Escolas Padre Anchieta

Curso Técnico em Química

Apostila
Fermentativa e Álcool

Profa.: Yumi

Jundiaí – SP
2010

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Conteúdo:

I - Microrganismos: Reino Monera (Bactérias) e Reino Fungi (Leveduras);

II - Microrganismos usados pelo homem na produção de alimentos;
III - Crescimento microbiano e Medida de crescimento;
IV – Estudo do crescimento microbiano;
V - Efeito dos fatores ambientais no crescimento microbiano;
VI - Meios para processos fermentativos;
VII - Meios de cultivo;
VIII - Normas de segurança de trabalho no laboratório de microbiologia;
IX - Técnicas de semeadura;
X – Processos fermentativos;
Aulas práticas;
Questionários para fixação.

I - MICRORGANISMOS

Os MICRORGANISMOS são seres muito pequenos que não podem ser vistos a olho nu
e, para enxergá-los, precisa-se da ajuda de um MICROSCÓPIO, que nada mais é do
que um instrumento que aumenta a imagem de um objeto através de um sistema de
lentes.

Dentre os seres microscópicos, tem-se as BACTÉRIAS, alguns FUNGOS (leveduras e

bolores), os PROTOZOÁRIOS, as ALGAS microscópicas e os VÍRUS (estes últimos são
tão pequenos que para enxergá-los é preciso usar microscópio eletrônico).

Onde os microrganismos vivem?

Os microrganismos encontram-se distribuídos em praticamente todos os lugares da

natureza. Estão no ar, na água (mares, rios, lagos e água subterrânea) e no solo.
Podem ser encontrados em maiores quantidades em lugares onde existe grande
quantidade de alimentos (matéria orgânica e inorgânica), umidade e temperatura
apropriada para que possam crescer e se reproduzir.

Como são os microrganismos?

Aqueles que interessam para a disciplina de Fermentativa e Álcool são os que estão
no Reino Monera (Bactérias) e no Reino Fungi (Leveduras).

Reino Monera

O reino Monera compreende todos os organismos unicelulares e procariontes (não

possuem carioteca que é a membrana nuclear), representados pelas bactérias e
pelas algas azuis (cianofíceas ou cianobactérias).

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Bactérias

1 – Classificação quanto à morfologia (forma):

As bactérias classificam-se basicamente em quatro categorias: cocos, bacilos,
espirilos e vibriões:

1.1 – Cocos (Coccus)

São bactérias de forma arredondada, cujo tamanho, em geral, situa-se entre 0,2 e 5
micrometro de diâmetro. Apresentam-se isoladas ou formando colônias.

Segundo a quantidade de bactérias e sua disposição, as colônias são classificadas

em:
diplococos - colônia de dois cocos;
étrade - colônia de quatro cocos;
sarcina - colônia cúbica de oito ou mais cocos;
estreptococos - colônia de cocos em fileira;
pneumococos - colônia de dois cocos em forma de chama de vela;
estafilococos - colônia de cocos dispostos em cacho;
gonococos - colônia de dois cocos reniformes (em forma de rim).

1.2 – Bacilos (Bacillus):

São bactérias em forma de bastonete, que medem, em regra, de 1 a 15 micrometro.

1.3 – Espirilos (Spirillum):

São bactérias que têm a forma de um bastonete recurvado. Os espirilos
propriamente ditos, formam filamentos helicoidais.

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1.4 – Vibriões (Víbrio):
Os vibriões são bactérias curtas, com espirais incompletas, e têm a forma de vírgula.

2 – Classificação quanto a alimentação:

A maioria das bactérias é heterotrófica por absorção retirando moléculas orgânicas

já digeridas do ambiente ou de seres vivos que parasitam.

Bactérias autotróficas ou autótrofos é o nome dado à qualidade do ser vivo de

produzir seu próprio alimento a partir da fixação de dióxido de carbono, por meio de
fotossíntese ou quimiossíntese.

A fotossíntese é o processo através do qual as plantas, seres autotróficos (seres

que produzem seu próprio alimento) e alguns outros organismos transformam
energia luminosa em energia química.

A quimiossíntese é a produção de matéria orgânica através da oxidação de

substâncias minerais.

3 – Classificação quanto a respiração:

As bactérias podem ser aeróbias ou anaeróbias.

Bactérias aeróbias obrigatórios: crescem somente em presença de
oxigênio.

As bactérias anaeróbias podem ser facultativas e obrigatórias (ou estritas).

Bactérias anaeróbias facultativas: são assim chamadas porque tanto
podem fazer respiração aeróbia - quando um ambiente tiver oxigênio - como
respiração anaeróbia - caso falte esse gás.
Bactérias anaeróbias obrigatórias ou estritos: não possuem as enzimas
adequadas para o aproveitamento do oxigênio e morrem na presença desse
gás como é o caso do bacilo do tétano.

4 – Classificação quanto à temperatura:

De acordo com a temperatura, as bactérias podem ser classificadas em:

Psicrófilas ou criófilas – crescem em temperaturas abaixo de 20°C;
Mesófilas – crescem entre 20 – 40ºC;
Termófilas – crescem entre 45 – 55ºC;
Estenotermófilas – crescem em temperaturas entre 65 – 80ºC.

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5 – Classificação quanto à reprodução:

As bactérias podem se reproduzir assexuadamente que é o mais comum e

sexuadamente um pouco mais raro.

5.1 – Assexuada
Ocorre por bipartição ou cissiparidade, onde a célula bacteriana duplica seu
cromossomo e se divide ao meio, originando duas novas bactérias idênticas à
original.

5.2 – Sexuada

A reprodução sexuada pode ocorrer de 3 formas:

Conjugação – consiste na passagem (ou troca) de material genético entre

duas bactérias através de uma ponte citoplasmática formada pelas fímbrias.

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 Transformação – a bactéria absorve moléculas de DNA disperso no meio.
Esse DNA pode ser proveniente, por exemplo, de bactérias mortas.

Transdução – as moléculas de DNA são transferidas de uma bactéria a outra

usando vírus como vetores.

6 – Estrutura bacteriana

Nucleóide - o cromossoma bacteriano consiste numa única molécula circular de DNA

que determina as características da célula e comanda as suas atividades.

Citoplasma - solução aquosa na qual estão suspensos todos os componentes

internos; pode conter substâncias úteis para a célula como enzimas e substâncias de
reserva.

Ribossomas - pequenos corpos granulares, com os quais ocorre a síntese de

proteínas; movem-se livremente no citoplasma.

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Membrana plasmática - envolve a célula bacteriana controlando as trocas de
substâncias com o exterior; pode formar invaginações para o interior em cuja
superfície se realizam processos como a respiração ou a fotossíntese.

Parede Celular - invólucro semi-rígido que dá forma às bactérias e as protege

contra vírus e substâncias tóxicas. É formada por polissacarídeos e polipeptídeos.

Cápsula - de aspecto gelatinosos, protege a bactéria da dessecação, dos vírus

bacteriófagos, células fagocitárias e anticorpos. Alguns antibióticos, como a
penicilina, atuam inibindo a produção de cápsulas.

Pili ou Fímbrias - numerosos apêndices filamentosos, de natureza protéica, muito

mais curtos e finos do que os flagelos; facilitam a aderência da bactéria a substratos
sólidos ou aos tecidos dos organismos parasitados.

Flagelo - as bactérias podem apresentar um número variável de flagelos, os quais,

rodando sobre a sua base, permitem que a célula se movimente.

7 – Esporulação bacteriana

Os esporos que se formam dentro da célula, chamados endosporos, são exclusivos

das bactérias (principalmente as pertencentes ao gênero bacillus e clostridium). Eles
possuem parede celular espessa, são altamente refrateis (brilham muito com a luz do
microscópio) e altamente resistentes a agentes físicos (dessecação e aquecimento) e
químicos (antisépticos).

Os esporos surgem quando a célula bacteriana não se encontra em um meio ideal

para o seu desenvolvimento. A célula que origina o esporo se desidrata, forma uma
parede grossa e sua atividade metabólica torna-se muito reduzida. Certos esporos
são capazes de se manter em estado de dormência por dezenas de anos,
representando uma forma de sobrevivência e não de reprodução. Ao encontrar um
ambiente adequado, o esporo se reidrata e origina uma bactéria ativa, que passa a
se reproduzir por divisão binária.

Os esporos são muito resistentes ao calor e, em geral, não morrem quando expostos
à água em ebulição.

As indústrias de enlatados toma medidas rigorosas na esterilização dos alimentos

para eliminar os esporos da bactéria Clostridium botulinum. Essa bactéria produz o
botulismo, infecção frequentemente fatal.

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Reino Fungi

Fungos

Estão incluídos neste grupo organismos de dimensões consideráveis, como os

cogumelos, mas também muitas formas microscópicas, como bolores e leveduras.

Os fungos ocorrem em todos os ambientes do planeta e incluem importantes

decompositores e parasitas. Fungos parasitas infectam animais, incluindo humanos,
outros mamíferos, pássaros e insectos, com resultados variando de uma suave
comichão à morte. Outros fungos parasitas infectam plantas, causando doenças
como o apodrecimento de troncos e aumentando o risco de queda das árvores.

Alguns fungos, tais como: Shiitake, Porto Bello, Champignon, shimeji, Maitake e
Mexican Corn Smut, são utilizados como alimento; outros são extremamente
venenosos.

Bolor e mofo, cogumelos, leveduras: Todos estes nomes se referem ao mesmo

elemento biológico: fungos.

são um tipo de vida extremamente poderosa pois conseguem brotar em paredes

feitas com cal, conseguem digerir óleos, conseguem crescer dentro do frigorífico,
mesmo a temperaturas muito abaixo de zero. Basicamente o que precisam é de
umidade, detestam ambientes secos.

Estrutura dos fungos:

Os fungos podem se desenvolver em meios de cultivo especiais formando colônias de

dois tipos:

leveduriformes - As colônias leveduriformes são pastosas ou cremosas,

formadas por microrganismos unicelulares que cumprem as funções
vegetativas e reprodutivas – as leveduras;

Filamentosas - As colônias filamentosas podem ser algodonosas, aveludadas

ou pulverulentas; são constituídas fundamentalmente por elementos
multicelulares em forma de tubo - as hifas.

O que nos interessa são as leveduras.

Leveduras

1 – Morfologia (forma):

As leveduras, como os bolores e cogumelos, são fungos. Apresentam-se

caracteristicamente, sob forma unicelular, isto é, formados por uma única célula. São
maiores que a maioria das bactérias, podem ter forma oval, podendo ser
alongadas e esféricas.

As leveduras gostam de açúcar preferindo como habitat, frutas, flores e as cascas

das árvores.

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Existem, aproximadamente, 350 espécies diferentes de leveduras, separadas em
cerca de 39 gêneros.

Leveduras vistas ao microscópio óptico

(cada estrutura circular corresponde a uma levedura)

2 – Reprodução:

Se reproduzem assexuadamente por brotamento ou por cissiparidade, processo pelo

qual na superfície da célula adulta (célula mãe) desenvolve-se uma pequena saliência
(célula-filha) que se transformará numa nova célula.

3 – Respiração:

As leveduras são capazes de crescimento anaeróbio facultativo. Podem utilizar oxigênio ou um

componente orgânico como aceptor final de elétrons, sendo um atributo valioso porque permitem
que esses fungos sobrevivam em vários ambientes.

As leveduras respiram aerobicamente para metabolizar hidratos de carbono formando dióxido

de carbono e água;

Na ausência de oxigênio elas fermentam os hidratos de carbono e produzem etanol e dióxido

de carbono

II - Microrganismos usados pelo homem para produção de alimentos

1 – Como agentes de fermentação alcoólica

As leveduras são os microrganismos mais importantes na obtenção do álcool por

via fermentação.
Produção de bebidas alcoólicas:
Fermentação do suco de uva: Saccharomyces cerevisiae - vinho
Fermentação do malte: Saccharomyces cerevisiae – Cerveja

Produção do Álcool: Fermentação alcoólica do melaço, seguida de

destilação (S. cerevisiae)

2 - Levedura alimentícia

A levedura é fonte de proteínas e vitaminas do complexo B e minerais. No

estado seco, contém cerca de 50% de proteína de boa qualidade

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3 – Como fermentos de panificação

As leveduras eram obtidas como subproduto de destilarias. Com o crescimento

populacional, nas áreas de concetração industrial, determinou o
desenvolvimento das indústrias de panificação, com isso aumentou a demanda
de consumo de leveduras pra panificação, exigindo-se melhor qualidade e com
razoável grau de padronização.

4 - Produção de Ingredientes de Alimentos

Ingredientes Função Organismo

beta-caroteno pigmento Blakeslae trispora
ácido cítrico acidulante Aspergillus niger
ácido glutâmico estimulante do sabor Corinebacterium glutamicum
ácido lático acidulante Estreptococos e Bacilos
lisina aminoácido Corinebacterium glutamicum
manitol açúcar Torolopsis mannitofaciens
vitamina B-12 vitamina Propionibacterium
goma xantana espessante Xanthomonas campestri

5 - Produção de enzimas

Enzimas Origem Indústria Aplicação

Aspergillus niger, A. suplemento de farinha,
oryzae, Bacillus preparação de massa,
Amilase Panificação
subtilis, Rhizophus alimentos pré-cozinhados,
spp, Mucor rouxii elaboração de xaropes
preparação de
Aspergillus niger,
Celulase Cerveja concentrados líquidos de
Trichoderma viride
café, clarificação sucos
Cerveja, impede que a cerveja se
Aspergillus oryzae,
Protease Panificação, enturva ao esfriar, abranda
Bacillus subtilis
Alimentar as carnes

6 – Como agentes produtores de ácidos

As bactérias podem formar inúmeros ácidos diferentes. O maior interesse

econômico são as produtoras de ácido lático, ácido acético e de ácido
propiônico. Os ácidos são provenientes da degradação anaeróbica de glicídios
por oxidação incompleta.

Produção de Vinagre: Transformação do álcool em acido acético.

Industrias de Lacticínios: Bactérias produtoras de acido láctico capazes de
provocar azedamente espontâneo do leite.
Ex.: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Lactobacillus etc.

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III - Crescimento microbiano
Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de
células e não ao aumento das dimensões celulares.

Medidas do crescimento microbiano

O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais
como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por
exemplo. Dentre as diferentes técnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos.

1 - Contagem total de células:

Esta metodologia envolve a contagem direta das células em um microscópio. A

contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a
impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser
contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido
às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados
celulares.

Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

2 - Contagem de viáveis:

Procedimento também conhecido como contagem em placa, que estima o

número de células viáveis (isto é, capazes de se reproduzir) em uma amostra.
Esta metodologia envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana em
diferentes tempos de crescimento, as quais são então inoculadas em meio
sólido. Após a incubação dos meios, o número de colônias é contado.

Este tipo de contagem está sujeito a grandes erros (agregados, duas células
próximas, originando uma colônia), que podem ser minimizados pela realização de
triplicatas para cada diluição.

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 Técnica de contagem de viáveis
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

3 - Massa de células: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou

do peso úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é realizado quando não é
necessário determinar o número preciso de microrganismos presentes.

Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é retirado da

cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à secagem. Realizam-se
então sucessivas pesagens, até o momento onde não observa-se mais variações.
Este procedimento pode também ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando
o sedimento, ou então secando-o (100 - 150°C/16 horas) e depois pesando-o.

4 - Turbidimetria: quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660

nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos
meios de cultura não interfere com os resultados. Tal metodologia requer a
confecção de uma curva padrão. Embora a análise turbidimétrica seja menos
sensível, é de rápida e fácil execução, não destruindo a amostra. Entretanto,
não permite a determinação de células viáveis.

5 - Análises químicas: A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio,

ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas.

IV - Estudo do crescimento bacteriano

Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la, como cultura
pura, em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas
e físicas, tais como fontes de nutrientes, osmolaridade, pH, presença ou ausência de
oxigênio e temperatura de incubação.

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A tendência de crescimento representada na Figura 1 só pode ser mantida
indefinidamente se houver um suprimento ilimitado de nutrientes, ambiente
inalterável e espaço ilimitado.

Em ambientes naturais e em condições experimentais nas quais as disponibilidades

de nutrientes e de espaço sejam limitadas, em um dado momento algum fator se
torna desfavorável: um nutriente essencial torna-se escasso (fontes de energia,
elementos-traço), produtos tóxicos do metabolismo acumulam-se em concentrações
que inibem a divisão celular, o espaço torna-se limitado, etc.

Quaisquer uma dessas situações, isoladamente ou em conjunto, inibem o

crescimento, provocando um declínio do número de células viáveis na população até
o ponto em que esta se extinga completamente (Figura 2).

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Em condições experimentais, quando se inocula uma população bacteriana em um
frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado), o
crescimento dessa população passa por quatro fases características, dependendo do
ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador.
Essas quatro fases estão representadas na Figura 3.

Fases do crescimento bacteriano

A curva de crescimento da Figura 3 representa as quatro fases do crescimento
populacional bacteriano em uma situação próxima da real quando uma população de
bactérias cresce em um ambiente fechado (modelo baseado no cultivo da bactéria E.
coli em um meio de cultura rico e sob condições aeróbicas).

1 - Fase lag
Fase de adaptação metabólica ao novo ambiente; o metabolismo celular está
direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas
condições ambientais encontradas pelas células. O número de indivíduos não
aumenta nesta fase, podendo até mesmo decrescer. A duração dessa fase depende
das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente.
A fase lag ocorre porque as células de fase estacionária encontram-se pobres de
várias coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares
necessários à absorção dos nutrientes presentes no meio.
A fase lag também é observada quando as células sofrem traumas físicos (choque
térmico, radiações) ou químicos (produtos tóxicos), ou quando são transferidas de
um meio rico para outro de composição mais pobre, devido a necessidade de
síntese de várias enzimas

2 - Fase exponencial
Nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os
nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando.
Fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. Esta taxa de

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crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Após
um determinado período de crescimento exponencial, as condições ambientais
tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais, acúmulo de
metabólitos tóxicos e limitação de espaço.
À medida que a disponibilidade de nutrientes diminui as células se tornam menos
capazes de gerar ATP e a taxa de crescimento se reduz. A duração da fase
exponencial é altamente variável dependendo tanto das características genéticas da
bactéria quanto das condições ambientais.

3 - Fase estacionária
Fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições
limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo, mas parte
das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de
morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis na população.
A curva de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária depende do
balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando
inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições
ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis.

4 - Fase de declínio
Fase em as células perdem a capacidade de se dividir, a taxa de morte celular
torna-se maior que a taxa de divisão e o número de células viáveis decresce
exponencialmente até a completa extinção da população.
Nesta fase muitas células assumem formas incomuns. Em bactérias formadoras de
esporos sobrevivem mais esporos que células vegetativas. A duração desta fase é
variável dependendo tanto das características genéticas da bactéria quanto das
condições ambientais.

V - Efeito dos fatores ambientais no crescimento microbiano

O crescimento dos microrganismos é grandemente afetado pelas condições

físicas e químicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem
influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em
questão.

1 - Temperatura:

A temperatura pode ter efeitos positivos ou negativos sobre o crescimento de uma

população bacteriana.

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À medida que a temperatura se aproxima de um valor ótimo, a taxa de
crescimento aumenta rapidamente porque a cinética de reação das enzimas das
células da população aumenta de modo diretamente proporcional; as reações
químicas tendem a ocorrer mais rapidamente com aumento da taxa de divisões
celulares. Contudo, há um limite além do qual algumas macromoléculas termos-
sensíveis tais como proteínas, ácidos nucléicos ou lipídios serão desnaturadas,
perdendo sua funcionalidade.

Há, também, uma temperatura mínima para o crescimento, abaixo da qual a

porção lipídica da membrana plasmática não apresenta fluidez suficiente para
funcionar apropriadamente.

Por temperatura ótima de crescimento entende-se aquela em que as células

dividem-se mais rapidamente, ou seja, apresentam um tempo de geração mais
curto. As temperaturas mínima e máxima de crescimento são a menor e a maior
temperaturas que permitem a divisão celular nas bactérias. Freqüentemente, a
temperatura ótima para o crescimento está mais próxima da máxima do que da
mínima.

Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de

temperatura, onde para alguns o ótimo encontra-se entre 5 e 10°C, enquanto para
outros é de 90 a 100°C.

Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com

os ótimos de temperatura:

Psicrófilos - Nenhum psicrófilo sobrevive no corpo humano

Obrigatórias: requerem baixas temperaturas para seu crescimento; o
crescimento ótimo se dá abaixo de 15ºC (Flavobacterium).

Extremos: os ambientes frios são predominantes na Terra (oceanos, polos,

solos) entretanto este grupo (bactérias, fungos e algas) é muito pouco
estudado. Destes, os mais conhecidos são as algas que crescem sob o gelo
ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando coloração vermelha.
Temperatura ótima fica em torno de 4°C e resistem até 14°C
aproximadamente.

Facultativas: apresentam crescimento ótimo em temperaturas de 20 a

30ºC, mas podem crescer, embora mais lentamente, em temperaturas de
refrigerador e têm alta probabilidade de contaminar e estragar produtos
resfriados tais como alimentos (por exemplo, Bacillus cereus) e sangue.

Mesófilos - Bactérias mesófilas apresentam crescimento ótimo em

temperaturas variando entre 20ºC e 40ºC, ou seja, a faixa de temperatura
mais comum na superfície da Terra e nos organismos animais. A maioria dos
patógenos humanos apresenta crescimento ótimo em temperaturas próximas
de 37°C.
o Bactérias termodúricas, suportam temperaturas abaixo de 100°C,
tais como Bacillus cereus, Clostridium botulinum e Listeria
monocytogenes, Se o processo de aquecimento de alimentos envasados
em recipientes metálicos ou de vidro for inadequado, tais bactérias
podem sobreviver e deteriorar o produto, representando uma séria
ameaça à segurança dos alimentos.

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 Termófilos e Hipertermófilos: ótimos de 45 e ≥ 80°C, respectivamente.
São encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo oceânico, em
fontes.
Os termófilos e hipertermófilos tem grande interesse biotecnológico porque
tendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminação por
outros microrganismos e possuem enzimas mais termoestáveis. São aquelas
cujas taxas de crescimento ótimo estão entre 50ºC e 60ºC. São
encontradas em pilhas de adubo orgânico. Algumas espécies toleram
temperaturas de até 110 °C em fontes termais.

2 - pH:

A maioria das espécies bacterianas pode crescer em meios cujo pH esteja entre 5 e
9, faixa na qual encontra-se a maior parte dos ambientes naturais. Os ambientes
naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de diferentes
tipos de microrganismos.
Nenhuma espécie bacteriana pode tolerar a faixa inteira de pH em qualquer uma
dessas categorias e muitas espécies toleram faixas de valores de pH que se
sobrepõem entre uma categoria e outra.

Bactérias neutrófilas - Bactérias neutrófilas crescem em faixas de pH entre

5,4 a 8,5. A maioria das bactérias apresenta um crescimento ótimo em
ambientes cujo pH se aproxima da neutralidade. A maioria das bactérias
patogênicas está incluída nessa categoria.

Bactérias acidófilas - Bactérias acidófilas crescem em faixas de pH

extremamente baixos, entre 0,1 e 5,4, como a bactéria Helicobacter pylori que
pode colonizar a parede estomacal. Algumas bactérias que reduzem enxofre a
ácido sulfúrico podem gerar e tolerar condições em torno de pH 1.

Bactérias alcalinófilas - Bactérias alcalinófilas crescem em faixas de pH

entre 8,5 e 11,5. A bactéria Vibrio cholerae apresenta um crescimento ótimo
em pH 9. A bactéria oportunista Alcaligenes faecalis pode criar e tolerar
condições alcalinas com pH 9 ou maior.

Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5). Os fungos
filamentosos podem crescer na faixa entre 1,5 e 11, mas as leveduras não
toleram pH alcalino.

3 - Tensão de O2:

Bactérias aeróbicas estritas ou obrigatórias - Bactérias aeróbicas estritas

crescem apenas onde há disponibilidade de oxigênio, como por exemplo, as
bactérias do gênero Pseudomonas.

Bactérias anaeróbicas facultativas - Bactérias anaeróbicas facultativas

utilizam oxigênio em seu metabolismo energético, mas também podem crescer
na ausência de oxigênio. As bactérias Escherichia coli e espécies de

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 Staphylococcus são encontradas no trato intestinal e urinário onde há pouca
disponibilidade de oxigênio. Todas as bactérias pertencentes à família
Enterobacteriaceae são anaeróbicas facultativas.

Bactérias anaeróbicas estritas ou obrigatórias - Bactérias anaeróbicas

estritas não crescem na presença de oxigênio que lhes é tóxico. A maioria das
espécies anaeróbicas estritas é encontrada no solo ou em micro-ambientes em
organismos animais que tenham se tornado anaeróbicos, como ferimentos
profundos ou a junção das gengivas com os dentes. São exemplos de
organismos anaeróbicos estritos as bactérias do solo Clostridium tetani
(causadora do tétano), Clostridium botulinum (causadora do botulismo) e as
bactérias associadas com doenças periodontais, como Porphiromonas
gengivallis e Prevotella intermedia. A grande maioria das bactérias associadas
aos intestinos de animais são anaeróbicas estritas.

4 – Água

Todas as células metabolicamente ativas requerem a presença de água. Uma vez que
os microrganismos estão expostos diretamente ao ambiente, a maioria das células
vegetativas das bactérias sobrevive apenas algumas horas sem umidade. Na
ausência de umidade apenas endósporos bacterianos podem sobreviver.

Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam variadas. É

o solvente universal. Os microrganismos se nutrem pela passagem de
substânicas em solução através da membrana citoplasmática. A água exerce
função primordial na regulação da pressão osmótica e regulação térmica. A
maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação.

Organismo Aw mínimo para o crescimento

Bactérias 0.91
Leveduras 0.88
Bolores 0.80

5 - Osmolaridade
A presença de solutos na água – sais ou açúcares que provocam a difusão de água
para dentro ou fora da célula – é importante para a sobrevivência de uma bactéria.

6 - Metabolismo e toxicidade
À medida que a população aumenta de tamanho aumenta o consumo de nutrientes
com conseqüente aumento da produção de produtos secundários do
metabolismo. Esses metabólitos, quando em baixos níveis têm pouco efeito nas
taxas de divisões celulares, mas em altas concentrações podem inibir a divisão
celular ou mesmo matar as células, conseqüentemente, diminuindo a taxa de
crescimento da população. Metabólitos tóxicos se acumulam rapidamente em
grandes populações bacterianas.
O metabolismo de todos os organismos gera produtos secundários tóxicos a partir do
oxigênio. Tais metabólitos são altamente reativos podendo destruir componentes
celulares essenciais tais como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios. Com exceção das

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bactérias anaeróbias estritas, todos os organismos sintetizam enzimas que detoxicam
esses compostos, como por exemplo, as enzimas superóxido dismutase, catalase e
peroxidase.

VI - Meios para processos fermentativos

Cada processo fermentativo necessita de um meio específico. Entretanto, todos os

meios devem atender às necessidades básicas dos microrganismos.

1 – Características desejáveis de um meio de cultura

deve utilizar nutrientes baratos e disponíveis em qualquer época do ano.
deve fornecer o máximo rendimento em produto ou biomassa.
deve permitir a máxima velocidade de formação de produto.
Não deve causar problemas de agitação e aeração, extração, purificação e de
tratamento de efluentes.

2 – Componentes necessários no meio de cultura

2.1 – Água
Componente utilizado em maior quantidade. Devem ser considerados fatores como:
pH dessa água;
presença de sais.

2.2 -Fonte de carbono

A maioria dos microrganismos utiliza a fonte de carbono como fonte de energia. Os
carbohidratos são frequentemente utilizados como fonte de carbono em processos
industriais. Algumas matérias-primas utilizadas são:
Glicose e sacarose – são raramente utilizadas por razões econômicas;
Melaço – subproduto da produção de açúcar e contém cerca de 50% de
açúcar;
Amido hidrolisado – obtido a partir da hidrólise ácida ou enzimática de farinha
de milho, batata ou mandioca. O único incoveniente é que a hidrólise ácida
pode gerar produtos tóxicos;
Amido e dextrinas;
Extrato de malte – exceçemte substrato para bolores e leveduras, contém
cerca de 90% de carbohidratos e também algumas substâncias nitrogenadas;
Lactose ou soro de leite – utilizado na produção de biomassa e na produção de
lactato de amônia para ração animal;
Celulose – obtida de resíduos de madeira, papel e bagaço, mas poucos
microrganismos metabolizam a celulose diretamente;
Metanol – metabolizado por poucas bactérias e leveduras;
Etanol – utilizado na produção de ácido acético.

3 -Fonte de nitrogênio.
Sais de amônio, nitrato e uréia;
Extrato de levedura – obtido a partir da levedura de panificação;
Peptonas – é um hidrolisado de proteína, tem custo elevado;
Farinha de soja – resíduo obtido após a extração de óleo de soja, contém 50%
de proteína e 30% de carbohidratos;
Líquido de maceração do milho – obtido durante a extração do amido de milho,
o extrato concentrado contém cerca de 4% de nitrogênio;

19/54
4 – Sais minerais
Magnésio, fósforo, potássio, enxofre, cálcio e cloro – são necessários em maior
quantidade;
Cobalto, cobre, ferro, manganês, molibidênio e zinco – são necessários em
quantidade mínima.

5 – Vitaminas
Para alguns processos deve-se adicionar vitamina pura. Como ácido glutâmico,
biotina.

6 – Oxigênio
Fundamental em processos aeróbios. Deve ser introduzido através da injeção de ar
esterilizado.

VII - Meios de Cultivo

Definição de meios de cultura: Associação equilibrada de agentes químicos

(nutrientes, pH, etc.) e físicos (temperatura, viscosidade, atmosfera, etc) que
permitem o cultivo de microorganismos fora de seu “habitat” natural.

Principais funções de um meio de cultura:

Fornecer condições de crescimento ao microrganismo desejado;
Fornecer condições para a formação do produto desejado;
Isolar e identificar espécies de microrganismos;
Estudar sua morfologia colonial;
Pesquisar sua patogenicidade;

1 - Classificação dos meios de cultivo:

1.1 - Quanto à consistência:

Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma
solução aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou
seja, o meio sofre uma turvação.

Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos
nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacarídeo proveniente de
algas marinhas, chamado ágar. São geralmente utilizados em tubos e a partir
desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana.

Meios sólidos: são aqueles que possuem uma porcentagem maior de ágar (cerca
de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em
tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido
em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, conseguir
o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja
feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em ágar inclinado fornece
somente o crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de
microrganismos.

20/54
1.2 - Quanto à finalidade
Meios de crescimento e conservação: meios cuja composição atende às
exigências nutritivas dos microrganismos, possibilitando o desenvolvimento em
condições satisfatórias.

Meios de enriquecimento: adição ao meio, de determinadas substâncias que

favorecem o desenvolvimento de certas linhagens. São meios adicionados de
substâncias altamente nutritivas, como proteínas (sangue, plasma),
aminoácidos, extrato de órgão de mamíferos, proteína de soja.

Meios seletivos: permitem dominância absoluta e o crescimento muito mais

rápido do microrganismo que se procura isolar. É o caso do não crescimento
das bactérias no meio ácido e a rápida multiplicação das leveduras no mesmo
meio.

Meios de diferenciação: põem em evidência determinadas propriedades

úteis para identificação de diferentes espécies. Ex: a capacidade fermentativa
de açúcares, lançamento de metabólitos ao meio, fazendo alterar o pH do
mesmo, tamanho e aspecto de colônias, etc., que irão auxiliar na diferenciação
de uma espécie para outra.

Meios para fins especiais: são meios que estimulam a capacidade que
certos microrganismos têm, como formação de esporos, produção de enzimas,
etc.

Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso

controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades
nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.

VIII - NORMAS DE SEGURANÇA NO TRABALHO NO LABORATÓRIO DE

MICROBIOLOGIA

As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os

princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas
utilizaremos uma variedade de bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem,
portanto é essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar
contaminações acidentais.

1- O uso do avental é obrigatório.

2- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e
equipamentos.

3- Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática.

21/54
4- Lavar e sanificar as mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que
for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar
no material.

5- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a

análise.

6- Utilizar exclusivamente material estéril para a análise.

7- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a

desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer
ferimentos ou cortes.

8- Não comer, beber ou fumar no laboratório.

9- Manter canetas, dedos e outros longe da boca.

10- Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.

11- Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.

12- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-

os sobre a bancada.

13- Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso.

14- Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na
estufa ou despejar na pia.

15- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou

substâncias inflamáveis por perto.

16- Trabalhe sempre próximo ao fogo.

XI - Técnica de Semeadura

A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de

meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras devem ser seguidas
nas inoculações:
-A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina)
devem ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome
cuidado de esfriá-las antes da coleta.
-Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen.
-Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a
bancada durante o cultivo.

Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o
ágar, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar
as condições de crescimento bacteriano.

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Técnica I: Meio Líquido

1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é

apresentada.
2- Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a
alça.

Técnica II: Meio semi-sólido

1- Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é

fornecida.
2- Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo
semi-sólido.

Técnica III: Meio sólido (ágar inclinado)

1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é

apresentada.
2- Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo
estrias na superfície do ágar.

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Técnica IV: Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento)

1- Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor
na parte de baixo da placa.
2- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é
apresentada.
3- Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma
possível toda a superfície da placa.

X – Processos fermentativos

1 - Produção de Ácido Lático

Para a produção do ácido lático, são as bactérias homoláticas do gênero Lactobacillus

e Streptococcus. A espécie escolhida depende do carboidrato disponível e da
temperatura a ser empregada:

Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus: temperatura na faixa de 45 -

50°C;
L. casei e Streptococcus lactis: temperatura ao redor de 30°c;
L. pentosis, L. leishmanii: temperatura acima de 30°C.

1.1 - Principais características das bactérias láticas

São bactérias Gram +, microaerofílicas, não esporuladas, usualmente não

apresentam motilidade, são catalase-negativa, apresentam colônias pequenas e
pigmentadas

Nutricionalmente muito exigentes. Possuem habilidade biossintética limitada e

necessitam de aminoácidos, vitaminas, purinas e pirimidinas. Necessitam para o
crescimento em laboratório: meios ricos em peptonas e hidrolisados protéicos,
extrato de levedura, vitaminas e nucleotídeos.

São bactérias acidófilas: toleram baixos valores de pH. Tolerância a pH:bastonetes:

não crescem a pH maior que 6,0; pH ótimo para crescimento: 4,5; cocos: pH neutro

Quando crescem na presença de O2, substâncias oxidantes tóxicas ao metabolismo

são produzidas: peróxidos (H2O2), superóxidos (O-2), radical hidroxila (OH-)

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1.2 - Processo de obtenção do ácido lático

Obtém-se o ácido lático a partir de diversas matérias-primas, subprodutos ou

resíduos da indústria alimentícia, como soro do queijo, melaço, glicose de milho.
Empregam-se, também, resíduos de elevada DBO (demanda bioquímica de oxigênio),
como os das indústrias de papel e polpa de celulose, aglomerados que contém
polímeros de açúcar.

Os substratos utilizados são principalmente a glicose, lactose e sacarose. Porém,

substratos amiláceos como de milho, batata e mandioca podem ser empregados,
desde que pré-hidrolisados enzimaticamente.

A concentração em açúcares do mosto é ajustada na faixa de 5 a 20% de

acordo com o microrganismo, a matéria-prima e o processo empregado.

pH - O pH, para propiciar elevado rendimento, deve-se situar nas

proximidades da neutralidade ou na faixa levemente ácida. É
importante manter o pH constante, pois conforme a acidez aumenta, ocorre
uma inibição da fermentação.

Tempo de fermentação - a fermentação se completa entre 1 a 7 dias, mas a

média é de 5 a 7 dias.

Rendimentos - a média é de 85 a 90% em relação ao açúcar consumido

(fermentado). O ácido formado é uma mistura racêmica.

1.3 - A utilização do ácido lático

é usado em alimentos, em fermentações, produtos farmacêuticos,

cosméticos e também na indústria química.
na alimentação, é usado como acidulante em produtos de confeitaria, na
fabricação de extratos, essências, sucos de frutas, refrigerantes e
outros. É empregado, ainda, na conservação de carnes, de vegetais e de
pescado.
na indústria têxtil é usado como mordente para estampar a lã. Emprega-
se, ainda, no preparo de couros e pele. Na fabricação de plástico,
utiliza-se o ácido lático transparente, de qualidade superior.
os lactatos são usados na indústria farmacêutica, de cosméticos e na
alimentícia;
os ésteres são usados principalmente na fabricação de tintas e vernizes,
de plastificantes e também como solventes

1.4 - Fermentação Lática

As bactérias utilizadas industrialmente são as anaeróbias e microaerófilas, para a

produção de ácido acético, lático, glucônico, propiônico e outros, ou para a produção
de alimentos como queijos, picles, chucrutes, vinagres, leites fermentados e outros.

Os fungos também são usados na produção de ácidos por via fermentativa. Os

principais ácidos são: cítrico, glucônico, fumárico, lático, gálico, ácidos graxos e
outros.

As bactérias envolvidas nos processos para obtenção de ácidos são principalmente as

do gênero Acetobacter e Lactobacillus.

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As bactérias podem formar inúmeros ácidos diferentes. São, no entanto, de maior
interesse econômico algumas das bactérias produtoras de ácido lático, ácido acético
e de ácido propiônico.

Os ácidos são provenientes da degradação anaeróbica de glicídeos por oxidação

incompleta.

1.5 - Importância das bactérias láticas na indústria de alimentos

Obtenção de vegetais fermentados: pickles, chucrute, azeitonas, forragem para

gado.

Gênero Leuconostoc - produção de sabor no chucrute; lacticínios: iogurtes, leites

acidificados, queijos, manteiga;

Leuconostoc, S. lactis, S. diacetilactis e L. cremoris: são usados como fontes de

flavorizantes na indústria de lacticínios e são responsáveis pelas diferentes
características conferidas à manteiga, queijos e iogurtes (diacetil).

Carnes curadas: salames e outros embutidos;

Biopolímeros: espessantes; expansor plasmático (plasma para repor volume em

grandes hemorragias).

Flavorizantes: produção de diacetil/acetoína a partir do citrato no leite 1g/L.

1.6 - Aspectos negativos da presença das bactérias ácido-láticas na indústria

Produção de acidez e aromas indesejáveis (diacetil) em: vinhos, sucos,

cervejas e outras bebidas destiladas: Ex. Pediococcus perniciosus e P.
damnosus, encontrados na cerveja.

Deterioração de produtos cárneos, vegetais e frutas.

A síntese de biopolímeros por Leuconostoc mesenteroides, consome sacarose:

na indústria açucareira, reduzindo o rendimento e provocando o entupimento
de filtros, bombas e tubulações.

2 – Produção de cerveja

" Existem muitos métodos de produção de cerveja mas existe apenas um

método básico de produção, e desde que se obtenham os resultados
esperados, um método não é necessariamente melhor que o outro "

2.1 – Mistura: é o processo que transforma os amidos da cevada maltada em

açúcares fermentáveis. Na cervejaria, eles começam espremendo a cevada maltada
entre cilindros para quebrar a semente.

Há uma troca no processo dos cilindros: quanto mais a semente é quebrada, mais
açúcares podem ser extraídos dos grãos; mas se elas estiverem muito quebradas, a
casca da semente pode esfarelar, o que pode prender a mistura. Se a semente for
quebrada somente o necessário, quando a mistura acabar, todas as cascas formam
um filtro que captura quaisquer sólidos que estejam no líquido; mas se as cascas

26/54
estiverem muito quebradas, elas entopem e não deixam o líquido passar: uma
mistura presa.

Moinho de grãos

A seguir, os grãos espremidos passam por um cano de alimentação para o cuba-filtro

da mistura. Este vasilhame separado tem um dispositivo chamado de hidratante, que
espirra água quente nos grãos conforme eles chegam, o que elimina quaisquer
elementos secos na mistura. Elementos secos significam açúcares desperdiçados. Os
grãos úmidos ficam no cuba-filtro da mistura por uma hora. Uma vez que o
vasilhame é separado, a temperatura permanece em aproximadamente 65°C.

O cuba-filtro da mistura

O objetivo da mistura é transformar os amidos da cevada maltada em açúcares

fermentáveis, que possam ser usados na próxima etapa do processo de fabricação da
cerveja. Amidos são séries de muitas moléculas de glicose encadeadas: estes
encadeamentos precisam ser quebrados em cadeias de apenas duas ou três
moléculas de glicose antes de poderem ser fermentadas. Aprendemos anteriormente
que a cevada maltada contém enzimas que podem quebrar o amido.

Existem dois tipos diferentes de enzimas na cevada maltada: alfa-amilase e beta-

amilase. As enzimas alfa quebram os longos encadeamentos dos amidos dividindo-
os na metade. As enzimas beta quebram os amidos cortando-os em pares, a partir

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do final da cadeia. A conversão só acontece se estas duas enzimas trabalharem
juntas durante um tempo razoável. Mas há um problema: as enzimas alfa são mais
ativas de 65° a 67°C e as beta são mais ativas de 52° a 62°C, portanto, a
temperatura e duração da mistura precisa ser cuidadosamente controlada para se
obter uma boa transformação.

As últimas etapas necessárias para completar a mistura são a filtragem e a

lavagem dos resíduos do malte. O líquido é tirado do fundo da cuba-filtro da
mistura e recolocado na parte de cima, para ser filtrado pelas cascas dos grãos. É
colocada então mais água quente nos grãos (processo chamado de lavagem dos
resíduos do malte), para garantir que todos estes açúcares sejam removidos.

A mistura é um processo incrível. Antes de seu início, os grãos não são doces, mas o
líquido que é retirado deles no final da mistura é bem doce e pegajoso. Este líquido,
que agora contém a maioria dos açúcares fermentáveis, vai para a fervura.

2.2 – Fervura: Quando a fervura terminar, teremos um mosto finalizado.

Para começar, o líquido da mistura é colocado em uma enorme caldeira de cerveja.

Ela é uma caldeira de cerveja de vapor tampada. Esta caldeira tem paredes
duplas com um espaço entre elas, pelo qual o vapor circula. Isto produz muito mais
calor, uma vez que o fundo e as laterais estão sendo aquecidas. A temperatura é
elevada até que o líquido se transforme numa robusta fervura, sendo mantida assim
por 90 minutos.

Um mosto fervendo

No começo da fervura são colocados os lúpulos, que agora são chamados de lúpulos
de fervura, e cuja tarefa é amargar a cerveja. Os ácidos que produzem o amargor
na cerveja não são fáceis de serem extraídos dos lúpulos, motivo pelo qual precisam
ser fervidos durante até 90 minutos. Os óleos que produzem o sabor e aroma do
lúpulo são muito voláteis e evaporam rapidamente, portanto os lúpulos de fervura só
contribuem para o amargor da cerveja (o sabor e o aroma são adicionados depois).

Caldeira de cerveja

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Dependendo do tipo da cerveja que está sendo fabricada, mais lúpulos podem ser
adicionados perto do final da fervura: são os chamados lúpulos finalizadores.
Geralmente, os lúpulos que são adicionados aproximadamente 15 minutos antes do
final contribuem para o sabor da cerveja. Os que são adicionados apenas alguns
minutos antes do final contribuem para o aroma da cerveja. Os óleos dos lúpulos que
dão à cerveja um cheiro diferente são os mais voláteis, portanto só precisam ficar no
mosto quente por alguns minutos, como as folhas de chá, para extrair os óleos.

2.3 – Separação dos sólidos: Antes do mosto ir para a próxima etapa, todos os
sólidos precisam ser separados do líquido, o que é feito de forma muito limpa. O
mosto é bombeado da caldeira e colocado novamente nela através de um jato. Este
fluxo do líquido forma um redemoinho - se você já mexeu folhas de chá numa xícara,
sabe que elas se movem para o centro do redemoinho. Quando este redemoinho é
formado na caldeira de cerveja, todos os lúpulos e outros sólidos vão para o centro.
A bomba então é desligada durante os próximos 20 minutos, o redemoinho pára
gradualmente e os sólidos vão para o fundo, formando um cone sólido.

A bomba que provoca o redemoinho na cerveja

Quando o mosto é drenado, os sólidos ficam na caldeira. A seguir, o mosto precisa

ser resfriado até a temperatura adequada para a levedura, o que é feito num
dispositivo de troca de calor de líquido para líquido. O mosto circula por um conjunto
de tubos enquanto água resfriada circula em outro conjunto. Os tubos com o mosto
quente transferem o calor para os tubos com a água resfriada.

Dispositivo de troca de calor

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A água é resfriada primeiro, então o volume de água necessário para esfriar um lote
inteiro de mosto é quase o mesmo do mosto. A água resfriadora termina o processo
numa temperatura de aproximadamente 76°C e é armazenada em um tanque
separado para o próximo lote de cerveja. Desta forma, economiza-se água e a
energia necessária para aquecê-la.

Tanques de armazenamento de água quente e fria

É importante resfriar rapidamente o mosto, para que a levedura possa ser colocada
logo em seguida e a fermentação comece. Isto reduz as chances de contaminação
por leveduras soltas no ar.

2.4 – Fermentação: é o processo no qual a levedura é transformada de glicose no

mosto para álcool de etileno e dióxido de carbono gasoso, tanto alcoolizando a
cerveja (em inglês) quanto a carbonizando. Para começar o processo de
fermentação, o mosto resfriado é transferido para um vasilhame de fermentação, no
qual a levedura já foi colocada. Se a cerveja que está sendo feita for uma ale, o
mosto será mantido numa temperatura constante de 20°C durante duas semanas. Se
a cerveja for lager, a temperatura será mantida a 9°C durante seis semanas. Uma
vez que a fermentação produz muito calor, os tanques precisam ser constantemente
resfriados para manter a temperatura adequada.

Tanques de fermentação

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Estes tanques de fermentação agüentam mais de 9 mil litros, o que significa que são
necessários 4 lotes de mosto para encher um tanque. Uma vez que a fermentação
demora no mínimo duas semanas, a capacidade de produção de cerveja é limitada
pela quantidade de tanques que se tem.

Quando o mosto é adicionado na levedura, a densidade específica da mistura é

medida. Mais tarde, a densidade específica precisa ser medida de novo para
determinar quanto álcool há na cerveja e para saber quando parar a fermentação.

O fermentador é fechado, exceto por um longo e fino cano de ventilação, que

permite que o dióxido de carbono saia do fermentador. Uma vez que há um fluxo
constante de CO2 no cano, o ar externo não consegue entrar no fermentador, o que
reduz a ameaça de contaminação por leveduras soltas.

Quando a fermentação estiver quase pronta, a maior parte da levedura irá para o
fundo do fermentador, que tem forma de cone, o que facilita a captura e remoção da
levedura, que é economizada e usada no próximo lote de cerveja. Ela pode ser
reutilizada algumas vezes até que comece a produzir um gosto diferente: lembre
que a fabricação comercial de cervejas tem tudo a ver com a consistência.

Enquanto a fermentação ainda estiver acontecendo e quando a densidade específica

tiver alcançado um nível pré-determinado, o tubo de ventilação de dióxido de
carbono é fechado. Como a fermentação continua, a pressão continua produzindo
CO2. É assim que a cerveja recebe a maior parte de sua carbonação, sendo o
restante adicionado mais tarde no processo. Deste ponto em diante, a cerveja ficará
sob pressão (exceto por um pequeno período durante o engarrafamento).

No término da fermentação, a cerveja é resfriada para aproximadamente 0°C, o que

ajuda a levedura restante a ir para o fundo do fermentador, junto a outras proteínas
indesejáveis que saem da solução nesta temperatura baixa.

Agora que a maioria dos sólidos foram para o fundo, a cerveja é lentamente
bombeada do fermentador e filtrada, para remover quaisquer sólidos que possam ter
ficado. Do filtro a cerveja vai para outro tanque, chamado de tanque da cerveja
limpa. Esta é a sua última parada antes do engarrafamento e do preenchimento de
barris. Aqui, o nível de dióxido de carbono é ajustado, formando um pouco de CO2
extra na cerveja através de uma pedra porosa.

2.5 - Engarrafamento e preenchimento de barris: A coisa mais importante no

processo de engarrafamento e preenchimento de barris é evitar que a cerveja seja
contaminada por leveduras soltas e manter o oxigênio longe da cerveja. Estes são os
principais fatores que reduzem o tempo de validade da cerveja.

As maneiras como a cerveja é transferida para garrafas e barris são bastante

parecidas, mas o engarrafamento tem algumas etapas a mais.

Para começar o processo, as garrafas vazias são colocadas na linha de

engarrafamento, onde primeiro são limpas com uma solução de cloro e depois
submetidas a um jato de CO2 para retirar a solução.

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 Limpeza da garrafa: esta seção inverte as garrafas,
limpa-as com solução, seca-a com CO2 e, então,
coloca as garrafas em pé novamente

A seguir, as garrafas entram num mecanismo parecido com uma torre, que comporta
12 garrafas. Cada garrafa gira em torno da torre uma vez, sendo limpa com CO2
várias vezes antes de ser preenchida. Isso impede que quando a cerveja for
colocada faça muita espuma. Depois a pressão é lentamente diminuída até que a
cerveja retorne à pressão do ambiente. Assim que cada garrafa sai da torre,
outra vazia toma o seu lugar.

Estação de preenchimento de garrafas

A seguir vem a máquina de fechamento, mas agora existe um pouco de espaço vazio
na parte superior da garrafa que precisa ser limpo. Para tanto, a garrafa é passada
sob um jato d 'água bem estreito e de alta pressão, produzindo espuma e retirando o
ar da garrafa. A tampa então é colocada antes de que qualquer ar consiga entrar na
garrafa novamente.

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 Máquina de fechamento de garrafas

Depois de colocada a tampa, o exterior da garrafa é limpo para retirar a cerveja que
pode ter escorrido durante o processo.

Limpeza de garrafas: observe a espuma na garrafa

Surpreendentemente, a parte mais difícil do processo de engarrafamento é a

colocação da etiqueta na garrafa. Colar uma etiqueta numa garrafa molhada de
cerveja fria não é uma tarefa fácil.

As etiquetas são colocadas na máquina de etiquetagem, que tem um dispositivo

giratório que passa cola nas etiquetas e então as gruda nas garrafas conforme elas
vão passando. Se tudo correr bem, a etiqueta ficará corretamente posicionada e terá
aderido bem à garrafa.

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 Máquina de etiquetagem

Uma impressora de tinta especial imprime na etiqueta as datas de engarrafamento e

vencimento da cerveja (três meses depois do engarrafamento).

Impressora de etiquetas

3 – Fabricação de vinho

O início do processo de produção

A época de colheita das uvas é especial. Alguns vinhedos utilizam técnicas mecânicas
de colheita, mas a maioria emprega trabalhadores para colher as uvas com as mãos.
Depois, as uvas são trazidas para a vinícola. Muitas vinícolas são localizadas dentro
dos vinhedos ou perto deles. Se a distância para a vinícola for grande, as uvas são
transportadas em caminhões refrigerados.

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 Quando as uvas chegam à vinícola, elas são prensadas

3.1 – Prensagem: As uvas são prensadas ao chegar à vinícola. Dentro da prensa,

existe um tambor giratório perfurado. Os buracos no tambor permitem que o suco e
a casca das uvas passem, mas os galhos ficam retidos dentro do tambor. As uvas
prensadas e o suco são conhecidos como mosto.

O que acontece em seguida depende do tipo de uva. A uva tinta (com casca) deve
ser enviada diretamente para os tanques de fermentação. As uvas brancas são
enviadas para uma prensa de vinho, onde o suco é separado da casca, já que o
vinho branco é produzido pela fermentação de uvas sem casca.

A prensa de vinho onde o suco é separado da casca

A prensa de vinho é um cilindro de aço inoxidável dentro do qual há uma bexiga

inflável de borracha. O mosto é colocado no cilindro, e a bexiga é inflada com ar. A
bexiga espreme a casca contra a parede do cilindro e força o suco a sair. O suco é
coletado e enviado para os tanques de fermentação. Em algumas vinícolas, as cascas
são recicladas e utilizadas como fertilizantes.

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3.2 – Fermentação: O mosto, seja ele de uvas tintas ou de uvas brancas
prensadas, é enviado para os tanques de fermentação. Os tanques de
fermentação são vedados, feitos de aço inoxidável e podem armazenar de 5 mil a
12 mil litros. Os tanques são refrigerados, para evitar que a temperatura suba
demasiadamente. O produtor adiciona açúcar e levedura para começar o processo de
fermentação. O tipo de levedura e a quantidade de açúcar dependem do tipo de
uva.

Tanques de fermentação

Quando a levedura entra em contato com o mosto, a concentração de glicose

(C6H12O6) é muito alta, então a glicose entra na levedura através da difusão. Na
verdade, enquanto existir glicose na solução, ela continua entrando na levedura.
Cada molécula de glicose que entra na levedura passa por um processo de dez
passos chamado glicólise. A glicólise gera dois açúcares, chamados ácido pirúvico
e ATP . O ATP fornece energia para a levedura para que ela se multiplique. O ácido
pirúvico são convertidos em dióxido de carbono (CO2) pela levedura e etanol
(CH3CH2OH), que é o álcool no vinho. A reação é:

C6H12O6 => 2(CH3CH2OH) + 2(CO2)

O processo de fermentação dura de 2 a 4 semanas. Durante esse tempo, o produtor

de vinho recolhe a amostra da fermentação do mosto e mede os níveis de pH para
saber se o processo está acontecendo corretamente.

3.3 – Armazenamento: Somente depois que processo de fermentação é concluído,

é que os vinhos tintos são enviados para a prensa para separar a pele do vinho. Os
vinhos são filtrados e a levedura é removida. Os vinhos brancos (que já estão sem a
casca) são colocados para descansar e a levedura é filtrada. Depois disso, os vinhos
são armazenados em tanques de aço inoxidável ou barris de carvalho (o carvalho dá
um sabor característico a muitos vinhos) dependendo do tipo de vinho. Em alguns
vinhos um segundo tipo de fermentação - chamado fermentação maloláctica - é
executado durante o armazenamento. Na fermentação maloláctica, o produtor
adiciona uma bactéria ao vinho que transforma o ácido málico, um subproduto do
metabolismo aeróbico (que requer oxigênio) em ácido lático, um subproduto do
metabolismo anaeróbico (que não requer oxigênio). O ácido lático é mais suave do
que o ácido málico. O processo de envelhecimento pode demorar de três meses a
três anos.

36/54
 O vinho, dependendo do tipo, é armazenado em barris de
carvalho ou tanques de aço inoxidável

3.4 – Engarrafamento: Depois que o produtor achar que o vinho envelheceu o

suficiente, é hora de engarrafá-lo e vendê-lo. O operador bombeia o vinho do tanque
de armazenamento para a máquina de engarrafar. O vinho é transportado
manualmente e uma quantidade pré-medida é colocada em cada garrafa. Depois que
cada uma é preenchida, o operador a coloca na máquina de rolha. A máquina cria um
vácuo dentro da garrafa, que suga a rolha para o gargalo da garrafa.

Máquinas de engarrafar (esquerda) e máquinas de

colocar rolhas (direita)

Depois que a rolha está na garrafa, o operador coloca a garrafa na máquina, que
envolve o gargalo com papel alumínio ou plástico (a cápsula). Depois, o operador
coloca a garrafa na máquina que cola o rótulo. Finalmente, o operador coloca a
garrafa dentro de uma caixa que vai ser distribuída.

37/54
 A máquina que coloca alumínio no gargalo (esquerda) e
a máquina que cola os rótulos (direita)

Muitas vinícolas promovem passeios para que as pessoas conheçam o processo de

elaboração do vinho. Algumas também têm salas de degustação onde você pode
provar e comprar os produtos

4 – Fabricação de fermento biológico

É um produto obtido a partir de culturas puras de leveduras do tipo Saccharomyces

cerevisiae, que por processo de fermentação para obtenção de biomassa, são
separadas fisicamente por prensagem ou filtração.

1 – Matérias-primas:

Leveduras: cultura pura de Saccharomyces cerevisiae;

Melaço de cana:
O melaço é resultante da etapa de centrifugação ou de decantação, no processo
de fabricação de açúcar, ou seja, é um subproduto de usinas de açúcar. Contém
açúcares redutores e parte de sacarose não cristalizada. É utilizado na
fermentação para produção de álcool, em especial o etanol, como matéria-prima
para fabricar cachaça, rum e fermentos biológicos.

Uréia ou amônia líquida: fonte de nitrogênio para as leveduras;

Ácido fosfórico ou outros sais: fonte de P2O5 para as leveduras;
Sais minerais;
Vitaminas.

2 – Fermentação:

O melaço bruto é diluído a 15º Brix, esterilizado e armazenado em tanques

fermentadores.

A etapa de fermentação divide-se 2 fases:

Laboratorial: inocula-se um tubo de cultura pura em 500mL de mosto

esterilizado e incuba-se por 24h em temperatura de aproximadamente 30ºC;
Transfere-se o conteúdo fermentado para 8 litros de mosto e incuba-se por
48h,

38/54
Tubo com cultura Melaço diluído Última etapa
e esterilizado fase laboratório

Industrial: transfere-se a última fase laboratorial para um tanque

fermentador com 10 mil litros de mosto e fermenta-se por mais 10h. Após
esse tempo transfere-se o conteúdo para outro tanque com 40 mil litros de
mosto e fermenta-se por mais 6 a 10h.

Esse último tanque de fermentação é transferido para outro tanque de fermentação,

totalizando um volume de 100 ton e fermenta-se por mais 12h que é a etapa final da
fermentação.

10 mil Litros 40 mil Litros 100 ton

Durante as fermentações deve-se controlar o pH entre 4,0 a 5,4 e a temperatura de

30 a 36ºC. A aeração (ar esterilizado) constante do mosto é muito importante para
produção de biomassa, pois deve ser uma fermentação aeróbia.

3 – Centrifugação:

Após o término da fermentação, o mosto resultante é centrifugado e lavada, dando

origem a um creme que fica estocado sob refrigeração até o momento de ser filtrado.

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4 – Filtração:

A filtração é feita por filtros rotativos à vácuo, a água retirada é descartada e a

massa celular é submetida à última etapa do processo: corte e embalagem.

3 – Tipos de fermento biológico:

Creme de leveduras: é um creme concentrado, pode ser usada em

panificação, deve ser armazenada em temperaturas entre 1 a 8ºC por 5 dias;

Fermento fresco: é uma massa de fermento que possui entre 65 a 70% de

umidade, deve ser armazenada entre 1 a 8ºC por 45 dias;

Fermento seco: é produzido pela secagem do fermento fresco, possui de 7 a

9% de umidade e pode ser guardado por 6 meses em temperatura ambiente;

Fermento seco instantâneo: o fermento é seco até 4 a 6% de umidade e tem vida útil de
2 anos em temperatura ambiente.

5 - Fabricação de Etanol

O etanol pode ser produzido com a fermentação de qualquer produto que contenha
açúcar ou outro carboidrato.

1- Matérias-primas:

Melaços – resíduo da produção de açúcar, constituída de 20% de água, 62%

de açúcares, 8% de cinzas, 3% de materiais nitrogenados e 7% de outros,
como goma e ácido, ou seja, cerca de 50% de açúcares fermentescíveis;

Caldo de cana de açúcar – obtido pela moagem da cana, contituída de 78 a

86% de água, 10 a 20% de sacarose, 0,3 a 0,5% de cinzas e 0,5 a 1,0% de
compostos nitrogenados;

40/54
2 – Preparação do sustrato (mosto):

O melaço é diluído com água enter 15 e 25º Brix.

No Brasil os mostos nas destilarias de álcool e de aguardente não constumam serem
esterilizados, usam-se antissépticos para criar ambiente favorável ao
desenvolvimento das leveduras e desfavorável a outros microrganismos. O ácido
sulfúrico, que se usa para a correção do pH do meio, age como antisséptico. A
penicilina também é um bom inibidor de contaminações.

3 – Preparo do inóculo (microrganismo):

Usam-se leveduras selecionadas com tolerância a altos teores de etanol e com boa
velocidade de fermentação.
Fermentos secos para panificação: usa-se 10 a 20g de leveduras para cada
litro de mosto (para volumes de mil a 10 mil litros iniciais de mosto com
concentração de 13 a 15º Brix, que depois de fermentados são divididos em
diversos fermentadores e realimentados com mostos diluídos até completar o
volume total das dornas nas destilarias.

Tubos de culturas selecionadas: nesse tipo de preparo do inóculo, existe a

fase laboratorial, onde um tubo de cultura é inoculado à 100mL de mosto
esterilizado com 5º Brix. Depois de fermentado passa-se para 500mL a 7º Brix
, este passado para 2500mL a 9º Brix e finalmente para 12500mL a 11º Brix.
A partir da última etapa laboratorial, passa-se o conteúdo para os tanques
fermentadores.

4 – Fermentação:

A fermentação na fase industrial pode ser dividido em 3 fases:

Fase preliminar: inicia-se no momento do contato do levedo com o mosto.
Ocorre uma multiplicação celular intensa, pequena elevação de temperatura e
pequeno desprendimento de dióxido de carbono. Sua duração é de 4 a 6h
variando de acordo com o sistema de fermentação de cada destilaria.

Fase tumultuosa: ocorre o desprendimento volumoso e intenso de dióxido de

carbono, elevação de temperatura, redução da densidade do mosto e elevação
da porcentagem de álcool e acidez. O aspecto da espuma difere para cada raça
de levedura e para cada tipo de substrato. A fase dura de 12 a 16h.

Fase final ou complementar: ocorre a diminuição do desprendimento do

dióxido de carbono e diminuição da temperatura, a concentração de açúcares
chega ao fim. Essa fase dura de 4 a 6h.

5 – Destilação e retificação:

Efetua-se a destilação do vinho, como é chamado o substrato fermentado, em

colunas de destilação, obtendo-se um líquido com teor alcoólico mais rico, mas, com
impurezas como dióxido de carbono, aldeído acético, entre outros.
Para retirar essas impurezas, emprega-se a retificação, operação pela qual separa-se
o álcool dessas impurezas.

6 – Desidratação:

Para obtenção de álcool com concentração superior a 97,2% em volume, emprega-se

a desidratação do etanol, que pode ser classificado em 2 processos:

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 Processo químico: emprega-se substâncias químicas como óxido de cálcio,
acetato de sódio, carbonato de potássio e outros, que são capazes de absorver
a água do etanol retificado;

Processo físico: baseia-se na variação da pressão, absorção de vapores

usando corpos sólidos, destilação em presença de um terceiro corpo e uso de
absorventes regeneráveis.

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 Aula Prática I

I - Título: Microscopia

II - Objetivo:
1 - Aprender os cuidados exigidos na utilização do microscópio;
2 – Aprender a preparar uma lâmina simples para microscopia utilizando fermento
biológico, fungos e outros materiais trazidos pelos alunos;

Microscópio:
1 = ocular
2 = objetivas e revólver
3 = platina
4 = charriot
5 = macrométrico
6 = micrométrico
7 = diafragma no condensador
8 = condensador
9 = botão do condensador
10 = dois parafusos centralizadores do
condensador
11 = fonte de luz
12 = controle de iluminação
13 = diafragma de campo (alavanca no lado
esquerdo do microscópio)
14 = dois parafusos de ajuste da lâmpada
(esquerdo e direito)
15 = focalizadora da lâmpada (alavanca no lado
direito do microscópio - não visível na fotografia)

Manipular o microscópio com as mãos limpas;

Cuidado para não subir muito a platina com a lâmina e não quebrá-la forçando
na lente objetiva;
Limpar o microscópio toda vez que cair alguma partícula sobre ele;
Ajustar sempre as lentes de acordo com a visão de cada um, usando o botão 5
e 6 que são o macrométrico e o micrométrico;
Ao terminar deixar o microscópio da forma que foi encontrada: Platina
abaixada e retraída, na objetiva menor, desligada, coberto e fora da tomada.

III - Materiais:
Microscópio;
Lâmina para microscopia;
Lamínula para microscopia;
Béquer de 300mL;
Bagueta ou bastão de vidro;
Envelope de fermento biológico seco;
Água destilada;
Papel higiênico macio ou lenço de papel;
5 espátulas;
Caixa de lâminas prontas;
Bandeja para acomodar as lâminas e lamínulas lavadas;

IV - Procedimento:
Hidratar o fermento com aproximadamente 250mL de água destilada;
Colocar a lâmina sobre a bancada e pingar uma gota da solução de fermento;

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 Colocar uma lamínula sobre a gota e retirar o excesso com papel macio
apenas apertando o papel com a mão sem deslizar a lamínula;
Colocar a lâmina pronta no microscópio e iniciar a focalização
cuidadosamente;
Anote as observações feitas;
Após a utilização da lâmina, a mesma deve ser lavada com água e colocada na
bandeja;
Proceder da mesma forma para preparar lâmina de outro material;
Podem ser escolhidas lâminas prontas também, disponíveis na caixa de
lâminas do laboratório.

V - Observações

Material Observações Ilustração

VI – Conclusão:

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 Aula prática II

I - Título: Fermentação

II - Objetivo: Observar a atividade fermentativa da levedura Saccharomymes

cervisae.

III - Materiais:
1 L de solução de Açúcar à 30%;
1 L de solução de Melaço de cana à 30%;
Fermento biológico fresco;
Água destilada;
Termômetro;
Proveta de 50mL;
Bico de Bunsen;
Tripé;
Tela de amianto;
2 Erlenmeyers de 250mL;
Fósforo;
Bexigas;
Elástico;
Papel indicador Universal;

IV - Procedimento:
Separar 2 erlenmeyers na bancada. Colocar 100mL das soluções de açúcar e
de melaço de cana (uma solução em cada erlen);
Dividir o tablete de fermento biológico ao meio (12,5g) e reservar;
Aquecer a solução de Açúcar e de Melaço que estão no erlen até
aproximadamente 37°C;
Colocar metade do fermento em cada erlen, dissolver bem o fermento
Acoplar a bexiga na boca do erlen e vedar bem com auxílio de um elástico.
Não deixar o erlen direto na bancada, pois vai esfriar muito rápido, coloque em
cima de uma tela de amianto;
Observe a fermentação;
Caso haja necessidade, aqueça levemente a solução;

V - Observações:

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VI – Questionário

1) Por que a bexiga ficou cheia? O que fez a bexiga encher?

2) Qual das 2 matérias-primas é melhor utilizar em escala industrial? Por que?
3) Por que a solução fermentada fica com cheiro de álcool?

VII - Conclusão:

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 Aula prática III

I - Título: Fatores que influenciam no crescimento microbiano

II - Objetivo: Observar e comprovar que, variando alguns fatores, os

micorganismos se comportam de diferentes maneiras. Na experiência faremos a
variação de pH, temperatura e ausência de oxigênio.

III - Materiais:
5 copinhos descartáveis de café numerados e com a identificação do grupo;
Bico de Bunsen;
Tela de amianto;
Tripé;
Béquer de 600mL;
Bagueta ou bastão de vidro;
Espátula;
Fósforo;
Balança semi-analítica;
Amido de milho ou farinha de trigo;
Ácido acético (vinagre);
Solução de hidróxido de sódio 1%;
Óleo de soja;
Bandeja pequena;
Caneta de retro;
Pincel atômico;

IV - Procedimento:
Pesar no béquer de 600mL aproximadamente 20g de amido de milho ou
farinha de trigo;
Colocar aproximadamente 200mL de água destilada, mexer bem até dissolver
todo o sólido;
Levar ao bico de Bunsen até formar uma massa cremosa e consistente
(mingau);
Deixar esfriar um pouco e distribuir nos copinhos descartáveis, colocar até a
metade do copinho;
Depois seguir a sequência abaixo:
Copo 01 = pingar 10 gotas de ácido acético e mexer bem, colocar em
temperatura ambiente;
Copo 02= pingar 10 gotas de hidróxido de sódio e mexer bem, colocar
em temperatura ambiente;
Copo 03 = colocar óleo de soja até cobrir totalmente o mingau, colocar
em temperatura ambiente;
Copo 04 = somente o mingau, colocar na geladeira;
Copo 05 = somente o mingau, colocar em temperatura ambiente;

Deixar em local que ninguém mexa e observar na próxima aula.

V – Observações:

VI – Conclusão:

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 Aula prática IV

I - Título: Técnicas microbiológicas

II - Objetivo:
1 – Aprender a técnica de distribuição de meio de cultura em placas com auxílio de
bico de Bunsen;
2 – Aprender a técnica de swab para verificação de contaminação;
3 – Observação de diferentes tipos de colônias microbianas que crescem em meio
contaminado;

III - Materiais:
Meio de cultura para crescimento misto (fungos e bactérias) esterilizado em
erlen e fundido;
Placas de Petri descartáveis;
Cotonetes esterilizados;
Bico de Bunsen;
Pisseta com álcool;
Fósforo;
Caneta de retro;
Estufa de incubação.

IV - Procedimento:
Desinfetar a bancada de trabalho com álcool;
Lavar as mãos com sabão e depois passar álcool;
Organizar os materiais na bancada em torno do bico de Bunsen;
Acender o bico de Bunsen regulando a chama;
Não conversar para evitar contaminação do meio de cultura;
Fazer a distribuição do meio de cultura do erlen para as placa de Petri (colocar
aproximadamente 15mL, tomando cuidado para não derramar fora da placa e
dentro do raio de segurança em torno da chama);
Deixar esfriar;
Pegar o cotonete e esfregar no local que queira testar a contaminação;
Passar o cotonete contaminado levemente sobre o meio de cultura (cuidado
para não rasgar o meio de cultura);
Identificar o grupo e o contaminante na placa;
Incubar à 35º C em estufa até próxima aula, com a placa invertida;
Observar as colônias desenvolvidas em cada placa e anotar o aspecto das
colônias;

V – Observações:

VI – Conclusão:

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Questionário I

Define-se citoplasma de uma bactéria como:

a – Um envoltório rígido que protege a bactéria contra as agressões físicas do
ambiente;
b – Um líquido viscoso onde se encontra uma região chamada nucleóide;
c – Uma secreção pegajosa que envolve a parede celular protegendo a bactéria da
fagocitose;
d – Uma membrana localizada sob a parede celular constituída de fosfolipídios;
e – Um líquido viscoso constituído por polissacarídios dissolvidos em água;
f – Nenhuma das anteriores.

A reprodução assexuada das bactérias por divisão binária consiste:

a – Na transferência de fragmentos de DNA de uma célula para outra;
b – Na duplicação da célula bacteriana sem a duplicação do cromossomo,
originando duas novas bactérias;
c – Na duplicação do cromossomo bacteriano bem como a divisão da mesma
originando duas novas bactérias;
d – Na fragmentação de um micélio bacteriano dando origem a outra bactéria
idêntica;
e – Na combinação de cromossomos de bactérias onde esta, se divide ao meio,
originando duas novas bactérias idênticas a ela;
f – Nenhuma das anteriores.

No processo sexuado de reprodução das bactérias, a transdução é:

a – Absorção de moléculas de DNA dispersas no meio;
b – Transferência de moléculas de DNA de uma bactéria a outra através de pelos
sexuais;
c – Passagem de pedaços de DNA de uma bactéria macho para a bactéria fêmea
através de microscópicos tubos protéicos;
d – Fragmentação de DNA através da esporulação bacteriana;
e – Duplicação do material genético e divisão celular originando duas novas
bactérias;
f – Nenhuma das anteriores.

Os estreptococos são agrupamentos de bactérias esféricas, a forma de seu

agrupamento pode ser definida como:
a – Agrupamento em cadeias longas;
b – Agrupamento irregular lembrando cachos de uvas;
c – Agrupamento em pequenas cadeias de amino-ácidos;
d – Agrupamento de células isoladas;
e – Agrupamento de cocos fragmentados em forma de cachos de uva;
f – Nenhuma das anteriores.

Analisando a classificação das bactérias quanto a cadeia alimentar, podemos

defini-los como:
a – Anaeróbios fermentantes e quimiossintetizantes que utilizam energia liberada
em reações inorgânicas;
b – Autótrofas que dependem de outros grupos para se alimentarem e
heterótrofos que produzem seu próprio alimento;
c – Saprófitas que produzem seu próprio alimento e heterótrofas anaeróbios
fotossintetizantes que dependem de outros grupos para se alimentarem;
d – Heterótrofas que dependem de outros grupos para se alimentarem e
autótrofas fermentantes;

49/54
 e – Autótrofas que produzem seu próprio alimento e heterótrofas que dependem
de outros grupos para se alimentarem;
f – Nenhuma das anteriores.

Qual a classificação dos microrganismos diante da presença ou ausência de

oxigênio?

Questionário II

1) Cite quais as formas de medida de crescimento microbiano.

2) Qual o princípio da turbidimetria na medida de crescimento microbiano?
3) Qual a diferença entre contagem do número total de indivíduos e a contagem
de microrganismos viáveis como forma de medida de crescimento microbiano?
4) Quais são as fases do crescimento microbiano em um processo de fermentação
descontínuo e o que ocorre em cada uma delas?
5) Cite os fatores que influem no crescimento microbiano.
6) Como são classificados as bactérias de acordo com a temperatura ótima de
desenvolvimento?
7) Por que a água é indispensável no crescimento microbiano se ele não é
considerado um nutriente?
8) Qual a função da agitação em um processo fermentativo?
9) Onde os microrganismos são utilizados pelo homem para produção de
alimentos?
10) Qual a constituição de um meio de cultura?
11) Como podemos definir meios de cultura seletivos e diferenciais?

Questionário III

1 – Existem fatores ambientais que influenciam no crescimento de microrganismos?

Você saberia explicar quais são esses fatores?
2 – Todos os microrganismos necessitam de oxigênio para se desenvolver ou têm
aqueles que se desenvolvem sem o oxigênio? Você sabe como eles são classificados?
Explique sua resposta.
3 – Como são classificados os microrganismos quanto à temperatura?
4 – Explique pó que alguns processos fermentativos apresentam a fase Lag extensa.
5 – Cite 5 itens importantes de norma de segurança no trabalho num laboratório de
microbiologia.
6 – No processo de fabricação da cerveja, quais os tipos de microrganismos
podemos utilizar?
7 – O que é Lúpulo?
8 – Por que é tão importante a fase de maturação do processo de fabricação da
cerveja?
9 – Qual a diferença entre a cerveja e o chope?
10 – Quais os tipos de microrganismos podemos utilizar no processo de obtenção de
ácido lático?
11 – Onde pode ser empregado o ácido lático nas indústrias de alimentos?
12 – Terminada a etapa de fermentação no processo de fabricação do ácido lático, a
próxima etapa é o aquecimento. Qual sua finalidade?
13 – Por que é utilizado aço inoxidável para fabricação dos equipamentos usados no
processo de obtenção do ácido lático?
14 – No processo de fabricação do fermento biológico, por que é tão importante a
aeração?
15 – Quais os tipos de fermento biológico que podem ser comercializados;

50/54
 16 – No processo de fabricação do etanol, o mosto não é esterilizado. Como as
indústrias lidam com as contaminações microbiológicas?
17 – Quais são os processos para concentração do teor alcoólico do etanol? Explique
cada um deles.
18 – Qual a diferença entre o vinho branco e o tinto?
19 – Em quais situações interrompe-se a fermentação no processo de fabricação do
vinho?
20 – Na produção de vinho, existe uma seleção de tipos de uvas para cada tipo de
vinho? Explique.

Questionário IV

1) Dentre os fatores que influenciam no crescimento microbiano, está a

temperatura. De acordo com a temperatura, os microrganismos,
especialmente as bactérias, podem ser classificadas em 3 grupos, são eles:
a – criófilas ou pscicrófilas crescem em torno de 1ºC / termófilas crescem em
torno de 70ºC / mesófilas crescem entre 20 e 40ºC;
b – termófilas crescem em torno de 10ºC / criófilas crescem em torno de 60ºC /
mesófilas crescem entre 20 e 40ºC;
c – pscicrófilas crescem em torno de 37ºC / mesófilas crescem em torno de 60ºC
/ criófilas crescem entre 20 e 40ºC;
d – pscicrófilas crescem em torno de 10ºC / termófilas crescem em torno de 60ºC
/ mesófilas crescem entre 20 e 40ºC;
e – Mesófilas crescem em torno de 37ºC / termófilas crescem em torno de 50ºC /
criófilas ou psicrófilas crescem entre 20 e 30ºC;
f – Nenhuma das anteriores.

2) Os microrganismos desempenham um papel importante na produção de

alimentos. O homem emprega-os nas indústrias como:
a – agentes de fermentação láctica / agentes produtores de ácidos / agentes de
fermentação alcoólica / panificação;
b – agentes de fermentação alcoólica / panificação / agentes de produção de
leucócitos / agente de fermentação láctica;
c – panificação / agentes fermentação biológica / agentes produtores de fermento
biológico / agentes produtores de ácidos;
d – agentes produtores de leveduras / panificação / agentes produtores de
glicídeos / agentes produtores de lactobacilos;
e – agentes de fermentação láctica / panificação / agentes de fermentação
glicólica / agentes produtores de ácidos;
f – Nenhuma das anteriores.

6) Num laboratório de análises microbiológicas, foram incubadas várias placas

com amostras, nas temperaturas de 35ºC, 65,5ºC e 9,8ºC. Houve crescimento de
colônias em todas as placas, portanto, a classificação desses microrganismos
quanto à temperatura seriam respectivamente:
a - psicrófilas, microaerófilas, mesófilas e termófilas;
b - mesófilas, termófilas, criófilas ou psicrófilas;
c - hipertermófilas, criófilas, mesófilas e termófilas;
d - mesófilas, estenotermófilas, psicrófilas ou criófilas e termófilas;
e - estenotermófilas, termófilas, microaerófilas e mesófilas;
f – Nenhuma das anteriores

51/54
 7) Num processo fermentativo cujo objetivo é a produção de biomassa, tem-se
grande preocupação com a qualidade dos microrganismos
comercializados. Uma das técnicas para medir o crescimento microbiano e verificar a
viabilidade dos mesmos é chamada “contagem de viáveis”. Porém esta técnica está
sujeito à erros devido:
a - as pequenas dimensões de algumas células;
b - à formação de agregados mitocondriais interferindo no resultado;
c - à agregados de células limitando e impossibilitando a passagem do
comprimento de onda;
d - à formação de colônias filamentosas muito juntas;
e - à agregados de duas células próximas originando uma colônia;
f – Nenhuma das anteriores

8) Em uma de suas experiências, um cientista identificou microrganismos com as

seguintes características:
Microrganismo 01 = formato de espirais incompletas parecendo vírgulas;
Microrganismo 02 = forma arredondada isolada e outras formando colônias;
Microrganismo 03 = formato de filamentos helicoidais;
Microrganismo 04 = forma de bastonetes.
Analisando os microrganismos acima com relação à classificação quanto a morfologia,
marque o item que identifica estes microrganismos respectivamente:
a - vibriões, bastonetes, diplococos e espirilos;
b - espirilos, cocos, vibriões e estreptococos;
c - vibriões, cocos, espirilos e bacilos;
d - cocos, bacilos, vibriões e estafilococos;
e - bacilos, cocos, bastonetes e diplococos;
f - Nenhuma das anteriores

9) Através do gráfico de crescimento microbiano podemos fazer várias

descobertas estudando-se as características de cada fase do desenvolvimento
microbiano durante o processo fermentativo. Tratando-se exclusivamente da fase
estacionária podemos afirmar que:
a - a contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viáveis
cai lentamente onde a maioria das células está em processo de morte;
b - o número de células que morre é equivalente ao número de células que nasce
e a quantidade de produtos finais de metabolismo é muito pequena, levando as
células à plenitude de seu crescimento;
c - há um crescimento líquido da população, são sintetizados vários metabólitos
secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas, ocorre também a
esporulação de bactérias;
d - não há aumento significativo da população, é um período onde o número de
organismos permanece praticamente inalterado, sintetizando seus constituintes,
crescendo e se duplicando em plenitude;
d - os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos sendo absorvidos pelas
culturas antigas permitindo um crescimento em equilíbrio dinâmico, havendo
assim um controle da densidade populacional e da taxa de crescimento;
e – Nenhuma das anteriores.

10) A esporulação é:
a – Fusão de duas hifas formando uma estrutura chamada de esporos;
b – Formação de uma parede grossa rica em fosfolipídios e ribossomos para
proteger de condições adversas;

52/54
 c – Desidratação do citoplasma bacteriano formando uma parede grossa com
intensa atividade metabólica;
d – Formação de uma parede grossa denominada esporo, proveniente de um
conjunto de hifas;
e – Desidratação da célula bacteriana com formação de uma grossa parede e
redução da atividade metabólica;
f – Nenhuma das anteriores.

11) Leveduras são:

a – Microrganismos unicelulares constituído de formas primitivas de bactérias
esféricas que se reproduzem por brotamento e liberam etanol e CO2 como
subproduto de sua alimentação;
b – Fungos de forma esférica, unicelulares, formam colônias pastosas,
reproduzindo-se por brotamento e liberando CO2 e etanol como subproduto de
sua alimentação;
c – Microrganismos pluricelulares constituído de formas primitivas de fungos, de
grande importância industrial, produzindo biomassa, etanol e CO2;
d – Fungos unicelulares que formam colônias filamentosas de grande importância
industrial, com formato esférico e se reproduzem por brotamento;
e – Microrganismos primitivos dos fungos, se reproduzem sexuadamente por
brotamento, formando colônias denominadas leveduriformes, produzindo
biomassa, etanol e CO2;
f – Nenhuma das anteriores.

12) Os microrganismos se comportam diferentemente em presença de

oxigênio livre. Podem ser classificados como microrganismos:
a – anaeróbios que não toleram a presença de oxigênio livre, morrendo
rapidamente nessas condições / facultativos que tanto podem crescer na presença
como na ausência de oxigênio livre / aeróbios que não exigem a presença de
oxigênio livre;
b – aeróbios que exigem a presença de oxigênio livre / microaerófilos que toleram
pequena quantidade de oxigênio / anaeróbios que tanto podem crescer na
presença ou na ausência de oxigênio livre;
c – aeróbios que não toleram a presença de oxigênio livre / anaeróbios
facultativos que tanto podem crescer na presença como na ausência de oxigênio
livre / anaeróbios que exigem a presença de oxigênio livre;
d – anaeróbios facultativos que tanto podem crescer na presença como na
ausência de oxigênio livre / microaerófilos que exigem a presença de oxigênio /
anaeróbios que morrem em condições de ausência de oxigênio livre;
e – anaeróbios que não toleram a presença de oxigênio livre / anaeróbios
facultativos que tanto podem crescer na presença como na ausência de oxigênio
livre / aeróbios que exigem a presença de oxigênio livre;
f – Nenhuma das anteriores.

13) Os alunos do curso técnico em Química fizeram a seguinte experiência

para a Feira de Química: “Incubaram em 3 recipientes várias espécies de
bactérias. O 1° recipiente hermeticamente fechado. O 2° recipiente totalmente
aberto. O 3° recipiente fechado porém com uma pequena abertura par a o
ambiente”. Em todos os recipientes houve crescimento de bactérias. Com
esses resultados podemos afirmar que as bactérias desenvolvidas em cada um
deles são respectivamente:
a - anaeróbios / aeróbios tolerantes / aeróbios obrigatórios;
b - anaeróbios obrigatórios / aeróbios obrigatórios / anaeróbios
facultativos;
c - aeróbios facultativos / anaeróbios obrigatórios / aeróbios estritos;
d - anaeróbios estritos / anaeróbios facultativos / anaeróbios obrigatórios;

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 e - nenhuma das anteriores.

14) Na aula prática no laboratório de biologia onde fizemos a observação

microscópica de leveduras para panificação, foi explanado vários cuidados e
regras para manipulação. Complete os espaços com os cuidados ou regras
para o item correspondente:

a) O aumento da Objetiva deve ser escolhida de acordo com

_____________________________________________________________;

b) A objetiva com aumento de 100 vezes somente deve ser usada com uso de
___________________________porque _____________________________;

c) Após o término das observações, deve se posicionar a objetiva

__________________________________ para guardar o microscópio;

d) Ao colocar a lâmina para observação na platina devidamente presa, ergue-se a

mesma até encontrar o foco vagarosamente, utilizando o macrométrico e o
micrométrico, tomando o cuidado para
_______________________________________________________________
___________________________________________________;

15) Construindo-se um gráfico global do crescimento microbiano em cultura

descontínua, em meio líquido, observa-se que a curva representativa desse
crescimento apresenta várias fases, dentre elas a fase lag. Essa fase só ocorre
quando:
a – os microrganismos semeados provêm de uma cultura nova, necessitando de
renovação, sintetizando material e produzindo etanol;
b – os microrganismos semeados provêm de uma cultura velha, necessitando
processar várias coenzimas e outros constituintes celulares para absorver os
constituintes do meio;
c – os microrganismos semeados provêm de uma cultura velha, necessitando de
renovação, aumentando de tamanho em consequência da síntese de material;
d – os microrganismos semeados provêm de uma cultura nova, prontas para o
desenvolvimento, aumentando a biomassa e liberando CO2 e etanol;
e – os microrganismos semeados provêm de uma cultura velha, precisam de um
período de adaptação para que possam absorver todos os metabólitos tóxicos do
meio;
f – Nenhuma das anteriores.

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