IMUNODIFUSO RADIAL SIMPLES

INTRODUO A tcnica de imunodifuso realizada em meio semi-slido, geralmente o gar ou agarose, que permite uma difuso mais homognea que em meio lquido, mas que tem o inconveniente de demorar entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitao. A difuso dos imunoprecipitados no gel depende do tamanho destes; quando so grandes ficam maior que o dimetro dos poros, o que impede a sua difuso. A imunodifuso pode ser simples ou dupla; simples, quando ou o antgeno ou o anticorpo fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio, at ocorrer precipitao; dupla, quando os dois componentes migram um em direo ao outro.

IMUNODIFUSO RADIAL SIMPLES A imunodifuso radial simples, foi introduzida por Mancini, em 1965, alm de ser uma tcnica de fcil realizao e de baixo custo, quantitativa. realizada em placas ou lminas revestidas de gar, na qual incorporado um anti-soro especfico para a molcula a ser quantificada. Princpio da Tcnica: O princpio desta tcnica consiste em uma imunoprecipitao em gel agarose entre o antgeno a ser quantificado e seu anticorpo homlogo. No gel de gar so depositados os reagentes, que so geralmente os anticorpos em pequenos orifcios escavados no gel. Estas molculas difundem-se no gar e quando reagem com o anticorpo, na concentrao correspondente zona de equivalncia, forma-se a linha de precipitao, o que ocorre entre 48-72 horas. O dimetro do halo que se forma ao redor do orifcio onde foram depositadas as amostras corresponde a concentrao da molcula com a curva padro obtida. Para a obteno da curva padro so utilizadas concentraes conhecidas da soluo padro e aps reao com anticorpos presentes no Agar, os halos so medidos. Por exemplo, se quisermos dosar as concentraes de IgM do soro de pacientes; para a obteno da curva padro deve-se ter uma soluo contendo IgM purificada de concentrao conhecida.

Esta tcnica utilizada para quantificar IgG, sistema Complemento.

IgM

e IgA

molculas

do

Procedimentos de preparo para realizao da tcnica: As amostras de soro devem ser processadas no mesmo dia da sua realizao, se isso no for possvel devem ser guardadas em refrigeradores a uma temperatura mdia de -20C, evitando que a amostra congele e descongele. Caso a amostra se torne turva, deve-se clarificar por centrifugao. Algumas amostras necessitam ser diludas para que possam ser introduzidas no orifcio da placa, para isso usa-se soro fisiolgico. Case sejam amostras peditricas, pela concentrao ser menor aconselha-se concentrar em dobro e realizar duas aplicaes em um perodo mximo de 30 minutos deixando secar aps a primeira aplicao. Modo de fazer: Abrir a placa e aplicar 5 microlitros de amostra utilizando uma micropipeta de preciso. Colocar algodo ou gaze umedecida no centro da placa para manter a umidade do Agar, aps fechar firmemente a tampa. Incubar em posio invertida, temperatura ambiente por aproximadamente 48 horas. Faz-se a leitura do halo com rgua milimtrica. Traar a reta que una no mnimo trs pontos. O objetivo de traar-se uma reta, que pode ser feita tambm atravs de programa estatstico computadorizado para se obter o valor da quantidade de imunoglobulina est presente na amostra, em mg/dl. O valor obtido deve ser comparado com os valores normais de referncia conforme segue:
IMUNOGLOBULINA G:

Adultos: 600-1650 mg/dl Crianas: 560-1500 mg/dl

Faz-se a dosagem de IgG principalmente para estudar as imunodeficincias. A deficincia de IgG deve-se a perda de protenas, a defeitos hereditrios na sntese, a defeitos adquiridos na produo, a toxinas ou a drogas imunossupressoras ou podem ser secundria aos processos tumorais linfides. Valores elevados se associam com mieloma e hepatopatias crnicas. No caso de infeces esperado um aumento policlonal da IgG srica.

 IMUNOGLOBULINA A:

Adultos: 90-400 mg/dl Crianas: 100-210 mg/dl

A medio de IgA em saliva til na investigao por infeces recorrentes do trato respiratrio superior nas crianas. (Se estima que um de cada 750 indivduos seja deficiente em IgA), embora a maioria dos pacientes sejam assintomticos. Na sndrome ataxiatelangiectasia esta imunoglobulina se encontra ausente. Um nmero significativo de pacientes com esta sndrome teriam anticorpos circulantes anti-IgA que pode produzir reaes anafilticas fatais. Nveis aumentados de IgA srica so comuns em pacientes com infeces intestinais,drmicas, renais e respiratrias.
IMUNOGLOBULINA M:

Adultos: 75-300 mg/dl Crianas: 40-200 mg/dl

A dosagem de IgM uma ferramenta a mais no estudo de imunodeficincias. No caso de infeces intra-uterinas a produo fetal de IgM aumenta e no momento do nascimento, o nvel de IgM est aumentado no cordo umbilical. Na macroglobulinemia de Waldenstrom e nas crioglobulinemias monoclonal, assim como no mieloma IgM, se observa um aumento monoclonal desta protena.

OUTROS MTODOS QUE SE BASEIAM NA REAO DE PRECIPITAO

Imunodifuso Dupla;

Imunoeletroforese;

Aglutinao Direta: Na reao de aglutinao direta as partculas antignicas (bactrias, hemcias, fungos, protozorios) podem estar na forma ntegra ou fragmentada. As reaes de aglutinao direta que utilizam as hemcias podem identificar os tipos sanguneos humano A, B, O e Rh. No caso da identificao do sistema ABO, as hemcias da pessoa so colocadas para incubar com anticorpos anti-A ou anti-B, em lminas. Se a aglutinao

ocorrer quando a incubao feita com anti-A ou anti-B, as clulas sero respectivamente, A ou B; se a aglutinao ocorrer com os dois anticorpos em questo as hemcias sero do tipo AB e caso no ocorra aglutinao, o tipo sanguneo ser O. Alm das hemcias, bactrias podem ser aglutinadas por anticorpos especficos, como no caso do teste para deteco de Salmonella (teste de Widal) e para o dianstico da brucelose (teste de Wright). Testes de aglutinao para identificar infeco com Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma e Leptospira tambm so realizados.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS CALICH, V.L.G. ; VAZ, C. A. C. . Imunologia Bsica. So Paulo,. 1. ed. SAO PAULO: Ed. Artes Mdicas,, 1988. v. 1. Ensaios imunolgicos nas enfermidades virais. Disponvel em: http://www.portaldeginecologia.com.br/congresso/ensaios.PDF Acessado em: 29 de outubro de 2011. Mtodos imunoqumicos para anlise de contaminantes ambientais: conceitos, estado da arte e perspectivas. Disponvel em: http://www.scielo.br/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S0100-40422005000300018 Acessado em: 29 de outubro de 2011.