CAPTULO 2.5.3.

ENCEFALOMIELITIS EQUINA (del Este o del Oeste)

RESUMEN
Los virus de la encefalomielitis equina del Este (EEE) o del Oeste (EEO) pertenecen al gnero Alphavirus de la Familia Togaviridae. Estos virus presentan un ciclo vital que afecta igual a pjaros que a mosquitos. La enfermedad aparece de forma espordica en los seres humanos y en los caballos desde la mitad del verano hasta finales del otoo. Los seres humanos y los caballos constituyen hospedadores tangenciales finales. En los caballos la enfermedad se caracteriza por la presencia de fiebre, anorexia y depresin fuerte. La infeccin por el virus de la encefalomielitis equina del Este (EEE) en los caballos es a menudo fatal, mientras que el virus de la encefallomielitis equina del Oeste (EEO) puede provocar una enfermedad subclnica o moderada con menos de un 30% de mortalidad. Se ha descrito que tanto la EEE como la EEO provocan enfermedad en las aves de corral, aves de caza y ratites. Los virus de la EEE y la EEO provocan enfermedades en los seres humanos; se han descrito infecciones graves y muertes en trabajadores de laboratorio. El trabajo con estos virus debera ser realizado solamente por personal inmunizado empleando cabinas de seguridad biolgica certificadas de acuerdo con los procedimientos de contencin de nivel 3 (ver el Captulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa). Identificacin del agente: Se puede realizar un diagnstico presuntivo de la EEE o la EEO cuando los caballos susceptibles presentan la somnolencia caracterstica y otros signos de la enfermedad neurolgica en las reas en las que son activos los insectos hematfagos. No se presentan lesiones generales caractersticas. Las lesiones histopatolgicas pueden proporcionar un diagnstico presuntivo. Normalmente, el virus de la EEE puede aislarse a partir del cerebro y, a veces, a partir de otros tejidos de los caballos muertos; sin embargo, el virus EEO raramente puede aislarse. Los virus de la EEE y la EEO pueden aislarse a partir de especmenes silvestres mediante inoculacin en ratones recin nacidos, huevos de pollo embrionados, cultivos celulares, o pollos recin nacidos. El virus se identifica mediante las pruebas de fijacin de complemento (FC), inmunofluorescencia o reduccin de la neutralizacin de placa (RNP). El ARNm vrico de la EEE o la EEO tambin puede detectarse mediante mtodos de transcripcin inversa y reaccin en cadena de la polimerasa. Pruebas serolgicas: Los anticuerpos pueden identificarse mediante RNP, inhibicin de la hemaglutinacin, pruebas de FC o enzimoinmunoensayo de captura de IgM. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas frente a la EEE o la EEO son seguras e inmunognicas. Se producen en cultivos celulares y se inactivan con formalina.

A. INTRODUCCIN
Los virus de la encefalomielitis equina del Este (EEE) o del Oeste (EEO) son miembros del gnero Alphavirus de la familia Togaviridae. Estos virus presentan un ciclo vital que flucta entre los pjaros y los mosquitos; desde mediados del verano hasta finales de otoo la enfermedad clnica puede presentarse en humanos y en caballos, los cuales son hospedadores finales para estos agentes. Normalmente, la EEE es una enfermedad fatal de los caballos y se ha diagnosticado en Quebec y Ontario en Canad, Texas y los estados al este de la Ribera del Mississippi en EEUU, las Islas del Caribe, Mxico, y Amrica Central y del Sur. La EEO puede ser subclnica, y la mortalidad en los caballos que padecen la enfermedad clnica es inferior al 30%. La enfermedad causada por el EEO se ha descrito en el oeste del EEUU y Canad, Mxico y Amrica Central y del Sur (8, 10, 16). El virus J de

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las tierras altas, relacionado antignicamente con el virus EEO, se ha aislado en el este de EEUU. Aunque generalmente se cree que no provoca enfermedad en los mamferos, ha sido aislado a partir del cerebro de un caballo que muri de encefalitis en Florida (4). An cuando la mortalidad es menor en el caso de la EEO, los signos clnicos de la EEE y la EEO pueden ser idnticos. Despus de un periodo de incubacin de 5 14 das, los sntomas clnicos son fiebre, anorexia y depresin. En los casos graves, la enfermedad en los caballos desemboca en la aparicin de hiperescitabilidad, ceguera, ataxia, depresin mental grave, postracin, convulsiones y muerte. Puede realizarse un diagnstico presuntivo de la infeccin por los virus de la EEE o la EEO en los caballos no vacunados si se observa la somnolencia tpica cuando el vector (mosquito) es abundante durante el verano en los climas templados, o durante la estacin hmeda en los climas tropicales o subtropicales. Sin embargo, varias enfermedades, como el virus del Oeste del Nilo, producen signos clnicos parecidos, y el diagnstico debe confirmarse mediante las pruebas que se describen a continuacin. A menudo la infeccin por el virus de la EEO abarca una amplia zona geogrfica, p. ej. casos espordicos en unas 1000 millas cuadradas. Normalmente, las infecciones por el virus EEE se presentan en zonas geogrficas limitadas. Se ha descrito que las infecciones por los virus de la EEE y la EEO han provocado una alta mortalidad en aves de caza criadas en cautividad, principalmente en faisanes, chukars y codornices. La mayora de las infecciones por encefalomielitis en las aves domsticas son provocadas por el virus de la EEE y tienen lugar en los estados de la costa este de los EEUU. El virus es introducido por los mosquitos, aunque la transmisin en las bandadas tiene lugar principalmente a travs de restos de plumas y mediante canibalismo. Tanto el virus de la EEE como el de la EEO han provocado una enfermedad letal en las ratites. Se ha descrito una enteritis hemorrgica en emus infectados con los virus de la EEE y la EEO, y los porcentajes de morbilidad y mortalidad pueden ser superiores al 85%. Recientemente se ha encontrado que los virus J de las Tierras Altas y el de la EEE producen en los pavos depresin, somnolencia, una disminucin en la produccin de huevos y un aumento de la mortalidad (3). Se ha descrito que el virus de la EEE provoca enfermedad en los cerdos (2). El virus de la EEE causa una enfermedad grave en los seres humanos con una tasa de mortalidad del 30 70% y una elevada frecuencia de aparicin de secuelas permanentes en los supervivientes. Normalmente la EEO es una infeccin leve en los humanos adultos, aunque puede ser una enfermedad grave en los nios. La tasa de mortalidad se encuentra entre el 3 y el 14%. Se han descrito infecciones graves y muertes en trabajadores de laboratorio; por lo tanto, cualquier manipulacin de estos virus debe realizarse con un nivel de contencin 3 (ver Captulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa). Se recomienda que se inmunice al personal frente a los virus EEE y EEO (14). Tambin deberan tomarse precauciones para prevenir la infeccin en los humanos cuando se realicen exmenes post mortem en caballos sospechosos de haber sido infectados por los virus de la encefalomielitis equina. Raramente se observan en los caballos lesiones patolgicas caractersticas, y, si se encuentran presentes, consisten nicamente en la congestin del cerebro y las meninges. Pueden manifestarse hemorragias equimticas de origen traumtico. Normalmente, se observan lesiones microscpicas a lo largo del sistema nervioso central, y pueden tener valor diagnstico. Existe una amplia evidencia de una respuesta inflamatoria grave que implica a la materia gris. Se observan degeneracin neuronal con infiltracin por leucocitos polimorfonucleares, gliosis difusa y focal e infiltracin perivascular con neutrfilos y linfocitos. Tambin se presentan neuronofagia y licuacin del neutrfilo. La extensin de las lesiones depende de la gravedad de la infeccin y la duracin de la afectacin neurolgica (16). Se han descrito procedimientos inmunohistoqumicos para el diagnstico de la EEE (9). Las lesiones del cerebro provocadas por el virus de la EEO son focales y presentan infiltraciones por linfocitos. Las lesiones cerebrales causadas por la infeccin con el virus de la EEE son ms graves y se manifiestan a lo largo de toda la materia gris. Se caracterizan por la presencia de un gran nmero de neutrfilos entre las clulas inflamatorias.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente

El mtodo definitivo para el diagnstico de la EEE o la EEO consiste en el aislamiento de los virus. Normalmente el virus EEE puede aislarse a partir de los cerebros de los caballos, a menos que hayan pasado ms de 5 das entre la aparicin de los signos clnicos y la muerte del animal. Frecuentemente el virus de la EEE puede aislarse a partir de tejido cerebral, incluso en presencia de un ttulo de anticuerpo srico elevado. El virus de la EEO raramente se asla a partir de los tejidos de los caballos infectados. El cerebro es el tejido elegido para el aislamiento del virus, aunque este ha sido aislado a partir de otros tejidos, como el hgado o el bazo. Se recomienda recoger un conjunto completo de estos tejidos por duplicado, uno para el aislamiento del virus y el otro en presencia de formalina para su examen histopatolgico. Los especmenes destinados al aislamiento del virus deberan enviarse refrigerados, si se pueden recoger en el laboratorio hasta 48 horas despus de la extraccin; en otro caso, deberan congelarse y enviarse con hielo seco. La recogida de un conjunto completo de tejidos permitir realizar tcnicas diagnsticas de otras enfermedades. Para llevar a cabo el aislamiento del virus, se prepara una suspensin del tejido al 10% en tampn salino fosfato (PBS), pH 7,8, que contiene seroalbmina

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bovina (BSA) (fraccin V; 0,75%), penicilina (100 unidades/ml), y estreptomicina (100 g/ml). La suspensin se clarifica mediante centrifugacin a 1.500 g durante 30 minutos. El ratn recin nacido es considerado un sistema hospedador sensible. Se inoculan intracranealmente uno o dos ratones de 1 4 das de edad con 0,02 ml de inculo, empleando una aguja del calibre 26 de 3/8 de pulgada (9.3 mm) unida a una jeringa de 1 ml. El lugar de la inoculacin es exactamente al lado de la lnea media de la porcin central de uno de los hemisferios laterales. Los ratones se observan durante 10 das; los ratones muertos se recogen diariamente y se congelan a 70C. Para realizar la identificacin del virus los cerebros de los ratones se concentran mediante aspiracin, empleando una aguja de una pulgada del calibre 10 (2,5 cm) unida a una jeringa de 1ml. Solamente se realiza un segundo pase si el virus no puede identificarse a partir de los ratones que mueren despus de la inoculacin. El embrin de pollo se considera menos sensible que los ratones recin nacidos cuando se emplea para el aislamiento primario de los virus EEE y EEO. Pueden inocularse suspensiones de tejido en la yema de huevos de pollo embrionados de 6 8 das. En los embriones infectados con estos virus no existen signos diagnsticos o lesiones. Los embriones inoculados deberan incubarse durante 7 das, aunque normalmente las muertes tienen lugar entre 2 y 4 das despus de la inoculacin. Generalmente slo se realiza un pase, a menos que se observen embriones muertos a partir de los cuales no se puede aislar el virus. Los pollos recin nacidos son susceptibles y se han empleado para el aislamiento del virus. Si se utiliza este mtodo, debe tenerse la precaucin de prevenir la exposicin del personal del laboratorio a los aerosoles, ya que las aves infectadas pueden eliminar virus muy infectivos. Los virus de la EEE y la EEO tambin pueden aislarse en varios sistemas de cultivos celulares. Los cultivos celulares empleados ms comnmente son los fibroblastos primarios de pollo o de embrin de pato; lneas celulares de rin de mono verde Africano (Vero), rin de conejo (RK 13), o rin de cra de hmster (BHK 21). Generalmente, el aislamiento se realiza en frascos de cultivo de 25 cm2. Las clulas confluentes se inoculan con 1,0 ml de suspensin de tejido. Despus de un periodo de adsorcin de 12 horas, se aade medio de mantenimiento. Los cultivos se incuban durante 7 das y se realiza un pase ciego. Los virus de la EEE y la EEO producirn un efecto citoptico en el cultivo celular. Los cultivos que aparenten encontrarse infectados se congelan. El fluido sobrenadante de los cultivos descongelados se emplea para realizar la identificacin del virus. Los virus de la EEE o la EEO pueden identificarse en los cerebros de ratones o pollos infectados, en sobrenadante de medio de cultivo celular, o en fluido amnitico o alantoideo cuando se utiliza la prueba de FC. Se prepara una suspensin al 10% en tampn veronal (barbitona); los fluidos obtenidos de los huevos o de los cultivos celulares se utilizan sin diluir o diluidos 1/10 en tampn veronal. El fluido o suspensin se centrifugan a 9.000 g durante 30 minutos, y el sobrenadante se ensaya frente a un suero hiperinmune o fluido asctico de ratn preparado frente a los virus de la EEE y la EEO empleando un protocolo normalizado de FC (13). Esta prueba requiere la incubacin de la mezcla suero antgeno con 7 unidades de complemento durante la noche a 4C. El virus puede identificarse en los cultivos celulares mediante inmunofluorescencia. El mtodo utilizado con menor frecuencia para la identificacin del virus consiste en la pruebas de neutralizacin, como se indica seguidamente. El cido nucleico del virus de la EEE presente en mosquitos y en los tejidos ha sido identificado mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores para el gen de la cpsida (15). El RNA se extrae empleando isotiocianato de guanidinio con fenol cido. Se realizan cuarenta repeticiones de un ciclo de amplificacin de tres fases con desnaturalizacin del cido nucleico, anillamiento del cebador y extensin del cebador. La temperatura y duracin de cada fase se optimizan en funcin de la pareja de cebadores, los reactivos y el termociclador empleado en las reacciones de PCR. Los productos de la reaccin o sus fragmentos se analizan en geles de agarosa del 2,0 2,6% que se tien con 1g/ml de bromuro de etidio. Un procedimiento alternativo de identificacin consiste en la hibridacin con una sonda de oligonucletido. Tambin se han descrito un mtodo de transcripcin inversa PCR para la deteccin del RNA del virus de la EEO, y mtodos alternativos para la deteccin del RNA del virus de la EEE (5, 7). Se ha desarrollado un enzimoinmunoensayo (ELISA) de captura antignica para el seguimiento del virus EEE en los mosquitos. Puede utilizarse en pases que no poseen instalaciones para el aislamiento del virus o la realizacin de la PCR (1).

2.

Pruebas serolgicas

La confirmacin serolgica de la infeccin por el virus de la EEE o la EEO implica un aumento o descenso de 4 o ms veces en el ttulo de anticuerpos, en muestras de pares de sueros recogidos con 10 14 das de separacin. Cuando se manifiesta la enfermedad clnica la mayora de los caballos infectados con los virus de la EEE o la EEO presentan un ttulo elevado de anticuerpos. Los caballos infectados con los virus de la EEE o la EEO normalmente presentan ttulos de anticuerpos durante la fase aguda de la enfermedad. En consecuencia, puede realizarse un diagnstico presuntivo si un caballo no vacunado con los signos clnicos adecuados presenta

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anticuerpos frente a los virus de la EEE y la EEO. La deteccin de IgM mediante ELISA puede tambin proporcionar un diagnstico presuntivo de la infeccin aguda (11). La prueba de reduccin de neutralizacin de placa (RNP) o, preferiblemente, una combinacin de las pruebas de inhibicin de la hemaglutinacin (IH) y RNP es el procedimiento utilizado ms frecuentemente para la deteccin de anticuerpos frente a los virus de la EEE y la EEO. En las pruebas de FC e IH existen reacciones cruzadas entre el anticuerpo frente a los virus de la EEE y la EEO. Los anticuerpos frente a los virus de la EEE y la EEO que se detectan mediante FC aparecen ms tarde y no son duraderos; en consecuencia, es menos til para el diagnstico serolgico de la enfermedad.

a)

Prueba de Fijacin del Complemento

La prueba de FC se utiliza frecuentemente para demostrar la presencia de anticuerpos, aunque los anticuerpos que se detectan mediante esta prueba pueden no persistir durante tanto tiempo como aquellos que se detectan con las pruebas IH o RNP. Como antgeno se utiliza habitualmente un extracto de cerebro de ratn obtenido en presencia de sacarosa/acetona. El antgeno positivo se inactiva mediante tratamiento con 0,1% de beta propiolactona. En ausencia de un suero internacional normalizado, el antgeno debera titularse frente a un suero positivo control preparado en la regin. El antgeno normal, o antgeno control, consiste en cerebro de ratn obtenido a partir de ratones no inoculados, y extrado y diluido de manera similar. Los sueros se diluyen 1/4 en tapn salino veronal que contiene un 1% de gelatina (VBSG), y se inactivan a 56C durante 30 minutos. Las titulaciones de los sueros positivos pueden llevarse a cabo empleando diluciones medias adicionales. Los antgenos para el FC y el antgeno control (cerebro de ratn sano) se diluyen en VBSG hasta conseguir la cantidad ptima para su fijacin, la cual se determina mediante titulacin frente a los sueros positivos; el complemento de cobaya se diluye en VBSG hasta contener 5 unidades hemolticas de complemento 50% (CH50). Los sueros, el antgeno y el complemento se mezclan durante 18 horas a 4C en placas de microtitulacin con fondo redondo. Los eritrocitos de oveja (SRBC) se estandarizan hasta obtener una concentracin del 2,8%. La hemolisina se titula para determinar la dilucin ptima frente al lote de complemento utilizado. La hemolisina se emplea para sensibilizar los SRBC al 2,8%, y estos se aaden a todos los pocillos de la placa de microtitulacin. La prueba se incuba durante 30 minutos a 37C. Las placas se centrifugan (200 g), y los pocillos se puntan en cuanto a la presencia de hemlisis. Se utilizan los siguientes controles: (a) suero y suero control con 5 CH50 y 2,5 CH50, respectivamente; (b) antgeno FC y antgeno control, cada uno con 5 CH50 y 2,5 CH50 de complemento, respectivamente; (c) diluciones de complemento de 5 CH50, 2,5 CH50, y 1,25 CH50; y (d) pocillos con clulas control, con slo SRBC, y VBGS como diluyente. Estos controles se ensayan para determinar la presencia de antgeno anticomplementario, suero anticomplementario, actividad del complemento utilizado en la prueba, e integridad del sistema indicador de SRBC en ausencia de complemento, respectivamente. Para evitar los efectos anticomplementarios, los sueros deberan separarse de la sangre lo antes posible. En la prueba deberan utilizarse sueros control positivos y negativos.

b)

Inhibicin de la hemaglutinacin
El antgeno que se emplea para realizar la prueba IH es el mismo que el descrito anteriormente para la prueba FC. El antgeno se diluye de manera que la cantidad empleada en cada unidad de hemaglutinacin (HAU) es de 4 a 8 veces la que aglutina el 50% de los RBC en el sistema de la prueba. El ttulo de hemaglutinacin y el pH ptimo para cada antgeno se determinan con RBC de oca diluidos en soluciones tamponadas a un pH que vara entre 5,8 y 6,6, con incrementos de 0,2 unidades. Los sueros se diluyen 1/10 en tampn salino borato, pH 9,0, y se inactivan a 56C durante 30 minutos. El tratamiento con kaolin se emplea para eliminar los inhibidores especficos del suero. Los sueros deberan adsorberse antes de su uso mediante incubacin durante 20 minutos a 4C con un volumen de 0,05 ml de RBCs de oca lavados y concentrados. Despus de realizar la inactivacin mediante calor, el tratamiento con kaolin y la absorcin, se preparan diluciones dobles del suero tratado en tampn borato, pH 9,0, con ovoalbmina al 0,4%. Se preparan diluciones dobles del suero (0,025 ml/pocillo) con tampn borato, pH 9,0, con ovoalbmina al 0,4% en una placa de microtitulacin de fondo redondo con 96 pocillos. Se aade el antgeno (0,025 ml/pocillo) al suero. las placas se incuban a 4C durante la noche. Los RBCs derivan de machos de ganso blanco1, y se lavan tres veces con dextrosa/gelatina/veronal (DGV), y se prepara una suspensin al 7% en DGV. La suspensin al 7% se diluye 1/24 en la solucin de pH adecuada, y se aaden inmediatamente a las placas a razn de 0,05 ml por pocillo. Las placas se incuban durante 30 minutos a 37C. En cada prueba se incorporan sueros

Son preferibles los RBC de los gansos blancos adultos domsticos, aunque se pueden utilizar otros gansos macho. Si se utilizan clulas de hembras, pueden presentar mayor variabilidad en la prueba. Se ha descrito que los RBC de gallo provocan un descenso en la sensibilidad de la prueba.

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control positivos y negativos. Una prueba slo se considera vlida si los sueros control dan los resultados esperados. Los ttulos de 1/10 y 1/20 son sospechosos, y los ttulos de 1/40 y superiores son positivos.

c)

Enzimoinmunoensayo
La tcnica ELISA se realiza recubriendo las placas de fondo plano con un anticuerpo IgM anti equino de captura (11). El anticuerpo se diluye siguiendo las recomendaciones del fabricante en tampn carbonato 0,5M, pH 9,6, y se aaden 50 l a cada pocillo. Las placas se incuban a 37C durante 1 hora y toda la noche a 4C. Antes de su uso, las placas recubiertas se lavan dos veces con 200 l/pocillo de PBS 0,01 M que contiene 0,05% de Tween 20. Despus del segundo lavado, se aaden 200 l/pocillo de PBS/Tween/5% de leche desnatada en polvo, y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Despus de la incubacin, las placas se lavan de nuevo tres veces con PBS/Tween. Los sueros control y problema se diluyen 1/100 y 1/1.000 con PBS 0,01 M, pH 7,2, que contiene Tween 20 al 0,05%, y se aaden 50 l en cada pocillo. Las placas se incuban a 37C durante 2 horas y despus se lavan tres veces. A continuacin, se aaden 50 l de antgeno viral a todos los pocillos. (La dilucin del antgeno depender de la fuente y debera determinarse empricamente). Las placas se incuban durante la noche a 4C y se lavan seis veces. Entonces se aaden 50 l de anticuerpo monoclonal (MAb) frente al virus de la encefalitis2 conjugado con peroxidasa de rbano picante. Las placas se incuban durante 60 minutos a 37C y entonces se lavan tres veces. Finalmente, se aaden 50 l de substrato ABTS (2,2 Azino bis [3 etilbenzo tiazolin 6 sulfnico]) recin preparado + perxido de hidrgeno, y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 15 40 minutos. La absorbancia del suero problema se mide a 405 nm. Una muestra problema se considera positiva si su absorbancia en los pocillos que contienen antgeno vrico es de al menos el doble que la absorbancia de la muestre ensayada en paralelo en los pocillos que contienen el antgeno control.

d)

Reduccin de la neutralizacin de placa.

La prueba RNP es muy especfica y puede utilizarse para distinguir entre las infecciones por los virus de la EEE y la EEO. La prueba RNP se realiza con fribrobastos de embrin de pato, o con cultivos celulares de clulas Vero o BHK 21. Los sueros se pueden analizar a una dilucin final de 1/10 y 1/100. Los puntos finales pueden establecerse empleando la prueba RNP o IH. El suero que se utiliza en la prueba RNP se prueba frente a100 unidades formadoras de placa virales. La mezcla virus/suero se incuba a 37C durante 75 minutos antes de la inoculacin sobre monocapas confluentes de cultivo celular en frascos de 25 cm2. El inculo se adsorbe durante 1 hora, seguido de la adicin de 6 ml de medio de cobertura. El medio de cobertura consiste en dos soluciones que se preparan separadamente. La solucin I contiene 2 x de Solucin Bsica de Sales de Eagle sin rojo fenol, 6,6% de lisado de extracto de lavadura con lactoalbmina, 4% de suero bovino fetal, 800 unidades/ml de penicilina, 400 g/ml de estreptomicina, 200 g/ml de nistatina, un 6% de una solucin al 7,5% de bicarbonato de sodio, y un 3,3% de una dilucin 1/5.000 de rojo neutro (1/8.000). La solucin II contiene un 2% de agar Noble esterilizado y mantenido a 47C. Se mezclan volmenes iguales de las soluciones I y II se ajustan a 47C justo antes de usarse. La prueba se incuba durante 48 72 horas, y los puntos finales se basan en una reduccin del 90% en el nmero de placas comparado con los frascos con el virus control, los cuales deberan producir unas 100 placas.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Las vacunas inactivadas frente a los virus de la EEE y la EEO se encuentran disponibles comercialmente. Las vacunas con virus atenuados de la EEE y la EEO no han resultado satisfactorias. Las vacunas autorizadas para su comercializacin en los EEUU se preparan empleando las siguientes combinaciones: EEE y EEO; EEE, EEO y encefalomielitis equina de Venezuela (EEV); y EEE y EEV. Adems, se han combinado toxoide del ttano y virus inactivado de la gripe con EEE y EEO, o EEE, EEO, y EEV. Las primeras vacunas se fabricaron a partir de virus multiplicados en huevos de pollo embrionados e inactivados con formalina. Las vacunas actuales se preparan a partir de virus multiplicados en cultivo celular, e inactivados con formalina (6) o monoetilamina.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Las cepas normalizadas de los virus de la EEE y la EEO que fueron aisladas hace unos 20 aos han sido utilizadas para la produccin de la vacuna y han resultado ser capaces de inducir una buena inmunidad. En diferentes regiones se han identificado cepas del virus de la EEE que son distintas antignicamente y en

Disponible en: Centers for Disease Control and Prevention, Biological Reference Reagents, 1600 Clifton Road NE, Mail Stop C21, Atlanta, Georgia 30333, Estados Unidos de Amrica.

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cuanto a su estructura molecular. Sin embargo, los aislamientos de Amrica del Norte y el Caribe parecen similares (17). Las cepas del virus de la EEO aisladas en diferentes pases han mostrado ser similares, en base a pruebas con MAb y anlisis de huella dactilar de RNA (10). Sera ventajoso utilizar un aislamiento bien caracterizado del pas donde la vacuna va a ser empleada. Los virus seleccionados deben ser inmunognicos y replicarse en cultivo celular con ttulos elevados.

b)

Mtodo de cultivo
Para realizar la multiplicacin de los virus empleados para la produccin de la vacuna se han utilizado fibroblastos primarios de embrin de pollo y clulas Vero. Los fibroblastos deberan prepararse a partir de embriones libres de patgenos. Tambin podran utilizarse otras lneas celulares susceptibles.

c)

Validacin como vacuna

Si se va a utilizar una lnea celular, el concentrado del inculo de referencia se ensaya para confirmar la identidad de la lnea celular, la especie de origen, y la ausencia de agentes extraos. Si se utilizan cultivos de clulas primarias, debera ensayarse una monocapa de cada lote de cada subcultivo para determinar la presencia de agentes extraos, como bacterias, hongos, micoplasmas, y virus. El inculo de referencia del virus debera ensayarse para asegurar la ausencia de bacterias, hongos, micoplasmas y virus extraos. Las vacunas se administran por va intramuscular (en la mayora de los casos) o intradrmica en la regin cervical, en dos dosis administradas con un intervalo de 24 semanas. Se recomienda la revacunacin anual. Todos los potros vacunados antes de 1 ao de edad deberan revacunarse antes de la siguiente estacin del vector.

2.

Mtodo de elaboracin

No se encuentran disponibles los detalles sobre la elaboracin de las vacunas que se encuentran actualmente en el mercado. En consecuencia, la informacin que se proporciona a continuacin est destinada a ser solamente un material de referencia sobre las vacunas y no un mtodo de elaboracin. Los virus y el cultivo celular deberan seleccionarse de manera que en menos 48 horas se obtenga un ttulo vrico elevado, > 106 DICT50 (50% de la dosis infectiva de cultivo celular) por ml. El virus que se utiliza para la elaboracin de la vacuna puede prepararse a partir del fluido sobrenadante de cultivos celulares infectados. El fluido se centrifuga cuando el 70 100% de las monocapas presentan los cambios citopticos caractersticos. El ttulo del virus se calcula mediante titulacin del cultivo celular o empleando ratones. El cultivo se clarifica mediante centrifugacin a baja velocidad y se filtra a travs de una gasa. El virus se inactiva aadiendo formalina hasta una concentracin final de .2.000 (0,05%) y mantenindolo a 37C durante 24 horas. El formaldehido restante se neutraliza con bisulfito sdico (6). El contenido libre residual de formalina en la vacuna inactivada no debera exceder un 0,2% de formaldehido.

3.

Control interno

Los cultivos deberan examinarse diariamente para poner de manifiesto el efecto citoptico vrico. Los virus concentrados deberan ensayarse para detectar contaminacin microbiana. La eficacia del proceso de inactivacin debera comprobarse mediante una prueba para detectar virus viables.

4.
a)

Control de lote
Esterilidad
Las pruebas para valorar la esterilidad y la ausencia de contaminacin de los reactivos biolgicos pueden encontrarse en el Captulo I.1.5.

b)

Inocuidad
La vacuna inactivada se ensaya para comprobar su inocuidad inoculando subcutneamente al menos diez pollos de 6 12 horas de vida con 0,5 ml de la vacuna. Los pollos se observan cada da durante 10 das para poner de manifiesto reacciones patolgicas que puedan ser atribuibles a la vacuna (12). La prueba de inocuidad tambin puede realizarse inoculando intracerebralmente al menos ocho ratones de 1 4 das de edad con 0,02 ml de la vacuna, y observndolos durante 7 das. Es crtico que las pruebas de seguridad se realicen con cada lote de la vacuna para asegurarse de que no existe ningn virus con virulencia residual.

c)

Potencia
La prueba de potencia se realiza inoculando a diez cobayas con virus de la EEE o la EEO empleando la mitad de la dosis del caballo, en dos ocasiones separadas 14 21 das, y utilizando la va recomendada para el caballo. Las muestras del suero de cada animal vacunado y cada control se ensayan mediante la

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prueba RNP 14 21 das despus de administrar la segunda dosis. Cuando se emplean clulas Vero, los ttulos de EEE y EEO deberan ser >1/40 (12). Si en la prueba RNP se utilizan fibroblastos de embrin de pato, los ttulos sern menores. Una prueba alternativa de potencia consiste en realizar una infeccin intracerebral 14 21 das despus de la segunda vacunacin. Cada cobaya se inocula con 0.1 ml de virus que contiene 100 LD50 (50% de la dosis letal). Se lleva a cabo la titulacin simultnea. Para que una vacuna sea aprobada, el 80% de los cobayas deben sobrevivir a ambos virus.

d)

Duracin de la inmunidad
Sobre la duracin de la inmunidad no hay estudios exhaustivos disponibles. Se recomienda una revacunacin anual. Los potros vacunados antes de un ao de edad deberan volver a ser vacunados de nuevo antes de la siguiente estacin del vector.

e)

Estabilidad
La vacuna liofilizada es estable e inmunognica durante 3 aos si se mantiene refrigerada a 2 7C. La vacuna debera desecharse despus de 3 aos. Las vacunas deberan utilizarse inmediatamente despus de la reconstitucin.

f)

Conservantes
Los conservantes que se utilizan son timerosal a una dilucin 1/10.000 y antibiticos (neomicina, polymixina, anfotericina B y gentamicina).

g)

Precauciones (riesgos)
Se han descrito la infeccin grave y la muerte debida a los virus EEE y EEO en los trabajadores de laboratorio; por lo tanto, cualquier trabajo con estos virus debe realizarse en un laboratorio de bioseguridad de al menos el nivel 2, empleando cabinas de seguridad biolgica, y el personal debera ser inmunizado frente a los virus EEE y EEO (14). Las yeguas preadas y los potros de menos de 2 semanas de edad no deberan vacunarse.

5.
a)

Pruebas con el producto final

Inocuidad
Ver Seccin C.4.b.

b)

Potencia
Ver Seccin C.4.c

REFERENCIAS
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Captulo 2.5.3. Encefalomielitis equina (del Este o del Oeste)

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* * *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la Encefalomielitis Equina (del Este o del Oeste) (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar el listado ms actualizado: www.oie.int).

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