Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm.

26 (3): 339-43 (2007)

Trabajos originales Recibido el 27 de noviembre de 2006 Aceptado el 28 de enero de 2007

Atividade Moluscicida de Extratos e de Aucubina de Vitex gardneriana Schauer (Verbenaceae) em Embries da Biomphalaria glabrata
Lvia Cristina Lira de S BARRETO 1, Elaine Faria Neves de Barros CARVALHO 2, Marclio Srgio Soares da CUNHA-FILHO 1, Clbio Pereira FERREIRA 3 e Haroudo Satiro XAVIER 3
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Departamento de Farmacia y Tecnologa Farmacutica, Facultad de Farmacia, Campus Universitario Sur, Universidad de Santiago de Compostela (USC), 15782, Santiago de Compostela, Espaa. 2 Departamento de Biofsica, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Av. Prof. Moraes Rego, S/N, Cidade Universitria, 50740-520, Recife/PE, Brasil. 3 Laboratrio de Farmacognosia, Departamento de Cincias Farmacuticas, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Av. Prof. Arthur de S, S/N, Cidade Universitria, 50740-521, Recife/PE, Brasil.
RESUMO. Estudo fitoqumico das folhas, cascas do caule e das razes de Vitex gardneriana Schauer (Verbenaceae) revelaram a presena de terpenides/esterides, saponinas, acares redutores, fenilpropanoglicosdeos e iridides. Os extratos oriundos das folhas e das cascas do caule apresentaram maior quantidade de metablitos secundrios e foram eleitos, junto com o iridide aucubina, para ensaio moluscicida frente a desovas de Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermedirio da esquistossomose mansnica. Os extratos selecionados (100 ppm) mostraram pronunciada atividade ovicida, superior ao do controle positivo de saponina, com mortalidade aproximada de 90%. A aucubina isolada (100 ppm) apresentou um resultado ainda melhor com 100% de mortalidade. SUMMARY. Molluscicidal Activity of the Extracts and Aucubin from Vitex gardneriana Schauer (Verbenaceae) on Embryos of Biomphalaria glabrata. Phytochemical study of leaves, stem bark and stem root of Vitex gardneriana Schauer (Verbenaceae) revealed the presence of flavonoids, terpenoids/steroids, saponins, reducting sugars, phenylpropanoglycosides and iridoids. Leaves and stem bark extracts presented higher amount of secondary metabolites that and have been selected, together with aucubine iridoid, to carry out molluscicidal test against Biomphalaria glabrata eggs, intermediate host of schistosomiasis. Selected extracts (100 ppm) showed pronounced ovicidal activity, higher than positive saponin control group, with mortality close to 90%. Aucubine isolated (100 ppm) presented even better result with 100% mortality.

INTRODUO Vitex gardneriana Schauer (Verbenaceae) uma rvore de pequeno porte encontrada no serto nordestino brasileiro, freqentemente s margens ou ao leito dos rios. Conhecida popularmente por Jaramataia, tem sido utilizada no tratamento de doenas inflamatrias, entretanto, a literatura descreve escassos estudos sobre esta espcie 1,2. Atividade moluscicida de espcies da famlia Verbenaceae foi descrita por Adewunmi e Sofowora em 1980, com destaque para Vitex oxycuspis Bak., que apresentou uma elevada mortalidade para os caramujos adultos da espcie Bulinus globosus utilizando extratos etanlicos do caule e das razes na concentrao de 100 ppm 3. Uma dcada depois, outras duas espcies desta mesma famlia, Lantana camara Linn e Lip-

pia grandiflora Mart. & Schauer, foram ensaiadas na concentrao de 200 ppm frente a Biomphalaria truncatus, apresentando uma mortalidade de 20 e 40%, respectivamente 4. A esquistossomose mansnica, doena parasitria causada pelo Schistosoma mansoni, tem sido reportada como um importante problema de sade pblica nos pases em desenvolvimento, com mais de 200 milhes de pessoas infectadas 5. No Brasil, mais de 8 milhes de pessoas so afetadas por esta enfermidade, sendo de grande endemicidade na Regio Nordeste e no Estado de Minas Gerais 6. Os medicamentos atualmente disponveis para o tratamento desta enfermidade reduzem sua morbidade, mas no controlam sua transmisso e possuem incmodos efeitos secundrios. Neste contexto, a busca de novas drogas contra os

PALAVRAS CHAVE: Aucubina, Esquistossomose mansnica, Atividade moluscicida, Verbenaceae, Vitex gardneriana. KEY WORDS: Aucubin, Molluscicidal activity, Schistosomiasis, Verbenaceae, Vitex gardneriana.
* Autor a quem dirigir correspondncia: E-mail: liviasa@usc.es

ISSN 0326-2383

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S BARRETO L.C.L. de, CARVALHO E.F.N. de B., CUNHA-FILHO M.S.S. da, FERREIRA C.P. & XAVIER H.S.

moluscos hospedeiros intermedirios do S. mansoni constituem uma das estratgias mais eficazes no combate a esquistossomose. Diversos vegetais com ao moluscicida tm sido investidos, afim de serem utilizadas pelas comunidades no combate aos caramujos, especialmente contra as espcies do gnero Biomphalaria sp 7. O objetivo deste trabalho foi identificar, desde um ponto de vista fitoqumico, os grupos de metablitos secundrios existentes em diferentes partes desta planta e estudar o efeito moluscicida dos extratos secos selecionados e do iridide glicosdeo isolado, aucubina, obtido de Vitex gardneriana em embries de Biomphalaria glabrata. MATERIAL E MTODOS Material vegetal O material vegetal utilizado neste estudo (folhas, cascas do caule e das razes de Vitex gardneriana Schauer) foi coletado no municpio de So Jos das Espinharas, Paraba/Brasil e submetido a secagem em estufa a 45 C, durante 10 h, sendo posteriormente triturado e acondicionado apropriadamente. Uma amostra contendo folhas, flores e frutos foi destinada a preparao de exsicata, identificada pela Dra. Rita de Cssia Arajo Pereira e depositada sob o nmero 60308, no herbrio Drdano de Andrade Lima da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuria - IPA. Padres e reagentes Foram utilizados os padres: -amirina, -sitosterol, canferol e saponina, fornecidos por Extrasynthese; cido glico e D(+)-glicose da MERCK; lapachol cedido pelo LAFEPE e ipolamida (padro secundrio). Os reagentes e solventes empregados neste estudo foram de grau analtico ou de elevado grau de pureza. Preparao dos extratos Folhas, cascas do caule e das razes, foram submetidas infuso metanlica durante 30 min. Para o estudo moluscicida, os extratos metanlicos das folhas e das cascas do caule foram secos sob presso reduzida a 30 C e em seguida solubilizados em gua na concentrao de 100 ppm. O isolamento do iridide glicosdeo Aucubina (Fig. 1), utilizado no estudo moluscicida, esta descrito por De S Barreto et al. 2. A partir do extrato metanlico seco das cascas do caule de V. gardneriana procedeu-se separaes cromatogrficas em coluna, inicialmente utilizando Sephadex LH 20 empacotada e eluda com metanol, obtendo-se uma primeira frao cristalina
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Figura 1. Estrutura qumica do iridoide glicosdeo aucubina.

que foi posteriormente recromatografada em gel de slica empregando como sistema de eluio acetato de etila : metanol (9:1). A purificao foi realizada por lavagem com benzeno at a obteno de cristais puros. As fraes eluidas foram acompanhadas por cromatografia em camada delgada desenvolvida em acetato de etila : cido frmico : acetona : gua (100:11:11:27) e revelados com vanilina clordrica. Abordagem fitoqumica por cromatografia em camada delgada A presena dos grupos de metablitos secundrios (alcalides 8, monoterpenides, sesquiterpenides e diterpenides 8, iridides 8, cumarinas 8, fenilpropanoglicosdeos 8, saponinas 8, quinonas 9, triterpenides e esterides 9, acares redutores 10, cido glico 11, flavonides 12,13, proantocianidinas e leucoantocianidinas 14, e taninos hidrolisveis 11,15, nos extratos metanlicos de V. gardneriana Schauer foi determinada por cromatografia em camada delgada (CCD) utilizando placas de gel de slica F254 (MERCK) como fase fixa e empregando-se diversos sistemas de desenvolvimento, padres e reveladores apropriados (Tabela 1). Avaliao da atividade moluscicida in vitro A atividade moluscicida foi avaliada de acordo com as normas da Organizao Mundial de Sade (OMS) 16. Grupos contendo 10 desovas de Biomphalaria glabrata cada, com cerca de 50 embries por desova, foram tratados com gua potvel (controle negativo) e solues aquosas a 100 ppm de saponina (controle positivo), extrato das folhas, extrato das cascas do caule ou aucubina. Os ovos de cada placa de desova foram submersos por 24 h nas referidas solues, com prvia contagem do nmero de embries inicial com auxlio de uma lupa. Em seguida, as solues foram substitudas por gua potvel, e os ovos observados quanto a seu desenvolvimento, durante 7 dias consecutivos temperatura ambiente. Passado este perodo, estabelecido pela ecloso dos embries do grupo controle, foi realiza a contagem dos ovos no eclodidos.

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Metablito

Sistema de Eluioa (v/v)

Revelador

Padro

Ref.

Alcalides Monoterpenides, sesquiterpenides e diterpenides Iridides Cumarinas Fenilpropanoglicosdeos Saponinas Quinonas Triterpenides e esterides Acares cido glico Flavonides Proantocianidinas Condensadas e Leucoantocianidinas Taninos hidrolisveis

AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 11 : 11 : 27) Benzeno - AcOEt (97 : 3) AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 11 : 11 : 27) ter-tolueno-AcOH 10 % (50 : 50 : 50) AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 11 : 11 : 27) AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 11 : 11 : 27) AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5) AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5) n-BuOH-Me2CO-Tampo fosfato pH = 5,0 (40 : 50 : 10 v/v) AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 11 : 11 : 27) AcOEt - Metiletilcetona - HCOOH - H2O (100 : 60 : 10 : 10) AcOEt - HCOOH - AcOH - H2O (100 : 11 : 11 : 27) AcOEt - Metiletilcetona - HCOOH - H2O (100 : 60 : 10 : 10)

Dragendorff

Vanilina sulfrica

Vanilina sulfrica U.V. NEU Anisaldedo KOH 10% LiebermanBurchard Trifeniltetrazlio NEU NEU

ipolamida saponina lapachol -amirina/ -sitosterol D(+)-glicose cido glico canferol

8 8 8 8 9 9 10 11 12,13

Vanilina clordrica Alumen de ferro 1%

14

11,15

Tabela 1. Condies cromatogrficas utilizadas para caracterizao fitoqumica dos extratos de Vitex gardneriana Schauer. NEU = cido etilborilaminoster a 1% em etanol; AcOEt = acetato de etila; HCOOH = cido frmico; AcOH = cido actico; n-BuOH = n-butanol; Me2CO = acetona.

RESULTADOS E DISCUSSO Abordagem fitoqumica Na Tabela 2 esto descritos os dados obtidos na prospeco fitoqumica, realizada de forma indita para esta espcie. Foi detectada a presena de flavonides, iridides, monoterpenides, sesquiterpenides, diterpenides, triterpenides, esterides, saponinas, acares redutores e fenilpropanoglicosdeos. Em contraste com os resultados negativos para alcalides, cumarinas, cido glico, proantocianidinas, leucoantocianidinas, taninos hidrolisveis e quinonas. Estes resultados coincidem com os descritos na literatura para outras espcies do gnero Vitex sp, em que se pode destacar a existncia de terpenides, esterides e flavonides 17, 18. Observou-se de forma qualitativa a presena

das mesmas substncias em todas as partes da planta estudada. Entretanto, os extratos metanlicos das folhas e das cascas do caule apresentaram manchas de maior intensidade, evidenciando uma maior concentrao de metablitos nestes preparados. Foi observada a presena de amirina e -sitosterol, alm de outros triterpenides e esterides no identificados. Cabe destacar ainda, a presena de saponinas e o resultado fortemente positivo para iridides. O padro ipolamida utilizado na deteco de iridides no foi encontrado, no entanto, observou-se a presena de vrias outras molculas deste grupo metablico. Estudos posteriores permitiram isolar e identificar um dos componentes majoritrios nos extratos avaliados, a aucubina (Fig. 1), iridide comumente

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Extratos metanlicos Metabolitos secundrios Folhas Caule Razes

Alcalides Monoterpenides, sesquiterpenides e diterpenides Iridides Cumarinas Fenilpropanoglicosdeos Saponinas Quinonas Triterpenides e esterides Acares cido glico Flavonides Proantocianidinas e Leucoantocianidinas Taninos hidrolisveis

++ ++ ++ ++ + ++ ++ -

+ ++ + ++ ++ ++ + -

+ + + + + + + Figura 2. Atividade moluscicida sobre embries de Biomphalaria glabrata aps 7 dias de tratamento.

Tabela 2. Triagem fitoqumica de folhas, cascas dos

caules e das razes de Vitex gardneriana Schauer. (++) = fortemente positivo, (+) = positivo e (-) = negativo.

encontrado neste gnero, e possvel marcador taxonmico 2. Diante destes resultados preliminares, foram selecionados os extratos oriundos das folhas e das cascas do caule para serem ensaiados quanto atividade moluscicida e comparados com os resultados obtidos para o metablito isolado aucubina. Avaliao da atividade moluscicida in vitro Utilizando a concetrao mxima recomendada pela OMS (100 ppm), solues aquosas dos extratos metanlicos secos das folhas e das cascas do caule de Vitex gardneriana apresentaram potente atividade moluscicida frente aos embries da espcie Biomphalaria glabrata, superiores inclusive ao controle positivo de saponina utilizado. Os resultados foram expressos como porcentagem de ovos no eclodidos, permitindo correlacionar o nmero de moluscos que tiveram desenvolvimento embrionrio semelhante ao grupo controle (Fig. 2). O gnero Vitex sp vem sendo bastante estudado, especialmente nos ltimos 10 anos, com destaque para a espcie Vitex agnus-castus de extensa utilizao na produo de medicamentos fitoterpicos no combate aos sintomas da

menopausa 19. Outras atividades biolgicas com este gnero j foram descritas, como por exemplo, propriedades antioxidantes e antiinflamatria (Vitex neguno) 20, 21; atividade inseticida (Vitex mollis) 22, atividade anticancergena (Vitex rotundifolia) 17, atividade antiglicmica (Vitex megapotamica) 23, entre outras. Apesar do elevado nmero de estudos e da diversificada atividade biolgica reportada, o trabalho apresentado o primeiro a relatar atividade ovicida contra moluscos neste gnero. A ao ovicida foi potencializada com a utilizao da aucubina isolada que apresentou 100% de mortalidade (Fig. 2). Este resultado constitui uma clara evidncia da relao existente entre esta substncia e a ao moluscicida encontrada nos extratos. Este iridide glicosdeo tem sido bastante descrito no gnero Vitex sp. 24,25. Vrias atividades farmacolgicas so atribudas a esta molcula, com destaque para sua ao antiprotozorio 26, antiinflamatria 27 e antimicrobiana 28. No entanto, sua atividade moluscicida nunca havia sido reportada. A maioria das substncias vegetais atualmente disponveis como moluscicida possui ao txica restrita aos animais adultos 29,30. Sua aplicao esta limitada aos perodos de baixa reproduo do molusco, necessitando de um tempo de exposio prolongado para um controle eficaz da natalidade e, em muitos casos, tambm necessrio recorrer a compostos qumicos sintticos mais efetivos contra seus embries, mas que ao mesmo tempo, constituem um risco ambiental considervel. Neste contexto, a potente ao ovicida, observada tanto para a aucubina como para solues aquosas dos extratos metanlicos secos

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de V. gardneriana, representa importante vantagem em relao s alternativas atualmente disponveis para o combate a esquistossomose mansnica. Estudos toxicolgicos com esta espcie vegetal comprovam sua inocuidade frente a peixes, alm da ausncia de toxicidade em animais de maior porte, como ratos, gatos e porcos 31, o que abre uma interessante perspectiva de incorporao de extratos desta planta em sistemas de irrigao, mananciais e rios. CONCLUSES O estudo apresentado revela importante atividade moluscicida de Vitex gardneriana Schauer frente aos embries de Biomphalaria glabrata. Os extratos metanlicos secos das folhas, das cascas do caule e da aucubina isolada mostraram-se ativos na dose preconizada pela OMS, apresentando inmeras vantagens em relao as alternativas atualmente disponveis no combate ao hospedeiro intermedirio da esquistossomose mansnica. Estes resultados preliminares abrem interessantes perspectivas quanto a utilizao futura desta planta no combate a esta doena tropical endmica, atravs do aproveitamento dos recursos naturais existentes partindose de uma fonte renovvel e com reduzido impacto ambiental em relao aos pesticidas sintticos atualmente disponveis.
Agradecimentos. Os autores agradecem a Dra. Rita de Cssia Arajo Pereira, da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuria - IPA, pela identificao botnica e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico - CNPq.
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