ENZIM-ENZIM PADA PROSES REKOMBINASI

Resume

Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Genetika II yang dibina oleh Prof. Dr. A. Duran Corebima, M. Pd, dan Prof. Dr. Hj. Siti Zubaidah, M. Pd

Oleh: Kelompok 4 Off. A Henyta Agustina Ika Sukmawati (109341417202) (109341421811)

The Learning University

UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI Oktober 2011

ENZIM-ENZIM PADA PROSES REKOMBINASI

Analisis genetic sudah mengungkap enzim-enzim yang berperan pada proses rekombinasi yang umum pada E. coli. Skrining sel-sel F- E. coli yang mengalami mutasi dengan bantuan teknik replica plating dapat digunakan untuk mengidentifikasi koloni-koloni mutan pada cawan yang awalnya tidak dapat membentuk rekombinan setelah berkonjugasi denagn sel-sel Hfr pada replica plate. Mutan-mutan yang tidak dapat melakukan rekombinasi tersebut bersangkut paut dengan gen-gen recA, rebB, dan recC.

Enzim-Enzim yang Dikode Gen recA, recB, dan recC Protein recA merupakan enzim yang berperan pada rekombinasi umum maupun perbaikan DNA (Ayala, dkk, 1984) dan gen recA dibutuhkan untuk peristiwa rekombinasi umum pada E. coli. Protein recA mengkatalisis pembentukan struktur Holliday. Protein tersebut menggunakan energy dari hidrolisis ATP untuk membuka DNA unting ganda dan memungkinkan terjadinya perpasangan dengan DNA unting tunggal, dan memungkinkan terjadinya sinapsis molekul DNA yang memiliki urutan pasangan nukleotida yang mirip. Protein ini juga mengkatalisis terbentuknya jembatan silang yang diikuti migrasi jembatan silang.

Gambar protein recA memperantarai dua kejadian transfer unting pembentukan jembatan silang Holliday

Pada E. coli juga terjadi rekombinasi di lingkup plasmid, yang ditunjukkan dengan bentukan molekul serupa angka delapan sebelum dipotong dengan endonuklease EcoRl. Namun bentukan tersebut tidak ada pada DNA plasmid yang berasal dari E. coli yang tidak memiliki gen recA. Hal ini menunjukkan bahwa bentukan serupa angka delapan itu merupakan perantara pada rekombinasi yang dikatalisasi oleh protein recA antara molekul-molekul plasmid. Sebaliknya, bentukan angka delapan tersebut ditemukan pada preparat DNA yang berasal dari sel E. coli yang memiliki gen recB atau recC. Maka, produk kedua gen ini baru bekerja setelah protein recA bekerja. Gen recB dan recC mengkode dua subunit suatu nuclease yang tergantung ATP. Nuklease tersebut berperan sebagai resolvase yang memotong jembatan silang pada struktur Holliday untuk menyempurnakan rekombinasi. Protein recA juga memegang peran dalam perbaikan DNA. Fungsi perbaikan ini diaktivasi oleh DNA unting tunggal. Protein recA memiliki aktivitas proteolitik yang distimulasi oleh DNA unting tunggal, yang memotong sekurang-kurangnya dua macam molekul repressor, yaitu repressor profag , dan produk gen lex A yang mengatur tingkat ekspresi gen recA maupun sejumlah gen yang terlibat dalam mekanisme perbaikan DNA serta fungsi survival yang disebut fungsi SOS. Meningkatnya produksi protein recA juga membantu pemulihan sel dengan cara memperantarai perbaikan oleh rekombinasi daerah yang rusak dan tidak rusak dari molekul DNA turunan pasca replikasi. Berkenaan dengan enzim recB dan recA ada sumber yang menyatakan bahwa jika kedua enzim ini tidak ada, maka hasil rekombinan berkurang hingga ratusan kali lebih sedikit (Watson, dkk, 1987). Kombinasi kedua aktivitas itu memunculkan DNA unting tunggal yang mempunyai suatu ujung bebas dan kondisi inilah yang mendorong enzim recA mulai melaksanakan reaksi perpasangan. Enzim recBC mulai melakukan pembukaan lilitan hanya pada DNA yang memiliki ujung dupleks bebas. Setelah berikatan, enzim recBC memanfaatkan energy ATP untuk bergerak sepanjang dupleks sambil membuka lilitan DNA maupun melilitkannya kembali. Selama pergerakan itu selalu ada segmen DNA yang terbuka dan terlihat sebagai dua lengkung unting tunggal. Aktivitas nuclease yang dimiliki oleh enzim recBC yang bekerja selama membuka lilitan DNA sangat penting fungsinya bagi rekombinasi.

Gambar enzim recBC mengadakan unting tunggal untuk rekombinasi Enzim recBC paling sering mendorong terjadinya rekombinasi pada DNA yang mengandung tapak yang disebut Chi, yang memiliki urutan 5-GTCGGTGG-3. Pada DNA yang sedang terbuka lilitannya, suatu aktivitas nuclease spesifik dari enzim recBC memotong unting tunggal DNA di dekat tapak Chi yang sedang terbuka. Terputusnya DNA itu menyebabkan unting tunggal DNA tidak melilit kembali pada saat enzim recBC bergerak menyusuri unting DNA. Sehingga terbentuk suatu untaian unting tunggal berujung bebas maupun suatu celah, dan justru pada celah serta ujung bebas unting tunggal DNA ini kemudian enzim recA berikatan mulai mendorong terjadinya pertukaran unting DNA dengan suatu pasangan yang homolog. Di samping recA, recB, dan recC ada juga beberapa gen lain yang produknya dibutuhkan untuk terjadinya rekombinasi yang efisien, sekalipun fungsi khususnya belum diketahui. Satu enzim lain yang ikut berperan pada proses rekombinasi yang homolog adalah enzim nuclease maupun beberapa protein yang diperlukan dalam sintesis DNA. Enzim nuclease memotong sambungan Holliday sehingga memisahkan molekul DNA rekombinan. Contoh protein pada sintesis DNA antara lain protein SSB, enzim polymerase DNA, dan DNA ligase. Enzim pada insersi ke dalam genom E. coli yang terjadi melalui rekombinasi Fag mengkode enzim integrase yang berperan pada saat insersi DNA fag ke dalam genom E. coli, yang terjadi melalui rekombinasi pada tapak-tapak spesifik yaitu attP (padagenom fag ) dan attB (pada genom E. coli). Hasil insersi melalui rekombinasi ini adalah terbentuknya

satu molekul sirkuler baru yang lebih besar. Insersi genom fag ke dalam genom E. coli juga membutuhkan protein IHF (Integration Host Factor) dan ion magnesium.

Gambar insersi fag ke dalam genom E. coli melalui rekombinasi spesifik tapak Enzim integrase dapat berperan sebagai suatu enzim topoisomerase. Dalam hal ini, enzim integrase membuat suatu pemutusan dalam posisi menyamping, dengan jarak tempat yang terpotong 7 nukleotida. Pemutusan unting DNA terjadi pada tapak attP maupun tapak attB (jika rekombinasi melibatkan genom fag maupun genom bakteri). Tapak attP terdiri dari 250 pasang nukleotida sedangkan tapak attB terdiri dari sekitar 20 pasang nukleotida. Baik enzim integrase maupun protein IHF berikatan pada posisi yang berbeda sepanjang tapak attP. Kebanyakan daerah inti tapak attB maupun attP terdiri dari 15 pasang nukleotida. Jika urut-urutan inti pada tapak attP ataupun attB mengalami perubahan sendiri-sendiri, laju rekombinasi sangat berkurang, tetapi jika perubahan yang terjadi pada tapak attP maupun attB identik, rekombinasi masih berlangsung efisien (Watson, dkk, 1987). Hal ini menunjukkan bahwa enzim integrase membutuhkan suatu homologi urut-urutan pada daerah inti seperti halnya urut-urutan khas yang merupakan tempat perlekatannya. Bila profag diinduksi untuk tumbuh, maka keadaannya akan beralih dari terintegrasi melalui peristiwa eksisi, di mana DNA fag maupun bakteri terlepas dan bebas satu sama lain. Profag memulai eksisi dengan mengekspresikan protein eksionase yang memungkinkan enzim integrase mengkatalisis rekombinasi yang melibatkan tapak-tapak perlekatan hybrid dari profag. Kemudian gabungan enzim integrase dan eksionase berikatan erat pada tapak hybrid bakteri profag dan mendukung kemampuan enzim melaksanakan reaksi yang sebaliknya (reverse).

Pertanyaan

1. Bagaimana peranan protein recA dalam perbaikan DNA? Jawab: Protein recA juga memegang peran dalam perbaikan DNA yang diaktivasi oleh DNA unting tunggal. Protein recA memiliki aktivitas proteolitik yang memotong sekurang-kurangnya dua macam molekul repressor, yaitu repressor profag , dan produk gen lex A yang mengatur tingkat ekspresi gen recA maupun sejumlah gen yang terlibat dalam mekanisme perbaikan DNA serta fungsi survival yang disebut fungsi SOS. Meningkatnya produksi protein recA juga membantu pemulihan sel dengan cara memperantarai perbaikan oleh rekombinasi daerah yang rusak dan tidak rusak dari molekul DNA turunan pasca replikasi. 2. Jelaskan proses rekombinasi yang didorong oleh enzim recBC pada tapak Chi! Jawab: Enzim recBC mendorong terjadinya rekombinasi pada DNA yang mengandung tapak Chi, yang memiliki urutan 5-GTCGGTGG-3. Pada DNA yang sedang terbuka lilitannya, suatu aktivitas nuclease spesifik dari enzim recBC memotong unting tunggal DNA di dekat tapak Chi yang sedang terbuka. Terputusnya DNA itu menyebabkan unting tunggal DNA tidak melilit kembali pada saat enzim recBC bergerak menyusuri unting DNA. Sehingga terbentuk suatu untaian unting tunggal berujung bebas maupun suatu celah, dan justru pada celah serta ujung bebas unting tunggal DNA ini kemudian enzim recA berikatan mulai mendorong terjadinya pertukaran unting DNA dengan suatu pasangan yang homolog. 3. Jelaskan peralihan keadaan profag dari keadaan terintegrasi melalui proses eksisi! Jawab: Bila profag diinduksi untuk tumbuh, maka keadaannya akan beralih dari terintegrasi melalui peristiwa eksisi, di mana DNA fag maupun bakteri terlepas dan bebas satu sama lain. Profag memulai eksisi dengan mengekspresikan protein eksionase yang memungkinkan enzim integrase mengkatalisis rekombinasi yang melibatkan tapak-tapak perlekatan hybrid dari profag. Kemudian gabungan enzim integrase dan eksionase berikatan erat pada tapak hybrid bakteri profag dan mendukung kemampuan enzim melaksanakan reaksi yang sebaliknya (reverse).