nucleotídeos de pares adjacentes
que resultam em mudanças do quadro de
leitura.
A inserção de genoma viral e
bacteriano, durante infecções é também
um outro fator indutor de mutações, como
as induzidas pelos vírus da hepatite e pela
bactéria gástrica Helicobacter pilori.
Processos inflamatórios crônicos ou
recorrentes podem também induzir
mutação genética, levando a perdas
funcionais ou ao câncer.
DNA Mitocondrial e Herança Materna
Extra-Nuclear
Os mitocôndrias possuem DNA circular,
com comprimento de 16 Kb no ser
humano, contendo cerca de 20 genes
expressos e o restante da molécula
constituída por seqüências repetidas. Os
primeiros estudos que demonstraram que
o DNA mitocondriano (DNAmt) é her-
dado da fêmea, foram realizados em
plantas, com o DNA de cloroplastos (no
caso dos cloroplastos, nem sempre isso é
verdade). Em mamíferos, os camun-
dongos Mus domesticus e Mus spretus
serviram de modelo animal para os
estudos que demonstraram que o DNAmt
é herdado exclusivamente da mãe.
Estudos posteriores demonstraram que o
mesmo acontece em outras espécies,
inclusive a humana. Este padrão de
herança genética é denominado herança
materna. O DNAmt contém RNAr,
RNAt, genes estruturais e subunidades
enzimáticas.
Os processos bioquímicos
realizados por mitocôndrias durante a
produção de energia, (cadeia respiratória
mitocon-driana) têm lugar em cinco
complexos protéicos: I, II, III, IV e V.
Dos 80 genes necessários para a síntese
das proteínas componentes desses
complexos, alguns se encontram no
próprio DNAmt, enquanto os demais
estão localizados no DNA nuclear. Os
genes do DNAmt sofrem uma taxa de
mutação 5 a 10 vezes superior a dos
genes do DNA nuclear, o que produz
distúrbios no metabolismo celular e está
também associado ao processo de
envelhecimento. Algumas mutações em
genes do DNAmt (herdadas da mãe)
resultam em deficiências congênitas nos
complexos da cadeia respiratória ou no
sistema enzimático de detoxicação e
eliminação de metabólitos tóxicos
produzidos ao longo da cadeia
respiratória. Em quaisquer dos casos, o
resultado será a manifestação de fenótipos
patológicos de diferentes graus de
gravidade, dependendo do tipo de
mutação e da extensão de suas
implicações. São exemplos de patologias
causadas por mutações no DNA de
mitocôndrias o sub-desenvolvimento
acompanhado de anorexia crônica durante
a infância, que resulta em baixa estatura,
desordens neurocognitivas, deterioração
neurológica progressiva. Esta condição
poderá resultar em demência, convulsões
e ataques de origem neurológica,
dificuldades de deglutição, desordens
visuais, surdez, desordens mielotróficas,
cardiomiopatias e arritmias, além de
desordens renais.
Todo o DNA de mitocôndrias
deriva do óvulo materno e o
espermatozóide não contribui nesse
processo. No caso de presença de
mutações no DNAmt, as mesmas estarão
presentes na maioria dos óvulos, mas não
em todos – devido à natureza aleatória de
distribuição dos mitocôndrias - o que
implica um alto risco de mais de um filho
com distúrbios derivados de tais
mutações. Além disso, cada mitocôndria
presente no óvulo contém várias cópias
de cada gene mitocondriano e se uma
mutação estivesse presente em todas as
cópias de um determinado gene, o
embrião provavelmente não sobreviveria
aos primeiros estágios da embriogênese.
Portanto, um indivíduo portador de
mutações mitocondrianas possui cópias
normais e cópias mutadas do mesmo
gene.
Mutações de novo (que não
estavam presentes originalmente no
óvulo) podem também ocorrer no
momento da fertilização, o que não
representará um risco para o restante da
progênie. Outra característica da mutação
herdada, é que ela não se encontra
necessariamente presente em todas as
células e tecidos do organismo, de forma
que apenas os tecidos portadores de
mitocôndrias mutados apresentarão dis-
funções. O número de cópias mutadas do
gene em questão, em relação ao número
de cópias normais presentes nos mito-
côndrias é também um fator decisivo para
a manifestação ou não do fenótipo
patológico.
Técnicas Utilizadas em Genética
Molecular
A seção de metodologia dos
trabalhos científicos atualmente publi-
cados sobre Genética Molecular men-
ciona diversas técnicas, pressupondo que
o leitor esteja familiarizado com elas, ao
menos conceitualmente. Portanto, descrê-
vemos a seguir, essas técnicas para
atualização e a título de uma pronta
referência.
PCR: Polymerase Chain Reaction, ou
Reação em Cadeia da Polimerase é uma
técnica de Biologia Molecular (1985),
através da qual é possível a amplificação
do número de cópias de uma seqüência
específica de DNA de maneira expo-
nencial. Esta técnica requer a existência
de uma sequência molde (template) que
será amplificada através da hibridização
com sondas complementares (primers) a
pequenos trechos de ambas as extre-
midades da sequência molde. A reação
requer a variação contínua de tempe-
ratura, permitindo a hibridização entre
fragmentos, a extenção por polime-
rização de nucleotídeos e em seguida a
desnaturação das seqüências recém-
sintetizadas, para que um novo ciclo
possa ser iniciado. Visto que a des-
naturação requer temperaturas próximas a
100oC, foi necessário isolar polimerases
de organismos termoresistentes, de modo
a possibilitar a reação enzimática em
cadeia, sem destruir a atividade enzi-
mática da polimerase.
Através da técnica de PCR, é
possível se utilizar um pequeno número
de moléculas de DNA e amplificá-las até
se obter o número desejado de moléculas.
Este procedimento é de grande valia na
clonagem de genes, análise de expressão
e identificação de indivíduos (paternidade
e medicina forense).
rtPCR: Semelhante ao PCR, porém
inclui uma etapa anterior na qual o RNA
é convertido em cDNA pela enzima
transcriptase reversa. O cDNA resultante
pode então ser amplificado por PCR.
Esta técnica permite a análise de ex-
pressão de genes em células ou tecidos
específicos.
PCR Semi-quantitativo: Variação do
PCR no qual os ciclos são otimizados no
sentido da amplificação ser o mais quanti-
tativa possível. Uma maneira de obter
este efeito é contaminar a reação de
amplificação com outra seqüência conhe-
cida - e geralmente presente em todas as
amostras – tal como genes zeladores (i.e.
housekeeping genes). Ao se atingir o
máximo possível de amplificação da
sequência contaminante, a reação pára de
progredir de maneira exponencial, impe-
dindo assim que, ao longo dos ciclos, as
seqüências em menor número sejam
amplificadas, produzindo um sinal tão
intenso como o gerado pelas seqüências
em maior número.
Real Time PCR (TaqMan): Variação da
técnica de PCR, inventada pela compa-
nhia Perkin Elmer, que permite a
visualização da amplificação à medida em
que a reação ocorre. Tal efeito é pos-
sibilitado atráves da adição de sondas
(probes) contendo moléculas fluores-
centes que são ativadas somente ao serem
degradadas pela polimerase. Assim, pode-
se detectar e quantificar a intensidade da
amplificação como sendo diretamente
proporcional à luz gerada.
LCR: Ligase Chain Reaction ou Reação
em Cadeia da Ligase consiste na
amplificação de um fragmento de DNA
pela ligação em cadeia de duas sondas
complementares. As sondas são plane-
jadas de modo a se hibridizarem ao DNA-
molde e serem ligadas pela enzima ligase.
A amplificação ocorre após múltiplas
etapas de desnaturação e ligação.
Southern Blot: Técnica de hibridização
de DNA-alvo com DNA-sonda. O DNA-
alvo, geralmente fragmentado, é sepa-
rado por eletroforese em gel de agarose e
transferido para uma membrana de nylon
ou nitrocelulose. O DNA-sonda é
marcado com radioatividade ou métodos
não radioativos e hibridizado ao DNA
imobilizado na membrana. O sinal
positivo é indicativo da presença no
DNA-alvo de seqüências semelhantes ou
idênticas às do DNA-sonda. Condições
de lavagem podem aumentar ou diminuir
o limite da hibridização, permitindo, por
exemplo, apenas a hibridização de
seqüências idênticas.
Dot Blot: Semelhante ao método anterior,
porém o DNA-alvo não é separado por
eletroforese, mas sim "blotted" ou
borrado em regiões específicas da
membrana. A vantagem é a rapidez e a
desvantagem é a falta de separação por
tamanho de fragmentos, o que im-
possibilita saber ao certo se a positividade
é devido à presença exata do gene
interrogado ou de genes semelhantes e/ou
com trechos com um grau de homologia
suficiente para permitir a hibridização
com a sonda.
Northern Blot: Mesma filosofia do
Southern Blot, porém o material alvo é
RNA, em vez de DNA. Essa técnica,
assim como o rt-PCR, permite a análise
de expressão de determinados genes em
células ou tecidos específicos.
Western Blot: Também semelhante aos
anteriores, contudo o alvo - que é sepa-
rado por tamanho e imobilizado em
membrana - é constituído de proteínas e a
sonda é substituída por anticorpos mono
ou policlonais, que investigam epítopos
específicos da proteína de interesse. A
detecção do sinal é geralmente por
quimio-luminescência.
ISH ou Hibridização In Situ (In Situ
Hybridization): Permite investigar a
expressão de seqüências de RNA em
lâminas de tecido. Técnica elegante, onde
se pode determinar com precisão a
localização do RNA expresso, por exem-
plo no tumor ou tecido conjuntivo
peritumoral. A hibridização é feita com
sondas RNA antisenso e o sinal detec-
tado por radioatividade ou imuno-
coloração.
Imunohistoquímica: Semelhante ao
anterior, porém o material investigado na
lâmina é proteína e não RNA - e a sonda
é substituída por anticorpos mono ou
policlonais. A detecção do sinal é por
imunocoloração.
Imunocitoquímica: Variação da técnica
anterior, na qual o tecido em lâmina é
substituído por células em suspensão.
Expression Analysis: É o uso de qualquer
técnica que permita a análise de
expressão gênica em tecidos ou células
diferentes, por exemplo, rtPCR, North-
ern Blots e, mais recentemente, os
modernos Biochips de DNA.
cDNA library: Biblioteca gênica gerada
pela clonagem de toda uma população de
cDNAs em um vetor de escolha. Tal
biblioteca representa o pool ou banco de
genes expressos naquele grupo celular,
visto que foi gerada através da conversão
das moléculas de RNA em DNA.
Genomic library: Biblioteca gênica
gerada pela clonagem de fragmentos de
DNA em um vetor de escolha. Tal
biblioteca representa todos os genes
presentes em um indivíduo - inde-
pendente do tecido utilizado.
Identificação Genética (DNA finger-
printing): Utilização da composição
genética de um indivíduo para permitir
sua identificação. Atualmente são
utilizados preferencialmente os Short
Tandem Repeats (STR), que após am-
plificação por PCR são separados de
acordo com o tamanho, gerando um
padrão altamente polimórfico que,
combinado, produz uma identificação
genética de alta resolução.
Fluorescence activated cell sorting
(FACS) ou Citometria de Fluxo (Flow
Cytometry): Separação celular com base
em moléculas expressas na superfície
destas células. Anticorpos marcados
específicos reconhecem as moléculas
marcadoras de superfície, gerando cores
diferentes de acordo com o anticorpo
utilizado. De acordo com a cor de cada
célula - ou combinação de cores, a
máquina promove a separação celular
para compartimentos diferentes. Este
método é também muito útil na iden-
tificação e classificação de tumores, de
acordo com os marcadores tumorais
expressos.
DNA Chip: Chips de sílica contendo
milhares de seqüências curtas de DNA,
ou seqüências inteiras de cDNA.
Utilizados preferencialmente para se
analisar simultaneamente a expressão de
milhares de genes em um determinado
tecido ou grupo de células. Pode-se, por
exemplo, analisar as diferenças de
expressão gênica entre tecido tumoral e
tecido normal e, ao mesmo tempo, obter-
se um mapa dos níveis de expressão de
milhares de genes.
Transgenic Mouse: Camundongos
transgênicos contendo um gene exógeno,
por exemplo, humano. Esta técnica
requer a microinjeção do gene em células
cultivadas in vitro, que depois são
introduzidas no útero da fêmea grávida.
Estas células transgênicas se misturam
com as células normais e geram um
animal quimérico, contendo células
normais e transgênicas. Através de
cruzamentos sucessivos, é possível obter
um animal completamente transgênico.
Knockout Mouse: Consiste na eliminação
de um gene específico no camundongo,
para estudo das alterações durante a
embriogênese ou na vida adulta do
camundongo. Por exemplo, abolindo-se a
função de um gene supressor tumoral,
pode-se observar o aparecimento precoce
de tumores. A ruptura é feita in vitro,
através da recombinação homóloga em
células embrionárias que são poste-
riormente selecionadas e implantadas na
fêmea grávida. O mesmo processo de
cruzamento de quimeras é necessário para
se obter um camundongo completamente
knockout.
Knockin Mouse: Variação da técnica
anterior, na qual o gene, ao invés de
eliminado, é substituído por outro. Por
exemplo, substitui-se a versão normal de
um gene pela versão alterada (com
mutações) e estuda-se o efeito fenotípico
de forma controlada.
SNP ou Single Nucleotide Poly-
morphisms: A mais sutil variação
genética entre indivíduos, consistindo na
variação que ocorre em um único
nucleotídeo, como acima exposto.
Estima-se que existam variações nucleo-
tídicas deste tipo a cada 1.000 ou 1.300
nucleotídeos. Considera-se na atualidade
que o grupo total de SNPs de um
indivíduo é o fator determinante para
todas as predisposições genéticas deste
indivíduo. Espera-se que futuramente,
com a possibilidade da análise simultâ-
nea de todos os SNPs, possa-se deter-
minar estatísticamente a predisposição
individual a múltiplas doenças e, desta
forma, tomar medidas preventivas muito
precocemente.
Bibliografia Consultada e Recomendada:
1) Peter Beurton, Raphael Falk, Hans-Jørg Rheinberger
(eds.) The Concept of the Gene in Development and
Evolution. Cambridge Studies in Philosophy and
Biology. Cambridge Univer-sity Press, 2000.
2) Alberts, B., Bray, D., Lewis J., Raff, M., Roberts, K.,
a
Watson, J. Molecular Biology of the Cell, 3 ed.
Garland Publishing, Inc., 1994.
3) Kornberg, R.D. Eukaryote transcriptional control.
Trends in Cell Biology, Trends in Biochemistry,
Science and Trends in Genetics (joint issue); 1999:24,
M46-8.
4) Yaspo, M-L., Reinhardt, R., Lenbrach, H. et. cols.
The DNA sequence of human chromosome 21. Nature;
18 May 2000; 311-319.