Rev. bras. hematol. hemoter.

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Murador P et al

Reviso / Review

Aspectos estruturais da membrana eritrocitria

Structural aspects of the erythrocyte membrane

Priscila Murador1 Elenice Deffune2

Este artigo descreve as estruturas e funes da membrana eritrocitria e sua importncia na medicina transfusional. A membrana eritrocitria uma das membranas mais conhecidas em termos de estrutura, funo e gentica. Como qualquer membrana plasmtica, tem como funo mediar transportes e, ainda, fornece ao eritrcito resistncia e maleabilidade. De acordo com a International Society of Blood Transfusion (ISBT), so mais de 500 antgenos expressos na membrana das hemcias e, destes, cerca de 270 esto envolvidos nos casos de reao transfusional e doena hemoltica do feto e do recm-nascido. Na classificao feita pela ISBT, destaca-se a srie de alta freqncia representada por antgenos presentes em mais de 99% dos indivduos de uma populao. Estes antgenos so conhecidos tambm como antgenos pblicos e a maioria, quando ausente, determina problemas graves do ponto de vista transfusional. Como exemplo dessa problemtica, uma gestante com ausncia do antgeno P j sofreu seis abortos de repetio por insuficincia placentria devido ao anticorpo formado pela ausncia do antgeno. Protenas importantes so descritas nesta reviso como: banda 3, glicoforinas, espectrina e outras. A banda 3 a mais abundante protena integral da membrana do eritrcito e sua principal funo mediar a troca de cloro e nions de bicarbonato atravs da membrana plasmtica. A segunda protena integral mais abundante a sialoglicoprotena glicoforina A (GPA). Com um alto contedo de cido silico, a GPA contribui com a rede de carga negativa na superfcie da membrana do eritrcito, minimizando, assim, a interao clula-clula e prevenindo sua agregao. Glicoforina C (GPC) o receptor para PfEBP-2 (baebl, EBA-140), o mais novo local de ligao identificado para o Plasmodium falciparum. O complexo tercirio espectrina, actina e 4.1R define a rede de citoesqueleto da membrana do eritrcito e ainda responsvel pela estabilidade sob mecanismos de estresse. Essa reviso da membrana eritrocitria importante para um melhor entendimento das reaes transfusionais, onde a formao de anticorpos contra antgenos de alta freqncia dificulta a transfuso compatvel. O estudo da diversidade antignica, a caracterizao bioqumica de diferentes protenas trar uma contribuio para o estabelecimento da sade, assim como para o diagnstico, desenvolvimento de tecnologias, como a produo de anticorpos monoclonais e conduta teraputica para muitas enfermidades. Rev. bras. hematol. hemoter. 2007;29(2):168-178. Palavras-chave: Membrana eritrocitria; protenas; antgenos; glicoforinas.

A membrana da hemcia A membrana da hemcia o modelo primrio para estudo de membrana plasmtica celular animal, pelo fato de ser desprovida de ncleo e organelas. As membranas
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plasmticas de um modo geral apresentam-se como barreiras seletivas que asseguram a composio interna constante das clulas, atravs do controle da transferncia ativa e passiva de inmeras molculas. Estas membranas tm um sistema estrutural complexo, citoesqueleto, que envolve

Mestre em Biotecnologia Mdica pelo Hemocentro da Faculdade de Medicina de Botucatu. Biloga do Hemocentro de Botucatu. Doutora em Imunologia Universidade Pierre et Marie Curie - IV - Paris. Docente do Dept de Urologia da Fac. de Medicina de Botucatu (Unesp).

Correspondncia: Priscila Murador Hosp. das Clnicas da Faculdade de Medicina de Botucatu Diviso Hemocentro - Distrito de Rubio Jr. s/n Lab. de Engenharia Celular 18618-000 Botucatu-SP Brasil E-mail: pmurador@fmb.unesp.br

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tanto a forma da clula, como sua mobilidade, deformabilidade e o transporte de macromolculas. Entre os diferentes constituintes da membrana apresentam-se receptores envolvidos em funes complexas que permitem a comunicao entre as clulas, reconhecimento imunolgico e fenmenos de adeso celular.1 A membrana eritrocitria, como as milhares de outras clulas do organismo humano, essencialmente constituda de lipdeos e protenas. A hemcia no um simples "saco" contendo hemoglobina. Os lipdeos e protenas esto dispostos na superfcie da hemcia de forma to complexa que so comparveis com os mais sofisticados mosaicos bizantinos.2 Esta membrana consiste em uma bicamada fosfolipdica, que representa aproximadamente 50% de sua massa total e forma a barreira entre dois compartimentos lquidos, intra e extracelular.3 As trocas entre estes compartimentos so feitas atravs de bombas, canais de trocas de ons e transporte molecular como o da glicose.2 Alm disso, a deformabilidade de sua membrana, a fluidez de seu citoplasma e a complexidade de sua superfcie membranria, em relao ao seu volume interno, asseguram as funes de transporte de O2 dos pulmes e remoo do CO2 dos tecidos para os pulmes. Esta capacidade de transporte depende das condies de adaptao circulatria e tambm da hemoglobina citoslica e de um polipeptdio maior da membrana: a banda 3 ou protena de troca de ons (anion exchanger 1, AE1). Como transportador de membrana, a AE1, ou banda 3, media as trocas de Cl-/HCO3-, aumentando ento a capacidade sangnea de transporte de CO2, garantindo a homeostase e o equilbrio cido-bsico. Por interao com lipdeos e protenas, a banda 3 multifuncional (AE1) une o complexo multiprotico do citoesqueleto e confere aos eritrcitos proprie-

Figura 1. Modelo de mosaico bilipdico e fludico da membrana celular

dades mecnicas e elsticas, regulando a viscosidade sangnea. Todas as protenas de transporte da membrana do eritrcito so produzidas nos estgios primordiais dos eritroblastos.3 O modelo estrutural de membrana eritrocitria mais aceito o de mosaico bilipdico e fludico proposto e descrito por Singer e Nicolson em 19721 como representado na Figura 1. Diversas doenas podem ser associadas a defeitos na estrutura dessa membrana que, embora a mais estudada, ainda possui vrias caractersticas sem um completo entendimento. Estes defeitos podem envolver outras protenas representadas graficamente na Figura 2.

FC= Fosfatidilcolina; EM= Esfingomielina; FS= Fosfatidilserina; FE= Fosfatidiletanolamina; GPA= Glicoforina A e GPC= Glicoforina C Figura 2. Protenas integrais e perifricas da membrana do eritrcito.

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Protenas de membrana As protenas que compem a membrana eritrocitria so estruturalmente classificadas em integrais ou transmembranrias e perifricas ou extramembranrias. Essas protenas do citoesqueleto membranrio formam uma verdadeira malha, que constitui quase uma concha para o material intracelular. Este esqueleto responsvel pela forma, bicncava normal ou anormal, em caso de defeitos genticos, dos glbulos vermelhos, e representa por si s 60% da massa protica de toda a membrana.2 As protenas integrais penetram ou atravessam a bicamada lipdica e interagem com a poro hidrofbica das molculas lipdicas. Fazem parte destas as protenas de transporte, como a banda 3, denominada protena transportadora de ons, e as glicoforinas A, B, C, D, que possuem receptores de membrana e antgenos que participam do reconhecimento clula-clula na extremidade externa e auxiliam na estabilizao do citoesqueleto atravs de ligaes com a protena 4.1 na face interna da membrana.5 Das diferentes protenas da membrana eritrocitria, o domnio citoplasmtico da banda 3 se destaca como um grande centro organizacional que interage com muitas outras protenas perifricas ou ligantes: anquirina (a maior ponte para o citoesqueleto espectrina-actina), protena 4.1, protena 4.2, aldolase, gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase (G3PD), fosfofrutoquinase (PFK), desoxihemoglobina, tirosinaquinase p72syk e hemicromos, que regulam a interao do citoesqueleto com enzimas glicolticas.6 Protenas integrais Banda 3, anion exchanger 1 (AE1)7 As protenas integrais da membrana ou transmembranrias esto incorporadas na parte mais profunda da bicamada lipdica. Seu domnio funcional pode se estender tanto nas zonas extra como intramembranrias. Exemplos disso so: a banda 3 ou anion exchanger 1 (AE1), implicada no mecanismo de transporte de muitas molculas e situada no compartimento extramembranrio, a citocromo- -5-redutase, que participa do mecanismo de reduo da metaemoglobina.7,8 A banda 3 considerada a principal protena integral da membrana e seu peso molecular de 102kDa. Representa 25%-30% de todas as protenas da membrana e tem em torno de 106 cpias por hemcia. Seu gene est localizado no cromossomo 17q21-q22. A banda 3 est expressa na membrana plasmtica de todos os eritrcitos e pode ser detectada tambm na membrana basolateral das clulas intercaladas nos tbulos distais e nas alas de Henle, proximal e distal. A banda 3 tem, recentemente comprovada, atuao na retirada de CO2 dos tecidos, regulando tambm o transporte de HCO3-. Alm disso, regula o metabolismo da glicose, mantm a morfologia eritrocitria e remove clulas senescentes. 170

Mutaes da banda 3 tm sido associadas esferocitose hereditria e acidose tubular renal. Outras mutaes foram identificadas no sudoeste da sia, determinando aumento da rigidez do eritrcito e resistncia infeco por malria associados ovalocitose. Um caso registrado na literatura relata ausncia de banda 3 com esferocitose hereditria e nefrocalcinose. A banda 3 tem sido considerada, ainda, como receptora para o Plasmodium. falciparum.7,9 Ela possui um domnio transmembranrio de 52kDa que atravessa de 12 a 13 vezes a bicamada lipdica, e um domnio citoplasmtico de 43kDa. O domnio transmembranrio tem um papel primordial na troca de ons, principalmente o cloro (Cl-) e bicarbonato (HCO3-). O Cl- transportado 1 milho de vezes mais rpido que o ction correspondente o potssio (K+) e apenas 1.000 a 10.000 vezes mais rpido do que um nion divalente como o sulfato (SO42-). Este mecanismo fisiolgico muito importante quando se tem perda rpida sangnea ou de volume atravs de outras vias.1,2,9 A combinao de diferentes tecnologias tais como time-resolved optical anisotropy (TOA) e saturation-transfer electron paramagnetic resonance (ST-EPR) spectroscopie tem sido utilizada para anlise da flexibilidade do domnio citoplasmtico prximo ao domnio transmembranrio, onde ocorre a troca de ons.10 A forte concentrao de resduos carregados negativamente no domnio citoplasmtico da banda 3 tem papel importante na interao desta protena com outras, sendo esta a responsvel pela fixao das protenas membranrias 4.1, 4.2 e anquirina. Este segmento citoplasmtico tem forte afinidade pelas hemoglobina, aldolases, G3PDH e a PFK. Estes stios tm o significado fisiolgico tambm na regulao da gliclise e auxiliam a formao de complexos multienzimticos.12 Em 2003, estudos descreveram aspectos da poro Nterminal da banda 3 ou AE1(CDB3) de hemcias humanas. A poro CDB3 o substrato executor da apoptose induzida pela caspase 3. A ao da caspase 3 observada em hemcias adultas, mas no em necitos ou hemcias jovens. Esta descoberta esclarece a eluio de alguns antgenos eritrocitrios durante o tempo de conservao das hemcias in vitro.12 No ano seguinte foi publicado um trabalho sobre a purificao e caracterizao do domnio C- terminal da banda 3, tambm denominada de HEM-B3, com 33 aminocidos. Os autores isolaram dois peptdios, C1 e KS4. O peptdeo C1, quando colocado em presena de extrato de membrana eritrocitria humana, desempenhou uma atividade de protease sobre a poro C- terminal GPA. No entanto, esta atividade inibida pela tripsina. O outro peptdeo isolado, KS4, no possui esta caracterstica.13 Ao analisar a importante contribuio das protenas de membrana e o formato das hemcias, o autor relacionou, por estudos dinmicos e por microscopia eletrnica, a acantocitose no s com as alteraes da banda 3, com deficincias

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da piruvato-quinase e pirimidina-5-nucleotidase. As alteraes da banda 3 esto tambm confirmadamente relacionadas com a estomacitose hereditria, fentipo In(Lu), coreaacantocitose e fentipo McLeod (KX).14 Em outro trabalho foi estudado o gene AE1 de dois irmos portadores de acidose tubular renal e nefrocalcinose. Este gene codifica a protena transportadora de nions (AE1) ou banda 3, expressa em hemcias e clulas dos tbulos renais. Os autores identificaram que uma deleo determina a mutao no cdon 888 (Ala-888-->Leu) seguida de stop codon na posio 889, truncando a protena em 23 aminocidos. Os autores sugerem que a anlise precoce do gene AE1 e a identificao da mutao descrita sejam decisivas para o diagnstico de nefrocalcinose.15 Casos de malformao congnita com proeminncia frontal e alteraes perifricas do Sistema Nervoso Central tm sido associados deficincia de glicosilao do tipo Ig. Esta deficincia compromete a glicosilao da protena banda 3 da superfcie da hemcia. Trata-se de uma mutao do gene ALG12 que codifica a dolichol-P-manose do sistema retculo-endoplasmtico, o que determina a hipoglicosilao da GPA e alteraes estruturais da banda 3. Portanto, o estudo eletrofortico desta protena em caso de malformao congnita pode levar ao diagnstico.16 O sucesso ou a refratariedade da esplenectomia no controle clnico da esferocitose hereditria foram analisados tambm. Nos estudos, os autores identificaram que os pacientes que tm sucesso com a esplenectomia mantm menos de 60 molculas de IgG fixadas sobre as hemcias ps-procedimento, caso estruturalmente tenham defeito na espectrina e na anquirina. Nos casos de refratariedade, observaram que as hemcias dos pacientes, aps o ato cirrgico, mantinham mais de 140 molculas de IgG fixadas e, portanto, continuavam sendo opsonizadas. Neste caso, o paciente era portador de deficincia na banda 3.17 A interao do marcador CD47 (Integrin-associated protein/IAP) na matriz extracelular de membranas que coexpressam a integrina tem sido alvo de pesquisas. Concluiuse que este marcador nos eritrcitos um ligante entre a banda 3 e o complexo Rh na manuteno da integridade da membrana. Macrfagos e clulas dendrticas expressam o receptor SIRP, o que os torna menos ativos, minimizando o efeito da doena auto-imune. Quando as clulas so CD47 negativas, o efeito inibidor da opsonizao no ocorre. Portanto, a interao CD47 e SIRP tem um papel importante na limitao do processo de destruio das hemcias em casos de anemia hemoltica auto-imune.18 Glicoforinas Glicoforina A (GPA) a maior sialoglicoprotena transmembrana dos eritrcitos, correspondendo a 2%-4% das protenas de mem171

brana. Em geral, as glicoforinas tm trs domnios: um domnio externo, onde esto os oligossacardeos, um segmento includo no interior da bicamada e um segmento interno citoplasmtico. O domnio externo carrega determinantes comumente conhecidos como Ena. A concentrao de GPA sobre as hemcias responsvel por 80% da carga negativa destas clulas em funo da sua constituio bioqumica composta de cido silico e carboidratos terminais. Essa superfcie negativa celular ajuda a minimizar a interao clulaclula e prevenir a aglutinao eritrocitria. A GPA suscetvel clivagem pela enzima tripsina, ficina e papana na regio prxima membrana eritrocitria. Seu peso molecular de 16kDa. A GPA parece estar presente de forma macia nas linhagens celulares eritrides e pode ser detectada em diferentes fases da diviso celular em eritroblastos basfilos e normoblastos.1,19 Os domnios extracelulares da GPA e banda 3 so extremamente polimrficos. A associao da GPA com o AE1 ou banda 3 contribui com propriedades mecnicas na membrana eritrocitria e tambm apresenta relao com o grupo sangneo Wrb cujo stio de ligao encontra-se exatamente na regio das duas protenas. Sobre o segmento N- terminal externo da GPA, esto representados os antgenos dos grupos sangneos M e N e os receptores de lectina, do vrus influenza e myxovirus. Esta poro da GPA atua ainda como receptora para o parasita da malria P. falciparum e para o vrus Sendai.20,21 A GPA e a GPB so pontos de ancoragem para 43 antgenos dos sistemas MNSs. Muitas anormalidades das glicoforinas esto descritas na literatura especializada. A ausncia de GPA no homem determina um grupo sangneo denominado En (a-), j a ausncia de GPA e GPB no mesmo indivduo determina um fentipo denominado Mk, e a ausncia apenas da GPB determina a falta dos antgenos S e s.21 Glicoforina B (GPB) uma glicoprotena transmembranria de 10kDa, codificada pelo gene localizado no cromossomo 4q28-31. Expressa determinantes para os antgenos S e s. Est presente em todas as hemcias e seus precursores. A funo das hemcias parece ser normal mesmo em indivduos com deficincia de GPA e GPB. Os indivduos com fentipo nulo MN: En(a-) so totalmente resistentes a infeces por Plasmodium falciparum.8,9,21 Glicoforina C (GPC) A GPC o menor componente protico da membrana eritrocitria. codificada pelo gene GYPC localizado no cromossomo 2. Este mesmo gene codifica uma forma truncada conhecida como glicoforina D - GPD. A GPC uma protena de 35kDa. As glicoforinas C e D definem os grupos sangneos Gerbich: Ge:1, Ge:2, Ge:3 e Ge:4. A maioria dos fentipos expressa os quatro antgenos, no entanto alguns indivduos que sofreram mutao podem expressar fentipos raros como

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Quadro 1. Glicoforinas A,B,C/D e banda 3: gene, localizao cromossmica, peso molecular, stio de expresso e interaes 31 Protena Gene GYPA Localizao 4q28.2-q31.1 PM (Da)* 16274 Sinnimos Grupo sangneo MN GPA, MN, PAS-2 Sialoglicoprotena Sialoglicoprotena MN Antgeno CD235a GYPB GPB 4q28-q3 9796 Grupo sangneo Ss PAS-3, GYPB, GPB, CD235b, Ss GPC GPC, D 35124 Glicoforina D GYPD, GPD, CD236 SLC4A1 17q21-q22 101798 SLC4A1 Banda 3 da membrana da hemcia BND3 Banda 3 Protena eritride Banda 3 EPB3 Anion exchanger protein 1 AE1, Antgeno CD233 Ubiquitria Hemcias Fgado Banda 4.1 Protena de membrana Palmitolato 1 Anidrase carbnica IV Anidrase carbnica II Calnexina Anquirina Anquirina 1 Complexo Rh Banda 4.1 Adaptado de Peri, S. Genome Research 2003 Hemcias Complexo protico Rh Stio de expresso Hemcias, feto, reticulcito Eritroblastos Interaes Banda 3 Receptor de Lectina Receptor de Mixovrus Rc virus influenza

GPA

*A literatura demonstra diferentes pesos moleculares, sendo assim, foi padronizado usar a mdia entre o menor e o maior peso descrito e adotar a unidade em daltons (Da).

o fentipo Leach (Ge1-,2-, 3-,4-), onde ocorre a deficincia completa tanto da GPC quanto da GPD. Todos os indivduos de fentipo Leach apresentam eliptocitose hereditria, destacando o papel importante da GPC e da banda 4.1 no complexo juncional.22 Informaes e caractersticas das diferentes glicoforinas esto descritas no Quadro 1. H muito tempo acredita-se que as glicoforinas servem como receptores para o P. falciparum. No entanto, a maioria dos estudos indicava a GPA como a receptora primria e a GPB como a secundria. A protena PfEBF-2 que se liga ao eritrcito humano dependente de cido silico; os autores demonstraram que ela no se liga nem GPA e tampouco GPB. A interao com o receptor da GPC representa um terceiro caminho para a invaso.23 Outras protenas da membrana eritrocitria Outras protenas maiores tm sido descritas na membrana do eritrcito. So receptores enzimticos ou hormonais como o receptor da insulina e o transportador de glicose que corresponde a uma protena da banda 4.5. As protenas perifricas formam o citoesqueleto da membrana constituindo-se, principalmente, por espectrina, actina, anquirina, protena 4.1 e 4.9. Mesmo aps a extrao das protenas de membrana do eritrcito em presena de detergente, o esqueleto membranrio conserva a forma da clula 172

originria. Trs das protenas j mencionadas interferem essencialmente na estrutura: a espectrina, a actina e a banda 4.1.3 Protenas perifricas Espectrina A espectrina a mais abundante protena perifrica do citoesqueleto e est presente em um nmero de 105 cpias por clula. Apresenta peso molecular de 285kDa. uma protena longa e fibrilar constituda por duas cadeias polipeptdicas e com peso molecular de 240 e 220kDa respectivamente, correspondendo s bandas 1 e 2 na representao esquemtica da eletroforese de protenas membranrias (Figura 3). A espectrina recebe esse nome por servir de sustentao membrana e ser a protena perifrica responsvel pelo fenmeno dos ghosts eritrocitrios. A espectrina e polipeptdios associados so responsveis tanto pelo formato do glbulo vermelho quanto pela sua deformabilidade, alm de constiturem elementos estabilizadores da bicamada lipdica.1 Esta protena, durante muito tempo, foi considerada especfica dos glbulos vermelhos; no entanto, sabe-se que ela est presente em muitos outros tecidos. Ela faz parte da

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Estas interaes espectrina-actina tm um elemento facilitador representado pela protena 4.1. A rede de espectrina se fixa a um fragmento de 43kDa que emergem no citoplasma, ligado banda 3 por intermdio da anquirina (banda 2.1).2 A anquirina, banda 2.1 ou sindena A anquirina possui trs domnios estruturais: domnio funcional, que se liga subunidade da espectrina; um segundo domnio funcional que interage com a banda 3; um domnio regulador que controla a funo dos dois precedentes. Esta protena tem peso molecular de 434kDa e est representado em um nmero de 105 cpias por clula. Nos estudos eletroforticos em gel de poliacrilamida, as membranas dos eritrcitos podem conter no local da corrida da anquirina (banda 2.1) bandas adicionais produtos de protelise da banda 2.1. Estas ltimas so denominadas 2.2, 2.3 etc.2 Arritmias cardacas ocorrem devido a mutaes da anquirina-B, tambm conhecida como anquirina 2. Essas mutaes resultam, ainda, em uma desregulao na organizao celular da bomba de sdio, na troca sdio/clcio e nos receptores inositol-1,4,5-triphosphate, os quais reduzem os nveis e a atuao desta protena em tbulos transversos. Alteraes na sinalizao de Ca2+ em cardiomicitos adultos tambm ocorrem, resultando em extrasstoles. Os autores identificaram um novo mecanismo para arritmia cardaca devido coordenao anormal de funes mltiplas relacionadas aos canais de transporte de ons.24 Banda 4.1 A banda 4.1 uma protena do citoesqueleto com gentica e localizao tpicas e diversas. Esta protena pode ser encontrada, alm da membrana plasmtica, em outras localizaes intracelulares e no ncleo. Possui peso molecular de 97kDa e est presente numericamente em 2x 105 cpias por clula.25 Os mecanismos de adeso celular so importantes no s para o mecanismo em si mas tambm para a manuteno da morfognese do tecido. A banda 4.1 integrante de uma famlia de protenas definidas sobre a membrana do eritrcito como "organizadores" do sistema de aderncia. Seu estudo eletrofortico tambm mostra subunidades denominadas 4.1a e 4.1b. A subunidade 4.1b est localizada no compartimento basal, regio de adeso da espermatognia.26 Estudos demonstram que o maior ponto de ligao da banda 4.1 na membrana do eritrcito com a glicoforina C (GPC) e D (GPD), e que a banda 4.1 purificada pode se ligar a dois locais distintos nas glicoforinas C/D. Uma destas interaes direta, envolvendo resduos 82-98 na GPC (61-77 na GPD), enquanto a outra interao medida pela p55, uma outra protena perifrica de membrana. A protena p55 tambm se liga GPC. No existem evidncias de que ocorra interao da banda 4.1 com a banda 3 tambm. Acredita-se que a distribuio nas ligaes das trs protenas a uma membrana normal seja correspondente a 40% para p55, 40% 173

Figura 3. Representao esquemtica de eletroforese de extrato de membrana eritrocitria; G3PDH = gliceraldedo-3-fosfatodesidrogenase (banda 6); PAS = Periodic Acid Schiff, colorao especfica para ster de cido silico 2

famlia de protenas dimricas, interage com a actina e com a calmodulina, que, por sua vez, interagem com clulas especficas no crebro e polipeptdeos especficos da camada ciliar do intestino. Os estudos bioqumicos mostram que a espectrina clivada pela tripsina em cinco segmentos: domnios I,II,III,IV e V partindo da extremidade NH2- terminal. Na cadeia , os domnios individualizados por ao da enzima so denominados de -I a IV a partir da extremidade C- terminal, como pode ser visto no Quadro 2. Ambas as cadeias e so fortemente homlogas, possuindo 30% de absoluta identidade e esto associadas de forma antiparalela; o grupamento NH2- terminal da cabea do domnio -I fica face ao grupo C- terminal do domnio -I. Os dmeros da espectrina so associados in vitro sobre a forma de tetrmeros dependendo da fora inica e temperatura. A zona de interao do tetrmero, que tambm a forma fisiolgica, constituda pela regio Nterminal de uma cadeia que est de frente para a regio Cterminal de uma cadeia do dmero oposto.12 Os tetrmeros de espectrina se unem a outros pela sua extremidade distal, atravs de curtos filamentos de actina que formam "ns" na malha do citoesqueleto eritrocitrio.
Quadro 2. Ao da tripsina sobre a espectrina: domnios e com seus respectivos pesos moleculares11 Domnios -I -II -III -IV -V Peso molecular (kDa) 80 46 52 41 41 Domnios -I -II -III -IV Peso molecular (kDa) 28 65 33 74 -

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para GPC/D e 20% para a banda 3. Uma mesma regio da banda 4.1 liga GPC/D e banda 3, enquanto o local de ligao da p55 diferente. A interao envolvendo a banda 4.1 com p55 e esta com GPC/D so de alta afinidade, enquanto a GPC/D com banda 3 de baixa afinidade.27 O Quadro 3 mostra as propriedades das principais protenas do citoesqueleto eritrocitrio.
Quadro 3. Propriedades das principais protenas do citoesqueleto Migrao Outras Eletrofortica denominaes Banda 1 espectrina Banda 2 Banda 2.1 Banda 4.1a Banda 4.1b Banda 4.9 Banda 5 Banda 7 dematina actina tropomiosina, estomatina espectrina anquirina ou sindena PM (kDa) 240 220 434 80 78 46 33 32 Interaes anquirina, banda 4.1 Actina espectrina, banda 3 espectrina, actina Actina, glicoforinas Actina espectrina, banda 4.1 ?

do citoesqueleto da maioria das clulas eucariontes. abundante e localiza-se logo abaixo da membrana citoplasmtica. uma protena de 33kDa que forma o denominado complexo juncional composto por 12 molculas de actina associadas banda 4.1, aducina e tropomiosina. Este complexo fortalece a ligao da actina com a espectrina. Existem dois tipos de actina: actina G (globular) e actina F (funcional), sendo esta ltima a que se compacta para formar o complexo juncional.12 Banda 6 Corresponde enzima gliceraldedo-fosfato desidrogenase (GAPD) de peso molecular de 36kDa que se liga banda 3 no mesmo local da hemoglobina. Banda 7 uma banda composta principalmente por tropomiosina de peso molecular de 32kDa. Para serem visualizadas no estudo eletrofortico, o extrato membranrio tem que ser tratado com MgCl2. Essa protena integra o complexo juncional associado actina.12 Aducina um heterodmero constitudo de trs subunidades: aducina 1, com peso molecular de 84kDa, aducina 2 com 81kDa e aducina 3, com 79kDa. Liga-se s actina e espectrina. Destaca-se que a ligao da aducina espectrina inibida pela banda 4.1, provavelmente por competirem pelo mesmo stio de ligao.12 Os quadros 4, 5 e 6 descrevem as protenas membranrias perifricas quanto a: nome, gene, localizao, PM, sinnimos, stios de expresso e interaes.31 A imunoematologia, a imunoqumica e a imunogentica so as trigmeas do ltimo sculo: elas nasceram, de fato, em Viena, em 1900, quando tudo comeou com a descrio do grupo sangneo ABO, por Karl Landsteiner. A descoberta desse sistema permitiu, mais concretamente, o estabelecimento das bases cientficas da transfuso sangnea. Nos anos seguintes sua descoberta, Landsteiner previu que os grupos sangneos permitiriam, um dia, identificar os homens to bem, ou melhor, que as suas prprias impresses digitais. Desde 1908, sabe-se cientificamente que os grupos sangneos pertencem ao capital hereditrio que cada um de ns recebe, que eles so transmitidos dos pais aos filhos, seguindo as leis da gentica, que alguns so constantes e diversos, constantes no mesmo indivduo, diversos na coletividade, distribudos segundo certas propores atravs dos sculos. So milenares dentro de uma populao dada, permanecendo os mesmos do nascimento morte do indivduo at o advento do transplante da medula ssea. O mosaico constituinte da membrana eritrocitria, os sistemas de grupo sangneo, suas colees e sries so testemunhos inequvocos da hereditariedade. A intrincada diversidade expressa 174

Adaptado de Peri, S. Genome Research 2003

Banda 4.2 ou palidina Protena de peso molecular de 80kDa, est representada 100 mil vezes em cada hemcia e liga-se com a banda 3 e com anquirina, desempenhando um papel organizacional na membrana.12 um importante componente no citoesqueleto da membrana eritrocitria porque regula a estabilidade e flexibilidade dos eritrcitos.28 Banda 4.9 ou dematina A Banda 4.9 fosforilada por vrias protenas quinases (PK) do eritrcito e apresenta peso molecular de 46kDa. Ao realizar cromatografia das protenas da membrana do eritrcito, duas protenas com similares mobilidades no gel de eletroforese foram encontradas: a primeira com peso molecular de 49kDa e pH bsico, e a segunda, com peso molecular de 50,5kDa, pH cido. Foi verificado que a protena de 49kDa se liga a filamentos de actina.29 Para demonstrar a versatilidade de atuao da banda 4.9, realizou-se um estudo no qual os autores usaram a tcnica de immunoblotting revelando-a com um anticorpo antibanda 4.9, purificado e marcado. Demonstrou-se e quantificou-se a presena de uma forma de reao imune na banda 4.9 nos crebros e cristalino de aves e bovinos, no corao de aves, tanto quanto em plaquetas humanas e de mamferos, aves, peixes e eritrcitos de anfbios. A banda 4.9 foi encontrada, ainda, em fibras corticais de cristalino e em neurnios cerebrais de aves.30 Banda 5 ou actina A banda 5 ou actina o maior componente protico

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Quadro 4. Protenas de membrana e caractersticas Protena espectrina Gene SPTAN1 Localizao 9q33-q34 PM (Da)* 285081 Sinnimos Stio de Expresso Hemcia Crebro Interaes tirosina fosfatase tipo 4A.1

-I espectrina no-eritride NEAS -II espectrina

SPTAN1 SPTA2 Calspectina

actina
aducina 1 e 2 sinapsina I e3B1 actina desmina anquirina 1 e 2 1 proteioquinase C banda 4.2 Espectrina beta I banda 8 (Na/Ca) banda 9 - isoforma A2 calpana 3 banda 4.1 caderina associada 1

anquirina

ANK2

4q25-q27

433768

anquirina no-eritride anquirina cerebral anquirina neuronal anquirina B

Crebro Msculo

Espectrina Espectrina 1 banda 8 (Na/Ca) Sigma receptor 1 molcula de adeso L1 NrCAM

ANK1

8p11.2

206289

anquirina R ANK anquirina eritride

Hemcias Crebro Msculo

Obscurina Espectrina molcula de adeso L1 banda 4 anion exchanger neurofascina Linfoma clulas T AE2 Titina Complexo Rh

Banda 4.1

EPB41

1p36.2-p

97062

Protein 4.1 presles EPB41

Ubiquitria

Receptor de dopamina D2 e D3 1 espectrina GPC banda 4.2 Espectrina banda 4.2 4.1, espectrina, Ras p21

Banda 4.2

EPB42

15q15

79896

Protena eritride 4.2 EPB42 E42P Palidina

Hemcia

banda 3 sitaxina 12 anquirina 1 e 2 CD47

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Quadro 5. Protenas de membrana e caractersticas Protena Banda 4.9 Gene EPB49 Localizao 8p21.1 PM (Da)* 45643 Sinnimos Dematina EPB49 Protena 4.9 Stio de Expresso Crebro Corao Msculo Rins Pulmes Stem cell Placenta Pncreas Fgado CAZ1 Banda 5 CAPZA1 1p13.1 32924 CAPPA1 CAPZ Hemcia Placenta Feto Msculo esqueltico CD2AP Actina 2 CapZ Interaes

actina
espectrina Actina Banda 4.2

1 Cap protein 1 Capping protein, 1 F-actina 1 CAPZ

EcapZ GAPDH Banda 6 GAPD 12p13.31-p13.1 36056 G3PD Gliceraldedo 3 fosfato Desidrogenase

Ubiquitria

Receptor de andrognio Fosfolipase D2 Tubulina Actina Banda3

Banda 7

STOM

9q34.1

31733

Banda 7.2 EPB72 EPB7 Protena integral de membrana eritrocitria banda 7 BND7 Estomatina

Hemcia

Anion exchanger 1 Amiloridina

Leuccito Clon Intestino delgado Ovrio Testculo Prstata Timo Bao Corao Placenta Pulmo Fgado Msculo esqueltico Pncreas, rins Adaptado de Peri, S. Genome Research 2003

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Quadro 6. Protenas de membrana e caractersticas Protena Aducina1 Gene ADD1 Localizao 4p16.3 PM (Da)* 84324 Sinnimos Stio de Expresso Ubiquitria Interaes Aducina 2 pt de choque 105 kDa

aducina
ADD1 Aducina eritride ADDA

espectrina
Calmodulina 1 Espectrina I espectrina Na+-K+-ATPase

Aducina 2

ADD2

2p14-p13

80859

ADD2 aducina Subunidade da aducina ADV

Crebro Stem cell Hemcia

Espectrina Rabphilin-3A Aducina Aducina 2 Calmodulina 1 Fyn

ADD3 Aducina 3

10q24.2-q24.3

79159

Aducina like 7.0 ADDL ADD3 Ubiquitria Adaptado de Peri, S. Genome Research 2003

na membrana eritrocitria define a identidade biolgica de cada um, reconhecendo o carter nico do ser humano. O estudo da diversidade dos antgenos, a caracterizao bioqumica das diferentes protenas e o estabelecimento das funes desta multiplicidade antignica trar uma substancial contribuio tanto para o estabelecimento do estado de sade, assim como para o diagnstico, desenvolvimento de tecnologias como a produo de anticorpos monoclonais e a conduta teraputica de muitas enfermidades, como o exemplo da malria.

Abstract This article describes the structures and functions of the erythrocyte membrane and its importance in transfusional medicine. The erythrocyte membrane is one of the best known membranes in terms of structure, function and genetic disorders. As any other plasma membrane, it mediates transport functions. It also provides the erythrocytes with their resilience and deformability. According to the International Society of Blood Transfusion (ISBT), more than 500 antigens are expressed in the erythrocyte membrane, and around 270 are involved in transfusion reaction cases and hemolytic diseases of the fetus and newborn. In the ISBT classification, the high frequency series is represented by antigens in more than 99% of population (high prevalence antigen). In transfusion, the absence of these antigens determines severe problems as for example, one woman without the P antigen suffered 6 repetitive miscarriages due to placental insufficiency, which was caused by an antibody formed against the absent P antigen. Some important erythrocyte membrane proteins are described here including Band 3, Glycophorins and spectrin. The most abundant integral membrane protein is Band 3

and its main function is to mediate exchange of chloride and bicarbonate anions across the plasma membrane. The second most abundant integral membrane protein in the human erythrocyte is sialoglycoprotein glycophorin A (GPA). With its high sialic acid content, GPA is the main contributor to the net negative cell-surface charge and is thus critical for minimizing cell-cell interactions and preventing red cell aggregation. Glycophorin C (GPC) is the receptor for PfEBP-2 (baebl, EBA-140), the newly identified erythrocyte binding ligand of Plasmodium falciparum. The ternary complex of spectrin, actin and 4.1R defines the nodes of the erythrocyte membrane skeletal network, and is inseparable from membrane stability when under mechanical stress. This erythrocyte membrane review is important for a better understanding of transfusion reactions, where the antibody formation against high prevalence antigens makes compatible transfusions difficult. The study of antigen diversity and biochemical characterization of different proteins will contribute to healthcare, as well as diagnosis, development of technology such as monoclonal antibody production and the therapeutic conduct of many diseases. Rev. bras. hematol. hemoter. 2007;29(2):168-178. Key words: Erythrocyte membrane; proteins; antigens; glycophorins.

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Avaliao: Editor e dois revisores externos Conflito de interesse: no declarado Recebido: 08/06/2006 Aceito aps modificaes: 29/12/2006

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