AO DE LA INTEGRACIN NACIONAL Y EL RECONOCIMIENTO DE NUESTRA DIVERSIDAD

Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica

SEMINARIO DE MICROBIOLOGA MDICA

TEMA: PLSMIDOS Y TRANSPOSONES

DOCENTE: Dra. Ysabel Massironi Palomino Alumno:
GMEZ MARTNEZ, LUIS MIGUEL. CICLO: V ICA-PER 2012

Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin

INDICE

PLASMIDOS

Definicin Clasificacin Aplicaciones Extraccin del ADN plasmidico Episoma

TRANSPOSONES

Historia Genes saltarines de la bacteria Definicin y Clasificacin Mecanismos de Accin de Transposicin Retrotransposones
Importancia

Plsmidos y Transposones

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INTRODUCCIN
Los mecanismos de resistencia bacteriana muestran una elevada sofisticacin bioqumica y gentica, limitando seriamente la utilidad de la terapia antiinfecciosa. El hallazgo de determinantes de resistencia con propiedades similares en organismos y ecosistemas notoriamente distantes sugiere la ocurrencia de un flujo gentico entre clulas de diferentes comunidades microbianas. En efecto, los genes que confieren resistencia a ciertos antibiticos, en bacterias

filogenticamente no relacionadas, demuestran ser idnticos, incluso en bacterias Gram positivas y Gram negativas.Se han identificado varios elementos genticos que participan en la transferencia de genes de resistencia, de los cuales los ms conocidos son los plsmidos autotransferibles o movilizables. Tambin se incluyen los transposones conjugativos y no conjugativos, el ADN de bacterifagos y, ms recientemente, los integrones y cassettes genticos de resistencia. La

transferencia de estos elementos entre diferentes bacterias puede ocurrir por conjugacin, transformacin o transduccin, procesos bsicos de transferencia de genes entre bacterias.

Es por eso que en la actualidad, es bien conocido el rol de plsmidos y transposones en la multirresistencia de las bacterias a los antibiticos y en la diseminacin natural de los determinantes de resistencia.

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PLASMIDOS

Definicin:

Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, circular y generalmente de pequeo tamao que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosmico. A diferencia de ste, los plsmidos no son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero pueden contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibiticos, a metales etc. Algunas clases de plsmidos poseen adems la propiedad conocida como "replicacin relajada", esto es, estn presentes en forma de muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificacin. Los plsmidos poseen un inters singular en Ingeniera Gentica por ser uno de los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (denominado entonces "inserto") se denomina molcula de vector recombinante. Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido ideal debe poseer al menos tres caractersticas: 1) Debe tener su propio origen de replicacin y por tanto la capacidad de replicacin autnoma independiente del genoma del hospedador. 2) Debe tener sitios de clonacin mltiple que permitan la apertura del DNA con enzimas de restriccin y hace posible la clonacin de insertos de DNA en la forma y orientacin determinada. 3) Debe poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar las clulas hospedadores que contengan el vector. La mayora de los plsmidos

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales. La presencia en el plsmido del gen de resistencia a ampicilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plsmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibitico (el gen de resistencia codifica una beta lactamasa, enzima que degrada la ampicilina). La mayora de los plsmidos usados en Biologia Molecular contienen el sitio de clonacin mltiple dentro el gen de la -galactosidasa lo que permite la interrupcin e inactivacin de este gen cuando un DNA inserto se clona en esta regin. En medios de cultivo que contengan el anlogo de la lactosa X-gal, esta estrategia permite distinguir las colonias bacterias que contienen el vector recombinante (con inserto) de aquellas que han recibido un vector no recombinante (sin inserto). Las bacterias que reciben el vector recombinante no pueden utilizar lactosa ni su anlogo y formar colonias blancas. Las bacterias que reciben un vector no recombinante s pueden utilizar la lactosa o su anlogo y formarn colonias azules.

Clasificacin:

Se pueden clasificar de acuerdo a sus propiedades de transferencia y al fenotipo que manifiestan: 1. Propiedades de Transferencia

a. Plsmidos Conjugativos: Los plsmidos conjugativos son aquellos que son los mediadores del proceso de la conjugacin. Estos plsmidos usualmente son grandes, tienen todos los genes necesarios para una replicacin autnoma y para la transferencia del DNA hacia una clula receptora (ej. Genes para el pilus sexual).
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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin b. Plsmidos No conjugativos: Los plsmidos no conjugativos son aquellos que no pueden mediar el proceso de la conjugacin. Estos son plsmidos usualmente ms pequeos que los plsmidos conjugativos y carecen de uno o ms de los genes necesarios para la transferencia del DNA. Un plsmido no conjugativo puede transferirse por conjugacin si la clula tambin alberga a un plsmido conjugativo.

2. Efectos en el fenotipo

a. Plsmido de Fertilidad (factor F): Los cuales contienen tra-genes, son capaces de conjugarse.

b. Plsmidos Bacteriocinognicos: Estos plsmidos poseen genes que codifican para substancias que matan a otras bacterias. Dichas substancias se llaman bacteriocinas o colicinas.

c. Plsmidos de Resistencia (factores R): Estos plsmidos acarrean genes de resistencia a los antibiticos.

i) Origen: El origen de los factores R no se conoce. Es probable que hayan evolucionado con otros propsitos y que el advenimiento de la era de los antibiticos haya proporcionado una ventaja selectiva para su amplia

diseminacin.

ii) Estructura: Los plsmidos R son plsmidos conjugativos en los cuales los genes para la replicacin y la transferencia se localizan en una parte del factor R y los genes de resistencia estn localizados en otra parte del mismo.

RTF (Resistance Transfer Factor): Acarrea los genes de transferencia.

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Determinante R: Acarrea los genes de resistencia. Los genes de resistencia frecuentemente forman parte de transposones.

Mecanismo de accin de los genes de resistencia:

a) Modificacin (detoxificacion) de antibiticos - ej. La enzima -lactamasa b) Alteracin del sitio blanco - ej. Resistencia a la estreptomicina c) Alteracin de la incorporacin- Resistencia a la Tetraciclina d) Substitucin de una ruta sensible - ej. Una nueva ruta de sntesis del acido flico como mecanismo de resistencia a las drogas conocidas como sulfas

Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales. Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria, debido a la divisin celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.

Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte Postsegregacional (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto un veneno de larga vida y un antdoto de vida corta. Las clulas hija que retienen una copia del plsmido sobreviven, mientras que una clula hija que falla al integrar el plsmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo de la clula padre.

Aplicaciones:
Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de gentica e ingeniera bioqumica, donde son comnmente usados para multiplicar (hacer muchas copias de) o como genes particulares

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin expresos. Muchos plsmidos estn disponibles comercialmente para dichos usos:

Prevencin de enfermedades: Los plsmidos se usan para realizar vacunas de ADN a gran escala: Vacunas contra TBC, SIDA y malaria, que en la actualidad, son muy costosas o para las que aun no existen vacunas, por lo que seran ms seguras y ms baratas.

Terapia Gnica: Se introducen genes en las clulas del cuerpo humano. Estos genes al replicarse codifican y realizan una accin teraputica, como el tratamiento de enfermedades hereditarias

monogenicas o adquiridas como la monofilia, fibrosis cstica, cncer, problemas vasculares y desordenes neurolgicos.

Produccin de antibiticos: El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene genes que hacen clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso siguiente el plsmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformacin. Luego,

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin la bacteria es expuesta a un antibitico particular. Solo la bacteria que toma copias del plsmido sobrevive al antibitico debido a que el plsmido lo hace resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer protena) y la protena expresada evita la accin del antibitico. De esta forma, los antibiticos actan como un filtro que seleccionan nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el plsmido de inters puede ser aislado.

Extraccin del ADN plasmidico:

Si bien existen kits comerciales para preparar DNA plasmdico, la realizacin de este protocolo se considera formativo, sencillo y permite obtener de modo rutinario DNA plasmdico con un grado de pureza aceptable. El material que entre en contacto con el cultivo de bacterias deber desecharse en un recipiente con leja.

1. Se toma 1 ml del cultivo de bacterias y se centrifuga en un tubo eppendorf durante 2 min (14000 rpm). Se elimina el sobrenadante por inversin del tubo o con ayuda de una pipeta, dejando el sedimento lo ms seco posible. 2. Se resuspende el sedimento de bacterias en 250 l de tampn de resuspensin empleando una pipeta (aspirar y expulsar el lquido varias veces sobre el sedimento hasta que desaparezca ste). Se incuba 2 min a temperatura ambiente.

3. Se aaden al tubo 250 l de la solucin de desnaturalizacin NaOH/SDS. Se agita el tubo por inversin suave (observar el aspecto y viscosidad de la disolucin). Posteriormente se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. 4. Se aaden a continuacin 300 l de acetato potsico 3 M y se mezcla el contenido del tubo (observar el aspecto del tubo, aparecer una turbidez blanca al precipitar las protenas y el DNA cromosmico). Se incuba 10 min en hielo.

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin 5. Se centrifuga 10 min (14000 rpm). 6. Con ayuda de una pipeta se transfiere cuidadosamente la fase acuosa sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo. Si la fase acuosa no est suficientemente limpia, y contiene restos del precipitado blanco, volver a centrifugar los tubos. 7. En este sobrenadante se encuentra RNA y el DNA plasmdico. Estos cidos nucleicos se precipitan con 2 volmenes de etanol absoluto fro. Mezclar bien por inversin y guardar a -20C durante al menos 20 min (congelador). 8. Pasado este tiempo, se centrifuga durante 30 min a 14000 rpm. 9. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El precipitado se lava de nuevo con 0,5 ml de etanol 70% fro (20 min, centrifugacin). 10. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El precipitado casi invisible, que contiene DNA plasmdico y RNA, se debe secar completamente para eliminar los restos de etanol que pueden interferir con procesos posteriores. El precipitado se disuelve en 25 l agua estril. 11. Finalmente se aaden 0,5 l de una solucin de RNasa (1 g/ml) y se incuba 20 min a temperatura ambiente. Este tratamiento con RNAasa degrada el RNA quedando una preparacin purificada de DNA plasmdico. Una alternativa a este paso es incluir la RNasa en el tampn inicial de resuspensin o tampn de lisis

RESULTADOS ESPERADOS El mtodo empleado para la obtencin del plsmido se denomina de "lisis alcalina": se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del DNA cromosmico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmdico permanece intacto debido principalmente a su pequeo tamao y su naturaleza circular y superenrollada.
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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin El tratamiento con alta concentracin de sal (acetato potsico) y SDS produce la precipitacin de gran parte de las protenas. El tratamiento con RNasa elimina la contaminacin de RNA que puede ser importante. La purificacin del DNA plsmidico se completa entonces por precipitacin con etanol. Es posible obtener DNA plasmdico con diferente grado de

superenrrollamiento que se puede visualiza tras la separacin por electroforesis y tincin con BrEt.

Episoma:

Un episoma es un factor gentico bacteriano que puede encontrarse como elemento aislado en el citoplasma o como parte integrante del cromosoma. El factor F es un episoma porque lo encontramos tanto como plsmido (en el citosol) como integrado en el cromosoma.

Transposones

Historia

Los descubre Barbara Mc Clintock en la dcada de los 40-50, en el genoma del maz. Son elementos del genoma del maz que tenan la capacidad de movilizarse favoreciendo la aparicin de determinados fenotipos.

Genes saltarines de la bacteria

Los elementos transponibles son segmentos de ADN capaces de moverse desde una posicin a otra en el genoma. Es decir que pueden transponerse o saltar desde un sitio determinado del genoma, separndose del resto del ADN, hasta otro sitio distinto al cual se integran.

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin Tambin pueden transponerse desde el cromosoma a un plsmido o viceversa o a distintos sitios dentro de la misma molcula de ADN. Los elementos transponibles estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, tanto en virus, como en clulas procariotas y eucariotas. Existen dos tipos de elementos transponibles: las secuencias de insercin (elementos IS) y los transposones (Tn).

Los elementos IS son segmentos pequeos de ADN, de aproximadamente 1 a 2 Kb que contienen la informacin gentica mnimamente necesaria para la transposicin. Poseen secuencias especficas en ambos extremos del fragmento que consisten en repeticiones invertidas una respecto de la otra. Estas secuencias, son reconocidas especficamente por enzimas codificadas en el mismo elemento IS, denominadas transposasas, responsables de la integracin del elemento al sitio blanco del genoma.

Los Tn son segmentos de ADN que adems de portar la informacin necesaria para la transposicin, contienen genes que pueden codificar diferentes propiedades fenotpicas. Dentro de stas se destaca la resistencia a ciertos antibiticos, como es el caso de la resistencia de alto nivel a la gentamicina que tienen algunas cepas de Enterococcus sp. Algunos plsmidos poseen uno o mas Tn que portan determinantes de resistencia a antibiticos; la capacidad de estos elementos para transponerse de un plsmido a otro, proporciona a la bacteria gran flexibilidad para desarrollar resistencia, dado que dichos plsmidos son generalmente conjugativos, por lo que pueden transferirse entre distintas bacterias.

La insercin de un elemento transponible puede producir diferentes efectos sobre la expresin de la informacin gnica como impedir la funcionalidad de un gen o activar la expresin de otro.

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Definicin y Clasificacin:

Los transposones (genes que saltan) son unos elementos genticos mviles que pueden transferir ADN de una posicin del genoma o entre distintas molculas de ADN dentro de una misma clula (p.eje. el de un plsmido a otro o de un plsmido a un cromosoma. Los transposones se detectan tanto en los eucariotas como en los procariotas. Los transposones ms simples se conocen como secuencias de insercin y su longitud comprende de 150 a 1500 pares de bases con repeticiones invertidas de 15 a 40 pares de bases y la informacin gentica mnima necesaria para su propia transferencia, es decir, el gen que codifica la transposasa. Los transposones complejos contienen otros genes, como genes que proporcionan resistencia a antibiticos. En ocasiones, los transposones se introducen en el interior de los genes y los inactivan. Si la insercin e inactivacin tiene lugar en un gen encargado de codificar una protena esencial, la clula muere. Algunas bacterias patgenas utilizan un mecanismo semejante para coordinar la expresin de un sistema de factores de virulencia, Los genes de actividad pueden agruparse en un islote de virulencia o patogenicidad rodeado por unos elementos mviles semejantes a los transposones que les permiten moverse tanto en el interior del cromosoma como hacia otras bacterias. Cualquier unidad gentica puede reaccionar ante la presencia de un estmulo ambiental como mecanismo de de coordinacin de la expresin de un proceso complejo.

Secuencia de Insercin:
una secuencia central con

Contienen

informacin para la transposasa, una enzima

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin necesaria para la transposicin, y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso. Esta secuencia repetida en orden inverso no es necesariamente idntica, aunque muy parecida. Cuando un transposn simple se integra en un determinado punto del ADN aparece una repeticin directa de la secuencia diana (5-12 pb).

Transposones compuestos: Constan de

una regin central rodeada por dos IS, esta regin central contiene genes bacterianos, frecuentemente loci de resistencia a

antibiticos. stos son los ms conocidos, pero tambin hay muchos ms. En principio, siempre que dos copias de una IS se situen relativamente cerca se forma un transposn compuesto, ya que el conjunto de las IS y la secuencia central puede funcionar como una unidad. Los elementos IS de los extremos pueden ser iguales o diferentes, tener la misma o diferente orientacin, o parecerse a otros IS conocidos. La estructura de los transposones compuestos es muy simplista porque en casos naturales una de las dos IS es inactiva.

Transposones TnA: Por ejemplo el Tn3 pertenece a la familia TnA: Su

tamao es aproximadamente igual a 5 Kb, tiene a los extremos secuencias ITR, adems tiene un gen que codifica para la transposasa, tiene un segundo que gen

codifica

para la enzima resolvasa, producto el de

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin este gen repite la transposicin. Y tiene un gen para la resistencia a antibiticos. Ejemplo: en E. Coli el factor F utiliza los IS para integrarse en el cromosoma principal de la bacteria. Adems el cromosoma principal de la bacteria tiene muchos IS donde el factor F se integra. Esto sirve para que una bacteria Hfr que se conjugue con una bacteria Hfr - intercambiando distintos genes. De modo que no se intercambia siempre los mismos genes.

Bacterifagos: Por ejemplo el transposon : Presenta ciclo ltico y

lisognico. El profago se inserta dentro del genoma de bacterias, pero no como una combinacin especfica sino que se integra al azar por un mecanismo transposicional. Cuando se reproduce lo hace por transposicin replicativa en la que cada copia de se inserta en otra parte del cromosoma bacteriano. Por lo tanto, es un transposn que pasa de tener genes que embalan su ADN como genes que regulan su transposicin.

Mecanismos de Accin de Transposicin:

Modelo replicativo: Se hace una copia, y esta se introduce en el receptor permaneciendo intacta la secuencia que se copia.

Modelo no replicativo:
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No conservativo: La situacin original es que tenemos un transposn y otro que no lo tiene. El transposn se escinde y el receptor lo recibe, quedando un hueco en el donante. Puede suceder que se repare o no.

Conservativa: El transposn se escinde pero no deja huecos, y el elemento gentico se inserta en otro sitio.

Retrotransposones:

Slo contienen

genes para la transcriptasa inversa y pueden transponerse. Se mueven en el genoma siendo transcritos a ARN y despus en ADN por retrotranscriptasa. A su vez, se clasifican en los de origen

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Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin retroviral (retrotransposones con LTR) y de origen no retroviral

(retrotransposones sin LTR).

Importancia:

Los transposones son segmentos de ADN con la capacidad de moverse a lo largo del genoma. Esta caracterstica de los transposones puede explotarse para utilizarlos como vectores de genes para la manipulacin del genoma. Los transposones pueden usarse como vectores para realizar transgnesis de clulas somticas y de lnea germinal y en la generacin de mutantes tanto con prdida de funcin como con ganancia de funcin. Adems los transposones pueden cobrar una gran importancia en las aplicaciones clnicas de terapia celular ya que permiten transferir genes a clulas madre. Las nuevas tecnologas basadas en transposones aportan la posibilidad de generar libreras de knockouts de genes especficos en modelos experimentales de enfermedades humanas en especies para las que no existe otro sistema de generacin de knockouts. Esto permitir estudiar mejor nuevas terapias en las especies cuyo modelo de enfermedad se acerca ms a la enfermedad humana. Los recientes avances en la reprogramacin hacia iPSCs podran facilitar la identificacin de los determinantes genticos involucrados en rutas fisiolgicas o patolgicas en clulas derivadas de pacientes con enfermedades genticas especficas. Las tecnologas basadas en transposones tienen un enorme potencial en el desarrollo de herramientas genmicas que posibiliten la conexin de la fisiologa y la gentica a nivel prctico.

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Bibliografa

Microbiologa de Murray

http://blogs.verleyen.fr/martha/files/2008/02/plasmidos.pdf http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S003498872004000500013&script=sci_arttext&tlng=en http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/18966/Capitulo2.pdf http://www.cienciaybiologia.com/bgeneral/organizacion-materialgenetico.htm http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/39%20AISLAMIENTO%20Y%20PURIFICACI%C3%93N%20DEL %20DNA%20DE%20UN%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/GeneticaBacteriana.pdf http://bioinformatica.uab.es/biocomputacio/treballs0001/Tarancon_Gemma/transposones_procariticos.htm http://www4.ujaen.es/~tpalome/Tema%2023.%20Transposones%20de%20 procariotas.pdf http://cienciadelatierra.wordpress.com/especiales/formasacelulares/transposones/

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