MAESTRA INSTITUCIONAL EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y MANEJO DE RECURSOS NATURALES TROPICALES

PROTOCOLO DE INVESTIGACIN
Frecuencia y niveles de infeccin de Nosema ceranae y Nosema apis en colonias manejadas de abejas africanizadas (Apis mellifera) en Yucatn, Mxico

ALUMNO: ANGEL ROBERTO BRICEO UC

ASESOR: DR. LUS MEDINA MEDINA

MRIDA YUCATN, ABRIL DE 2012

I

MAESTRA INSTITUCIONAL EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y MANEJO DE RECURSOS NATURALES TROPICALES

H. COMIT TUTORAL

DRA, VIRGINIA MELNDEZ RAMREZ

M. EN C. JOS CHAVIER DE ARAUJO FREITAS

II

NDICE
1. INTRODUCCIN 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo general 2.2. Objetivos particulares 3. REVISIN DE LITERATURA 3.1. Situacin de la apicultura y la abeja africanizada 3.2. El proceso de africanizacin 3.3. Nosemosis en las abejas melferas 3.3.1. Generalidades de Nosema sp. 3.3.2. Ciclo biolgico de Nosema sp. 3.3.3. Mecanismos de transmisin de Nosema sp. 3.3.4. Daos provocados por de Nosema sp. 3.3.5. Surgimiento de Nosema ceranae 3.3.6. Virulencia de N. ceranae y su relacin con el desorden del colapso de las colonias 3.3.6. Diagnstico de Nosema ceranae y Nosema apis 3.3.7. Situacin de la nosemosis en Mxico 4. HIPTESIS 5. MATERIALES Y MTODOS 5.1. Ubicacin del rea de estudio 5.2. Obtencin de las muestras 5.3. Identificacin de esporas de Nosema sp. 5.4. Deteccin molecular de N. apis y N. ceranae con PCR 1 3 3 3 4 4 5 6 6 7 9 9 10 12 13 15 16 17 17 18 18 19 III

5.4.1. Preparacin de la muestra para la PCR 5.4.2. Anlisis de PCR Mltiple 5.5. Anlisis estadstico 6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 7. PRESUPUESTO 8. REFERENCIAS

19 19 20 21 22 23

IV

1. INTRODUCCIN
A nivel mundial, la apicultura se encuentra amenazada por mltiples enfermedades y parasitosis que pueden ocasionar daos considerables a esta actividad cuando los niveles de infeccin o infestacin son elevados (Higes et al., 2007), ya que pueden provocar una reduccin en la poblacin de abejas, baja produccin de miel e incluso pueden ocasionar la mortalidad de la colonia (Williams et al., 2008). Las principales parasitosis que afectan a las abejas melferas (Apis mellifera) son la varroosis, causada por el caro ectoparsito Varroa destructor (Rosenkrans et al., 2010), y la nosemosis, causada por microsporidios del gnero Nosema (Higes et al., 2006); ambas parasitosis ocasionan importantes prdidas econmicas en las principales regiones apcolas. La nosemosis, afecta las clulas epiteliales del intestino medio de las abejas adultas (obreras, znganos y reinas) (Fries, 2010), ocasionando un lento desarrollo poblacional de la colonia y una disminucin en la poblacin de abejas adultas, y en la produccin de miel (Bourgeois et al., 2010). Nosema apis causa la enfermedad en Apis mellifera, mientras que N. ceranae, tiene como hospedero a la abeja asitica, A. cerana (Higes et al., 2007). Estudios recientes han demostrado que N. ceranae puede infectar a A. mellifera, ya que han aparecido abejas infectadas en diversas regiones de importancia apcola a nivel mundial, tales como Europa (Higes et al., 2006), Asia (Huang et al., 2007), Norteamrica (Chen et al., 2008; Williams et al., 2008; Guzmn et al., 2011) y Sudamrica (Invernizzi et al., 2009). La emergencia de N. ceranae en estas regiones se ha relacionado con prdidas considerables de colonias de A. mellifera y un aumento en la prevalencia de nosemosis (Chen y Huang, 2010), reportndose como ms virulenta que N. apis (Higes et al., 2006; Paxton et al., 2007). A diferencia de los efectos negativos que esta parasitosis causa en colonias de abejas de A. mellifera establecidas en pases con clima templado, en las 1

regiones con climas tropicales o subtropicales como Mxico, la nosemosis ha sido considerada de poca importancia (Wilson y Nunamarker, 1983). Sin embargo, la prevalencia y niveles de infeccin (nmero de esporas/abeja) de Nosema sp., han incrementado en algunas regiones tropicales, desde el diagnstico de la especie N. ceranae en las abejas A. mellifera (Martnez-Puc et al., 2011). Estudios realizados en Yucatn, previo al diagnstico de N. ceranae en A. mellifera, sealaban una baja prevalencia y niveles de infeccin de nosemosis (Quezada-Eun y May-Itz, 1996). Sin embargo, en aos recientes se ha registrado un incremento en la prevalencia (81.8% de colonias positivas) de esta parasitosis (Martnez-Puc et al., 2011). Aun cuando no existe un reporte oficial de la presencia de N. ceranae en poblaciones de abejas africanizadas en Yucatn, se sugiere que esta nueva especie de Nosema podra estar involucrada en el aumento de los niveles de infeccin y la frecuencia de la parasitosis en Yucatn, por lo que es importante determinar su presencia (Martnez-Puc et al., 2011). La identificacin de las especies N. apis y N. ceranae mediante microscopia resulta poco efectiva debido a la enorme semejanza entre las esporas de ambas especies (Bourgeois et al., 2010). En la actualidad se han desarrollado mltiples ensayos de biologa molecular utilizando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), los cuales resultan muy efectivos para la determinacin de ambas especies (Higes et al., 2007; Invernizzi et al., 2009; Bourgeois et al., 2010). Debido al notable incremento en la frecuencia y en los niveles de infeccin observados en Yucatn, en este estudio se pretende determinar, mediante PCR, la presencia de las especies N. ceranae y N. apis y conocer la prevalencia, y los niveles de infeccin de nosemosis en colonias manejadas de abejas africanizadas (Apis mellifera), bajo condiciones tropicales en Yucatn, Mxico.

2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general Determinar la presencia de las especies N. ceranae y N. apis, as como evaluar la frecuencia y niveles de infeccin de nosemosis en colonias manejadas de abejas africanizadas, en condiciones tropicales en Yucatn, Mxico.

2.2.

Objetivos particulares Determinar, a travs de PCR, la presencia de N. apis y N. ceranae en colonias manejadas de abejas africanizadas (Apis mellifera), en condiciones tropicales en Yucatn, Mxico.

Cuantificar los niveles de infeccin de Nosema sp., en colonias manejadas de abejas africanizadas (Apis mellifera), en condiciones tropicales en Yucatn, Mxico.

Determinar el nmero de colonias positivas a infecciones simples (N. ceranae y N. apis) y mixtas (N.ceranae + N. apis), en colonias manejadas de abejas africanizadas (Apis mellifera), en condiciones tropicales en Yucatn, Mxico.

3. REVISIN DE LITERATURA
3.1. Situacin de la apicultura y la abeja africanizada La apicultura a nivel mundial ha cobrado gran auge, no slo por el valor econmico que se genera en la produccin y el comercio de la miel, y otros derivados (Genersch, 2010), sino tambin, por los beneficios que ofrecen las abejas melferas al incrementar la productividad agrcola, por medio de la polinizacin de distintos cultivos (Gallai et al., 2008). Para Mxico la produccin apcola representa una gran derrama econmica, puesto que destaca como el sexto pas productor de miel (52.8 mil toneladas en 2009) y el tercer pas exportador de la misma (con una cifra de 30 mil toneladas y un ingreso a nuestro pas de 83.87 millones de dlares en 2008) (Claridades agropecuarias, 2010). A pesar de su importancia, la apicultura mexicana se ha visto afectada por una variedad de circunstancias, una de las ms representativas es la aparicin de las abejas africanizadas, puesto que ha ocasionando una serie de cambios en el manejo de las colonias (Guzmn-Novoa et al., 2011). El trmino abeja africanizada es usado para referirse a las descendientes de las abejas africanas (A. m. scutellata) que fueron introducidas a Brasil y que se aparearon con subespecies europeas con las que se trabajaba en las regiones tropicales de Sudamrica (Guzmn-Novoa et al., 2011). Las abejas africanas fueron introducidas a Brasil en 1956 como parte de un programa de mejoramiento gentico, para obtener una abeja mejor adaptada a las condiciones tropicales e incrementar la produccin de miel, en comparacin con las razas europeas (A. m. mellifera, A. m. ligustica, A. m. caucasica y A. m. crnica), (Rindener et al., 1991). La liberacin accidental de algunas de estas colonias provoc que las descendientes de estas abejas colonizaran el continente americano, con un continuo entrecruzamiento con abejas europeas locales (Quezada-Eun, 2008). El avance de la abeja africanizada en Amrica del sur se vio limitado en regiones con bajas temperaturas y por las barreras geogrficas. Sin embargo, 4

debido a su gran habilidad reproductiva, su comportamiento defensivo y migratorio, se adaptaron y distribuyeron ampliamente en ms de 20 pases americanos, incluido Mxico (Guzmn-Novoa et al., 2011). En Mxico, la abeja africanizada se report por primera vez en 1986, en la frontera sur del estado de Chiapas. Al principio y por varios aos estuvieron dispersndose en el sureste del pas. En 1987 ya haban sido localizadas en los en la Pennsula de Yucatn, Oaxaca, Tabasco y el sur de Veracruz. Para 1989, llegaron a Guerrero, Michoacn y Tamaulipas, y en el altiplano (Quezada-Eun, 2007). En Yucatn los primeros enjambres africanizados se detectaron en 1987 en su parte sur, para 1990 ya se encontraba distribuida en toda la entidad (Paxton et al., 1991). Un estudio realizado durante 1992 demostr que el porcentaje de enjambres silvestres africanizados en el estado era de 80%, para 1993 el porcentaje de enjambres silvestres africanizados alcanz un 97% (May-Itz, 1995). 3.2. El proceso de africanizacin en Yucatn Durante su dispersin por las Amricas, las abejas africanizadas han retenido un genotipo predominantemente africano, debido a que al mayor flujo de genes africanos hacia las poblaciones de abejas europeas, que en sentido inverso (Quezada-Eun, 2007). Tanto las colonias silvestres, como las manejadas, manifiestan caractersticas de las abejas africanas pocos aos despus de la llegada de los enjambres africanizados a una regin, este proceso se conoce como africanizacin (Guzmn-Novoa et al., 2011). La africanizacin de las colonias de abejas no ha obedecido a un solo factor, sino a la interaccin de varios de ellos (Quezada-Eun, 2007). La permanencia de las caractersticas africanas en las poblaciones silvestres se produce por el remplazo del genotipo materno de origen europeo. Los factores biolgicos y de comportamiento, tales como el parasitismo de las colonias europeas, comportamiento altamente defensivo, alta tasa reproductiva y migratoria, y la superioridad numrica de znganos, son los principales causantes 5

de un flujo de genes asimtrico que ha ocasionado que las abejas africanizadas sean invasoras sumamente exitosas (Guzmn-Novoa y Page). La presencia de estas caractersticas en las abejas melferas ha representado un reto para la apicultura mexicana. Entre los principales efectos indeseables de las abejas africanizadas se encuentra su comportamiento altamente defensivo y su tendencia a abandonar las colmenas (evasin) (GuzmnNovoa et al., 2011). Algunos autores relacionan el manejo de estas abejas con una reduccin en la produccin de miel, aunque los resultados no han sido concluyentes (Guzmn-Novoa y Page, 1994). Lo que es seguro, es que el manejo de esta raza de abejas ha requerido una mayor inversin econmica por concepto de equipo de proteccin y reubicacin de los apiarios (Uribe et al., 2003). Esta situacin ha propiciado que algunas regiones del pas se intente mantener la lnea europea materna a travs del remplazamiento de reinas con genotipos europeos o seleccionados (Guzmn-Novoa et al., 2011). Sin embargo, en Yucatn se ha observado un marcado avance en el manejo de colonias de abejas africanizadas por los apicultores, destacando actualmente como uno de los principales estados productores de miel, en Mxico (Claridades agropecuaria, 2010). Diferentes estudios atribuyen a las abejas melferas africanizadas una menor vulnerabilidad a algunas enfermedades infecciosas, parsitos y

depredadores, en relacin con las razas europeas (Page y Guzmn-Novoa, 1997). No obstante, al igual que en otras regiones del mundo, la presencia de graves enfermedades y parasitosis en las abejas melferas impactan la apicultura en Yucatn. En el estado, las principales enfermedades que daan a las abejas melferas son la varoosis, causada por el caro Varroa destructor y la nosemosis, provocada por hongos del gnero Nosema (Martnez-Puc, 2011). 3.3. Nosemosis en las abejas melferas 3.3.1. Generalidades de Nosema sp.

La nosemosis en abejas es una parasitosis causada por microsporidios del gnero Nosema, que afecta el tracto digestivo de las abejas adultas (reinas, 6

znganos y obreras). La Clase Microsporidia est constituida por ms de 1,500 especies anteriormente consideradas dentro del grupo de los protozoarios (Fries, 1997). Estudios recientes han determinado su cercana relacin con el reino Fungi (Lee et al., 2008; Corradi and Keeling, 2009), constituyndolos como un grupo muy peculiar de hongos intracelulares, los cuales infectan a los invertebrados, incluyendo a los insectos (Higes et al., 2007). En las abejas melferas se han reportado dos especies de Nosema con importancia sanitaria: N. apis, la cual infecta a la abeja europea Apis mellfera y N. ceranae, cuyo hospedero natural es la abeja oriental A. cerana (Higes et al., 2006; 2007). sta parasitosis presenta una distribucin mundial, y fue considerada como la principal parasitosis de las abejas melferas, antes de la aparicin de la varoosis (Fries et al., 2010). Los efectos de la nosemosis se consideran poco importantes en regiones que cuentan con climas tropicales o subtropicales, a diferencia de los pases con climas templados donde causa importantes prdidas econmicas (Higes et al., 2007). Nosema apis fue descubierta en 1909 por el alemn Enoch Zander, el cual la describi como la principal causante de la nosemosis (Fries, 2010). Posteriormente, en 1994 un nuevo microsporidio fue identificado parasitando a la abeja melfera asitica A. cerana, el cual fue denominado como Nosema ceranae. Hasta ese momento se crea que N. ceranae solamente parasitaba a la abeja asitica, sin embargo, estudios posteriores confirmaron que tambin poda infectar a Apis mellfera (Higes et al., 2006; 2007; Paxton et al., 2007). 3.3.2. Ciclo biolgico de Nosema sp.

Los microsporidios son hongos altamente evolucionados, los cuales viven como patgenos intercelulares obligados y cuya nica forma de vida libre es a travs de esporas metablicamente inactivas. La propagacin de los

microsporidios sucede nicamente en el interior de las clulas infectadas del hospedero y no se ha reportado la existencia de reproduccin extracelular (Lee et al., 2008; Corradi and Keeling, 2009). 7

Las abejas melferas se infectan con Nosema sp., a travs de la ingestin de esporas contenidas en la miel, polen, o el agua, las cuales germinan en el ventrculo de las abejas por efecto de los cidos estomacales. El mtodo de ingreso a las clulas es a travs de la eyeccin del filamento polar, una estructura nica de los microsporidios, capaz de penetrar las clulas epiteliales del ventrculo e inyectar el contenido celular de la espora (esporoplasma) al interior de la clula (Fries, 1997). El ciclo de vida intracelular tiene dos fases, la proliferativa (o merogonia) y la esporognica (esporogonia) (Gider et al., 2010). En el momento en el que el contenido de la espora se encuentra dentro de la clula, inicia el proceso de maduracin del esporoplasma, en donde el citoplasma de la clula husped y el par de ncleos del esporoplasma se fusionan, y pasa al estadio de meronte o clula madre. El meronte se convierte en merozotos por fisin binaria, este proceso es conocido como ciclo merognico y da lugar a la formacin de esporas o esporogonia, donde los merozotos se diferencian en esporontes, y cada uno produce dos esporoblastos, los cuales madurarn y se convertirn en esporas infectivas. Posterior al periodo de maduracin, las clulas epiteliales del ventrculo sufrirn ruptura, causando la liberacin de las esporas hacia el interior de este rgano, donde se lleva a cabo la reproduccin y germinacin de nuevas esporas, pudiendo reinfectar a otras clulas epiteliales o ser expulsadas al exterior por medio de las excretas de la abeja (Fries, 1997). Bajo condiciones ptimas de temperatura, la espora concluye su ciclo biolgico de 48 a 70 horas posteriores a la infeccin (Fries, 1997; Gider et al., 2010). La temperatura es un factor importante para la multiplicacin y germinacin de las esporas (Malone et al., 2001), pudindose encontrar en una actividad limitada de las esporas por debajo de los 20C y por arriba de los 35C, presentando una temperatura ptima para su desarrollo y multiplicacin entre los 30 y 35C (Fries, 1997).

3.3.3.

Mecanismos de transmisin de Nosema sp.

La dispersin de las esporas dentro de la colonia de abejas depende del nivel de infeccin que afecta a las abejas. Con respecto a esta parasitosis, se ha encontrado que el patgeno es transmitido de una forma horizontal, dependiendo de la capacidad de la espora para propagarse a nuevos individuos (Fries y Camazine, 2001; Webster et al., 2004). La transmisin horizontal ocurre cuando individuos dentro de una poblacin transmiten el parsito a otros individuos de la misma generacin (Wilde et al., 2005), y esta puede ocurrir dentro de la misma colonia o entre distintas colonias (intercolonia) (Fries y Camazine, 2001). El mecanismo de infeccin de Nosema sp., incluye la presencia de tipos distintos de esporas, las cuales juegan un papel importante en la transmisin horizontal. Durante la multiplicacin de las esporas en el interior de una abeja infectada, se produce la formacin de dos tipos de esporas con caractersticas infectivas distintas. Un tipo de espora con cubierta delgada procede a infectar a otras clulas epiteliales sanas, aumentando los niveles de infeccin del hospedero, mientras que otro tipo de espora con paredes gruesas, es liberada al exterior para infectar a nuevos individuos, gracias a su capacidad de permanecer en latencia por periodos prolongados (Fries,1997). Las esporas se pueden transmitir entre individuos de manera directa o indirecta, la primera se presenta a travs del intercambio de alimento entre abejas obreras, reinas y znganos, la segunda se presenta cuando una abeja sana entra en contacto con material o alimento contaminado con esporas como los residuos fecales depositados en los panales como resultado de la introduccin del material biolgico (reinas u obreras) infectado, o a travs de la ingestin de agua en fuentes contaminadas (Fries, 1997; Fries et al., 2003; Webster et al., 2004; Huang et al., 2007). 3.3.4. Daos provocados por Nosema sp.

Las abejas con seales de enfermedad demuestran sntomas como alas temblorosas, incapacidad para volar, parlisis, movimientos convulsivos y prdida de los pelos del trax, y en muchos casos se suele asociar la infeccin con la 9

disentera y por lo general las obreras parasitadas presentan el abdomen inflamado, aunque puede deberse a otras causas (Higes et al., 2007). En muchas ocasiones cuando la colonia est muy infestada, se suelen observar manchones de excretas y abejas muertas a la entrada del panal (Chen y Huang, 2010). La infeccin por nosemosis representa para las abejas una gran prdida energtica, que a largo plazo es incompatible con la vida. En las abejas obreras se observa la reduccin en el desarrollo de las glndulas hipofarngeas, y menor acumulacin de grasas en su cuerpo. De igual manera durante la infeccin, el aprovechamiento del polen como alimento es menor y la protena almacenada en el cuerpo se consume con mayor rapidez, reduciendo la longevidad de la abeja, lo que reduce el tiempo de vida activo y la produccin de la miel y el polen en la colonia (Higes et al., 2007; Chen y Huang, 2010; Fries, 2010). Tambin se ha estudiado el detrimento que esta parasitosis representa para las abejas reinas. Cuando la abeja reina resulta infectada por Nosema sp., ocurre una degeneracin progresiva de los ovarios, lo que resulta en una disminucin de la postura de huevos y una disminucin en la produccin de sustancia inhibidora del desarrollo de los ovarios en obreras (Webster et al., 2004; Chen y Huang, 2010). La presencia de la reina infectada es motivo para que la colonia se encuentre infestada durante un largo periodo de tiempo, y para ello es recomendable realizar intercambio de reinas cada ao y as evitar una mayor contaminacin a otros individuos de la colonia. 3.3.5. Surgimiento de Nosema ceranae

Por dcadas la nosemosis en las abejas melferas fue nicamente atribuida a la especie Nosema apis, conocida por afectar a la abeja europea Apis mellifera (Zander, 1909). En 1996 se realiz el descubrimiento de una nueva especie de Nosema en la abeja asitica A. cerana, por lo que fue llamada N. ceranae (Fries et al., 1996). Una dcada despus, Huang et al., (2005) confirmaron la infeccin natural de N. ceranae en colonias de A. mellifera, en Taiwan. El anlisis de muestras provenientes de distintos continentes donde la apicultura es practicada, demostr una amplia distribucin de N. ceranae, poco 10

tiempo despus de su aparicin en Taiwan, fue reportada en Europa (Higes et al., 2006; Paxton et al., 2007), Estados Unidos (Chen et al., 2007), Canad (Williams et al., 2008) China (Liu et al., 2008), Vietnam (Klee et al., 2007), Sudamrica (Invernizzi et al., 2009) y recientemente en Mxico (Guzmn-Novoa et al., 2011). Este descubrimiento impuls la realizacin de mltiples estudios sobre este nuevo parsito. Gracias al monitoreo continuo de las colmenas y al estudio de colectas antiguas, investigadores de algunos pases pudieron estimar el momento de arribo de este parsito y su dispersin. Trabajos realizados en Asia, Norteamrica y Europa (Klee et al., 2007; Paxton et al., 2007), muestran una mayor proporcin de infecciones causadas por N. ceranae, en regiones ms clidas, mientras que las infecciones por N. apis son ms comunes en regiones templadas. Sin embargo, la mayora de estos estudios se concentran en regiones templadas y se tienen muy pocos estudios de lo que sucede en regiones con climas tropicales. Dentro las regiones templadas, se han muestreado colmenas infectadas en Estados Unidos, Canad (Chen et al., 2007; Williams et al., 2008) y Europa (Higes et al., 2006; Klee et al., 2007, Paxton et al., 2007), tales estudios sugieren un aumento progresivo en la frecuencia de infeccin por N. ceranae; el anlisis de muestras tomadas de colonias de abejas con nosemosis, de ms de una dcada de antigedad, arroj solo la presencia de N. apis, en contraste con muestras recientes en donde se observan infecciones mixtas por N. apis y N. ceranae, e infecciones puras con N. ceranae. Datos obtenidos en colmenas de Alemania no sugieren que se est produciendo este fenmeno. El estudio molecular de 319 colmenas, en Suecia, indic la presencia de infecciones puras, solo con N. apis (83%), e infecciones mixtas con ambas especies (17%) (Fries, 2010). Nosema ceranae tambin se ha extendido ampliamente en regiones tropicales de Asia y Amrica. Esta especie fue detectada por primera vez en Sudamrica en 2006, en 3 colmenas de la ciudad de Sao Paolo, Brasil, lo cual qued confirmado en estudios posteriores (Klee et al., 2007). Un estudio

molecular ms detallado fue llevado a cabo en Argentina, en donde se analizaron 20 muestras de colmenas con nosemosis, provenientes de 6 regiones 11

geogrficamente distantes, arroj un 100% de colmenas con infecciones simples por N. ceranae (Plischuk et al., 2008). Posteriormente, un estudio en Uruguay realizado en 2009, inform de la presencia de N. ceranae en las Amricas desde 1990, el dato ms antiguo hasta el momento (Invernizzi et al., 2009). Usando diagnosis por PCR-RFLP de 29 muestras de abejas infectadas con nosemosis, se encontraron infecciones simples por N. ceranae en todas las muestras. El primer esfuerzo para detectar N. ceranae en Mxico, fue llevado a cabo en 34 colonias de abejas africanizadas muestreadas en 2004, provenientes de 4 estados (Novoa-Guzmn, 2011). Los resultados mostraron la presencia de N. ceranae en 94% de las colonias muestreadas. Este es el dato ms antiguo de la presencia de N. ceranae en colonias de abejas africanizadas, previamente reportado por Caldern et al. (2008) en colectas de 2006 y por Klee et al., (2007) en abejas colectadas en Brasil, en el ao 2006. 3.3.6. Virulencia de N. ceranae y su relacin con el sndrome del colapso de las colonias Se considera que la afectacin por nosemosis es de poca importancia en pases con clima tropical o subtropical, como Mxico (Wilson y Nunarmaker, 1983). Sin embargo, otros estudios han demostrado que la infeccin por Nosema ceranae suelen dominar regiones ms clidas, mientras que las regiones ms fras suelen mostrar una mayor presencia de N. apis (Martn-Hernndez et al., 2007; Williams et al., 2008; Fries y Forsgren, 2009). Los estudios realizados para evaluar la gravedad de esta nueva parasitosis, detectaron una alta prevalencia en periodos de primavera y otoo en Taiwn (Huang et al., 2007). De igual manera en Espaa, se observ una alta prevalencia de la parasitosis en primavera y los meses ms fros (Higes et al., 2007). En 2007, ya se registraba a esta especie ampliamente distribuida en Estados Unidos (Chen et al., 2008) y Canad (Williams et al., 2008). Desde la emergencia de N. ceranae, se le ha atribuido una mayor virulencia y un amplio tropismo de tejidos (Chen y Huang, 2010), ya que la infeccin no se restringe solamente al intestino medio, como en N. apis, sino que tambin se 12

extiende a los tbulos de malpigio, glndulas hipofarngeas, glndulas salivales y cuerpos grasos. Esta caracterstica causa en el hospedero un mayor estrs energtico, y mayor mortalidad en las colonias de abejas (Chen et al., 2008). En la actualidad, se sugiere que esta parasitosis puede ser uno de los causantes de las grandes prdidas de las colonias de abejas melferas del continente Europeo y en los Estados Unidos, fenmeno conocido como el sndrome del colapso de las colonias (Fries et al., 2003, Higes et al., 2005; 2006; 2007; Fries, 2010). Este sndrome se caracteriza por la disminucin progresiva del nmero de las abejas adultas, sin causa aparente, hasta la prdida y desaparicin de la colonia (Higes et al., 2005). No es posible atribuir la causa de este fenmeno a un solo factor, por lo que en la actualidad se ha relacionado con el efecto del estrs nutricional, el efecto de qumicos y plaguicidas, contaminacin ambiental y por la interaccin entre enfermedades y parsitos como Varroa destructor, Nosema ceranae y el Virus de la Parlisis Aguda (IAPV) (Higes et al., 2005; 2006; 2007; Fries, 2010). 3.3.6. Diagnstico de Nosema apis y Nosema ceranae

En las abejas melferas an no se han definido sntomas externos que demuestren una clara infeccin con N. apis o N. ceranae, y solo a travs de la diseccin del abdomen, es posible observar una inflamacin del ventrculo, caracterstica de la infeccin (Fries, 1997). Esto ha impulsado el desarrollo de diversas pruebas de laboratorio capaces de identificar la presencia de estas especies. Por medio del anlisis con el microscopio de luz es posible separar a ambas especies, diferenciando entre el tamao de las esporas, puesto que estas son ligeramente ms pequeas en N. ceranae, que en N. apis (Fries et al., 2006). No obstante, este mtodo es poco confiable debido a la gran similitud de la estructura externa y el tamao de las esporas de ambas especies. A travs del microscopio electrnico de barrido, se pueden identificar las especies basndose en el nmero de espirales que forman el filamento polar dentro de las esporas, siendo mayor el 13

nmero de espirales en N. apis que en N. ceranae (Fries et al., 2006; Chen et al., 2009). En la actualidad se han desarrollado diversos mtodos de anlisis molecular, basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), para un rpido y confiable diagnstico de la presencia de N. apis y N. ceranae. Los mtodos cualitativos ms simples permiten solamente detectar la presencia o la ausencia de fragmentos de ADN objetivo. Uno de los primeros mtodos reportados fue el de Higes et al (2006), utilizando PCR-RFLP y la secuencia del gen SSUrRNA, con este mtodo logr amplificar el ADN de N. ceranae en 20 muestras de Espaa y demostr la presencia de N. ceranae en A. mellifera. Posteriormente Klee et al., (2007) lograra desarrollar un mtodo rpido para diferenciar entre N. ceranae y N. apis de muestras europeas, basado en PCR-RFLP de una secuencia parcial del mismo gen. Chen et al., (2008) demostr por primera vez la presencia de N. ceranae en Estados Unidos, por medio de PCR simple y primers especie-especficos. Algunos mtodos han logrado cuantificar los niveles de infeccin de las especies de Nosema, a travs de PCR tiempo real (RT-PCR). Burgeois et al., (2010), demostr que es posible estimar el nmero de esporas de N. ceranae y N. apis por abeja, permitiendo evaluar con alta sensibilidad el nivel de infeccin de las colmenas. Sin embargo, esta tcnica no es viable para la mayora de los estudios, debido a los costos y la dificultad de la tcnica. Las PCR mltiples utiliza varios pares de primers objetivos de diferentes loci en una reaccin de PCR simple. Esto permite la amplificacin simultnea del ADN de ambas especies de Nosema. Martn-Hernndez et al., (2007) realiz los primeros ensayos de PCR mltiple, utilizando dos pares de primers amplificados de la secuencia 16S del ARN ribosomal. Este mtodo fue til para la deteccin de las dos especies de microsporidios para muestras europeas, demostrando una alta sensibilidad en muestras de esporas purificadas, homogeneizadas y reinfecciones entre ambas especies. 14

Para la deteccin de las especies de Nosema es recomendable la utilizacin de PCR mltiples, puesto que las infecciones mixtas son comunes en varias regiones (Paxton et al., 2007). Sin embargo, los niveles de deteccin de este mtodo pueden ser menores comparados con otros ensayos, debido a un mayor riesgo de acumulacin de productos no especficos (Gyarmati, 2008). 3.3.7. Situacin de la nosemosis en Mxico

Los casos de nosemosis, causada por N. apis, N. ceranae o ambas especies, presentan una amplia distribucin mundial, incluso algunas veces las infecciones se relacionan con la presencia de otros parsitos, como Varroa destructor (Martnez-Puc et al., 2011). En Mxico, la nosemosis se report por primera vez en 1965, los primeros estudios realizados durante 1989 registraron una prevalencia del 3.8%, por lo que fue relegada como una parasitosis de poca importancia para la apicultura mexicana (Wilson y Nunamarker, 1983). Los trabajos pioneros acerca de la nosemosis en Yucatn, revelaron una prevalencia de 44% (Guzmn-Novoa, 1981). Para 1990 se report una menor prevalencia de 7.2% en apiarios comerciales, lo cual se atribuy al ingreso de la abeja africanizada en el estado (Garca-Milln y Quezada-Eun, 1993). Un trabajo reciente de Martnez-Puc, 2008, demostr un incremento en las colmenas positivas a esta parasitosis en Yucatn, alcanzando una prevalencia de 81.8%. Tales resultados pueden ser atribuidos a diversos factores, como un manejo inadecuado por parte de los apicultores, la poca del muestreo (juniodiciembre), puesto que se relaciona una mayor precipitacin pluvial con la intensidad de infeccin, y a la asociacin con el parsito Varroa destructor, No obstante, existe la sospecha de la presencia de Nosema ceranae en Yucatn (Martnez, 2008), la cual tambin podra estar relacionada con este incremento de casos positivos. Recientemente, Guzmn-Novoa et al., 2011) report la presencia de Nosema ceranae en colonias de abejas africanizadas de los estados de Hidalgo, Estado de Mxico y Distrito Federal. Esto hallazgo nos sugiere que N. ceranae ya se encuentra infectando los apiarios yucatecos, aunque se necesitan ensayos moleculares para la identificacin definitiva de este parasito. 15

4. HIPTESIS
4.1. Hiptesis general La mayor prevalencia y niveles de infeccin de Nosema sp., estar relacionada con infecciones simples de Nosema ceranae, en colonias manejadas de abejas africanizadas (Apis mellifera), en condiciones tropicales en Yucatn, Mxico.

16

5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. Ubicacin del rea de estudio El estudio ser realizado en el Departamento de Apicultura del Campus de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias (CCBA), de la Universidad Autnoma de Yucatn (UADY), ubicada en el km 15.5 de la carretera Mrida-Xmatkuil. Las muestras provienen de colectas previas en 12 localidades del estado de Yucatn (Martnez Puc, 2008) (Ver Figura 1).

Figura 1. Distribucin de los sitios de muestreo de las colonias manejadas.

17

5.2.

Obtencin de las muestras El material biolgico proviene de un estudio previo de Martnez-Puc (2008).

Entre los meses de junio a diciembre de 2006, se colectaron un total de 165 muestras de abejas adultas, provenientes de colonias manejadas distribuidas en 12 localidades del estado de Yucatn. Cada muestra consisti de 200 abejas adultas con ms de 8 das de edad (Organizacin Mundial de Sanidad Animal OIE, 2008), colectadas de la parte superior del alza o de la entrada de la colmena, ya que en abejas ms jvenes an no se detectan las esporas de Nosema sp., lo que nos conducira a falsos negativos. Cada muestra fue depositada en un frasco con 70 ml de etanol al 85% para su conservacin. 5.3. Identificacin de esporas de Nosema sp. La presencia de esporas de Nosema sp., y los niveles de infeccin en las abejas, sern determinados por medio del anlisis del contenido intestinal, de acuerdo a la tcnica de Cantwell (1970), modificado por Fries et al., (1984). Esta tcnica consiste en macerar con un mortero el ventrculo de 60 abejas adultas por cada muestra, se le aaden 60 ml de agua destilada al macerado y 8 gotas de nigrosina (0.5 g/ml) para teir las esporas. Se toma una gota del macerado y se coloca en un portaobjeto, para observar en el microscopio ptico a 400 aumentos. Las muestras que resultaran positivas a esporas de Nosema sp. sern contabilizadas con ayuda de la cmara de Neubauer y se determinar el nivel de infeccin.
Nmero de esporas Niveles de infeccin = Nmero de abejas X 100

La prevalencia o frecuencia de infeccin se obtiene de la relacin entre las muestras positivas a la presencia de esporas de Nosema sp., divididas entre el nmero total de muestras en el estudio. 18

5.4.

Deteccin molecular de N. apis y N. ceranae con PCR Mltiple 5.4.1. Preparacin y extraccin de ADN

Para el rompimiento de la espora de Nosema sp., se aadir 1 ml de la muestra del experimento anterior a un tubo de Eppendorf, se centrifugar por 3 minutos a 16,100 x g, y se decantar el sobrenadante. Posteriormente se

congelar la pastilla (pellet) con nitrgeno lquido y se triturar con la punta de una pipeta estril sellada (sellar la pipeta manteniendo la punta en contacto con la flama de un mechero de Bunsen, dndole forma en un tubo de 1.5ml) hasta que est pulverizada. Este paso ayudar a destruir las paredes de la espora de Nosema (Klee et al., 2007). La extraccin del ADN se realizar por medio del kit comercial, High Pure PCR Template Preparation Kit (No. 1796828 Roche Diagnostic) (Organizacin Mundial de Sanidad Animal OIE, 2008). 5.4.2. Amplificacin con PCR Mltiple

Se utilizar un anlisis de PCR Mltple para detectar ambos microsporidios (N. apis y N. ceranae) gracias al uso de cebadores especie-especficos de

acuerdo a la publicacin de la Organizacin Mundial de Sanidad Animal OIE (2008) (Ver Tabla 1).

Tabla 1. Cebadores seleccionados para la deteccin de N. ceranae y N. apis por PCR mltiple Tamao del producto Especificidad PCR (pb) 218-219 N. ceranae

Cebador 218MITOC FOR 218MITOC REV 321APIS FOR

Secuencia
5-CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA-3 5-CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG-3 5GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGT

321

N. apis 19

A-3

321APIS REV

GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAAC TATG-3

Tomada de Organizacin Mundial de Sanidad Animal OIE ( 2008).

Las reacciones de la PCR se realizan en volmenes de 50-l que contienen 5 l de ADN molde, 25 l de High Fidelity PCR Master Mixture (Roche Diagnostic), 0,4 M de cada cebador, 0,4 mM de cada desoxinucletido trifosfato, 3 mM de Cl2 Mg, 0,2 mg/ml de albmina de suero bovino, 0,1% de Triton X-100 y 5 l de ADN molde de N. apis o N. ceranae. Los parmetros para la amplificacin son: un paso inicial de activacin de la PCR de 2 minutos a 94C seguido de 10 ciclos de 15 segundos a 94C, 30 segundos a 61,8 y 45 segundos a 72C, y 20 ciclos de 15 segundos a 94C, 30 segundos a 61,8C y 50 segundos a 72C ms un ciclo de alargamiento de 5 segundos para cada ciclo sucesivo y un paso de extensin final a 72 C durante 7 minutos. Los controles negativos (de la extraccin del ADN) se incluyen en todos los experimentos de la PCR. Los pesos moleculares de los productos de la PCR se determinan por electroforesis en gel de agar TAE (Tris-acetato/cido etilendiamino tetraactico) al 2% en tampn TAE estndar, teido con bromuro de etidio y visualizado por iluminacin UV. 5.5. Anlisis estadsticos Se realizar un anlisis de varianza de una cola (Statgraphics), para determinar si existen diferencias significativas entre la prevalencia y los niveles de infeccin de las colonias positivas a nosemosis: 1. Colmenas positivas a Nosema ceranae 2. Colmenas positivas a Nosema apis 3. Colmenas con infecciones mixtas (Nosema ceranae y N. apis)

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6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
2011 Actividades Primer semestre 2012 Segundo semestre Tercer semestre 2013 Cuarto semestre

AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL

Revisin de literatura Avances de protocolo de investigacin Revisiones de avances de protocolo de investigacin Salidas de campo de adiestramiento Estandarizacin de la tcnica de PCR Cuantificacin de esporas de Nosema sp. Deteccin molecular de Nosema apis y N. ceranae Anlisis estadsticos Entrega de protocolo de investigacin Realizacin escrito de tesis Redaccin del artculo cientfico Presentacin de examen de grado

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7. PRESUPUESTO
Tabla 2. Presupuesto global estimado del proyecto de tesis. RUBROS Personal Equipo proteccin de COSTO
$ 2,000.00 $ 1,400.00 $350.00 $100.00 $100.00 $200.00 $250.00 $200.00 $200.00

DESCRIPCIN
Apoyo tcnico en campo Equipo de proteccin: Overol Velo Guantes Botas de hule Ahumador Alzaprima Cepillo de pelo de camello Frascos de eppendorf Mallas filtradoras Reactivos Nitrgeno lquido Papelera y consumibles Muestreos

FINANCIAMIENTO
Beca CONACYT Beca CONACYT

Materiales reactivos

$500.00 $200.00 $1,500.00 $1000.00 $2,500.00

Departamento Apicultura y CONACYT

de Beca

Salidas campo Acervo bibliogrfico

de

2,000.00$

Departamento Apicultura y CONACYT Beca CONACYT

de beca

2,000.00$

Libros: publicaciones destacadas Publicaciones: tarifa por publicacin en revista cientfica

Publicaciones y patentes Total

$1,000.00

Departamento Apicultura y CONACYT

de Beca

14,100.00 MXN

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8. REFERENCIAS
1. Bourgeois A., T. Rinderer, L. Beaman y R. Danka. 2010. Genetic detection and quantification of Nosema apis and N. ceranae in the honey bee. Journal of Invertebrade Pathology, 103: 5358 2. Cantwell G. 1970. Standard methods for counting Nosema spores. American Bees Journal, 110(6), 222-223 3. Chen Y. y P. Huang. 2010. Nosema ceranae, a newly identified pathogen of Aphis mellifera in the USA and Asia. Apidologie, 41: 364-374 4. Chen Y., Evans J., Smith B. y Pettis J. 2008. Nosema ceranae is a long-present and wide-spread microsporidian infection of the European Honey bee (Apis mellifera) in the United States. Journal of Invertebrate Pathology. 97(2): 186188. 5. Claridades agropecuarias. 2010. Situacin actual y perspectiva de la apicultura en Mxico. ASERCA, SAGARPA. Mxico, 199: 3-34 pp. 6. Corradi, N. y P. Keeling. 2009. Microsporidia: a journey through radical taxonomical revisions. Fungal Biology Reviews, 23: 18. 7. Fries I. 1997. Protozoa. En: Morse R. y Flottum K. (Ed). Honey Bee Pests, Predator and Diseases. Third edition. Harvard University Press. Pp 59-72 8. Fries I. 2010. Nosema ceranae in European honey bees (Apis mellifera). Journal of Invertebrate Pathology, 103:S73S79 9. Fries I y S. Camazine . 2001. Implications of horizontal and vertical pathogen transmission for honey bee epidemiology. Apidologie, 32: 199214 10. Fries I., G. Ekbohm y E. Villumstand. 1984. Nosema apis, sampling techniques and honey yield. Journal of Apicultural Research, 23(2): 102-105 11. Fries I., F. Feng, A. Da Silva, S. Slemnda y J. Pieniazek. 1996. Nosema ceranae sp. (Microspora: Nosematidae), morphological and molecular

characterization of a microsporidian parasite of the Asian honey bee Apis ceranae (Hymenoptera: Apidae). European Journal of Protistology, 32: 356-365 12. Fries I. y E. Forsgren. 2009. Nosema ceranae fungerar inte som Nosema apis. Nosema ceranae does not function as Nosema apis. Bitidningen, 107, 2021 23

13. Fries I., R. Martn, A. Meana, P. Garca-Palencia y Higes M. 2006. Natural infections of Nosema ceranae in European honey bees. Journal of Apicultural Research, 45: 230233. 14. Fries I., S. Slemenda, A. Silva, N. Pieniazek. 2003. African honeybees (Apis mellifera scutellata) and nosema (Nosema apis) infections. Journal of apicultural Research, 42: 13-15 15. Gallai N., J. Salles, J. Settele y B. Vassiere. 2008. Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecological Economics, 68: 810-821. 16. Garca E. 1981. Modificaciones al sistema de clasificacin climtica de Cpen para adaptarlo a las condiciones de la Repblica Mexicana. Instituto de Geografa, UNAM. 17. Garca-Milln M. y J. Quezada-Eun. 1993. Distribucin de la Nosemosis en apiarios comerciales del estado de Yucatn. Apicultura Moderna, 5: 2-22 18. Genersch E. 2010. Honey bee pathology: current threats to honey bees and beekeeping. Applied Microbiology and Biotechnology, 87(1): 87-97 19. Gisder S, N. Mockel, A. Linde y E. Genersch. 2010. A cell culture model for Nosema ceranae and Nosema apis allows new insights into the life cycle of these important honey bee-pathogenic microsporidia. Environmental

Microbiology, 13(2): 404-413 20. Guzmn-Novoa E. 1981. Contribucin al Estudio de la Nosemiasis de las Abejas. Tesis de Licenciatura. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autnoma de Mxico. Mexico, 46 pp. 21. Guzmn-Novoa E. y R. Page. 1994. The impact of africanized bees on Mexican beekeeping. American Bee Journal, 134: 101-106 22. Guzmn-Novoa E., A. Correa-Bentez, L. Espinosa-Montao y G. GuzmnNovoa. 2011. Colonizacin, impacto y control de las abejas melferas africanizadas en Mxico. Veterinaria Mexicana, 42(2): 149-178 23. Guzmn-Novoa E., M. Hamiduzzaman, M. Arechavaleta-Velasco, G. Koleoglu, P. Valizadeh y A. Correa-Bentez. 2011. Nosema ceranae has parasitized

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Africanized honey bees in Mexico since at least 2004. Journal of Apicultural Research, 50(2): 167-169 24. Gyarmati P. 2008. Implementation of molecular detection Diss. Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala. 25. Higes M., P. Garca-Palencia, R. Martn-Hernndez y Meana A. 2007. Experimental infection of Apis mellifera honeybees with Nosema ceranae (Microsporidia). Journal of Invertebrate Pathology, 94: 211-217 26. Higes M., R. Martn y A. Meana. 2006. Nosema ceranae, a new microsporidian parasite in honeybees in Europe. Journal of Invertebrate Pathology, 92 (2): 9395. 27. Higes, M., R. Martn, A. Sanz, N. lvarez, A. Sanz, P. Garca-Palencia y A. Meana. 2005. El sndrome de despoblamiento de las colmenas en Espaa. Vida Apcola, 133: 15-21. 28. Higes M., R. Martn-Hernndez, C. Botas, E. Bailn, A. Gonzlez-Porto, L. Barrios, M. del Nozal, J. Bernal, J. Jimnez, P. Palencia y A. Meana. 2008. How natural infection by Nosema ceranae causes honey bee colony collapse. Environmental Microbiology, 10: 26592669. 29. Huang W., J. Jiang y C. Wang. 2005. Nosema ceranae infection in Apis mellifera. 38th Annual Meeting of Society for Invertebrate Pathology, Anchorage, Alaska 30. Huang W., J. Jiang, Y. Chen, C. Wang. 2007. A Nosema ceranae isolate from the honeybee Apis mellifera. Apidologie, 38: 3037 31. Invernizzi C., C. Abud, I. Tomasco, J. Harriet, G. Ramallo, J. Camp, H. Katz, G. Gardiol y M. Yamand. 2009. Presence of Nosema ceranae in honeybees (Apis mellifera) in Uruguay. Journal of Invertebrate Pathology, 101: 150-153 32. Klee J., A. Besana, E. Genersch, S. Gisder, A. Nanetti, D. Tam, T. Chinh, F. Puerta, P. Kryger, D. Message, F. Hatjina, S. Korpela, I. Fries y R. Paxton. 2007. Widespread dispersal of the microsporidium Nosema ceranae, an emergent pathogen of the western honey bee, Apis mellifera. Journal of Invertebrate Pathology, 96: 110

25

33. Lee S., N. Corradi, E. Byrnes, S. Torres-Martinez, F. Dietrich, P. Keeling y J. Heitman. 2008. Microsporidia evolved from ancestral sexual fungi. Current Biology, 18: 16751679 34. Malone L., H. Gatehouse y E. Tregidga. 2001. Effects of Time, Temperature, and Honey on Nosema apis (Microsporidia: Nosematidae), a Parasite of the Honeybee, Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae). Journal of Invertebrate Pathology, 77: 258268 35. Martn-Hernndez R., A. Meana, L. Prieto, A. Martinez-Salvador, E. GarridoBailon y M. Higes. 2007. Outcome of colonization of Apis mellifera by Nosema ceranae. Applied and Environmental Microbiology, 73: 63316338 36. Martnez-Puc J. 2008. Situacin actual de las principales parasitosis en abejas africanizadas en el estado de Yucatn. Tesis de Maestra en Produccin Animal. UADY. Yucatn, Mxico, 75pp. 37. Martnez-Puc J. 2011. Frecuencia de Varroa destructor, Nosema apis, Acarapis woodi en colonias manejadas y enjambres silvestres de abejas (Apis mellifera) en Mrida, Yucatn, Mxico. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias, 2(1): 25-38 38. May-Itz W. 1995. Prevalencia de Nosema apis Z.y Acarapis woodi R. En colonias silvestres de abejas africanizadas y europeas (Apis mellifera L.) en el estado de Yucatn. Tesis de Licenciatura. Universidad Autnoma de Yucatn. Mxico. 59pp. 39. Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE). 2008. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008. Versin electrnica disponible en:

http://www.oie.int/es/normas-internacionales/manual-terrestre/acceso-en-linea/ 40. Page R. y E. Guzman-Novoa E. The Genetic Basis of Disease Resistance. En: Morse R., K. Flottum. Editors. 1997. Pp 469-492. Honey Bee Pests, Predators, and Diseases. Medina OH: AI Root Co. 41. Plischuk S., R. Martn-Hernndez, C. Lange y M. Higes. 2008. Deteccin de Nosema ceranae (Microsporidia) en Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) de la regin Pampeana. Crdoba, Argentina: VII Congreso Argentino de

Entomologa 26

42. Paxton J., M. Echazarreta y M. Garca. 1991. Africanized honey bees in Yucatan, Mexico: a detailed survey. American Bee Journal, 131(10): 646-648 43. Paxton R., J. Klee, S. Korpela y I. Fries. 2007. Nosema ceranae has infected Apis mellifera in Europe since at least 1998 and may be more virulent tan Nosema apis. Apidologie, 38: 558-565 44. Quezada-Eun J. 2007. A retrospective history of the expansion of Africanized honeybees in Mexico. Journal of Apicultural Research, 46: 295-300 45. Quezada-Eun J. y W. May-Itz. 1996. Caractersticas morfomtricas, poblacionales y parasitosis de colonias silvestres de Apis mellifera

(Hymenoptera: Apidae) en Yucatn, Mxico. Folia Entomolgica Mexicana, 97: 1-19 46. Rinderer T., J. Stelzer, B. Oldroyd, S. Buco y W. Rubink. 1991. Hybridization between European and Africanized honey bees in the neotropical Yucatan Pennsula. Science, 253: 30911 47. Rosenkranz P., P. Aumeier y B. Ziegelmann. 2010. Biology and control of Varroa destructor. Journal of Invertebrate. Pathology,103: S96S119 48. Uribe J., E. Guzmn-Novoa, G. Hunt, A. Correa Bentez, R. Zozaya. 2003. Efecto de la africanizacin sobre la produccin de miel, comportamiento defensivo y tamao de las abejas melferas (Apis mellifera L.) en el Altiplano mexicano. Veterinaria Mxicana, 34:47-59. 49. Webster T., K. Pomper, G. Hunt, E. Thacker y S. Jones. 2004. Nosema apis infection in worker and queen Apis mellifera. Apidologie, 35: 49-54 50. Wilde J., S. Fuchs, J. Bratkowski y M. Siuda. 2005. Distribution of Varroa destructor between swarms and colonies. Journal of Apical Research, 44(4):190-194 51. Williams G., A. Shafer, R. Rogers, D. Shutler y D. Stewart. 2008. First detection of Nosema ceranae, a microsporidian parasite of European honey bees (Apis mellifera), in Canad and central USA. Jornal of Invertebrate Pathology, 97: 189-192 52. Wilson W. y R. Nunamarker. 1983. The incidencia de Nosema apis Z. in honey bees in Mxico. Bee World, 64(3): 132-136 27

53. Zander E. (1909) Tierische Parasiten als Krankenheitserreger bei der Biene. Mnchener Bienenzeitung, 31: 196204.

28