Ensayos microbiolgicos.

Rafael Romn Guerrero

PRCTICA9:

RECUENTODECOLIFORMESTOTALESENAGUASDEL RIOGENIL.
1.-OBJETIVO Y FUNDAMENTO:
Los Coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C. Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliformes forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc. Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que adems fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella. Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran ndices de contaminacin fecal. Pero el verdadero ndice de contaminacin fecal es Escherichia coli ya que su origen fecal es seguro. Desde el punto de vista metodolgico Escherichia coli es el Coliforme fecal que adems es positivo a la prueba del Indol.

Mtodo del nmero ms probable (NMP) - El mtodo del nmero ms probable (NMP), al igual que el mtodo de recuento en placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realizacin de una serie de diluciones seriadas al dcimo de la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo. - Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o ms clulas microbianas a partir de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern transparentes. - A medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el

cual algunos tubos contendrn tan slo un organismo y otros, ninguno. A partir del nmero, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas, puede determinarse el nmero ms probable de clulas estadsticamente en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de nmeros ms probables. Este valor multiplicado por el factor de dilucin correspondiente nos proporciona el nmero de clulas viables de la muestra. Ventajas y desventajas del mtodo por el NMP: -Puede emplearse para aquellos microorganismos que no crezcan en medio slido. -Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo para slidos o menores a 1 por 10mL para lquidos, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. -Asimismo, es el nico mtodo a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el mtodo de filtracin ni es recomendable el recuento en placa debido a la presencia de partculas. -Se prefiere tambin este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.) Caldo EC: La mezcla de fosfatos regula el pH, la triptosa es el elemento nutritivo y el cloruro sodico aporta la salinidad necesaria para el crecimiento de los germenes. La lactosa favorece a los coliformes, y su consumo se pone de manifiesto mediante la produccin de gas.

2.- MATERIAL Y REACTIVOS USADOS:

-Tubos de ensayo. -Agua de peptona tamponada. -Muestra (agua del rio Genil). -Vaso de precipitados -Caldo EC. -Gradilla. -Estufa -Pipetas automticas y puntas estriles. -Campana Durham -Tapones de caucho estriles -Tapones de algodn graso o metlicos -Leja para el cementerio.

3.- PROCEDIMIENTO:
-Preparacin de caldo EC. En nuestro caso no fue necesario ya que tomamos unos tubos sobrantes del ao pasado. -Preparacin de la muestra. 1.- Comprobar que el recipiente est bien cerrado e invertir unas 3 veces totalmente para homogeneizar la muestra. 2.- Retirar la tapa interior y verter un poco en un vaso de precipitados estril. -Preparacin de las diluciones seriadas.

1.- Tomar 1ml de la muestra y con una pipeta automtica llevar a un tubo de ensayo con 9ml de agua de peptona. La boca del tubo se esteriliza pasndola sobre la llama girando el tubo. Esta sera la dilucin 10-1. 2.- Con unas pinzas, esterilizadas a la llama, tomar un tapn de caucho y colocarlo en el tubo de ensayo. Invertirlo unas tres veces para que toda la muestra se reparta bien. 3.- Tomar de la dilucin 10-1 con una pipeta automtica 1ml, llevar a otro tubo de ensayo con agua de peptona y repetir la misma operacin. Esta sera la dilucin 10-2. 4.- Repetimos el mismo proceso para las diluciones restantes, 10-3, 10-4, 10-5. 5.- Depositar todas las puntas de pipeta utilizadas en un recipiente, preferentemente en un vaso de precipitado de plstico, con un poco de leja diluida. -Inoculacin de los tubos con el medio de cultivo: 1.- Poner en una gradilla de forma ordenada todos los tubos que vayamos a inocular y rotular debidamente. 2.- Tomar 3 tubos con caldo EC e inocular en cada uno con una pipeta automtica 1ml de la dilucin 10-1. Esterilizar la boca de cada tubo correctamente y desechar las puntas utilizadas en un vaso con leja diluida. 3.- Agitar con las palmas de las manos imprimindoles a los tubos un movimiento rotatorio, con cuidado de no meter aire dentro de la campana de Durham. 4.- Repetir los pasos anteriores para las diluciones 10-2 a 10-5. 5.- Llevar los tubos a la estufa a 31C durante unas 24-48 h. Recuento de los tubos positivos -La reaccin ser positiva cuando se produzca desprendimiento de gas en la campana Durham, por lo menos en 1/10 partes de su volumen, como consecuencia de la fermentacin de la lactosa con formacin de cido lctico y gas en presencia de sales biliares -El mtodo del nmero ms probable (NMP) nos proporciona un recuentro de viables. Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen slo un microorganismo y los otros, ninguno. -A partir del nmero, determinado por los tubos que presentan burbujas en tres diluciones sucesivas, puede determinarse el nmero ms probable de clulas estadsticamente en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de nmeros ms probables. Este valor multiplicado por el factor de dilucin correspondiente nos proporciona el nmero de clulas viables de la muestra. 4.- RESULTADOS, OBSERVACIONES Y CONCLUSIN: Hemos obtenido los sigioentes resultados: Diluci n Total

Muestra
3

10-1 2

10-2 1

10-3 0

10-4 0

10-5 0 93 grmenes/ml

Como hemos tomado el resultado a partir de la dilucin 1/10 multiplicaremos el resultado por 10, con lo que tenemos: 93X10= 930.

Recuento de coliformes totales=930 germenes/ml de agua del rio Genil.

Segn los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano (ver tabla anexa), esta agua no es apta para el consumo humano. Adems, no es potable y tampoco es sanitariamente permisible, es decir, que no podemos destinarla para fregar, lavar, etc. 08-05-2011