Replikasyon,Telomeraz

DNA REPLKASYONU
DNA moleklnn eini oluturarak ogalmasna replikasyon denir.. DNA kendini eleyebilen yegane biyomolekldr Replikasyon komplementerlik ilkesine dayanr. Kaltsal bilgi hcre blnmesi sonunda eksiksiz olarak ,eit paylarda yeni kuaklara aktarlr

Genetik materyal DNA yaps Semikonservatif replikasyon DNA replikasyonu Replizom:replikasyon makinesi Replikasyon balangc,uzama,sonlanma aamas Telomeraz

 Nkleotidlerin fosfodiester balar ile birbirine balanmas sonucu polinkleotidler meydana gelir. Polinkleotidler poliribonkleotidler (RNA),polideoksiribonkleotidler(DNA) olarak ayrlr. Fosfodiester balar bir nkleotidin eker moleklnn 5-OH grubu ile dier nkleotidin seker grubunun 3-OH grubu arasnda oluur.bylece bir nkleotidin bir ucunda serbest 5_fosfat grubu diger ucunda 3_OH grubu bulunur.

eker-P omurgas ve 3D yaps Antiparalel zincirler mavi ile gsterilmitir bazlar aras H balar A-T arasnda 2 G-C arasnda 3 ba bulunur.
3.34nm Helixin bir dn

Bazlar aras mesafe 0.334nm (3.34Angstrom)

eker ve bazdaoluan birim nkleozid olarak adlandrlr. Fosfodiester ba iki komu deoksiriboz arasndadr.

Replikasyon

 lk kez Meselson ve Stahl (1958) deneyleri ile DNA nn yar koruyucu tipte bir replikasyon gerekletirdiini kantlamlardr.

DNA replikasyonunda double heliksin iki zinciri ayrlr ve herbir zincir kalp grevi grerek semikonservatif modelde replikasyonu salar

Bugn kabul gren gre gre DNAnn replikasyonu semikonservatifdir; bir DNA moleklnn iki kolundan her biri yeni bir DNA kolu sentezi iin bir kalp olarak grev grr ve sonuta meydana gelen iki yeni DNA molekl yeni ve eski kollar ierirler

 DNA zincirlerinin herbiri dierinin tam komplementer ei olduundan herbir zincir yeni DNA zincirinin sentezi iin kalp olarak grev alr

 Replikasyon spesifik balama noktasna sahiptir ve byme tek bir ynde 5---3 ynde ilerler. Replikasyon,balama,uzama ve sonlanma aamalarndan oluur. Primer olarak sentezlenen molekl genellikle modifiye edilir.(Metilasyon)

DNA sentezini gerekletiren enzim DNA polimeraz

 1959 arthur kornberg ve arkadalar DNA sentezini gerekletiren enzim( DNA polimeraz) izole etti Enzim dNTPleri byyen tek zincirli DNAnn 3 ucuna atasal zinciri kalp olarak kullanarak eklemektedir. Sbstratlar dNTPlerdir. E.colide 3 tip pol vardr DNA pol I, II, ve III

DNA polimerazlar
lk tanmlanan DNA polimeraz I dir.Asl replikasyon enzimi DNA polimeraz IIIdr, Primere,Mg iyonuna,DNA kalbna,dNTP lere ihtiya duyar. DNA polimerazn oluturduu DNA zinciri 5-OH den 3-OH uzar

Prokaryotlarda DNA polimerazlar

DNA polimeraz eitleri(Prokaryot)

Polimerlemedeki 35 5---3 Etkinlik eksonkleaz etkinlik ----------------------------------------------DNA poli.1 + + DNA poli 2 + DNA poli3 + -

Eucaryotlarda DNA polimerazlar

DNA polimerazlar(karyotlar)
5farklDNA polimeraz,alfa,beta,gama,delta ve epsilon tanmland Poli. gama mitokondri DNAsentezini Alfa,delta,epsilonblnenhcrelerdesentez Betablnen blnmeyen hc.DNAonarm

 Maya DNA pol I, II, III pol , ve edeerdir, I ve III hcrenin yaamn srdrmesi iin nemlidir beta onarmda grev alr FEN1 karyotlarda RNA primerini uzaklatran 5-3exonkelaz aktivitesine sahip enzimdir.E.coli DNA pol I enzimine benzer

DNA Replikasyonunun Temel Mekanizmalar:

Hem prokaryotik hemde karyotik hcrelerde replikasyonun temel mekanizmalar ayndr. Replikasyon balang noktalarnn tayini DNA ift ipliinin znmesi Replikasyon atalnn olumas

E.Coli kromozomunda dairesel ekilli DNA moleklnn replikasyonu be aamada gerekleir: 1) Parental ift heliksin almas.

2) Bir oligonkleotid primerinin sentezi. 3) DNA zincirinin 5 3 ynnde bymesi.

4) Primerin karlmas. 5) Yeni sentez edilen DNA zincirinin birlemesi

Replikasyon balang noktalarnn tayini:

Bir orijinden bir replikasyon baladktan sonra replike olan DNA nn uzunluguna replikon denir. Prokaryotlarda embersel DNA da bir balang,vede zt ynlere dogru hareket eden 2 replikasyon atal bulunur.replikasyon E.Coli 30 dak(.4x10zeri alt.bp). karyotik hcrede ise ok sayda balang ve biti noktalar bulunur

Replikasyonun orijin noktas

Pro ve karyotlardaki replikasyon belirli bir noktadan (orijin) balar

E.Coli replikasyonu ve bu noktaya oriC ad verilir ve iki ynde ilerler. DnaA kutusu denen 13b lik blgeye DnaA proteininin balanmas replizom oluumundaki ilk evredir. A ve T nt lerince zengin blgede DnaAnn balanmas burann almasna neden olur. Alma ilerledike daha fazla DnaA tek zincirli DNAya balanr. DnaA oriCyi kapladnda iki tane helikaz (DnaB proteini) balanr ve 53 ynnde kaymaya balar ve replikasyon atalnda heliksi amaya balar.

DNA pol III holoenzim ve primaz protein-protein etkilemlerini kullanarak replikasyon atalna balanr sentez balar.

 Birbirinden uzaklaan her iki yne hareket eden replikasyon atallar(2 adet) yar sakl replike olduktan sonra ter olarak adlandrlan sonlanma blgesinde

 Balang noktalar zel nukleotid dizilerinden oluur ( A ve T den zengin tekrarlayan nukleotid dizileri) ve diziye zel olan DNA ya balanan proteinler = balatc proteinler tarafndan tannr. Bu proteinlerin balang noktalarna balanmas ile replikasyonun ilk adm atlr.

Prokaryotlardaki ve karyotlardaki replikasyon orijinleri (bakteri-maya)

Saccoromyces cerevisia da;

Replikasyon orijin noktalarnda 11 nukleotidlik bir dizinin tekrar saptanmtr. (A veya T)TTTAT(A veya G)TTT(A veya T)

 Replikasyonun olduu noktada sarmala ait zincirlerin almasyla ortaya kan yap Replikasyon ataldr.

Replikasyon ift ynl ise orjinden itibaren zt yne doru ilerliyen iki replikasyon atal meydana gelir.

DNA ift ipliinin znmesi

Replikasyonun balyabilmesi iin DNA ift zincirinin sarmal yapsnn zlmesi gereklidir. zlme ilemi balatc protein kompleksinde yer alan DNA helikazlar ile gerekletirilir.

Replikasyon atalnn olumas

Helikaz aktivitesi ile alan ift zincirde replikasyonun olduu blgeye replikasyon atal denir.

 karyotiklerde her bir balang noktas arasnda 30-300 kilobazlk bir mesafe bulunur. (1 kilobaz=1000 baz).3x10zeri dokuzbp.30.000replikasyon orjini

Replikasyon atalnda replikasyonda i gren 4 temel yap vardr; DNA helikaz, DNA sarmaln zen enzim Primaz, DNA sentezinin balyabilmesi iin gerekli olan RNA primerlerini (RNA ncl molekl) sentezleyen enzim DNA Polimerazlar, kalp zincire komplamenter yeni DNA zincirini sentezleyen enzim Tek zincire balanan (SSB) proteinler, replikasyon atalnn srekliliini saglayan ,tek DNA ipliine balanarak katlanmay nleyen proteinler

Helikaz denen bir enzim, replike olacak DNA ift heliksinin kvrmlarn aar. entikleyici ve yeniden kapatc enzimlere DNA topoizomerazlar denilir Bir defa DNA kvrm aldktan sonra primaz denen spesifik bir RNA polimeraz, kromozom DNAsnn replikasyonunun balangcn temsil eden zel bir blgesini tamamlayc ve primer RNA veya nc RNA denen ksa bir RNA eridi sentez eder DNA ift heliksi atallanma noktasnda aldktan ve primaz aamalar tamamlandktan sonra DNA polimerazlarn etkisiyle uygun deoksinkleozid trifosfatlardan (dNTP) deoksinkleozid monofosfatlarn (dNMP) giriiyle DNA polimerizasyonu balar ve devam eder

Replikasyonun Balama ve Uzama aamas

Balang aamas
Primer yada balatc RNA zincirine ihtiya vardr. Eleme bu ksa zincirin 3OH gurubuna DNA polimeraz tarafndan fosfodiester bag ile ilk deoksiribonkleotid-5monofosfatn eklenmesiyle balar.

 Sentez esnasnda iki fosfat grubu kopar,5c bal olan fosfat grubu diger nkleotidin d-ribozunun 3-OH grubuna kovalent olarak balanr. Bylece zincir uzamas 5---3ynnde devam eder.

Zincirlerin uzamas hem proteinlerde hemde nkleik asitlerde monomerik birimlerin birer birer eklenmesiyle

gerekleir

DNA replikasyon yn (yeni sentezlenen zincirin yn) 5 3 ucuna dorudur

Okazaki paralar sentez edildikten sonra DNA polimeraz Iin 53 ekzonkleaz aktivitesi vastasyla RNA primeri karlr; DNA ligaz, kalan entikleri kapatr

Replikasyon atal DNA sentezinde heliks boyunca ilerler Kesintisiz zincir sentezi duraksamadan replikasyon atal ynnde gerekleir

Kesintili zincir sentezi ters ynde ilerler ve replikasyon atalndan uzaklaarak zincirbyr.okazaki fragmentleri 1000-2000bp dir

E.coliden izole edilen eit DNA polimeraz vardr. Bir E.coli hcresi, yaklak 400 molekl DNA polimeraz I, 40 molekl DNA polimeraz II ve 10 molekl DNA polimeraz III ierir Bilinen btn DNA polimerazlar zincir uzamasn zellikle 53 ynnde katalize ettiklerinden zincir uzamas, nc erit denen eritte devaml olurken geciken erit denen dier eritte kesintili olur

Geciken erit zerinde oluan kk polinkleotid paralarna okazaki paralar denmitir; bunlar, DNA replikasyonunda ara rnlerdir

 Kesikli DNA zincirlerinin oluumunu deneysel olarak gsteren Okazaki ve Ark.(1968) dan dolay bunlara Okazaki Paralar ad verilmitir. (karyotlarda 1-3kb lk paralar) Her bir Okazaki parasnnda balangcnda RNA primerleri bulunmaktadr.

 DNA pol IIIRNA primerlerinin ucuna yeni DNA ile uzatr

DNA pol I komu fragmentlerin 5 ucundaki RNAlar uzaklatrr ve boluu doldurur. Primaz DNAdan kopyalad ksa RNA primerleri sentezler DNA ligaz komu fragmentleri birletirir.

 Replikasyon ilerledike RNA primerleri kesilip karlr ortaya kan bo alanlar DNA polimerazlar tarafndan kalp DNA ya uygun olarak sentezlenir ve iki DNA ucu ligaz enzimi ile birletirilerek bir btn DNA iplii oluur. karyotiklerde replikonlarda tamamlanan DNA paralarda yine ligaz enzimi ile birletirilir.

DNA ligaz iki ucu ak DNA zincirlerini yaptran tek enzimdir.

Herbir replikasyon atal saniyede 1000 nt hzda alr.

Pol III ok alt birimli bir yapdr ve enzimin ekirdei katalitik aktiviteye sahiptir ve dier yardmc proteinlerle birlikte (accessory proteins) buna holoenzim ad verilir. Katalitik ekirdein biri kesintili dieri kesintisiz zincir sentezini yapar. Baz yardmc proteinler iki katalitik kor arasnda kpr grevi grerek koordineli biimde kesintili ve kesitntizis sentezi gerekletirir.

Replizom:DNA replikasyon Makinesi

 Polimeraz dimerini Sentez kesintisiz oluturan her bir zincirde srekli monomer ,kalp olarak zincirlerden birine gerekleirken,kesi beta-alt ntili zincir,sentezin birimlerinnin her iki zincirde ayn oluturduu anda devam kskalarla etmesini salamak baglanr. iin ilmekoluturma Ldr.

Yeni bir DNA eridinin sentezi tamamlandktan sonra DNA giraz, replike olmu DNAnn tekrar doal haline kvrlmasna yardmc olur

Replikasyon srasnda nkleozomlarn toplanmas:

karyot ve prokaryotlarda replikasyon semikonservatiftir ve herikisinde de kesintili/siz zincir sentezi vardr.
Replizomdaki bileenler prokaryotlarda 13 karyotlarda 27 tanedir (bugne kadar belirlenmi olan). karyot DNAs ekirdekte kromatin olarak bulunur ve kromatinin temel birimi nkleozomdur.

Sentez srasnda nkleozomlar atasal zincirden ayrlr bir yandan da yeni zincir iin yenileri sentezlenir.
bir yandan eski histonlar rastgele yeni sentezlenen zincirler zerine datlr ve yeni sentezlenen histonlar ise chromatin assembly factor I araclyla gnderilir. CAF1 histonlara balanr ve onlar replikasyon atalna hedefler ve orada yeni sentezlenen DNA ile balanr. CAF1 ve tad histonlar proliferating cell nuclear antigen denen bir proteine balanarak replikasyon atalna ular.

TOPOZOMERAZLAR
DNAnn bir yada her iki ipliinde kesik oluturarak,DNA nn kvrlmasn engeleyen enzimlerdir. Topoizomerazlar,DNAnn 2.yapsn dzenler. Replikasyon,transkripsiyon,paketlenme olaylarnda fonksiyon grr

Bir tr topoizomeraz olan DNA giraz spersarmall yapda kesik oluturur ve replikasyon atal nndeki gerilmeyi azaltr. Sonra kr yeniden onarr.

Topoizomerazlar DNA yapsna spersarmallar ekleyen yada onlar krarak DNA gerilimini azlatan enzimlerdir. Krklar tek yada ift zincirde oluturulabilir.

DNA Repliasyonunda Topoizomerazlar

Replikasyon atalnda ortaya kan Sperkvrmlarn almas-zlmesinde i grrler

topoizomeraz l ;Tip I tek iplikli DNAy keser topoizomeraz ll ;Tip II ift iplikli DNAy keser

Replikasyon doruluu
Replikasyon esnasnda hata oran 10 zeri dokuzla 10 zeri on kadardr. Hidrojen kprlerinin kurulamamas yanl gsterir. Proof reading mekanizmas yanln dzeltilmesi

Bakterilerde replikasyon dngs 2040dk da biter ama karyotlarda 1.4 saat srer.nk sadece birtek kromozomda sentez olmaz. Mayada oriC bakteridekine benzer AT zengin blgeye balang proteinleri balanr ve sentez balar. Yksek yapl organizmalarda orijin tam olarak belirlenmemitir.Ancak bin hatta onbinlerce nt uzunlukta olabilir. Bakteri aksine birok replikasyon orijini bulunur. nsann 23 kromozomunda binlerce replikasyon atal belirlenmitir. Dolaysyla birok orijinden iki ynde birok replikasyon atalnda sentez srer.karyotlardaki DNA sentezi sadece hcre dngsnn S faznda olur.

DNA sentezinin enerjetii

Yksek enerjili Bu reaksiyonun ester ba oluumu geriye enerji tketen bir dnm,pirofosf reaksiyondur.enerji at grubunun pirofosfat grubunun pirofosfataz trifosfattan tarafndan ayrlmasyla aga inorganik fosfata cikan enerjiden dnm ile/Delta salanr. G=-7kcal/mol nlenmi olur.

karyotlarda Replikasyon

 karyotiklerde DNA moleklnn prokaryotlardan daha byk olmas ve histon proteinleri ile kromatin yap oluturmalar nedeniyle farkl sentez aamalar gzlenir.
Bakterilerde sentez hz: 50.000 b/dk Memelilerde sentez hz: 1.000 b/dk

karyotik hcrelerde replikasyon admlar Replikasyon orijin noktalarnn tayini DNA ift ipliinin znmesi Replikasyon atalnn olumas DNA polimeraz aktivitesi, sentez ve uzama Yeni sentezlenen DNA paralarnn birletirilmesi Kromatin yapsnn yeniden oluumu

 Bir replikasyon nitesi iinde , her bir balang noktas birbirinden yaklak 30 000 - 300 000 nukleotidlik aralklarla bulunur. Replikasyon orijin noktasndan balayan ve zt ynde ilerleyen replikasyon atallar replikasyon kabarcklar oluturur.

karyotik DNA da replikasyon orijinleri, 20 ila 80 orijinlik gruplar eklinde (bir replikon=replikasyon nitesi) aktiflenirler. Tm DNA replike oluncaya kadar S faz boyunca yeni replikasyon orijinleri aktiflenmeye devam eder.

 karyotik DNA polimerazlar , , , , ve . : mitokondriumda bulunur . mtDNA replikasyonunda i grr Dierleri nukleusta bulunur. :primaz enzimi ile RNA-DNA paralar. : DNA tamiri. sentezi. : DNA tamiri.

 Polimeraz alfa primaz enzimi ile kompleks halde bulunur.RNA-DNA paralarnn sentezini gerekletirirler Polimeraz delta,RNA-DNA primerleri zerinden kesintili vede kesintisiz iplikleri sentezler Polimeraz delta,primerleri uzaklatrr,vede boluklar doldurur. Ligaz DNA fragmentlerini birletirir.

 DNA replike olduka yeni sentezlenen histonlar ile kromatin eklinde yeniden dzenlenir. Histonlarda hcre siklusunun S faznda sentezlenir.

S faz boyunca ayn kromozomun farkl blgeleri farkl zamanlarda replike olur. Kondens kromatin (heterokromatin) ge S faznda replikasyona urar Aktif kromatin (kromatin) erkan S faznda replikasyona urar rnein; aktif X kromozomu S faz boyunca, inaktif X kromozomu ge S faznda replike olur

Replikasyonun Kontrol
Pozitif kontrol:
ORC (origin Recognition Complex), CdC6 ve Cdt1 aksesuar proteinler MCM (Mini chromosomeMaintainence) Negatif Kontrol:
GemininMCMnin DNAya balanmasnn elgeller

Replikasyon ve kanser tedavisi

Nkleozid analoglar ile DNA sentezinin inhibisyonu Deoksiriboz halkasndan 3- karbonundan hidroksil grubunun kartlmas r: 2,3-didoksinozin Antikanser tedavi: sitozin arabinozid

Replikasyon ve kanser tedavisi

Topoizomeraz inhibisyonu: Etoposide (VP-16): testikler tmrler & kk hcreli akier karsinomasnn tedavisinde

TELOMERAZ
Telomeraz kromozomal ulardaki TTAGGG tekrarlarnn sentezinden sorumlu olan ribonukleoprotein yapda zel bir DNA polimerazdr. Telomeraz; telomeraz RNAs ve telomeraz proteinlerinden oluur.Kendi RNAsn kendi bnyesinde tamas ile dier ters transkriptazlardan ayrlmaktadr.

 Telomeraz enzimi hcre tipine bal olarak her hcre blnmesinde telomer boyunda meydana gelen kayb tamir eder.
Telomeraz enzim aktivitesi;embriyonik hcrelerde,hemapoetik hcrelerde,sa folkllerinde,tamir gren hcrelerde ve stem hcrelerinde yksek oranda olduu belirlenmi olmasna ramen;normal somatik hcrelerde bu aktivitenin hi olmad yada belirlenemiyecek kadar az olduu tesbit edilmitir.

nsan telomeraznn alt birimleri

RNA komponenti (hTR) Reverse transkriptaz (hTERT) Protein komponenti (TP1)

 Telomeraz RNAs Telomeraz RNAs ,telomer DNA tekrarlarna komplementer olan bir diziyi iermektedir.Bu dizi insanda 3-AUCCCAAUC-5 seklindedir. Telomeraz Proteinleri TERT;RNAdan DNA sentezlenmesinde grev alan katalitik proteinlerdir. hTERT;nsanda bulunan telomeraz revers transkriptaz enzimidir.TERT proteini yapsna sahiptir.Telomerazn aktif olmasn salar.Telomeraz inaktif hcrelerde hTERT sentezlenmesi,telomeraz tekrar aktifletirir.

Replikasyon u problemi Telomer-telomeraz

 Telomeraz enziminin iki tip fonksiyonu vardr. 1)kromozom ularnda replikasyonu gerekletirmek 2)kromozom tamiri.Kromozomlarn nontelomerik blgelerinde oluan krk blgelerine telomerik diziler ilave ederek tamir etmektir.ki tip kromozom tamiri bulunmaktadr. geliim esnasnda programlanm kromozom tamiri >mayalardan insana kadar eitli trlerde tanmlanan ve kromozom krklarn takiben kendiliinden oluan kromozom tamiridir.

Telomerazn kanserle olan ilikisi

Ggs karnisomalarn %93 primer akcier karsinomalarn %80 hepatoselller karnisomalarn %85 beyin tmrlerin %66-94 hematolojik karsinomalarn %67-100 endometrial kaesinomalarn %95inde telomeraz aktivitesinin artm olduu belirlenmitir.

 Telomeraz enziminin aktivitesi tmr hcrelerinin oalmas asndan ok nemlidir.Bu zelliinden dolay kanser tedavisinde nemli rol oynamaktadr. >Tedavi yollarndan biri telomeraz aktivitesini durdurmaktr.Fakat bu terapi hematopoietik kk hcreleri,sperm hcreleri ve tamir hcrelerinde negatif etki yapar. >Dier tedavi yolu;kanser hcrelerinin telomer boyu,kanser hcrelerinin blnemeyecei bir uzunlua getirilmesi

 mmortal insan soylarnda %98 orannda ve primer tmrlerde de %90 orannda telomeraz aktivitesi tespit edilmi ve bu hcrelerde ki telomer boylar normal bir insan sperm telomerleri ile karlatnda yinede ksa olduu gzlenmitir.Bundan dolay spermlerde,yani eem hcrelerinde srekli bir telomer aktivasyonu varken immortal hcre ve kanser hcrelerinde telomerlerde mitotik saati faliyete geirecek oranda bir ksalma gereklemesi ile telomeraz enzimi aktivitesi kazanmakta ve ksalan telomer yapsn korumaya almakta olmas gsterilmitir.