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MANUAL ILUSTRADO: NORMAS GERAIS PARA USO DE LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA E MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NA PRTICA ANALTICA MICROBIOLGICA
(5a Edio)
ELABORAO: Prof Dulce Lins Profa Cristina Maria Prof Eduardo Alcio Prof Silvana Mendona
INSTRUES GERAIS Em um laboratrio de microbiologia as condies de higiene e limpeza devem ser rigorosas, para evitar possveis fontes de contaminaes, que constituam um risco em potencial para todos os envolvidos no trabalho e manuseio. NORMAS GERAIS PARA USO DE UM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA Desinfeco do laboratrio: de fundamental importncia manter uma ateno diria em relao desinfeco do laboratrio de Microbiologia. Esta visa eliminar qualquer interferncia externa que possa influir na qualidade dos trabalhos desenvolvidos, assim como proteger o pessoal envolvido de qualquer contaminao ambiental. muito importante que se determine periodicamente, o ndice de contaminao do laboratrio. No incio e trmino de cada trabalho prtico, a superfcie da bancada deve ser desinfetada. Podem ser usadas solues de lcool 70% (m/m) ou lcool 70% (m/m)+Iodo 0,25% (m/v), soluo de hipoclorito de sdio, etc. Em caso de acidentes provocados por respingos, quebras de frascos, tubos e placas que contenham materiais contaminados, deve-se proceder imediatamente desinfeco. Todo material contaminado antes de ser lavado, deve passar pelo processo de esterilizao, para que toda a sua flora microbiolgica seja completamente destruda, evitando-se que o mesmo seja uma fonte de contaminao. Nunca se deve deixar sobre a bancada de trabalho, lminas retiradas do microscpio. Este material deve ser colocado em recipiente contendo uma soluo desinfetante adequada. Todo material que deve ser esterilizado e/ou lavado (tubos, pipetas, placas frascos, etc.) dever ser colocado em lugar indicado, ao final de cada atividade desenvolvida no laboratrio. As alas e as agulhas inoculadas, aps o uso, devem ser esterilizadas chama. O autoclave, que um equipamento usado nas atividades rotineiras do laboratrio, deve ser inspecionado e verificado quanto eficincia de esterilizao periodicamente. Deve-se ter sempre o cuidado de lavar e realizar a antissepsia das mos, antes e aps o trmino dos trabalhos realizados no laboratrio.
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Solues qumicas devem ser pipetadas com auxiliar de pipetagem (pra de borracha) e as pipetas qumicas devem estar separadas das microbiolgicas. MATERIAIS USADOS NOS LABORATRIOS MICROBIOLGICOS Esses materiais podem ser enumerados da seguinte forma: Conjunto de uso do Aluno(a) Vidrarias Acessrios Equipamentos Faz-se necessrio conhecer suas utilidades, caractersticas especficas e seu manuseio, para utiliz-los de maneira correta no controle microbiolgico. 1. CONJUNTO DE USO DO ALUNO (Material bsico): Cada aluno deve portar uma bata (avental), uma caneta marcadora para vidraria (caneta para retroprojetor pode substituir), um auxiliar de pipetagem (pra de borracha) e um caderno de laboratrio para anotaes dos experimentos.. A bata no deve ser de material semi-sinttico (bastante inflamvel) e sim de algodo. Na etapa de aprendizado o aluno deve preferir bata de manga curta, para evitar risco de acidentes com a chama do bico de Bnsen.
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2. VIDRARIAS: 2.1 Tubo de cultura: So tubos de vidro, sem borda ou com tampa de plstico rosquevel. Seu tamanho pode variar de acordo com o trabalho a ser realizado. So utilizados no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio de cultura, trazendo a vantagem de economizar meio e espao fsico.
2.2
Placas de Petri
So recipientes redondos, de vidro ou plstico, com tampa rasa. Geralmente recomendado determinar-se o seu dimetro e altura, de acordo com o tipo de trabalho a ser realizado. As mais usadas medem cerca de 100 mm de dimetro por 10 mm de altura. Servem para conter meio de cultura slido; Sua superfcie extensa facilita o isolamento de espcies microbianas distintas.
2.3
Pipetas graduadas(sorolgicas):
So utilizadas para diluies, inoculaes, distribuies de meio, etc. Em microbiologia estas pipetas devem ser esterilizadas com uma poro de algodo hidrfobo na parte superior. Estas pipetas podem ser sopradas, pois no se requer muita preciso. As pipetas para uso com substncias qumicas devem ser separadas das microbiolgicas (usar auxiliar de pipetagem de 3 vias). As pipetas microbiolgicas so usadas com dispensadores automticos.
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2.4- Pipetas de Pasteur: So tubos de vidro ou polipropileno, no graduados, estirados em capilar. Servem para transferncia de pequenos volumes de lquidos. Podem ser usadas com uma pequena pra de borracha na extremidade superior.
2.5- Ala de Drigalsky: obtido pela manipulao de uma vareta de vidro chama do maarico. Serve para espalhar suspenses de microrganismos na Placa de Petri contendo meio de cultura slido. Deve ser flambada chama antes e aps o uso.
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2.6- Lminas de vidro: So de vidro claro e transparente, com formato retangular. So utilizadas para exame dos microrganismos em microscpio ptico. Geralmente so armazenadas em caixa de vidro contendo lcool 95%.
2.7- Lminas escavadas: uma lmina especfica, que serve ao chamado ensaio em gota pendente, ou seja, o material observado suspenso em uma gota de lquido. Muito utilizada na observao da mobilidade dos microrganismos. 2.8- Lamnulas: So pequenas lminas de vidro transparente, quadradas, finas, destinadas a cobrir as preparaes contidas nas lminas, nos ensaios a fresco. Tambm so usadas para o preparo de lminas fixadas para uso por longos perodos..
2.9- Hematocitmetro de Newbauer: Tambm denominada lmina de contagem ou cmara de Newbauer. So escavadas, milimetradas e permitem contar o nmero de clulas contidas em um volume determinado de suspenso microbiana. 2.10- Frascos de Cultivo Microbiano: De vidro borossilicato e tampa rosqueada de polipropileno, autoclavvel. So vidrarias utilizadas para anlises de gua e alimentos.
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So tubos de vidro pequenos e cilndricos. Servem para captar o gs formado em uma fermentao.
2.13-Termmetros: So utilizados em estufas microbiolgicas, de secagem e esterilizao, banhos de gua (banhos-maria), etc. Deve-se prezar por termmetros calibrados pela Rede Brasileira de Calibrao RDC (INMETRO), cujas incertezas sejam conhecidas. Deve-se dar preferncia a termmetros de lcool (bulbo vermelho).
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2.14-Balo de fundo plano (chato) (A) e Erlenmeyer (B) : So utilizados em Microbiologia para armazenar quantidades maiores de meio de cultura. O erlenmeyer uma vidraria muito utilizada tambm na multiplicao celular de microrganismos em meio de cultura lquida com agitao ou aerao.
A 3. ACESSRIOS:
3.1
um aquecedor a gs com chama, cuja temperatura varia de acordo com a regulagem. suprido com gs liquefeito de petrleo (GLP) e proporciona uma chama que permite a realizao da manipulao das anlises microbianas. Deve-se verificar com freqncia se no h vazamentos de gs nas conexes.
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3.2
Cabo de Kolle:
um cilindro metlico, contendo um material isolante trmico na extremidade, usado para manipulao microbiana da ala de platina (ou nquel-cromo). Na outra extremidade metlica h um orifcio onde colocada a ala ou agulha que so fixadas mediante encaixe rosquevel, utilizado como suporte para este fim.
3.3
um fio de platina ou outra liga metlica, medindo aproximadamente cinco centmetros, recurvado em uma de suas extremidades. adaptado ao cabo de Kolle. Este material utilizado para transferir inculos slidos ou em suspenso. A agulha um fio de platina ou de outra liga, que fixado ao cabo de Kolle, utilizada para semear meio slido em profundidade.
3.4
Esptulas e pinas:
Estes utenslios so normalmente produzidos em ao inoxidvel. A esptula utilizada para pesagem de pequenas massas, enquanto a pina para manipulao de lminas, lamnulas, etc...
SOLUES:
4.1 Solues Desinfetantes: As solues desinfetantes so utilizadas para antissepsia das mos (lcool 70% m/m), ou desinfeco das bancadas (hipoclorito de sdio 2,5%, lcool 70% m/m ou lcool 70% m/m+ Iodo 0,1-0,5% m/v), ou ainda para descarte de resduos lquidos e de pipetas contaminadas (no usar soluo inflamvel com lcool 70%). Antes de iniciar qualquer atividade as bancadas devem ser desinfetadas e providenciado recipiente com soluo de hipoclorito de sdio para descarte das pipetas. As solues podem ser armazenadas em pissetas plsticas.
4.2 Solues Corantes: As solues corantes so utilizadas para preparao de microrganismos para a observao microscpica. 5 EQUIPAMENTOS UTILIZADOS: 5.1- Agitador do tipo rotatrio (Shaker): munido de uma plataforma onde os recipientes contendo o meio lquido so fixados O mesmo gira de modo circular, agitando o meio continuamente durante a incubao e tambm expondo maior superfcie do meio fase gasosa.
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5.2- Contador de colnias: utilizado para contagem de colnias em Placa de Petri. constitudo de um suporte onde colocada a placa e acima desta, em distncia definida, situa-se uma lente (lupa) que possibilita o aumento de 1,5 vezes. Pode acompanhar uma caneta para contagem. Quando o equipamento est funcionando, a placa iluminada, permitindo assim maior nitidez e realce das linhas que subdividem o suporte.
5.3 Estufa incubadora(Microbiolgica): um tipo especfico de estufa que apresenta alm da porta metlica, uma porta de vidro. Apresenta um sistema de aquecimento controlado por resistncia eltrica. O aquecimento controlado atravs de um termostato e a temperatura acompanhada com termmetro analgico ou digital. A temperatura no deve ter uma variao superior 0,5C. Para determinar a temperatura, coloca-se um termmetro com o bulbo submerso em lquido (glicerina, gua, etc.) para maior homogeneidade da medida. Esse equipamento utilizado como auxiliar no crescimento e reproduo dos microrganismos, uma vez que fornece a temperatura adequada a cada espcie microbiana.
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5.4- Incubadora de banho de gua (banho-maria): um equipamento indispensvel para realizaes dos ensaios de coliformes termotolerantes (44,5C 0,2C). O mesmo dotado de um termmetro, termostato e tampa para o controle de temperatura do banho.
5.5- Estufa de Esterilizao: um tipo especfico de estufa que apresenta um sistema de aquecimento controlado por resistncia eltrica, munida de termostato e termmetro para o controle de temperatura. Em geral este equipamento utilizado para esterilizar vidrarias.
5.6- Potencimetro; um equipamento muito utilizado no laboratrio de Microbiologia para se determinar o pH dos diferentes tipos de meios de culturas e solues tampo.. constitudo por eletrodos, botes de ajuste e dotado de um sistema eletrnico capaz de fornecer leituras diretas com exatido de 0,1 unidades de pH.
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Verifica-se a exatido do aparelho pelo menos duas vezes ao dia, usandose solues-padro tamponadas. Eletrodo de Vidro Sensor de Temperatura
5.7- Balanas: So destinadas a pesagens das diferentes substncias usadas no preparo dos vrios tipos de meios de cultura, solues e corantes. Podem ser analgicas ou digitais. As balanas devem ser mantidas sobre uma base slida protegidas de vibraes, e tambm de umidade e mudanas bruscas de temperatura.
5.8- Autoclave: um equipamento destinado esterilizao pelo calor mido (vapor dgua sob presso). Normalmente, so utilizados para esterilizar guas de diluies, meios de cultura que suportem temperaturas elevadas (115-120C), materiais contaminados que vo ser descartados e outros. O autoclave de laboratrio pode ser do tipo horizontal ou vertical, contendo os seguintes acessrios: caldeira cilndrica hermeticamente fechada por uma tampa de bronze ou cobre, dotada de manmetro, vlvula de escape de ar e de segurana. Em seu interior existe uma cesta metlica (mvel) onde so colocados todos os materiais a serem esterilizados.
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empregado o uso de bioindicadores ou fitas de controle para se testar a eficincia deste equipamento.
5.9 Geladeiras e Congeladores (Freezers): As geladeiras so utilizadas para a conservao de meios de cultura estreis, solues e amostras de contra-prova. As culturas microbianas e solues no devem ser colocados no mesmo equipamentos que as amostras. Jamais poder guardar refeies, lanches, bebidas ou qualquer outro alimento que ir ser consumido. Se contiver material com risco biolgico dever ser identificada com o pictograma adequado. Culturas vivas no devem ser congeladas.
5.10 Agitador Magntico: munido de uma plataforma metlica onde o recipiente contendo o meio lquido e uma barra magntica revestida de material inerte colocado. O mesmo gira a barra magntica de modo circular, agitando o meio continuamente durante a incubao e tambm expondo maior superfcie do meio fase gasosa,
5.11 Microscpio tico: Equipamento utilizado para o estudo dos microrganismos. Os equipamentos mais usados permitem o aumento de at 1.250 vezes e podem ser monocular ou binocular. Deve-se ter cuidado para no utilizar preparaes a fresco com a objetiva de imerso.
5.12 Auxiliar de Pipetagem (pipeting aide): Equipamento utilizado para pipetar lquidos viscosos tais como meios de cultura e culturas microbianas. As pipetas devem ter uma proteo de algodo hidrfobo para proteger o auxiliar de possveis contaminaes.
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5.13 Cabines de Fluxo Laminar Horizontal (A) e Vertical (B): As cabines de fluxo horizontal se prestam para a manipulao de materiais estreis como meios de cultura esterilizados e amostras de materiais estreis (solues injetveis, nutrio parenteral, etc). No devem ser usadas para materiais muito contaminados ou culturas puras de microrganismos, pois o fluxo de direcionado no sentido do operador. Nosso modelo (Pachane)apresenta filtro tipo HEPA (high efficiency particulate air [filter]", classe A3, NBR-6401, EU-13, com eficincia de filtrao de 99.995 % para partculas de 0,3 mcron.
B
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Verificar o nvel da gua, e completar se necessrio, at atingir o nvel adequado (cobrir as resitncias eltricas). Acondicionar o material de modo que o vapor circule livremente e sem que se encoste s paredes do cesto metlico. Fechar a tampa apertando cuidadosamente os parafusos diametricamente opostos, deixando aberta vlvula de escapamento de ar. Deixar expulsar todo o ar de seu interior. Fechar a vlvula de escape de ar quando o vapor sair num jato contnuo. Esperar o manmetro atingir a presso interna desejada (em geral 1,1 atm ou 1,1 Kgf/cm2) o que corresponde temperatura de 121C. Regular o aquecimento da autoclave de modo a permanecer na temperatura desejada durante o tempo necessrio. Ao trmino do tempo necessrio, desligar o aquecimento e, com a vlvula de escapamento aberta, deixar a presso cair lentamente at o ponto zero. Abrir num movimento rpido a tampa e deixar escapar os vapores. Retirar o material e esperar esfriar.
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de fundamental importncia em um laboratrio de Microbiologia a limpeza e as condies de higiene. Estes fatores devem sempre prevalecer para se ter um ambiente de trabalho isento de possveis contaminaes. Para a limpeza de vidrarias em uso corrente, devemos executar as seguintes etapas: Os materiais quando novos e tambm usados (previamente esterilizados) porm sem elevada contaminao, so lavados com soluo detergente e passados sob gua corrente (5 a 8 enxagues), e em seguida enxaguados com pores pequenas de gua destilada (03 enxagues). Deixa-se escorrer, coloca-se em estufa com uma temperatura controlada em torno de 70C para secagem. Materiais usados em anlises e culturas microbianas, isto , com culturas desenvolvidas e que vo ser descartadas, devem ser autoclavados durante 30 minutos, a uma temperatura de 121C. Desta forma ficam isentos de contaminaes e so manuseados sem nenhum risco de contaminar o operador e tambm as pias e materiais de limpeza. Aps a esterilizao do material contaminado os meios de cultura ainda no solidificados so colocados no lixo comum e a vidraria lavada com gua corrente e deixada durante 12 horas em soluo de detergente. Em seguida procede-se a lavagem como descrito anteriormente.. Lminas e lamnulas quando retiradas do microscpio so colocadas em uma soluo desinfetante (hipoclorito de sdio) e deixadas submersas por 24 horas antes de serem lavadas com gua corrente e com gua destilada. Aps a limpeza so acondicionadas em frascos com boca larga contendo lcool 96GL.
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TESTE DE EFICINCIA DE AUTOCLAVES E ESTUFAS DE ESTERILIZAO de fundamental importncia em um laboratrio de Microbiologia demonstrar o controle e a eficincia da esterilizao. Para esta avaliao so realizados monitoramentos mecnicos (controle e registro do tempo, temperatura e presso durante a esterilizao) e utilizados indicadores fsicos ou biolgicos. Como indicador fsico bastante utilizado a fita indicadora de temperatura (a) e como teste biolgico para estufas (calor seco) e autoclaves (calor mido) esporos de Bacillus subtilis var. niger (fitas) e Bacillus stearothermophillus (ampolas) (b), respectivamente.
a b
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