ELECTROFORESIS DE DNA

Nilver Jhon Zenteno Guillermo1 y Jorge Luis Podesta Hernandez 2 (1)Lab. de Biloga Molecular , EAP de Ciencias Bilgicas, UNMSM. Matricula N0 09100059 (2)Lab. de Biloga Molecular , EAP de Ciencias Bilgicas, UNMSM. Matricula N0 01112040

RESUMEN Se presentan los resultaros del anlisis realizado sobre muestras de DNA del guisante (Pisum sativum) y de Argopecten purpuratus. Se tomaron 19 muestras (entre ambas enpecies) de DNA en estado de conservacin desconocido y se someti a electroforesis en gel de agarosa. Luego de la corrida se observo que las muestras 3,5 y 6 estaban es su estado nativo, la muestra 7 en estado temprano de degradacon y, todas las demas muestras en estado de degradacin alta y con contaminadas por RNA y ptoteinas. Palabras clave: electroforesis,gel, agarosa,DNA,Pisum

La concentracin e integridad del ADN extrado, as como el tamao de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separacin de molculas (protenas, isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidn). La matriz funciona como un filtro, separando las molculas en un campo elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta que poseen. En el caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (nodo) durante la

electroforesis (Posso y Ghneim 2008). La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a travs de la concentracin de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamao migran ms rpidamente hacia el nodo que aquellos de mayor tamao. Al aumentar la concentracin de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolucin en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta

proporcionalmente la velocidad de migracin de los fragmentos en el gel (Posso y Ghneim op cit.). Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tincin con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentracin mediante un anlisis comparativo con patrones de concentracin conocida. Los colorantes fluorescentes actan mediante insercin entre las pares de bases que conforman el cido nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualizacin de ADN y ARN. Sin embargo, ste es un reactivo altamente txico, con propiedades mutagnicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados especficamente para reducir los riesgos potenciales de mutagnesis. La tcnica para la cuantificacin de ADN consiste simplemente en la utilizacin de una secuencia de concentraciones de solucin patrn de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentracin desconocida. El clculo de las concentraciones se hace bajo la

luz ultravioleta segn la fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta, incluso con mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografa digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imgenes (Posso y Ghneim op cit.).

MATERIALES Y MTODOS Las muestras de DNA fueron obtenidas en prctica de extraccin de DNA realizadas anteriormente. Los materiales y reactivos usados fueron los siguientes: Agarosa Buffer 1XTBE Matraz de 200ml Microondas Bandeja de corrida Peines
Bandeja de pocillos Cmara electrofortica

Pipeta automtica Fuente de poder Marcador molecular de tamao

LambdaDNA/HindIII marker Loading Dye Bromuro de etidio

Plus

Transiluminador de luz UV Se procedi a la preparacin del gel de agarosa: 1. Prepare la bandeja sellando los bordes por presin o con cinta adhesiva (esto depende del modelo de cmara utilizado) y pngale los peines. 2. Pese la agarosa para preparar 30ml de 1%(peso/volumen) 3. Coloque la agarosa dentro del matraz de 200mL que contenga 30 mL de buffer TBE 1X (pH 8) y caliente en el microondas o en el bao de Mara hasta su completa disolucin. 4. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solucin. 5. Sirva la solucin en la bandeja de corrida vertiendo la solucin lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el rea de corrida de las muestras con una punta limpia. 6. Deje polimerizar la agarosa 7. Para la corrida, llene el tanque de la cmara de electroforesis con buffer TBE 1X (pH 8) hasta cubrir el gel.

8. En la bandeja de pocillos, colocar 2ul de Loading Dye +8ul de DNA total, mezclar bien con la pipeta automtica y colocarlo en uno de los pocillos del gel (repetir esto para las dems muestras), en uno de los pocillos del gel colocar el Marcador de tamao molecular LambdaDNA/HindIII Plus marker. 9. Conecte los electrodos de la cmara a la fuente de poder, grade el voltaje a 100V y corra las muestras por 30 minutos. 10. Apagar la fuente de poder, retirar el gel y sumergirlo cuidadosamente en una solucin de Bromuro de etidio. 11. Colocar el gel en transiluminador para observacin de las bandas. el la

RESULTADOS Y DISCUSIN Las lecturas de absorvancia de DNA ya los grados de pureza se muestra en la tabla 1. El valor ms bajo de la relacin A260/A280 fue de 18.53% y se dio en las muestras 9, 10, 11 y 12; el valor ms alto fue de 36% y las tuvieron las muestras 3, 5 y 6. De la tabla y de los valores mostrados en ella, se evidencia que las muestras 3, 5y 6 estn en su estado nativo, ya que su grado de pureza sobrepasa de 30% y estas son la misma muestra repetida; la muestra 7 con grado de pureza 29.2% nos indica que esta casi nativa pues

se acerca al 30%; el resto de las muestras cuyos valores son mucho menores a 30% estn degradados y tambin presentan contaminacin proteica. En el grfico 1 se muestra el avance de las muestras de DNA. En ella se observa que las bandas de las muestras 3, 5, 6 y 7 estn ms enmarcadas y ms cerca a los pocillos; esto indica que tienen un alto grado de pureza y que estn en su estado nativo. En cambio las bandas de las muestras 8, 9, 10, 11 y 12

tienen una distancia mayor de migracin, ello evidencia que estn en estado de degradacin; ahora bien por la coloracin intensa que presentan estas bandas indicara que presentan contaminacin posiblemente con RNA y protenas (debido a la mala purificacin sometida). En lo que se refiere a las dems muestras no mencionadas, se observa casi nula las bandas, ello indica que extrajeron poca muestra con la pipeta o que la muestra se perdi (se sali) al momento de ponerlo en los pocillos en el gel.

GRFICA 1: Absorvancia y Grado de pureza de muestras de DNA

TEGID O Animal Animal Vegeta l Animal Vegeta l Vegeta l Animal Vegeta l Animal Animal Animal Animal Vegeta l Vegeta l Vegeta l

MUEST RA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 17 18 19

A260 0.33 6 0.33 6 0,22 9 0,33 6 0,22 9 0.22 9 0,32 5 0,23 9 0,36 7 0,36 7 0,36 7 0,36 7 0,25 7 0,25 7 0,25 7

A280 0.14 2 0.14 2 0,10 6 0,14 2 0,10 6 0.10 6 0,16 5 0,13 7 0,16 5 0,16 5 0,16 5 0,16 5 0,12 6 0,12 6 0,12 6

A260/A28
0

% 25% 25% 36% 25% 36% 36% 29,2% 26,3% 18,53 % 18,53 % 18,53 % 18,53 % 26,85 % 26,85 % 26,85 %

2,366 2,366 2,16 2,366 2,16 2.16 1,9697 1,74 2,224 2,224 2,224 2,224 2,040 2,040 2,040

GRFICA 1: Migracin de DNA por electroforesis en gel de agarosa

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 1. Las muestras evidenciaron sus grados de pureza y estados de conservacin (nativo o degradado), la mayora estaban degradadas.
2. La

tcnica de electroforesis de DNA en gel de agarosa es muy prctica y sencilla, nos provee de una gran certeza para el anlisis de bandas visibles a luz UV, en cuanto a la precisin mayor, existe la filtracin en gel de poliacrilamida, pero esta es muy toxica y requiere de un adecuado grado de seguridad. de etidio, se recomienda evitar el contacto con la piel (use guantes), ya que este compuesto es un agente carcingeno y posiblemente tambin cancergeno.

4. En la observacin de bandas, tener cuidado de no observar directamente la luz UV, sino utilizando proteccin adecuada( lentes de proteccin UV)

REFERENCIAS . Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera. 2008. Uso de Marcadores Microsatlites para la Estimacin de Diversidad Gentica en Plantas. Ediciones IVIC. . Bio-Rad: Protocolo que acompaa al Quantum Prep Miniprep Kit.Nelson DL, Cox MM (2001): Principios de Bioqumica, 3 ed. Editorial Omega (Barcelona, Espaa), pp 1119-1128. . Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp 152-154.

3. Al trabajar con el Bromuro