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5. Enzimas
5a. Introduo
Em termos quantitativos, a funo das protenas que domina a formao de tecidos dos seres vivos. Pode pensar em cabelo, pele, carne, em particular. Todavia, existe um outro tipo de protenas que no existe em quantidades grandes no corpo, mas sim muito importante, tendo a funo de catalisador dos processos bioqumicos no corpo. Estes biocatalisadores so chamados: "enzimas". A ao dos biocatalisadores depende em grande parte da forma molecular, em particular da superfcie da molcula da prpria protena. Por exemplo: imagine que certas molculas do substrato (os reagentes) querem reagir para formar um produto. S ser possvel uma reaco no momento que estas molculas entram em contacto duma maneira bem definida. No uma opo real esperar at as molculas por acaso chocam desta maneira. Mas quando se encontram l os biocatalisadores, a enzima atrai as molculas que cabem duma s maneiro na superfcie da enzima. Assim as molculas dos reagentes so ajudadas em chocar exactamente da maneira certa e podem logo reagir formando o produto que logo se afasta da enzima. Pode ser o substrato que pretende reagir. Cabe muito bem na superfcie da enzima, i., no centro activo. Uma vez chegado, o substrato pode facilmente (com ajuda dos lugares a, b e c) reagir.

A equao da reaco apresenta-se de seguinte modo: E+S ES E+P

Onde S = Substrato (reagente), e P = Produto

O funcionamento das enzimas, por consequncia, depende da superfcie da sua molcula. Qualquer influncia que pode mudar esta superfcie estraga o trabalho da enzima. Assim, uma aco de desnaturao desastrosa. A enzima j no funciona. Pode ser uma temperatura alta demais: uma desnaturao irreversvel. Ou mudana de pH, ou mudana do ambiente por acrescentar lcool ou sais. As enzimas mostram sempre um valor de pH ou uma temperatura que o melhor para seu funcionamento: a temperatura ptima ou o pH ptima. Em termos quantitativos, a funo das protenas que domina a formao de tecidos dos seres vivos. Pode pensar em cabelo, pele, carne, em particular. Todavia, existe um outro tipo de protenas que no existe em quantidades grandes no corpo, mas sim muitssimo importante, tendo a funo de catalisador dos processos bioqumicos no corpo. Estes biocatalisadores so chamados: enzimas. Portanto: As duas funes principais das protenas: 1. Formao de tecidos (msculos, pele, ossos, colgene, armazenamento) 2. Catlise enzimtico (controle das reaces, transmisso de impulsos nervosos, proteco imunitria) O estudo das protenas constitui condio base para a compreenso da gentica nas aulas de biologia e bioqumica. Este estudo no laboratrio inclui - de modo geral e entre outros - a purificao e separao de protenas, por tcnicas como: cromatografia e electroforese.

Histria
Louis Pasteur (1822 -1895) foi um dos primeiros cientistas a estudar reaces catalisadas por enzimas. Ele acreditava que leveduras ou bactrias vivas eram necessrias para estas reaces, a que denominou fermentaes - por exemplo, a converso de glicose em lcool por leveduras. Em 1897, Eduard Bchner fez um filtrado sem clulas, que continha enzimas preparadas, traturando clulas de leveduras com areia bem fina. As enzimas contidas neste filtrado converteram glicose em lcool, provando assim que para a actividade enzimtica no era necessria a presena de clulas vivas. Bchner recebeu o Prmio Nobel de qumica em 1907 por este trabalho. Duas caractersticas gerais das enzimas: I. II. Enzimas so protenas (a parte estrutural); tm a estrutura da protena;tm a possibilidade de desnaturao, em particular sob influncia do pH e da temperatura; Enzimas so (bio)catalisadores (a parte cintica); muito especfico e eficiente;holoenzima = apoenzima + coenzima/grupo prosttico

5b. A especificidade das enzimas

A aco dos biocatalisadores depende em grande parte da forma molecular, em particular da superfcie da molcula da prpria protena. Por exemplo: Imagine que certas molculas do substrato (os reagentes) querem reagir para formar um produto. S ser possvel uma reaco no momento que estas molculas entram em contacto duma maneira bem definida. No uma opo real esperar at as molculas por acaso chocam desta maneira. Mas quando se encontram l os biocatalisadores, a enzima atrai as molculas que cabem duma s maneiro na superfcie da enzima. Assim as molculas dos reagentes so ajudadas em chocar exactamente da maneira certa e podem logo reagir formando o produto que logo se afasta da enzima. Pode ser o substrato que pretende reagir. Cabe muito bem na superfcie da enzima, i., no centro activo. Uma vez chegado, o substrato pode facilmente (com ajuda dos lugares a, b e c) reagir.

A equao da reaco apresenta-se de seguinte modo: E + S ES E + P

Onde S = Substrato (reagente), e P = Produto, E a enzima que participa, mas fica igual ao fim. Exerccio 30 Mais um tipo de catalizao enzimtica encontra-se na imagem em seguida. Estude bem a imagem e explique como est garantida a especificidade desta enzima.

A especificidade das enzimas deve-se forma tridimensional da molcula:

Na figura podemos apenas ver uma imagem didimensional. Uma ideia tridimensional podemos ver na figura. Os dois substratos que reagem podem ser as partes amarela e verde. A imagem - de facto - mostra o complexo enzima+substratos. Exerccio 31 A ltima reaco (S1+ S2 Explique a sua resposta. P) pode ser uma condensao?

Erros no DNA ou mutaes podem criar confuso no corpo humano, i., produzir enzimas com erros no superfcie ou falta duma enzima. Tais enzimas deficientes impossibilitam uma das reaces bioqumicas do metobolismo ( eventuais doenas). Exerccio 32 Hemoglobina (Hb) podemos considerar tipo enzima com um activador. Qual o activador em Hb? Exerccio 33 Num diagrama de energia, mostre o que 'energia de activao' duma reaco qumica Resposta

5c. A estrutura das enzimas

5 Os dois substratos S1 e S2 ligam-se enzima especificamente. Outras molculas a no cabem (em termos de espao). O lugar onde se ligam os Vrias vezes, mas no sempre, encontra-se neste centro uma coenzima (ligeiramente) ou um grupo prostico (bem ligado). Mudanas na forma do centro activo pode terminar a aco da enzima. O centro, muitas vezes, tem uma estrutura de fenda, l dentro mais ou menos apolar.

Coenzimas e grupos prosticos ( ) facilitam a aco da enzima. A enzima completa, incluindo cofactores e grupos prostticos, chama-se holo-enzyme (ingls), A enzima sem cofactores e grupos prostticos chama-se apo-enzyme. Frequentemente, a coenzima uma vitamina, e a mesma coenzima pode ser associada com enzimas diferentes. Algumas enzimas requerem uma parte inorgnica, tal como um io metlico (por exemplo, Ca2+, Mg2+ ou Zn2+). Este componente inorgnico um activador. Do ponto de vista funcional, um activador equivalente a uma coenzima, mas componentes inorgnicos no so chamados de coenzimas. A enzima uma protena com:
o o o o

Uma estrutura primria, produzida sob controle do DNA = a sequncia dos aminocidos Uma estrutura secundria, = o -helix (tipo mola) da estrutura primria Uma estrutura terciria, = o resultado quando o -helix se vai dobrar em 3 dimenses; a forma tridimensional defina a especificidade e a sua inibio Uma estrutura quaternria (nem sempre) um conjunto de (4) estruturas tercirias iguais

Tipos de enzimas, nomenclatura:

De modo geral, o nome duma enzima comea com o substrato +, em seguida, a actividade da enzima Oxidoreductases catalisam reaces redox (ex. glucose-oxidase) Transferases Hidrolases Liases Isomerases Ligases transferem grupos funcionais dum doador para um aceitador. separar molculas (ex. peptidases, proteases) tiram ou juntam certos grupos funcionais (ex. decarboxilase) mudam ismeros (mutase) para ligar molculas (piruvatocarboxilase)

6 Exerccio 34 A que tipo pertencem: a. A enzima que pode mudar D-glicose em L-glucose? b. A enzima que pode mudar fosfato em fosfito? c. A enzima que pode mudar sacarose em glicose e frutose?

5d. Outras propriedades das protenas

Protenas so sensveis para o ambiente, em particular para o valor do pH e a temperatura. Os dois podem causar mudanas na forma tridimensional, at desnaturao.

Desnaturao de protenas (e polissacardeos)

Para tal existem vrios mtodos (por exemplo):

Aquecimento causa mais movimento dos tomos e ligaes; pode estragar as ligaes vanderwaals ou as ligaes polares; no se estragam as ligaes covalentes. Aquecimento extremo pode estragar as ligaes dentro das molculas e formar outras substncias, at chegar a produtos finais, como gua e carbono (resduo preto) Juntar cido ou lcool pode estragar pontes de hidrognio, ou seja, a estrutura terciria e secundria.

Exerccio 35

As figuras mostram a sensibilidade da actividade das enzimas (biocatalisadores) pela temperatura e pH. O eixo-y mostra a actividade da enzima. Indique nas figuras uma escala de temperatura e pH no eixo-x (uma estimativa) Exerccio 36 Explique o que acontece ao ferver de um ovo durante alguns minutos. Uma temperatura alta desastrosa para a enzima: desnaturao irreversvel, enquanto que uma temperatura baixa somente diminui a velocidade/actividade sem desnaturar. Ao voltar de temperaturas baixas para temperaturas de 30 a 40C, a actividade volta. (ideia: arrefecer o corpo para depois de muitos anos recuperar?!) A maior parte das enzimas funciona melhor a valores de pH por volta de 7, mas existem algumas que tem seu ptimo a temperaturas diferentes, por exemplo a pepsina (pH ptima 1-2). Mudanas fortes de pH podem desnaturar as enzimas, at irreversvel. Exemplos: Pepsina 1,5 Amilase 6,6 Lipase Sacarase 7,0 no estmago na saliva no estmago

8,0 resp. 7,0 no pncreas resp. no intestino

Exerccio 37 Que ser o pH na boca? Justifique a sua resposta. O funcionamento das enzimas, por consequncia, depende da superfcie da sua molcula. Qualquer influncia que pode mudar esta superfcie estraga o trabalho da enzima. Assim, uma aco de desnaturao desastrosa. A enzima j no funciona. Pode ser uma temperatura alta demais: uma desnaturao irreversvel. Ou mudana de pH, ou mudana do ambiente por acrescentar lcool ou sais. As enzimas mostram sempre um valor de pH ou uma temperatura que o melhor para seu funcionamento: a temperatura ptima ou o pH ptima. Exerccio 38

8 No sistema digestivo do homem h vrias enzimas que se responsabilizam pela digesto. Todas tm o seu pH ptimo: stio enzimas pH-ptimo Na saliva No estmago No pncreas amilase e maltase peptase, rennase 6,6 1,5 - 4 6,6 - 8,5

amilase, maltase, lipasse, tryptase, polipeptidase 6,6 - 9

Nos intestinos maltase, sacarase, lactase, ereptase

a. Explique as variaes nos valores de pH nos quatro lugares b. Por qu sacarase e lactase s aparecem na ltima parte do sistema de digesto. Resposta

5e. Regulao da actividade enzimtica:

Reaces no catalisadas, que podem requerer horas de fervura na presena de um cido ou de uma base forte, podem ocorrer em fraces de segundo, na presena da enzima apropriada, temperatura ambiente e em pH muito prximo do neutro. As enzimas actuam como catalisadores, diminuindo grandemente a energia de activao de reaces bioqumicas especficas. A energia de activao diminuda permite que estas reaces se processem em altas velocidades, temperatura do corpo. Existem vrias maneiras de regulao da actividade enzimtica: Varias enzimas nem sempre esto disponveis / prontas para funcionar, mas sim encontram-se no estado de 'pro-enzimas' ou zimognios. Razes para tal so: a proteco duma enzima vulnervel ou somente necessrio no caso de acidentes. Assim, no estmago, existe a pepsinognio que pode formar a enzima pepsina a valores baixos de pH. Uma vez formada, a pepsina no pode voltar. O pepsinognio perda uma cadeia de 44 aminocidos. O prprio produto pode (em concentraes altas) voltar, assim proibindo a enzima a continuar sua aco. Conhecendo a enzima, possvel elaborar substncias que podem - especificamente influenciar a aco da enzima (inibidores, molculas com estruturas comparveis com o substrato normal, mas no igual), assim impossibilitando a enzima na sua aco regular. Estas drogas usam-se - por exemplo - na quimioterapia para proibir o metabolismo de tumores. Certas enzimas tm, alm do centro activo, um outro stio onde possam ligar certos grupos; so centros alostricos. Substncias que cabem neste centro alostrico podem mudar a forma tridimensional da enzima, incluindo o centro activo, e assim mudar a especificidade ou a actividade. Pode ser uma influncia positiva (mais actividade) ou negativo.

9 Exerccio 39 A seguinte afirmao verdadeira, sim ou no? Explique a sua resposta. a. A enzima um (bio)catalisador que influencia a velocidade da reaco. b. Um catalisador acelera (ou reduz) a velocidade V duma reaco qumica: S P c. Explique as letras S, P e V nas suas prprias palavras a um colega.

De modo geral, as reaces bioqumicas so reaces em equilbrio. Isto implica que a formao do produto chega ao seu mximo depois de algum tempo (t), logo que o equilbrio se estabeleceu. Sem catalisador, essas reaces so muito lentas; t pode chegar a valores de horas ou dias. A presena do catalisador no aumenta a concentrao do produto no equilbrio, mas sim o tempo necessrio para atingir esta concentrao. Em vez de dias ou horas, o produto forma-se dentro de segundos (que muda o grfico). O biocatalisador - normalmente - acelera o processo qumico com factores de 106 ou mais.

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Decurso da reaco

O substrato forma um complexo com a enzima. Este complexo chamado 'o estado de transio. Depois a enzima e o produto separam-se. S+E ES a P + E b

A formao do complexo (a) ema reaco em equilbrio a; a ltima reaco b no . A enzima acelera a obteno do equilbrio (no muda o prprio equilbrio) e acelera a formao do produto.

5f. Michaelis Menten (veja tambm o anexo)

Cada reaco tem sua prpria velocidade V com o seu prprio constante de velocidade k

Com trs pressupostos que criam uma situao ideal / ptima, pode-se afirmar que a velocidade chega velocidade mxima Vmax

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Os trs pressupostos so: 1. um estado estationrio (steady state) no qual a concentrao do intermedirio ES no muda; a formao do complexo ES acontece com a mesma velocidade do que a degradao do mesmo. 2. Toda enzima presente participa; 3. O sistema encontra-se num ambiente ptima (saturao com S, o melhor pH, a melhor temperatura); assim a velocidade V chega velocidade mxima Vmax

a velocidade da formao do intermedirio ES:

a velocidade da quebra do intermedirio ES (para dois lados):

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KM o constante de Michaelis Exerccio 40 Explique como chegar a esta expresso a partir do pressuposto 1. Resposta KM mostra a afinidade pela enzima ao substrato; um KM baixo implica muito ES, portanto, muito substrato S; isto : pequeno KM implica velocidade maior. A relao entre a velocidade da reaco e KM pode-se ler na equao de Michaelis Menten:

Os valores de KM podem variar de 0 at milhares Exerccio 41 Leia bem a tarefa prtica laboratorial, tente imaginar esta prtica e d o seu comentrio: Divida-se um extracto neutro (pH=7) da mucosa gstrica em duas partes iguais (A e B). Acidifica-se a parte A com HCl at atingir o pH 2: esta mistura j no mostra actividade de degradao proteica. Dilui-se a parte B com um volume igual de gua: esta mistura no mostra nenhuma actividade. Tratam-se ambas as partes, A e B, com base, at atingir um pH 8,5: no h nenhuma actividade enzimtica de degradao proteica. Acidificam depois as duas partes de pH 8,5 para atingir pH 2: S parte B mostra actividade de degradao proteica. Exerccio 42 Tente compreender a seguinte descrio duma experincia, junto com os grficos: "Na comparao das enzimas, determinam-se os parmetros de Vmax e Km , medindo a velocidade da reaco (V) em funo da concentrao do substrato [S]." Neste caso mede-se, para uma quantidade padro de hexocinase ou glicocinase, a velocidade da formao (V) de GlucoseFosfato (o produto G6P) em funo da concentrao de glicose (S). Os resultados mostram que as Vmax das duas enzimas so iguais (formam-se 100 nmol G6P por minuto), mas os Km diferem bastante: Km da hexocinase = 0,1 mM, Km da glicocinase = 10 nM (factor 100)."

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Considere mais uma vez o seguinte equilbrio, com um intermedirio SE:

o constante de Michaelis mostra a afinidade da enzima para o substrato a equao de Michaelis-Menten mostra a relao entre KM e a velocidade da reaco Existem vrios tipos de inibio das enzimas: 1. Inibio pelo produto 2. Inibio por drogas 3. Inibio alostrica