Principio de la Prueba

Rubella IgG

La prueba ImmunoComb II Rubella IgG consiste en un ensayo inmuno-enzimtico indirecto de fase slida (EIA). La fase slida es un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente est sensibilizado en dos reas reactivas: punto superior inmunoglobulina humana (Control Interno) punto inferior antgenos de rubola inactivados La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solucin reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un perodo de incubacin en cada etapa. Al comienzo de la prueba, las muestras de suero o plasma son prediludas en relacin 1:11 y agregadas al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. Luego se inserta el Peine en los pocillos de la fila A. Los anticuerpos anti-rubola, en caso de estar presentes en las muestras, se unirn especficamente a los antgenos de rubola en el punto inferior del diente del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la fila B. En la fila C, el IgG anti-rubola capturado en los puntos inferiores del diente, y la inmunoglobulina humana en los puntos superiores (Control Interno) reaccionarn con el anticuerpo IgG anti-humano marcado con fosfatasa alcalina (FA). En las prximas dos filas, los componentes no ligados son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reaccionar con componentes cromognicos. Los resultados pueden verse como puntos azul grisceos en la superficie del diente del Peine. Formacin del complejo antgeno de rubola anticuerpo; 30 min Unin del conjugado anti-IgG humano; 20 min

anticuerpo anti-rubola

0459
Cdigo: 60400002 Formato: 3 x 12 tests
FA

FA

FA

conjugado anti-IgG humano

Reaccin enzimtica de color; 10 min

sustrato cromognico

Para diagnstico nicamente

Propsito de Uso
El kit ImmunoComb II Rubella IgG es una prueba rpida para la determinacin semi-cuantitativa de anticuerpos IgG contra el virus de la rubola en suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit.

Figura 1. Principio de la Prueba

El kit incluye un Control Positivo (IgG anti-rubola) y un Control Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al trmino de sta, el diente utilizado con el Control Positivo debe mostrar dos puntos de color azul grisceo. El diente usado con el Control Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy tnue o la ausencia del mismo. El punto superior tambin deber aparecer en todos los dems dientes para confirmar que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada correctamente.

Introduccin
El virus de la rubola es miembro de la familia Togaviridae, que se encuentra principalmente en poblaciones humanas. La trasmisin ocurre principalmente por aerosol o contagio directo, con una incidencia mxima en el grupo de 5 a 14 aos de edad. En general, la infeccin se manifiesta como una enfermedad benigna y autolimitada, caracterizada por un eritema mculo-papular (sarampin alemn), fiebre leve y linfadenopata. Ocasionalmente pueden presentarse artralgia y artritis moderadas y pasajeras. En contraste, la infeccin primaria de rubola contrada durante el embarazo temprano puede dar como resultado dao fetal severo, bito o aborto. Los sntomas de nios infectados congnitamente incluyen serias anormalidades anatmicas y neurosensitivas, tales como sordera, defectos cardacos, cataratas, glaucoma y retraso mental. El retraso en el crecimiento y la diabetes mellitus tambin han sido asociados con complicaciones tardas de la rubola congnita. La vacunacin generalizada ha reducido significativamente la incidencia en todos los grupos de diferentes edades. Sin embargo, 10 a 20% de los adolescentes an parecen ser suceptibles al virus. La lectura cualitativa de los anticuerpos IgG contra el virus de rubola es una herramienta til para el diagnstico de la enfermedad y para determinar el status inmunolgico. Los anticuerpos del virus aparecen cuando los salpullidos comienzan a desaparecer. En los adultos, los anticuerpos IgG usualmente persisten durante toda la vida. Como consecuencia, un ttulo estable de IgG anti-rubola es prueba de exposicin previa al virus, mientras que un aumento cudruple o mayor constituye un diagnstico de infeccin reciente. Sin embargo, un ttulo incrementado de IgG en la ausencia de sntomas clnicos tambin podra implicar una reinfeccin. Puesto que los anticuerpos IgM no son producidos luego de la reinfeccin, esta posibilidad debera ser excluida por un resultado negativo en una prueba de IgM anti-rubola. La produccin de anticuerpos IgG circulantes contra el virus de rubola por nios infectados congnitamente usualmente persiste de 3 a 4 aos despus del parto. Por lo tanto, la determinacin serial del nivel de IgG anti-rubola en el nio ayudar en la diferenciacin entre la rubola congnita (nivel constante) o la rubola neonatal (incremento en el ttulo).

Contenido del Kit Peines

El kit contiene 3 Peines de plstico. Cada Peine tiene 12 dientes, uno para cada prueba (Figura 2). Cada diente es sensibilizado en dos reas reactivas: punto superior inmunoglobulina humana (Control Interno) punto inferior antgenos de rubola inactivados
ImmunoComb II

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Control Interno Antgenos de rubola

Figura 2. Peine
Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante.

Bandejas de Desarrollo
El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, cubiertas con papel de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Los contenidos de cada fila son los siguientes:

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Fila A Fila B Fila C Fila D Fila E Fila F

diluyente de la muestra solucin de lavado anticuerpos de cabra anti-IgG humano marcados con fostatasa alcalina solucin de lavado solucin de lavado solucin de sustrato cromognico que contiene 5-bromo4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT)

Preparacin de la Prueba
Equilibre todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente (22-26C). Preparacin de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37C durante 20 minutos; o deje a temperatura ambiente (22-26C) durante 3 horas. Lleve todos los otros componentes (Peines, diluyente de la muestra, controles y muestras) a temperatura ambiente. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, a ser desechado como desecho biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo; rmpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, slo cuando las instrucciones de la prueba as lo indiquen. Preparacin del Peine Precaucin: para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o solamente una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el nmero de cdigo del kit, "00", para permitir la identificacin de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o crtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el nmero requerido para las pruebas (Nro. de pruebas ms 2 controles). c. Vuelva a meter la porcin no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el envoltorio (con un clip, por ejemplo) a fin de mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 a 8C para su uso posterior.
ImmunoComb II
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Figura 3. Bandeja de Desarrollo

Control Positivo 1 frasco (tapa roja) de 0,2 ml de plasma humano diludo, inactivado con calor, diludo a un nivel crtico de 15 IU/ml para anticuerpos IgG contra el virus de rubola. Control Negativo 1 frasco (tapa verde) de 0,2 ml de plasma humano diludo reconstitudo, inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti-rubola. Diluyente de la Muestra 1 botella de 5 ml. Perforador para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la Bandeja de Desarrollo. CombScale para leer los resultados de la prueba.

Seguridad y Precauciones
Todos los materiales de origen humano usados en la preparacin de los controles pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos al antgeno de superficie de la hepatitis B, as como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C. Ya que ningn mtodo de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminacin viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirrgicos y ropas de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines* usados, Bandejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use el kit despus de la fecha de caducidad. El kit es transportado entre 2 - 8 C. Durante el transporte el kit o debe mantenerse entre 30 C por cortos perodos de tiempo, no excediendo un total de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no se ha daado durante el transporte." o Almacene el kit en su caja original de 2 - 8 C. No congele el kit. Despus de abrir el kit por primera vez, los componentes deben o ser almacenados de 2 - 8 C. El desempeo del kit despus de abrirlo por primera vez es estable hasta la fecha de expiracin del Kit, cuando se o almacena de 2 - 8 C. Despus del primer uso, el peine y la bandeja no deben ser usados por ms de tres veces. Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 das a temperaturas de 2 a 8C antes de la prueba. Para almacenar las pruebas por ms de 7 das, conglelas a 20C o a temperaturas ms bajas. Despus de descongelar las muestras de suero, centrifguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sdico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test.
o

Conservacin y estabilidad del kit

Figura 4. Fraccionamiento del Peine

Instrucciones de la Prueba
Predilucin de Muestras y Controles 1. Para cada muestra y control, dispense 100 l de diluyente de la muestra en un microtubo o pocillo de microtitulacin. 2. A cada microtubo o pocillo, aadir 10 l de una muestra, o del Control Positivo o Control Negativo suministrado con el kit. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solucin con la pipeta. Reaccin Antgeno-Anticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo) 3. Pipetee 25 l de una muestra prediluda. Perfore la cubierta de papel aluminio en un pocillo de la fila A de la Bandeja de Desarrollo con la punta de la pipeta o el perforador y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solucin con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 4. Repita el paso 3 para las dems muestras prediludas y los dos controles prediludos. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. 5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces. b. Deje el Peine en la fila A e incube por 30 minutos. Active el cronmetro. Hacia el final de los 30 minutos, perfore el papel de aluminio de la fila B usando el perforador. No abra ms pocillos de los necesarios. c. Al cumplirse los 30 minutos, saque el Peine de la fila A. Absorba el lquido adherido a las puntas de los dientes apoyndolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Primer Lavado (Fila B) 6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila B. Agite: inserte y retire vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el trascurso de 2 minutos; mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila C. Despus de 2 minutos, retire el Peine y absorba el lquido adherido como en el paso 5c. Unin del Conjugado (Fila C) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle como en el paso 5a. Programe el cronmetro para 20 minutos. Perfore el 2

Manipulacin de las Muestras

Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario (no proporcionado)

Pipetas de precisin ajustables con puntas desechables y capacidad de 10 l, 25 l y 100 l Tijeras Cronmetro de laboratorio o reloj Microtubos o pocillos de microtitulacin
* A menos que sea archivado para consulta posterior

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papel aluminio de la fila D. Despus de 20 minutos, retire el Peine y absorba el lquido adherido. Segundo Lavado (Fila D) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Agite repetidamente durante 2 minutos, como en el paso 6. Mientras tanto, perfore el papel aluminio en la fila E. Despus de 2 minutos, retire el Peine y absorba el lquido adherido. Tercer Lavado (Fila E) 9. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos. Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Despus de 2 minutos, retire el Peine y absorba el lquido adherido. Reaccin de Color (Fila F) 10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Programe el cronmetro para 10 minutos. Despus de 10 minutos, retire el Peine. Detencin de la Reaccin (Fila E) 11. Inserte de nuevo el Peine en la fila E. Despus de un minuto, retire el Peine y djelo secar al aire.

Orgenics CombScale
For/Pour/Para/Fr RUBELLA IgG IU/mL 15 30 C+ 60 120 240

WINDOW/NUANCLER/VENTANA/FENSTER

Calibrar el CombScale

Figura 7. CombScale
1. Calibre el CombScale. Coloque el punto inferior en el diente del Control Positivo bajo la intensidad de color ms similar en la escala de colores. Ajuste la regla hasta que aparezca la lectura "15; C+" en la ventanilla sobre la intensidad de color seleccionada. 2. Lea los resultados sin cambiar la posicin calibrada de la regla. Compare la intensidad de color de cada punto inferior con la intensidad ms similar en la escala de colores. Registre el valor indicado en la ventanilla (en IU/ml) sobre esa intensidad como el ttulo aproximado de IgG anti- rubola para la muestra correspondiente. _______________________________________ * Basado en el 1er Estndar Internacional de la OMS para Inmunoglobulina humana anti-Rubola cdigo RUBI-1-94. Documentacin de los Resultados Debido a que el color que aparece en los Peines es estable, es posible archivar los Peines para consulta posterior.

Almacenamiento de Partes No Usadas del Kit

Bandeja de Desarrollo Si no us todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede almacenarla para ser usada posteriormente: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva ancha a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar la(s) Bandejas(s) de Desarrollo, Peine(s), perforador, diluyente de la muestra, controles e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperaturas de 2 a 8C.

Resultados de la Prueba Validacin

A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son vlidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5): 1. El Control Positivo debe producir dos puntos en el diente del Peine. 2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control Interno). El punto inferior no aparece o aparece muy tnuemente, sin afectar la interpretacin de los resultados. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior (Control Interno). Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son vlidos y las muestras y controles deben ser reexaminados.

Limitaciones
Como ocurre con otras pruebas ideadas para ser usadas en diagnsticos in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relacin con todos los sntomas, historial clnico y otras pruebas de laboratorio del paciente.

Eficacia de la Prueba*

La sensibilidad y especificidad del kit ImmunoComb II Rubella IgG fueron evaluadas en un panel de 223 muestras de suero y comparado con una prueba ELISA diferente con un umbral de deteccin de 15 IU/ml. Los resultados son resumidos en la Tabla 1. Tabl1 1. Resultados de la Prueba ImmunoComb II Rubella IgG Prueba de Referencia Positivo Negativo 126 0 Positivo 0 97 Negativo Las siguientes caractersticas de desempeo fueron calculadas: Sensibilidad 100 % Especificidad 100 %

Control Positivo

Control Negativo

Resultados Invlidos

Figura 5. Validacin de la Prueba

Repetibilidad
Diez peines fueron escogidos al azar de varias partes de un lote de produccin. Un suero positivo fue analizado 12 vecesen estos 10 peines. En todos los peines se observ el mismo ttulo de Rubella IgG.

Interpretacin Cualitativa de los Resultados

Lectura Cualitativa Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de muestra con la del punto inferior del diente del Control Positivo (Figura 6). Un punto con intensidad mayor que o igual a la del Control Positivo indica la presencia de anticuerpos IgG contra el virus de rubola. Un punto con intensidad menor que la del Control Positivo es considerado como un resultado negativo.

Reproducibilidad
Tres muestras fueron analizadas en peines tomados de tres lotes de produccin diferentes. Las muestras fueron analizadas por duplicado. En todos los peines se observ el mismo ttulo de Rubella IgG.

Reaccin cruzada
No se encontr significativa reaccin cruzada con muestras positivas para Toxoplasma y CMV.

Resultado Negativo

Control Positivo

Presencia de anticuerpos IgG contra el virus de rubola

Interferencia
Interferencia con muestras hemolisadas (hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipmicas (colesterol hasta 281.6 mg/dl; triglicridos 381 mg/dl) bilirrubina alta (hasta 20 mg/dl) no fue significativo.
_______________________________ * Detalles disponibles segn requerimiento

Figura 6. Resultados de la Prueba

Interpretacin Semicuantitativa por Lectura Visual El nivel de IgG anti-rubola en cada muestra puede ser evaluado comparando la intensidad del color del punto inferior en cada diente, con la escala de color del CombScale suministrado con el kit. Esto se hace como sigue (Figura 7):

* Datos detallados disponibles

400/S8/CE

Bibliografa
Chernesky MA, Mahony JB. 1991. Rubella Virus. In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp. 918-923. Enders G. 1984. Problems of Rubella diagnosis by various IgM techniques and the need for test combinations. In: Habermehl K-O, ed. Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology. Springer Verlag, Berlin, pp. 146-161. Evans AS, Brachman JS, eds. Viral Infections of Humans. rd Epidemiology and Control. 3 edition. New York, NY: Plenum Medical Book Company, 1998. Frenkel LM, Nielsen K, Garakian A, et al. A search for persistent rubella virus infection in persons with chronic symptoms after rubella and rubella immunization and in patients with juvenile rheumatoid arthritis. Clin Infect Dis 1996; 22:287-94. Mellinger AK, Cragan JD, Atkinson WL, et al. High incidence of conjenital rubella syndrome after a rubella outbreak. Pediatr Infect Dis J 1995; 14:573-8. Fabricante Representante autorizado en UE PBS-Orgenics 19, rue Lambrechts-BP41 92404 Courbevoie Cedex, France Tel: 01 41 99 92 92 Fax: 01 41 99 92 95 Version: 400/S8/CE (07/2004)

P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel Tel:972-8-9429201 Fax:972-8-9438758

Leyenda de los smbolos

CARD

ImmunoComb tarjeta Bandejas de Desarrollo Control positivo Control negativo Perforador Consulte las instrucciones de uso Atencin,ver instrucciones de uso Producto sanitario para diagnstico in vitro Limite de temperatura

PLATE CONTROL + CONTROL

PERFORATOR

IVD

36

Contenido suficiente para 36 ensayos Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea

REF DIL COMBSCALE LOT

Nmero de catlogo diluyente de la muestra CombScale

Codigo de lote Fecha de caducidad Numero de serie

400/S8/CE

Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba

Preincubacin de la Bandeja de Desarrollo: 3 hrs a temperatura ambiente, o 20minutos a 37C

Tomar y prediluir muestras y controles

Agregar muestras y controles prediludos a la fila A. Mezclar

Sacar el Peine del empaque

Insertar el Peine y mezclar en fila A. Incubar.

Perforacin de la fila B

Absorber lquido adherido a los dientes

Insertar Peine y agitar en fila B. Incubar

Luego de mezclar/agitar e incubar en filas C,D y E...

10

Reaccin de color en fila F

Resultados

Resumen del Procedimiento de la Prueba

Las instrucciones abreviadas a continuacin son para las personas experimentadas en el uso del kit ImmunoComb II Rubella IgG. (Para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo) 1. Lleve todas las muestras y reactivos a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente. 2 Prediluya 10 l de cada muestra y control con 100 l de diluyente de la muestra. 3. Vierta 25 l de cada muestra y control prediludos en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo, y mezcle. 4. Inserte el Peine en la fila A y contine como se describe en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen del procedimiento de la prueba Etapa Reaccin antgeno-anticuerpo Lavado Unin del conjugado Lavado Lavado Reaccin de color Detencin de la Reaccin Fila A B C D E F E Proceda como se indica Mezcle; incube 30 minutos; absorba. Agite; incube 2 minutos; absorba. Mezcle; incube 20 minutos; absorba. Agite; incube 2 minutos; absorba. Agite; incube 2 minutos; absorba. Mezcle; incube 10 minutos. Incube 1 minuto; seque al aire.
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Manera de romper el peine

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