Biologia Molecular I

Protocolos das aulas experimentais

Rui Oliveira Departamento de Biologia Universidade do Minho Braga

Extraco de DNA genmico de Saccharomyces cerevisiae O procedimento bsico de qualquer protocolo de extraco de DNA envolve lise celular, com libertao de todo o material intracelular, e purificao do DNA. O processo de rompimento das clulas a parte do protocolo que mais varia se compararmos os diferentes processos de extraco de diferentes materiais biolgicos: bactria, levedura, clulas vegetais, clulas animais, etc. Com a lise celular so libertados para a soluo todos os compostos intracelulares: protenas, lpidos, polissacardeos, cidos nucleicos, molculas orgnicas de baixo peso molecular e ies. No caso de leveduras, o rompimento das clulas usualmente executado por aco enzimtica duma -glucanase (Zymolyase" ou Lyticase) que catalisa a degradao da parede celular. Outro processo o rompimento mecnico com agitao forte das clulas misturadas com esferas de vidro de O,5mm de dimetro. Duma maneira geral, os protocolos com rompimento enzimtico do origem a DNA de maior peso molecular e apropriado para a clonagem e construo de bancos genmicos. Em ambos os casos, emprega-se um detergente para completar a lise. Assim, a purificao do DNA consistir em libertar o DNA de todos os compostos referidos, o que feito usualmente por precipitaes diferenciais e aco de enzimas especficas como por exemplo proteases e RNases. Nas precipitaes diferenciais, recorre-se, geralmente, mistura fenol/clorofrmio/lcool isoamlico em que o fenol e clorofrmio desnaturam as protenas, ficando estas solubilizadas na fase fenlica que se separa com maior eficcia da fase aquosa por aco do clorofrmio e lcool isoamlico. Os passos posteriores de purificao baseiam-se na insolubilidade do DNA em etanol na presena de concentraes relativamente elevadas de caties monovalentes. Em soluo vo permanecer solutos orgnicos e resduos de fenol e clorofrmio. Posteriormente, usado etanol a 70% no qual se dissolvem a maioria dos caties, resultando DNA praticamente puro no precipitado. O DNA genmico extrado por estes processos usado para a construo de bancos genmicos, aps tratamento com enzima de restrio e incubao convenientes para a obteno de fragmentos do tamanho pretendido; para anlise de "Southern"; e como molde para amplificao in vitro por PCR. O DNA deve ser guardado solubilizado a -70C para prevenir mutaes espontneas e aco de DNases que possam contaminar a soluo. No entanto, a congelao e descongelao sucessivas provoca quebras nas cadeias de DNA. Por isso, para

armazenamento por longos perodos de tempo, deve-se guardar o DNA em alquotas a -70C. Se o armazenamento for por um perodo curto, deve-se ento guardar a 4C. Regra geral, o DNA dissolvido, para armazenamento, em tampo TE (pH8,0) em que o EDTA previne a degradao do DNA por aco queladora de metais pesados que promovem a quebra das ligaes fosfodister e doutros caties necessrios aco das DNases.

Extraco de DNA genmico de Saccharomyces cerevisiae

(Protocolo simplificado segundo Holm et al., 1986) 1 dia 1 - Inocular 10ml de meio YPD (em Erlenmeyer de 50ml) com a estirpe de levedura em estudo e incubar a 30C, 160r.p.m. durante a noite. 2 dia 2 - Colher as clulas por centrifugao a 7000g, 2min a 4C e ressuspender o sedimento celular em 1ml de gua ultra-pura. Transferir para um microtubo de 1,5ml. 3 - Centrifugar 20-30seg velocidade mxima numa microcentrfuga e ressuspender o sedimento em 0,15ml de SZB. Incubar a 37C durante 30-40min com agitao frequente. Verificar a ocorrncia de lise celular por observao microscpica de suspenses em triton X-100 5% (v/v). Considerar o tratamento completo quando mais de 80% das clulas foram lisadas. 4 - Adicionar 0,15ml de soluo SDS-TE, agitar brevemente em vortex e incubar a 60C-65C durante 5-10min. A partir deste passo, usar luvas nas manipulaes para proteger o DNA 5 - Adicionar 0,15ml de acetato de potssio 5M, agitar brevemente em vortex e incubar em gelo durante 30-45min. 6 - Centrifugar em microcentrfuga velocidade mxima durante 15min a 4C. Transferir 0,3ml do sobrenadante para um novo microtubo. 7 - Adicionar 0,2ml de acetato de amnio 5M e 1ml de isopropanol pr-arrefecido. Incubar a -20C entre 10min at vrias horas. 8 - Centrifugar velocidade mxima numa microcentrfuga, a 0C durante 5min,

rejeitar o sobrenadante e lavar o sedimento com etanol 80% frio. Secar ligeiramente o sedimento (pode ser feito com o recurso a uma bomba de vcuo). 9 - Dissolver o sedimento em 200l de gua ultra-pura, adicionar 2l de RNAase 10mg/ml e incubar a 37C durante 10min. 10 - Adicionar 4l de NaCl 5M e 2l de proteinase K 20mg/ml. Incubar a 37C durante 10min. 11 - Extrair com 200l de fenol, centrifugar velocidade mxima durante 30seg numa microcentrfuga e transferir o sobrenadante (fase aquosa) para um novo microtubo. Ter o mximo de cuidado com o fenol pois um forte oxidante: evitar inalar e entrar em contacto com a pele. Colocar os restos de fenol e o material com que tenha entrado em contacto em recipientes prprios. 12 - Adicionar 2 volumes de etanol absoluto frio, misturar bem e centrifugar a 12000g, 10min a 0C. 13 - Remover com cuidado o sobrenadante com uma micropipeta. Adicionar etanol 70% at metade do volume do microtubo e centrifugar a 12000g, 2min a 4C. 14 - Remover o sobrenadante como no passo 13, tentando eliminar todas as gotas de etanol que tenham ficado aderentes s paredes do microtubo e deixar o microtubo aberto para secar completamente o sedimento. 15 - Dissolver o sedimento em 50l de TE. Referncias Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
(Pags.: E.10-E.14)

Strathern JN and Higgins DR.1991. Recovery of Plasmids from Yeast into Escherichia coli: Shuttle vectors. In: Methods in Enzymology, vol.194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C, and Fink, G (eds). Academic Press, Inc. San Diego. (Pags.: 319-329)

Sites da internet teis http://research.nwfsc.noaa.gov/protocols html Site completssimo com protocolos para muitas aplicaes em biologia molecular. http://lena.jax.org/~jcs/techniques/techniques.html Site com muitos protocolos e com conselhos prticos para determinados passos dum protocolo. http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/ Site da Universidade de Stanford contendo uma base de dados com o genoma de levedura e ferramentas de procura e anlise de genes e protenas, bem como links para pginas pessoais e institucionais com protocolos de biologia molecular para leveduras. Materiais biolgicos S. cerevisiae W303-1A a leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 Meios de cultura e solues YPD: Extracto de levedura 1% (p/v); peptona 2% (p/v); glucose 2% (p/v). SZB: Sorbitol 1M; citrato de sdio 100mM; EDTA 60mM; zymolase 60.000 0,5mg/ml; 2-mercaptoetanol 100mM. Soluo SDS-TE: SDS 2% (p/v); tris-HCl 0,1M (pH8,0); EDTA 10mM.

Extraco de DNA plasmdico de Escherichia coli

Plasmdeos bacterianos so molculas de DNA extracromossmico, circulares e de replicao autnoma. Nos habitats naturais, os plasmdeos so frequentes, conferindo aos seus hospedeiros caractersticas (fentipos) que podero constituir vantagem selectiva. Destes fentipos, contam-se a resistncia a antibiticos, resistncia a metais pesados, produo de enzimas de restrio, produo de aminocidos raros e produo ou catabolismo de molculas orgnicas complexas. Ainda em habitats naturais, muitos plasmdeos tm a capacidade de transferir o seu DNA para outros hospedeiros que podero ser de estirpes diferentes e, at, de espcies diferentes por um processo denominado conjugao na qual est envolvido um gene: mob. Na replicao dos plasmdeos esto envolvidos vrios genes que podero ser exclusivamente do genoma do hospedeiro ou, ento, deste e do prprio plasmdeo. O local de origem da replicao (ori) juntamente com os elementos de control cis constituem o replicon ou replicador. Para replicadores diferentes, o mecanismo de replicao diferente, podendo envolver mais ou menos genes e enzimas do hospedeiro. Duma maneira geral, plasmdeos que partilham mecanismos semelhantes de replicao, envolvendo os mesmos genes e as mesmas enzimas, so incompatveis, ou seja, no podem coexistir no mesmo hospedeiro. Assim, numa clula que contenha dois plasmdeos com replicadores semelhantes vai ocorrer um fenmeno que se poder denominar competio, entre os plasmdeos, seja pela maquinaria de replicao do hospedeiro, seja pela vantagem selectiva conferida por cada um ao hospedeiro. Deste modo, foram criados grupos de incompatibilidade aos quais pertencem plasmdeos com replicadores idnticos. Por outro lado, plasmdeos pertencentes a grupos de incompatibilidade diferentes possuem replicadores cujos componentes no so comuns. Uma consequncia do tipo de replicador dum plasmdeo constitui uma propriedade extremamente importante: o nmero de cpias por clula. Plasmdeos cujo mecanismo de replicao no depende grandemente de protenas codificadas por genes pertencentes exclusivamente ao genoma do hospedeiro, so ditos multicpia. Tal deve-se ao facto da sua replicao no estar dependente do ciclo celular, em que h sntese dos factores de replicao apenas no incio da diviso celular, nem das protenas iniciadoras da replicao, que so instveis, levando a que o seu nmero por clula seja elevado: mais de 20 cpias. Por outro lado, os plasmdeos em que a replicao est fortemente dependente das protenas do

hospedeiro, tm a sua replicao sicronizada com a replicao do cromossoma da clula, sendo o nmero de cpias por clula inferior a 20. Para alm do fenmeno de incompatibilidade entre plasmdeos e do nmero de cpias por clula, os plasmdeos tambm so caracterizados pelas marcas selectivas. As marcas selectivas so fentipos conferidos por alelos dominantes plasmdicos que permitem distinguir clulas portadoras desse plasmdeo das no portadoras, atravs de testes simples em que se tenta evidenciar esse fentipo. As marcas selectivas mais usadas em plasmdeos bacterianos so a resistncia a antibiticos. Assim, clulas portadoras destes plasmdeos so resistentes a determinado antibitico, enquanto que as que no o possuem mantm a susceptibilidade. Por exemplo, no caso frequente da ampicilina, o gene plasmdico que lhe confere resistncia codifica uma -lactamase que uma enzima que catalisa a degradao do anel -lactmico caracterstico das penicilinas como a ampicilina. As clulas portadoras deste plasmdeo so capazes de formar colnias em meios de cultura contendo ampicilina, enquanto que as clulas que no o possuem no so viveis nesses meios. Aos plasmdeos de ocorrncia natural, foram feitas alteraes para melhorar as suas qualidades para vrios fins entre os quais se contam a clonagem de genes e a sua expresso aumentada. Assim, criaram-se os chamados vectores plasmdicos de clonagem e os vectores plasmdicos de expresso. Por manipulao das marcas selectivas, dos replicadores e de sequncias sem funo, foram criados novos plasmdeos com marcas selectivas convenientes, com maior nmero de cpias e mais pequenos em tamanho. Por outro lado, foram introduzidas sequncias novas para aumentar o nmero de locais de clonagem (locais de clonagem mltipla) para os vectores de clonagem e introduo de promotores de expresso fortes a montante do local de clonagem nos vectores de expresso. Tal como para o DNA genmico, a extraco de DNA plasmdico envolve a lise celular e purificao do plasmdeo. Os mtodos mais frequentes de lise so a lise alcalina e a lise por fervura. A lise alcalina feita com SDS que desnatura as protenas e dissolve os lpidos e NaOH que desnatura todo o DNA (cromossmico e plasmdico). Por neutralizao com acetato de potssio, o DNA plasmdico (cccDNA: covalently closed circular DNA) renatura rapidamente porque as duas cadeias no se podem separar devido aos super-enrolamentos, enquanto que o DNA genmico, constituido por longas cadeias, se mantm desnaturado e precipitado com as protenas.

No mtodo de lise por fervura, as clulas so lisadas com lisozima que catalisa a degradao da parede celular bacteriana, detergente e calor. Daqui resulta a libertao dos plasmdeos e RNA, enquanto que o DNA cromossmico se mantm ancorado membrana plasmtica que precipita juntamente com os restantes constituintes celulares. Os mtodos de coluna de afinidade de provenincia comercial baseiam-se na lise alcalina. A purificao do DNA efectuada por passagem da mistura por uma coluna contendo uma resina insolvel que tem a propriedade de fixar selectivamente o DNA. Por lavagens da resina com uma soluo com etanol para o manter insolubilizado, purifica-se o DNA que , posteriormente, eluido com gua ou tampo TE.

Duma maneira geral, a qualidade do DNA plasmdico obtido por lise por fervura inferior do DNA obtido pelos outros mtodos. No entanto, para tratamento de grandes quantidades de amostras em simultneo, o mtodo de lise por fervura o preferido pela sua rapidez de execuo. A estirpe de bactria e tipo de plasmdeo, nomeadamente o seu tamanho, so os parmetros principais que influenciam o rendimento final em DNA, que pode ser de 2-5g de DNA por 1,5ml de cultura para o plasmdeo pBR322 e de 3 a 5 vezes mais para o pUC19, independentemente do mtodo usado.

Extraco de DNA plasmdico de Escherichia coli

Mtodo qumico por lise alcalina de preparao de DNA plasmdico em pequena escala ("miniprep") 1 dia 1 - Inocular 2ml de meio LB (contendo um antibitico apropriado: ampicilina) com uma colnia da estirpe bacteriana. Incubar a 37C com agitao forte (~200r.p.m.) durante a noite. 2 dia 2 - Transferir 1,5ml da cultura para um microtubo e centrifugar a 12000g, 30seg a 4C numa microcentrfuga. 3 - Remover o sobrenadante por aspirao, deixando o sedimento o mais seco

possvel. 4 - Ressuspender o sedimento em 100l de soluo I a 4C. Agitar bem em vortex para completa disperso do sedimento. A partir deste passo manipular com luvas para proteger o DNA 5 - Adicionar 200l de soluo II. Misturar por inverso rpida do microtubo cinco vezes (no usar o vortex), assegurando-se que toda a superfcie interna do microtubo tenha entrado em contacto com a soluo. Colocar o microtubo em gelo. 6 - Adicionar 150l de soluo III. Misturar mantendo o microtubo invertido e agitando lentamente com movimentos circulares durante ~10seg. 7 - Centrifugar a 12000g, 5min a 4C numa microcentrfuga. Transferir o sobrenadante para um novo microtubo. 8 - Precipitar o DNA com 2 volumes de etanol absoluto temperatura ambiente. Misturar no vortex e incubar 2min mesma temperatura. 9 - Centrifugar a 12000g, 5min a 4C numa microcentrfuga. 10 - Aspirar lentamente o sobrenadante. Colocar o tubo em posio invertida sobre papel absorvente. Remover gotas de sobrenadante que tenham ficado aderidas s paredes do microtubo. 11 - Lavar o sedimento de DNA com 1ml de etanol 70% a 4C. Repetir o passo 10. Deixar o sedimento secar ao ar durante ~10min. 12 - Dissolver o DNA em 50l de tampo TE (contendo RNAase A 20g/ml), misturando brevemente em vortex. Armazenar o DNA a 4C. Rendimento esperado: 3-5g DNA/ml de cultura (mtodos de lise alcalina e lise por fervura) Referncias Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
(Pags.: 1.21-1.32)

Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. Eds. 1992. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore. (Pags.: 1.6.1-1.6.10) Sites da internet teis http://research.nwfsc.noaa.gov/protocols html Site completssimo com protocolos para muitas aplicaes em biologia molecular. http://lena.jax.org/~jcs/techniques/techniques.html Site com muitos protocolos e com conselhos prticos para determinados passos dum protocolo. Materiais biolgicos E. coli DH5 supE44 lacU169 (80 lacZM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 E. coli DH5[pBR322] E. coli DH5[pUC19] E. coli DH5[YEplac195] E. coli DH5[YEp13] Meios de cultura e solues Meio LB com ampicilina (LBamp): Tryptone 1% (p/v); Extracto de levedura 0,5% (p/v); NaCl 1% (p/v). Ajustar pH 7,5 com NaOHaq. Autoclavar 20min, 120C, 1bar. Antes de distribuir o meio pelas placas e quando estiver a uma temperatura de 50C-60C, adicionar ampicilina 100mg/ml em gua ultra-pura esterilizada para uma concentrao final de 100g/ml

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Soluo I: Glucose 50mM; tris.HCl 25mM, pH8,0; EDTA 10mM, pH8,0. Soluo II: NaOH 0,2N (diluido previamente dum "stock" 10N); SDS 1%. Soluo III: Acetato de potssio 5M, 60ml; cido actico glacial, 11,5ml; H2O (ultra-pura), 28,5ml. Tampo TE: Tris.HCl 10mM, pH8,0; EDTA 1mM, pH8,0.

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Determinao da concentrao e grau de pureza de DNA

O mtodo mais usado para a determinao do grau de pureza de DNA o mtodo espectrofotomtrico. Uma vez determinado o grau de pureza da amostra, a concentrao pode ser avaliada tambm por espectrofotometria, no caso de amostras puras, ou por intensidade de fluorescncia emitida pelo brometo de etdeo, se a amostra estiver contaminada com as impurezas habituais resultantes dos protocolos de extraco: protenas, fenol, agarose e RNA. Na anlise espectrofotomtrica, a absorvncia a 260nm proporcional quantidade de cidos nucleicos, sendo a seguinte a proporcionalidade:

Absorvncia

Equivalncia
~50g/ml dsDNA ~37g/ml ssDNA ~40g/ml ssRNA ~20g/ml oligonucletidos em cadeia simples

260nm

Para a determinao do grau de pureza, faz-se a leitura da absorvncia a 280nm que proporcional quantidade de protenas e fenol e a 325nm que proporcional quantidade de partculas em suspenso e sujidade das "cuvettes". O grau de pureza frequentemente calculado atravs da relao A260/A280 que deve ser entre 1,8 e 2,0. Para valores inferiores a 1,8, considera-se a amostra contaminada com protena e fenol. Em amostras contaminadas ou muito diluidas (<250ngDNA/ml) a concentrao determinada por emisso de fluorescncia por intercalao selectiva de brometo de etdeo. Este mtodo pode ser realizado em simultneo com a anlise da amostra por electroforese, bastando usar um padro conveniente, aparelhagem de leitura de fluorescncia em geles e software de tratamento de imagem.

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Determinao da concentrao e grau de pureza de DNA por espectrofotometria

1 - Ligar o espectrofotmetro e regular para 260nm. 2 - Fazer o zero de absorvncia com 1ml de gua ultra-pura em "cuvette" de quartzo. 3 Na mesma "cuvette" de quartzo adicionar 695l de gua ultra-pura e, depois, 5l do DNA a quantificar (diluio de 140x). Tapar a "cuvette" com parafilm e inverter vrias vezes para misturar. 4 - Fazer a leitura de absorvncia a 260nm. 5 - Repetir as leituras a 280nm e 325nm.
Significado e converso para concentrao das leituras de absorvncia de amostras de cidos nucleicos.

Significado

Equivalncias e intervalo de confiana

A260

Proporcional concentrao de cidos nucleicos

A260=1 <=> ~50g/ml dsDNA A260=1 <=> ~37g/ml ssDNA A260=1 <=> ~40g/ml ssRNA A260=1 <=> ~20g/ml de oligonucletidos em cadeia simples

A280 A325

Proporcional concentrao de fenol e protenas Proporcional quantidade de partculas em suspenso e sujidade das "cuvettes"

1,8 < A260/A280 < 2; corresponde a DNA ou RNA puros

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Referncias Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (Pags.: E5) Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. Eds. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore. (Pags.: A.3D.1-A.3D.3)

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Electroforese de DNA em gel de agarose

A electroforese de DNA consiste na separao de diferentes fragmentos de DNA de acordo com as suas diferentes mobilidades num campo elctrico. A electroforese pode ser analtica, tendo como objectivo a anlise de determinada amostra de DNA, por identificao de fragmentos constituintes, quantificao e determinao do peso molecular. Por outro lado, a electroforese pode ser preparativa quando o objectivo a separao e purificao de determinada fraco ou fragmento que faam parte duma amostra. Num campo elctrico, definido pela diferena de potencial em Volts e pela distncia entre os elctrodos em centmetros (V/cm), as molculas de DNA migram para o elctrodo positivo (nodo) devido s cargas negativas dos grupos fosfato. Esta migrao retardada pelo atrito das molculas com o suporte da electroforese. Como a relao carga/massa igual para diferentes fragmentos de DNA, o parmetro principal a condicionar a migrao de DNA numa mesma electroforese a dimenso dos fragmentos. Para o planeamento duma electroforese preciso ter em conta todos os factores que influenciam a migrao de DNA de modo a aproveitar o melhor possvel as potencialidades desta tcnica: Peso molecular Fragmentos lineares de DNA em cadeia dupla migram atravs duma matriz de gel a velocidades inversamente proporcionais ao log10 do nmero de pares de bases devido a um maior atrito com a matriz com o aumento do tamanho. Concentrao da agarose Pelas mesmas razes da influncia do peso molecular na mobilidade, o aumento da concentrao da agarose leva ao retardamento da migrao electrofortica. A linearidade entre migraoXpeso molecular , tambm, alterada pelo que se deve adaptar este parmetro gama de tamanhos de fragmentos que se pretende resolver. Conformao do DNA Consideram-se trs conformaes do DNA: forma I o DNA circular fechado (cccDNA ou "covalently closed circular DNA"); forma II o DNA circular com uma quebra numa ligao fosfodister ("nicked"); forma III o DNA linear em cadeia dupla (dsDNA ou "double stranded DNA"). Duma maneira geral, sob condies usuais, cccDNA migra mais rapidamente do que fragmentos do mesmo tamanho de

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dsDNA

porque a conformao circular tem menor raio hidrodinmico devido aos super-enrolamentos. Na forma II, os enrolamentos desaparecem por causa da quebra duma ligao fosfodister o que faz com que seja a forma mais lenta em electroforese. Voltagem aplicada A voltagens elevadas os fragmentos maiores tendem a migrar a velocidades maiores do que as previstas na relao linear migraoXpeso molecular. Assim, as electroforeses destinadas separao de fragmentos de elevado peso molecular devem ser feitas a voltagens inferiores. Composio do tampo de electroforese Os tampes mais usados neste tipo de electroforese so o tris/acetato (TAE) e o tris/borato (TBE). O TBE tem maior capacidade tampo, no entanto, deve ser evitado em electroforeses preparativas com purificao de DNA a partir de geles de agarose. Presena de brometo de etdeo O brometo de etdeo tem a propriedade de se intercalar entre pares de bases do DNA, conferindo maior rigidez e comprimento molcula. Isto faz com que a migrao das formas de DNA II e III seja menor. Quanto ao cccDNA, a intarcalao de brometo de etdeo introduz enrolamentos positivos, diminuindo o nmero de enrolamentos negativos que existem espontaneamente. Isto faz com que a migrao seja menor porque a molcula aumenta o seu raio hidrodinmico. No entanto, com o aumento da concentrao de brometo de etdeo e aps adquirir o estado de ausncia de enrolamentos, a molcula comea a diminuir o raio hidrodinmico porque aumentam os enrolamentos, desta vez, no sentido positivo. Assim, a migrao passa a ser mais rpida. Para a visualizao do DNA aps a corrida, usa-se o brometo de etdeo como corante especfico do DNA porque tem a capacidade de se intercalar entre pares de bases. Sob radiao ultra-violeta, o brometo de etdeo emite fluorescncia, surgindo corado apenas o DNA. Este corante pode ser incorporado no tampo com a vantagem de se poder parar a corrida, verificar se a migrao foi ou no suficiente, e, se necessrio, continuar a electroforese. No entanto, por razes de segurana, pode-se corar o gel apenas no fim da corrida. Para este caso particularmente conveniente a adio dum corante (azul de bromofenol ou xileno de cianol) s amostras para uma avaliao correcta da migrao: o xileno de cianol migra juntamente com fragmentos de ~5Kb enquanto que o azul de bromofenol migra juntamente com fragmentos de ~0,5Kb.

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Com o recurso electroforese, podem-se separar fragmentos de DNA desde 5bp at 10.000Kb. Fragmentos de 5bp at 500bp so bem separados com geles de poliacrilamida que tm a capacidade de distinguir fragmentos que diferem em apenas um par de bases. Os geles de agarose (agar purificado) so utilizados para fragmentos de 200bp at 50Kb, desde que se adapte a concentrao de agarose dimenso dos fragmentos a separar. Para fragmentos de dimenses superiores a 50Kb, recorre-se a tcnicas de electroforese em campo pulsado: FIGE - "fieldinversion gel electrophoresis" e CHEF - "contour-clamped homogeneous field electrophoresis". Nestes tipos de electroforese, h aplicao alternada de campos elctricos com sentidos e/ou direces diferentes de modo a provocar a contraco e extenso das longas molculas de DNA a separar durante a migrao para o nodo, fazendo com que estas tenham um movimento denominado reptao.

Electroforese de DNA em gel de agarose

Preparao do gel de agarose 1 - Preparar uma soluo de agarose em tampo TAE com concentrao final de 0,8% (p/v). Aquecer a mistura em microondas, com agitao frequente, at toda a agarose se ter dissolvido. 2 - Colocar o tabuleiro da tina de electroforese no respectivo suporte de preparao do gel ou, na sua falta, selar com fita adesiva de autoclave. Colocar o pente em posio conveniente no tabuleiro para um correcto posicionamento dos poos: distncia extremidade e base do gel. 3 - Verter a agarose no tabuleiro at uma altura de ~5mm. Eliminar bolhas de ar que se tenham formado, aspirando com uma micropipeta e deixar solidificar temperatura ambiente. 4 - Quando o gel se tiver formado, retirar lentamente o pente para no danificar os poos, colocar o tabuleiro na tina de electroforese, de modo a que os poos estejam do lado do elctrodo negativo, e adicionar tampo TAE at ~1mm acima do gel.

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Preparao das amostras 5 - Para cada amostra, misturar num microtubo: 100-500ng de DNA 4l de tampo de amostra (5x conc.) gua ultra-pura q.b.p. 20l 6 - Aplicar as amostras nos respectivos poos, enchendo lentamente cada poo com uma micropipeta. No deixar extravasar a amostra do poo para no contaminar os poos vizinhos. 7 - Colocar a tampa da tina. Verificar que as amostras esto colocadas do lado do polo negativo (ctodo, elctrodo de cor preta) e que a migrao ser no sentido do polo positivo (nodo, elctrodo de cor vermelha). 8 - Ligar os cabos fonte de electricidade. Ligar a fonte e regular para uma voltagem de 1-5V/cm (distncia medida entre os elctrodos). Verificar se h desprendimento de bolhas dos elctrodos devido electrlise e se, passados alguns minutos, o azul de bromofenol j comeou a migrar no sentido correcto. 9 - Aps migao julgada conveniente (por avaliao da posio do azul de bromofenol a sensivelmente 3/4 do comprimento do gel), desligar a corrente elctrica na fonte, desligar os cabos e retirar a tampa da tina. Retirar o gel cuidadosamente para no partir e cor-lo em banho numa soluo de brometo de etdeo 0,5g/ml, durante 30-45min temperatura ambiente. O brometo de etdeo um agente mutagnico potente, usar sempre luvas e colocar em recipiente prprio todo o material que tenha entrado em contacto com este corante 10 - Examinar o gel radiao ultra-violeta e fotografar para arquivar. As radiaes U.V. so extremamente perigosas, particularmente para os olhos, provocando leses na retina. Evitar qualquer exposio dos olhos a estas radiaes. Usar sempre culos protectores ou mscaras de material opaco aos U.V.

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Referncias Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
(Pags.: 6.3-6.20)

Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. Eds. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore. (Pags.: 2.5.1-2.5.9) Sites da internet teis http://www.scioncorp.com/frames/fr_scion_products.htm Contm software grtis para anlise de geles para MacOs e para Windows. http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ Contm software grtis para anlise de geles com possibilidade de quantificao por densitometria. Meios de cultura e solues Tampo TAE (soluo "stock" 50x conc.): Tris base 242g; cido actico glacial 57,1ml; EDTA 0,5M (pH8,0), 100ml; gua ultra-pura q.b.p. 1000ml. Tampo de amostra (6x conc.): Azul de bromofenol 0,25% (p/v); xileno de cianol FF 0,25% (p/v); glicerol 30% (p/v).

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Transformao de Escherichia coli

Transformao o processo de introduo de DNA em clulas. A primeira descrio de transformao de E. coli data de 1970 quando Mandel e Higa demonstraram que clulas de E. coli tratadas com solues geladas de cloreto de clcio e depois brevemente aquecidas, podiam importar para o seu interior DNA do bacterifago . Embora nunca se tenha conseguido compreender o mecanismo de transformao, est bem estabelecido que a exposio de clulas de E. coli a caties a baixas temperaturas induz um estado de competncia em que as clulas so capazes de importar DNA exgeno. Atravs de experimentao emprica, o processo de transformao foi modificado para melhorar a eficincia e reprodutibilidade de modo a adaptar esta tcnica rotina da biologia molecular. Assim, foram feitas modificaes no tempo de exposio das clulas ao io clcio; foram usados outros ies como o rubdio, mangans e potssio; e adio doutros compostos como o dimetilsulfxido ou ditiotreitol. Muitas das alteraes introduzidas levaram a uma melhoria da eficincia embora, por vezes, sem se conseguir explicar as razes, sendo frequente a adopo de protocolos diferentes de acordo com o laboratrio e, tambm, de acordo com o experimentador. O processo qumico de transformao mais usado o mtodo com cloreto de clcio. Neste mtodo, as clulas so cultivadas at meio da fase exponencial e lavadas e concentradas com uma soluo de cloreto de clcio. O DNA adicionado suspenso e depois as clulas so sujeitas a um choque trmico. Aps breve incubao em meio no selectivo, so espalhadas em placa com meio selectivo. Outro processo de transformao muito usado a electroporao, tendo sido originalmente desenvolvido para a transformao de clulas eucariotas. Nesta tcnica aplicado um campo elctrico forte e breve suspenso de clulas com DNA o que levar, eventualmente, abertura de poros na membrana celular atravs dos quais entram os plasmdeos. Para E. coli, o campo elctrico de ~12,5KV/cm e a descarga elctrica atravs dos elctrodos aumenta rapidamente at ao mximo de voltagem. Posteriormente, a voltagem decresce exponencialmente, sendo o tempo de pulso, normalmente, de ~5mseg. O pulso elctrico caracterizado por dois

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parmetros: a fora do campo elctrico, e o tempo. A fora do campo elctrico regulada previamente no aparelho para a voltagem pretendida e o tempo constante do pulso determinado pela resistncia do circuito e pela capacitncia. Normalmente, para bactrias, a resistncia regulada para 200 e a capacitncia para 25F, obtendo-se, assim, um tempo de pulso de ~5mseg. Na preparao de clulas competentes faz-se a lavagem e concentrao das clulas em gua ultrapura para que a suspenso celular tenha o mnimo de condutividade elctrica e, posteriormente, ressuspende-se o sedimento em glicerol 10% que actuar como estabilizador osmtico. Na transformao com o mtodo do cloreto de clcio podem-se obter eficincias superiores a 108 transformantes/gDNA. No entanto, na rotina laboratorial de esperar obter 106 a 107 transformantes/gDNA, sendo essencial para a eficincia os seguintes factores: colheita das clulas em fase exponencial, manuteno das clulas em gelo, contacto prolongado das clulas com cloreto de clcio, uso de reagentes de mxima pureza e limpeza do material. Se qualquer destes parmetros no for cumprido com rigor (por exemplo a existncia de impurezas nos reagentes, de restos de detergente no material de vidro ou uma subida momentnea da temperatura das clulas), a eficincia da transformao pode ser drasticamente reduzida. Por electroporao, a transformao efectuada com uma eficincia que poder ser da ordem de 1010 transformantes/gDNA desde que se cumpram com rigor todos os parmetros referidos para o mtodo com cloreto de clcio. Para ambos os mtodos de transformao, possvel preparar as clulas competentes previamente e congel-las a -70C sem que haja perda de competncia. Para ambos os mtodos considerados, h variaes de eficincia, em maior ou menor grau, em funo do tamanho e concentrao do plasmdeo e da estirpe bacteriana. Por isso, cada tipo de experincia de transformao deve ser precedido por um estudo de eficincia para optimizar o protocolo. Imediatamente a seguir transformao (choque trmico no mtodo do cloreto de clcio ou descarga elctrica na electroporao), adicionado meio no selectivo s clulas e procede-se a uma incubao breve (30-60min a 37C) para que ocorra expresso do gene plasmdico de resistncia ao antibitico, de modo a haver suficiente protena sintetizada para

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conferir resistncia no momento em que as clulas forem espalhadas no meio selectivo. No caso frequente de seleco de transformantes resistentes ampicilina, o gene plasmdico que confere a resistncia codifica uma enzima (-lactamase) que degrada o antibitico. Depois de sintetizada, esta enzima segregada para o exterior celular, formando-se uma zona em redor das colnias de transformantes com menor concentrao do antibitico ao fim de mais de 16 horas de incubao. Assim, em placas com incubao muito prolongada, pode ocorrer o surgimento de colnias satlite, identificveis por serem muito pequenas comparadas com as colnias de transformantes, e que so resultantes do desenvolvimento de clulas no transformantes que, deste modo, so viveis. O problema que estas colnias satlites podero provocar o de dificultar a repicagem dos transformantes para sua recuperao, bastando, para ultrapassar esta situao, analisar as placas com menos tempo de incubao.

Transformao de Escherichia coli

Transformao qumica com CaCl2 I) Preparao de clulas competentes 1 - Inocular 50ml de meio LB (em Erlenmeyer de 250ml) com uma s colnia da estirpe de E. coli. Incubar durante a noite a 37C, a 250r.p.m. 2 - Inocular 400ml de LB (em Erlenmeyer de 2000ml) com 4ml da cultura e incubar nas mesmas condies de temperatura e agitao at DO590 de 0,375. 3 - Transferir a cultura para 8 tubos de 50ml de polipropileno pr-arrefecidos e deixar no gelo durante 5-10min. 4 - Centrifugar a 1600g durante 7min, a 4C. 5 - Ressuspender lentamente cada sedimento em 10ml de soluo de CaCl2 gelada. 6 - Centrifugar a 1100g, 5min a 4C. 7 - Ressuspender cada sedimento em 10ml de soluo de CaCl2 gelada. Manter a suspenso em gelo durante 30min.

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8 - Centrifugar a 1100g, 5min a 4C. 9 - Ressuspender cada sedimento em 2ml de soluo de CaCl2. 10 - Distribuir alquotas de 250l por microtubos esterilizados e arrefecidos. Congelar imediatamente a -70C. II) Transformao das clulas competentes 11 - Descongelar uma alquota de clulas competentes em banho de gelo e colocar 100l num microtubo arrefecido. Manter no gelo. 12 - Adicionar 10ng de DNA (10 a 25l) e misturar com movimentos circulares da ponta da micropipeta. Manter em gelo durante 10min. 13 - Provocar um choque trmico s clulas, colocando o microtubo num banho a 42C e deixar durante 2min. 14 - Adicionar 1ml de meio LB. Incubar 60min, 37C a 250r.p.m. 15 - Espalhar em placa de LB suplementado com o antibitico apropriado (ampicilina), diluies de 10-1, 10-2 e 10-3. Incubar a 37C durante 12 a 16 horas. Fazer um controle com clulas competentes sem adio de DNA Eficincia esperada: 107-108 transformantes/g pDNA Referncias Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. Eds. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore. (Pags.: 13.7.1-13.7.10) Hanahan D, Jessee J, and Bloom R. 1995. Techniques for Transformation of E. coli. In: DNA Cloning 1, A Practical Approach. Core Techniques, 2nd Edition. Glover DM and Hames BD ed. IRL Press. Oxford, UK Sites da internet teis http://research.nwfsc.noaa.gov/protocols html Site completssimo com protocolos para muitas aplicaes em biologia molecular. Meios de cultura e solues Meio LB ("Luria broth"):

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Tryptone 1% (p/v); extracto de levedura 0,5% (p/v); NaCl 1% (p/v); ajustar pH 7,5 com NaOHaq.; autoclavar 20min, 120C, 1bar. Soluo de CaCl2: CaCl2 60mM glicerol 15% (p/v) LB slido com ampicilina: Meio LB; agar 2% (p/v); autoclavar a 120C, 1bar durante 20min. Antes da distribuio pelas placas, adicionar ampicilina 100mg/ml esterilizada por filtrao, para uma concentrao final de 100g/ml. Guardar as placas a 4C.

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Digesto total e parcial com enzimas de restrio. Mapas de restrio

Endonucleases de restrio so enzimas que reconhecem pequenas sequncias de DNA e cortam o DNA em cadeia dupla num local especfico dentro dessa sequncia ou adjacente a ela. De acordo com as caractersticas de corte, as enzimas de restrio so classificadas em trs tipos. As enzimas tipo I e III, para alm da aco nuclesica, tm aco modificadora (metilao) na mesma protena. Acresce que as enzimas do tipo I cortam ao acaso prximo da sequncia de reconhecimento. Por estas razes, as enzimas do tipo I e III no so usadas em investigao de rotina em biologia molecular. As endonucleases de restrio do tipo II so sistemas binrios em que uma subunidade tem aco nuclesica e a outra aco de metilao. Ambas estas aces so efectuadas em locais especficos dentro ou adjacentes sequncia de restrio no DNA. Estas sequncias so de 4 a 8 nucletidos, havendo algumas enzimas que reconhecem sequncias maiores. Como h especificidade para o local de corte, as enzimas de restrio podem ser usadas para a degradao de molculas de DNA com obteno de fragmentos de menor tamanho, cujas extremidades so conhecidas em termos de sequncia nucleotdica e que podem ser separados em electroforese em gel de agarose. As sequncias das extremidades e o tamanho dos fragmentos obtidos variam de acordo com a enzima de restrio usada. Pela possibilidade de manipulao em locais especficos do DNA, as enzimas de restrio constituem ferramentas bsicas em biologia molecular. Duma maneira geral, so usadas para o estabelecimento de mapas de restrio de fragmentos de DNA cuja sequncia desconhecida, fragmentao de DNA genmico para separao electrofortica e posterior anlise por "southern", criao de fragmentos menores dum DNA clonado para subclonagem num vector apropriado e criao de sondas marcadas para anlises por "southern" e "northern". De acordo com o modo de corte da cadeia dupla, h enzimas que originam extremidades sem nenhuma das duas cadeias protuberante ("blunt ends"), quando o corte feito no eixo de simetria (Dral por exemplo). Enzimas que no cortam ao longo do eixo de simetria da sequncia de reconhecimento deixam extremidades com uma das cadeias protuberante que pode ser a extremidade 3' (Kpnl) ou 5' (BamHI). Endonucleases com a mesma sequncia de reconhecimento so

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designadas isosquismeros e podem ou no originar extremidades iguais nos fragmentos a que do origem (Sau3AI e Ndell). Por outro lado, enzimas que sejam isosquismeros, ou no, podem originar extremidades com cadeias protuberantes semelhantes e que portanto podem ser ligadas umas s outras por haver sequncias complementares. Estas enzimas (BamHI e Bglll por exemplo) produzem extremidades compatveis e so de grande utilidade pois so ferramentas essenciais na construo de molculas recombinantes. Dois factores so essenciais para a eficincia de corte das endonucleases de restrio: pureza do DNA e o tampo de digesto. As impurezas habituais presentes em amostras de DNA (protena, fenol, clorofrmio, etanol EDTA, SDS e elevada concentrao de sais) podem inibir por completo determinadas enzimas de restrio. Muitas vezes este problema pode ser ultrapassado empregando maior quantidade de enzima, no entanto, geralmente melhor fazer nova purificao do DNA. Por outro lado, em amostras conservadas em tampo TE, o EDTA pode quelar caties que sejam necessrios actividade da enzima a usar. A influncia de todos estes factores dependente da enzima de restrio, pelo que se devem ter em conta quando se verifica ausncia de actividade, assegurando-se que as condies de reaco foram as ideais. Os componentes essenciais dos tampes de digesto so: tampo tris para pH 7,5- 8,0; ies de magnsio, cloro, sdio e potssio; um agente redutor como o ditioeritritol, ditiotreitol ou 2-mercaptoetanol. Embora haja especificidades da actividade em relao a todos o estes factores, o mais importante a concentrao de ies (fora inica). Assim, dividem-se as enzimas em trs grupos: as que requerem elevada fora inica, mdia fora inica e baixa fora inica. Esta propriedade particularmente importante para digestes com vrias enzimas de restrio em que impossvel a digesto simultnea com enzimas que requerem diferentes foras inicas. Nestes casos devem-se fazer as digestes em separado, comeando pela enzima de menor fora inica, desnaturar a enzima por calor, ajustar a concentrao de sais e proceder segunda digesto. As consequncias do uso de condies no ideais em digestes com enzimas de restrio so a ausncia de actividade ou a "star activity" em que a enzima perde a especificidade para a sequncia de reconhecimento, passando a fazer cortes no s nos locais especficos mas tambm noutros. Um factor que pode ser importante em alguns casos o grau de metilao do DNA. A produo de enzimas de restrio um mecanismo de defesa contra a

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infeco por DNA exgeno em bactrias. Para precaver a aco contra o prprio DNA, estas enzimas de restrio promovem a metilao de nucletidos, ficando ento a sequncia de reconhecimento imune sua aco. Assim, quando se trabalha com DNA plasmdico proveniente de estirpes bacterianas com capacidade de metilao, deve-se ter em ateno, tambm, a sensibilidade da enzima a usar para a metilao dos nucletidos da sequncia de reconhecimento. A estratgia mais usada o uso de estirpes bacterianas manipuladas geneticamente para a perda desta capacidade. A acrescentar aos cuidados a ter nas condies de digesto, as enzimas de restrio so extremamente instveis e de elevado preo. Assim, devem-se cumprir normas rigorosas para evitar desperdcios e perdas de actividade (ver o protocolo).

Digesto total e parcial de DNA com enzimas de restrio

Digesto total 1 - A um microtubo colocado no gelo adicionar: 0,2-1g de DNA 2l de tampo conveniente (10x conc.) gua ultra-pura esterilizada q.b.p. 19l. Misturar suavemente agitando no vortex. Manter o microtubo no gelo. 2 - Adicionar 1l da enzima de restrio e agitar novamente como em 1. As enzimas de restrio so extremamente caras e de grande instabilidade. Nas preparaes comerciais, estas enzimas esto em solues concentradas de glicerol e mantidas a -20C. Assim, deve-se ter o maior cuidado ao pipetar estes produtos para evitar desperdcios e desnaturaes, de acordo com os seguintes conselhos: certificar-se que usa sempre uma ponta nova da micropipeta; mergulhar o mnimo possvel da ponta no lquido para pipetar; manter a soluo da enzima o mnimo de tempo possvel fora do recipiente refrigerador ou gelo; usar o mnimo possvel de enzima, garantindo que este volume no contribui com mais de 10% do volume final de reaco.

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Para calcular a quantidade a usar, consultar a ficha tcnica do fabricante. De um modo geral, 1unidade corresponde quantidade de enzima necessria para digerir completamente 1g de DNA do fago lambda, durante 1 hora a 37C e com o tampo adequado. Para efeitos prticos, considera-se que: 1U digere 1g DNA/hora 3 - Incubar a mistura temperatura conveniente de acordo com a enzima (normalmente 37C) e durante ~1,5horas. 4 - Para determinados fins, a reaco pode ser parada atravs da adio de EDTA 0,5M para uma concentrao final de 10mM, ou, no caso de se tratar duma enzima termolbil, atravs do aquecimento da mistura a 65C durante 10-15min. 5 - Analisar os produtos da reaco em electroforese em gel de agarose. Digesto parcial Proceder segundo o protocolo da digesto total excepto nos tempos de incubao. Para a amostra de DNA genmico, aumentar o volume de reaco para 60l e retirar alquotas de 20l ao fim de 15min, 30min e 45min de incubao. Uma vez retirada cada alquota, proceder imediatamente inactivao da enzima por aquecimento a 65C durante 15min ou adio de EDTA para uma concentrao final de 10mM. Analisar igualmente o DNA por electroforese em gel de agarose, incluindo um controle com DNA genmico no digerido (tempo de incubao 0min). Referncias Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
(Pags.: 5.3-5.14)

Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. Eds. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore. (Pags.: 3.0.3-3.3.2)

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Sites da internet teis http://www.promega.com/reguide/default.htm Site da empresa Promega contendo um guia dedicado a enzimas de restrio com informao exaustiva e conselhos na utilizao de destas enzimas. Meios de cultura e solues Consultar as fichas tcnicas do fabricante das enzimas.

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