UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS QUMICA- BACHARELADO

RICADO PATRICK DONIZETE SILVA

Exerccios sobre tcnicas caracterizao/purificao de protenas

Alfenas/MG 2012

Bioqumica para Qumica Bacharelado Exerccios sobre tcnicas de caracterizao/purificao de protenas

1- Quais os princpios da tcnica de eletroforese de protenas.

A eletroforese se baseia principalmente na separao de protenas baseada nas suas cargas lquidas, j que protenas possuem cargas lquidas diferentes em um mesmo ph. Os diferentes tipos de eletroforese empregam na sua maioria um suporte slido (como papel ou gel) que evita a mistura de protenas por conveco. Na eletroforese em papel a amostra aplicada em uma tira de papel, saturada com uma soluo tampo. As extremidades do papel so emersas em reservatrios distintos contendo soluo tampo. O sistema submetido a uma diferena de potencial e as protenas migram em direo ao plo de carga oposta com velocidade proporcional carga. J a eletroforese em gel a mais utilizada para separao de protenas. Os gis utilizados por esta tcnica podem ser preparados com porosidade varivel, o que proporciona reparao das molculas segundo seu tamanho, alm da sua carga. Protenas menores migram mais depressa que as maiores formando bandas que so visualizadas por colorao especfica. A eletroforese em gel permite a separao de protenas alm de fornecer informaes adicionais como o nmero de protenas, a massa molar e quantas subunidades a protena possui.

2- A protena X tem ponto isoeltrico igual a 4,3. Usando a tcnica de focalizao isoeltrica, ela foi separada de diversas outras protenas que eram contamintes da preparao. Qual foi o pH usado para essa tcnica? Justifique bioquimicamente o pH usado e a purificao.
Nesta tcnica, a separao das protenas ocorre em funo de seus respectivos pontos isoeltricos numa fita de poliacrilamida com gradao contnua e conhecida de pH, submetida a voltagem crescente, ou seja, as protenas migram sob ao de um campo eltrico em um gel contendo um gradiente de pH e a migrao se interrompe ao atingirem seu ponto isoeltrico. Portanto, o pH usado para essa tcnica foi de 4,3, o ponto isoeltrico da protena X, pois nesse momento que a carga lquida da protena ser zero.

3- Mostre como possvel determinar a massa molar de uma protena usando: a) eletroforese desnaturante; b) cromatografia por permeao em gel. a) A eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecilssulfato de sdio (SDS)
um mtodo muito utilizado para a anlise de massas moleculares de protenas oligomricas. O gel uma matriz constituda de um polmero de acrilamida com ligaes cruzadas de N, N-metil-bis-acrilamida, cuja porosidade da malha pode ser escolhida. Quanto maior a concentrao de acrilamida, menores sero os poros da malha formada. Antes de iniciar a eletroforese, as variveis forma e carga nativa das protenas devem ser eliminadas para que a separao dependa apenas de sua massa molecular. Para isso, as protenas so misturadas com SDS, um detergente anfiptico cuja funo desnatur-las,

ou seja, convert-las numa estrutura linear a forma nativa geralmente globular e conferir-lhes densidade de carga uniforme. O SDS tem alta carga negativa e uma cauda hidrofbica que interage com as cadeias polipeptdicas numa proporo aproximada de 1,4 g de SDS para cada grama de protena, tornando-as negativamente carregadas. Na ausncia do SDS, as protenas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido ao diferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais. Alm da adio do SDS, as protenas podem ser opcionalmente fervidas na presena de um agente redutor, como ditiotreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol, que desfazem as pontes dissulfetos, ajudando a eliminar a estrutura tridimensional dos polipeptdeos. Aps esse tratamento, as protenas so aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente eltrica, fazendo com que elas migrem atravs da malha de acrilamida em direo ao plo positivo. Dependendo do seu tamanho, cada protena se mover diferentemente: as protenas menores migraro mais rapidamente, enquanto que as maiores tero mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se movero mais lentamente. Quando se representa a mobilidade eletrofortica frente ao logaritmo dos pesos moleculares conhecidos de diversas cadeias polipeptdicas (protenas marcadoras), obtm-se uma reta que pode ser utilizada como padro para o clculo do peso molecular das subunidades da protena de interesse. Tambm pode ser feito o gel de poliacrilamida sem o uso do dodecilssulfato de sdio (SDS). Com isso, a protena em questo no sofre a desnaturao, fazendo assim que ocorra a separao entre as protenas durante a corrida por sua carga residual final, sua conformao tridimensional e seu peso molecular. b) Na cromatografia por permeao em gel uma mistura de duas protenas, elas so aplicadas sobre um gel formado por esferas porosas. As molculas da protena menor podem penetrar nos poros das esferas, as maiores percorrem a coluna com velocidade maior sendo coletadas em primeiro lugar. Aps a separao para a determinao da massa molar usa-se o espectrmetro de massa obtendo o pico on molecular que a massa molar do composto analisado.

4- Qual o princpio da purificao de protenas por dilise? Que tipo de contaminantes, em geral, podem ser removidos dessa forma?
A dilise um processo utilizado para separar protenas de substncias de baixo peso molecular. A dilise no uma tcnica cromatogrfica, mas um tipo de filtrao molecular. A mistura de protena e molculas pequenas colocada dentro de um saco de material semipermevel, como o celofane (acetato de celulose). Quando o saco de dilise imerso em tampo, as molculas proteicas ficam retidas, enquanto as molculas pequenas ou ons atravessam a membrana de dilise.

5- Qual o efeito da eluio de uma soluo aquosa com alta fora inica em uma coluna de troca inica qual esteja adsorvida uma protena? Justifique.
Molculas com carga de mesmo sinal que a resina so eluidas primeiramente, seguidas por molculas com carga oposta, em uma ordem definida pela magnitude da carga apresentada pela protena nas condies da cromatografia. Geralmente escolhem-se

valores de ph e de concentrao salina que determinem a ligao da protena de interesse resina escolhida, seguem-se alteraes dessas condies que levem a eluio de protena.