V Mostra Interna de Trabalhos de Iniciao Cientfica 26 a 29 de outubro de 2010

ISBN 978-85-61091-69-9

AVALIAO DO GRAU DE HEMLISE E SUA INTERFERNCIA EM ANLISES BIOQUMICAS DE AMOSTRAS OBTIDAS POR DIFERENTES TCNICAS DE COLETA DE SANGUE VENOSO
Marina de Souza Bastos1; Alessandra Aparecida Berner2; Edivan Rodrigo de Paula Ramos3
RESUMO: Este trabalho realizou a dosagem srica de LDH, TGO, potssio, glicemia e hemoglobina livre de amostras obtidas por mtodo tradicional com seringa, mtodo de coleta a vcuo e mtodo de coleta onde a agulha espetada na tampa do tubo destinado a coleta a vcuo, com o objetivo de verificar se este ltimo procedimento causa hemlise significativa e altera o resultado dos exames realizados. As amostras foram obtidas de trs voluntrios, sendo que de cada voluntrio foram realizadas duas punes. Cada analito foi determinado 10 vezes, em cada amostra, para obteno da mdia e do desvio padro, utilizados para o clculo do coeficiente de variao analtico. Os resultados foram analisados pelo teste One-way Anova (no paramtrico) seguido de Bonferroni. As diferentes tcnicas de coleta, nos trs voluntrios, produziram diferenas significativas na dosagem de hemoglobina livre e na atividade de LDH. Por outro lado, tais alteraes no ocorreram para os exames de potssio srico e de TGO. Apenas no voluntrio C foi encontrada reduo da glicemia nas amostras obtidas por coleta a vcuo e espetada. Estes resultados mostram que espetar a agulha no tubo a vcuo para transferncia de sangue no produz hemlise maior em relao s outras tcnicas de coleta.

PALAVRAS-CHAVE: Controle de qualidade; diagnstico laboratorial; hemlise.

1 INTRODUO A determinao de um diagnstico preciso depende, muitas vezes, de exames laboratoriais. Por isso, extremamente importante que esses resultados representem com exatido a real situao clnica do paciente. A coleta de material biolgico o primeiro passo para todas as anlises efetuadas em laboratrio clnico. Dela dependem todas as etapas seguintes, de forma a ser impossvel a obteno de resultados exatos sem um procedimento correto de coleta. Ainda que existam revises e discusses sobre a forma ideal para a realizao da coleta de sangue venoso, observam-se, na prtica, variaes no procedimento de puno venosa entre diferentes laboratrios e diferentes profissionais. Este fato gera a dvida se estas oscilaes na obteno de sangue venoso podem provocar diferenas significativas nos resultados dos exames laboratoriais. Embora, a coleta de sangue venoso possa ser feita pelo mtodo tradicional da seringa e agulha ou pela utilizao do sistema a vcuo, verifica-se, na prtica, uma mistura destes procedimentos. Neste caso, a coleta feita pela forma tradicional, mas a
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Acadmica egressa do Curso de Biomedicina do Centro Universitrio de Maring - CESUMAR, Maring- PR. Programa de Iniciao Cientfica do Cesumar (PICC). marynabastos@yahoo.com.br 2 Tcnica do Laboratrio de Anlises Clnicas do Centro Universitrio de Maring - CESUMAR. ale_berner@hotmail.com 3 Orientador, docente do Curso de Biomedicina do Centro Universitrio de Maring - CESUMAR. edivanramos@yahoo.com.br

Anais Eletrnico
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agulha perfura a tampa de borracha do tubo a vcuo para transferncia do sangue da seringa para o tubo de coleta. Entretanto, a Federal Occupational Safety & Health Administration2 e a Sociedade Brasileira de Patologia Clnica e Medicina Laboratorial6 no recomendam a utilizao da agulha no momento da transferncia do sangue da seringa para o tubo devido possibilidade de ocorrer hemlise que pode interferir nos resultados de alguns exames bioqumicos. Apesar disso, no foram encontrados na literatura estudos que demonstrem se este procedimento de coleta realmente possa interferir de forma significativa nos resultados destes exames. Diante disso, este trabalho foi proposto e teve por objetivo coletar amostras de sangue venoso pelo mtodo tradicional e transferir o sangue para um tubo destinado coleta a vcuo perfurando a tampa do tubo, visando observar se este procedimento pode causar hemlise e interferir nos resultados de alguns exames bioqumicos. 2 MATERIAL E MTODOS Este trabalho foi realizado com amostras de sangue colhidas de trs voluntrios (identificados como A, B e C), sendo que de cada voluntrio foram realizadas duas punes, uma pela tcnica a vcuo e a outra pela tcnica tradicional (agulha e seringa). Contudo, no sistema tradicional, a transferncia do sangue para o tubo de coleta a vcuo foi feita de duas formas distintas: 5 mL de sangue foram transferidos aps a retirada da agulha da seringa e da tampa do tubo, (mtodo tradicional recomendado), e os outros 5 mL foram transferidos perfurando com a agulha a tampa do tubo destinado coleta a vcuo (mtodo misto). Dessa forma, foram obtidas trs amostras de sangue, de acordo com a tcnica de coleta e transferncia do sangue: amostra 1 (mtodo tradicional), amostra 2 (mtodo misto) e amostra 3 (mtodo a vcuo). O estudo foi feito de maneira cega, onde o pesquisador no sabia o tipo de coleta pela qual a amostra foi obtida. O soro obtido foi utilizado para determinao das seguintes dosagens bioqumicas: transaminase glutmico-oxalactica (TGO/GOT/AST), lactato desidrogenase (LDH), potssio, glicose e hemoglobina. Com exceo do potssio srico que foi determinado por meio de eletrodo on seletivo (ISE) em Analisador de Eletrlitos 9180-AVL, os demais exames foram realizados utilizando-se mtodos espectrofotomtricos, cujas absorbncias foram determinadas em fotmetro Bioplus 2000. A verificao de hemlise foi feita por anlise visual e por dosagem de hemoglobina livre no soro. Cada analito, em cada amostra, foi determinado 10 vezes para obteno da mdia e do desvio padro, utilizados para o clculo do coeficiente de variao analtico. Adotouse como variao analtica aceitvel os valores de coeficiente de variao inferiores a 5%. Os resultados foram analisados estatisticamente pelo teste One-way Anova (no paramtrico) seguido de Bonferroni para anlise da varincia entre os grupos. Atribuiu-se como nvel de significncia valores de p<0,05. A realizao da anlise estatstica foi feita com auxlio do programa GraphPad Prism 3.0. Este trabalho foi executado mediante parecer favorvel do Comit de tica em Pesquisa do CESUMAR (CEP-Cesumar) nmero CAE 0048.0.299.000-09. 3 RESULTADOS E DISCUSSO A palavra hemlise definida na literatura como um rompimento da membrana da hemcia, causando a liberao da hemoglobina e outros componentes internos no lquido circundante. Ela pode ser originada in vivo e/ou in vitro. Enquanto a hemlise in vivo sugere uma condio clnico-patolgica, a in vitro demonstra erros no procedimento de coleta, processamento, transporte ou armazenamento da amostra, como por exemplo a
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aplicao prolongada do torniquete, uso do sistema de coleta vacutainer e transferir o sangue da seringa para o tubo sem remover a agulha2,6. A hemlise pode interferir na fase analtica por diferentes maneiras. Primeiro, a hemoglobina livre apresenta absortividade alta em comprimentos de onda variando entre 415 e 570 nanmetros. Dessa forma, a hemoglobina provoca uma elevao aparente na concentrao dos analitos medidos nestas escalas de comprimento de onda, por elevar a absorbncia das amostras. Alm da hemoglobina, as hemcias contm vrias protenas estruturais, enzimas, lipdios e carboidratos, e muitos destes podem tambm interagir ou competir com os reagentes de ensaio ou elevar a quantidade do analito dosado no plasma ou soro7. O interesse em avaliar se diferentes formas de coleta podem resultar em padres de hemlise diferentes, tem sido objeto de estudo de alguns pesquisadores. Grant4, por exemplo, avaliou 454 amostras de sangue colhidas por puno venosa utilizando agulha ou cateter, e tambm avaliou o mtodo de transferncia do sangue da seringa para o tubo, se foi diretamente pela agulha ou aps remoo da agulha. Os resultados por ele encontrados mostraram que 32% das amostras apresentaram algum padro de hemlise e que o modo de transferncia do sangue da seringa para o tubo no teve relao com a hemlise da amostra. Este ltimo resultado nos chama ateno, pois de certa forma, foi semelhante ao encontrado neste trabalho. Aqui, embora nenhuma das amostras avaliadas tenha apresentado um padro visual de hemlise, a dosagem de hemoglobina livre mostrou variaes significativas entre as diferentes formas de coleta. Contudo, estas variaes no foram semelhantes nos trs voluntrios (figura 1). Logo, sugere-se que o mtodo de transferncia do sangue da seringa para o tubo, no influencie na intensidade da hemlise, indicando que as diferenas na quantidade de hemoglobina srica observadas estejam mais associadas ao procedimento de coleta do que propriamente forma de transferncia do sangue para o tubo e/ou sistema de coleta.

Figuras 1 (esquerda) e Figura 2 (direita). Nveis sricos de hemoglobina e TGO em amostras de soro obtidas por diferentes tcnicas nos voluntrios A, B e C. A altura das colunas representa a mdia desvio padro de 10 dosagens. *p<0,05 em relao coleta tradicional. # p<0,05 em relao coleta espetada. ** p<0,05 em relao coleta a vcuo. One-way Anova seguido de Bonferroni.

As hemcias apresentam elevada quantidade da enzima TGO. Portanto, a presena de hemlise na amostra pode elevar a atividade desta enzima no sangue e, dessa forma, proporcionar um falso resultado positivo. Contudo, no encontramos
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alteraes significativas na atividade de TGO nas amostras obtidas pelas diferentes tcnicas (Figura 2). Apesar da quantidade de hemoglobina livre ter variado conforme a tcnica de coleta demonstrado que concentraes de hemoglobina at 45 mg/dL no produzem alteraes significativas na dosagem de TGO1. Como as coletas a vcuo, tradicional e mista no produziram hemlise com valores de hemoglobina livre superior a 45 mg/dL, possvel afirmar que estas tcnicas de coleta, se bem executadas, no interferem no resultado final dos exames de TGO. Outra enzima presente em elevada quantidade na hemcia a LDH, logo qualquer intensidade de hemlise tem sido relacionada a um aumento considervel na atividade srica da LDH5. De fato, observamos, tanto no voluntrio A, quanto no voluntrio C, que as amostras com maior valor de hemoglobina srica tiveram, respectivamente, os maiores valores de atividade srica de LDH (figura 3), sugerindo que o tipo de coleta e a forma de transferncia do sangue da seringa para o tubo podem alterar a atividade srica de LDH, mostrando a necessidade de um controle de qualidade mais rigoroso no procedimento de coleta de amostras para realizao deste exame.

Figuras 3 (esquerda) e Figura 4 (direita). Nveis sricos de LDH e glicemia em amostras de soro obtidas por diferentes tcnicas nos voluntrios A, B e C. A altura das colunas representa a mdia desvio padro de 10 dosagens. *p<0,05 em relao coleta tradicional. # p<0,05 em relao coleta espetada. ** p<0,05 em relao coleta a vcuo. One-way Anova seguido de Bonferroni.

A determinao do potssio srico tambm reconhecida como um exame cuja hemlise causa forte interferncia, uma vez que mais de 98% do potssio existente no organismo se encontra no interior das clulas. A influncia do grau de hemlise nas dosagens de potssio foi avaliada por Frank et al.3 que, em seis pools de soro, adicionaram hemcias lisadas, produzindo amostras de soro com diferentes graus de hemlise. Atravs de fotometria de chama e tcnicas de eletrodo on seletivo, os autores verificaram que o potssio teve seus valores falsamente elevados e de forma proporcional ao grau de hemlise. Contudo, nossos resultados no demonstraram diferenas entre a concentrao srica de potssio nas amostras obtidas por diferentes tcnicas. Se considerarmos que os resultados de Frank et al.3 evidenciaram uma elevao do potssio srico dependente do grau de hemlise e que os nveis de hemlise observados nas amostras avaliadas aqui foram baixos, possvel inferir que alteraes nos nveis de potssio srico no sejam significativas em amostras com baixa taxa de hemlise. Por apresentar colorao avermelhada, as amostras hemolisadas podem interferir na absorbncia de mtodos colorimtricos cuja colorao final seja vermelha. Neste
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sentido, realizamos a dosagem de glicose pela metodologia de Trinder8, cujo produto final da reao a quinoneimina, uma substncia de colorao avermelhada. Logo, seria esperado que uma hemlise visual causasse um falso resultado elevado para a glicemia. O que observamos foi uma pequena reduo, porm significativa, dos valores glicmicos apenas no voluntrio C, para as amostras obtidas por tcnica de coleta mista e a vcuo (figura 4). A reduo, ao invs de aumento, talvez possa ser explicada pelo fato de no ter sido observada hemlise visual e, dessa forma, no haver influncia colorimtrica da hemoglobina na absorbncia final da quinoneimina. Alm disso, diferentes estudos vm demonstrando que a hemlise, em pequeno grau, pode diluir a amostra de soro, fazendo com que o resultado da glicemia seja reduzido e no elevado. 4 CONCLUSO Os resultados deste trabalho mostram que os nveis de hemoglobina livre em amostras de soro variam significativamente com a tcnica de coleta e transferncia utilizadas. Contudo, esta variao parece estar mais relacionada ao procedimento de coleta, caracterstica de cada flebotomista, do que propriamente ao tipo de tcnica de coleta empregada e a forma de transferncia da amostra para o tubo de ensaio. Alm disso, o padro de hemlise observado no alterou a dosagem srica de potssio nem a atividade srica de TGO, sugerindo que estes exames no tm seus resultados alterados quando h pequena taxa de hemlise. Por outro lado, observou-se uma alterao significativa da atividade srica de LDH, que foi diretamente proporcional aos nveis de hemoglobina srica, demonstrando que a determinao de LDH altamente influenciada pela hemlise. Pequenas taxas de hemlise tambm podem causar diluio da amostra e reduzir os valores de alguns exames como a glicemia de jejum. REFERNCIAS BASQUES, J. C. - Especificaes de qualidade analtica. Labtest Diagnstica. 2005. FEDERAL OCCUPATIONAL SAFETY & HEALTH ADMINISTRATION. Disposal of contaminated needles and blood tube holders used for phlebotomy. U.S. Department of Labor. Disponvel em: <http://www.osha.gov/dts/shib/shib101503.html>. Acesso em: 22 set. 2009. FRANK, J. J. et al. - Effect of in vitro hemolysis on chemical values for serum. Clin. Chem., 24 (11): 1966-1970, 1978. GRANT, M. - The effect of blood drawing techniques and equipment on the hemolysis of ED laboratory blood samples. J. Emerg. Nurs., 29 (2): 116-121. 2003. SCHEFFER, J. F.; GONZLEZ, F. H. D. - Enzimologia clnica em medicina veterinria. Porto Alegre, UFRGS, 2003. Disponvel em: <http://www6.ufrgs.br/bioquimica>. Acesso em: 15 set. 2009. SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLNICA MEDICINA LABORATORIAL. Recomendaes da Sociedade Brasileira de Patologia Clnica Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso. 2. ed. So Paulo, 2009. 109 p.

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STANKOVIC, A. K. - The laboratory is a key partner in assuring patient safety. Clin. Lab. Med., 24: 10231035, 2004. TRINDER, P. - Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. Ann. Clin. Biochem., 6: 24-27, 1969.

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