UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE SALUD PUBLICA CATEDRA DE MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA

PRACTICA N 8
MICOLOGA: PROCEDIMIENTOS BSICOS DE LABORATORIO Objetivos: 1. Que los estudiantes conozcan las precauciones de seguridad de ESTRICTO CUMPLIMIENTO en un laboratorio de diagnstico micolgico. 2. Que los estudiantes adquieran los conocimientos necesarios en las tcnicas bsicas para la recoleccin, preparacin y examen microscpico directo de los especmenes. 3. Que los estudiantes adquieran los conocimientos necesarios en las tcnicas bsicas para el aislamiento primario, el examen macroscpico y microscpico de los medios de cultivo y la posterior identificacin de hongos, ya sean saprfitos oportunistas o patgenos clnicamente importantes. 4. Que los estudiantes visualicen e identifiquen los componentes estructurales de los hongos modelo que se estudiaran en la presente prctica.

Precauciones de seguridad de ESTRICTO CUMPLIMIENTO en un laboratorio de diagnstico micolgico 1. Ya que muchos hongos producen condias o esporas que se aerolizan fcilmente, las precauciones son esenciales con el fin de prevenir la contaminacin ambiental del laboratorio y la infeccin del personal que labora en el mismo. 2. Una apropiada cabina de bioseguridad puede ser usada cuando se procesa una muestra con hongos. El cultivo de levaduras puede manejarse en la misma forma que el cultivo bacteriano y se manipulan rutinariamente. 3. Debe tenerse cuidado de no salpicar material infeccioso por flameado descuidado de la aguja o asa de alambre. Muchos trabajadores prefieren usar incineradores para evitar este riesgo. 4. Los medios inclinados en tubo son ms seguros de manejar que las placas. Las placas de Petri jams deben utilizarse si se sospecha de Coccidioides o si los cultivos se va a enviar por correo. 5. Se debe realizar una preparacin hmeda de todos los hongos antes de la siembra por deslizamiento sobre un medio de cultivo; no coloque sobre un medio de cultivo un aislado que pueda ser Histoplasma, Blastomyces o Coccidioides. 6. Siempre que la muestra lo permita, decante sobrenadante dentro de recipientes con desinfectante. 7. Todos los materiales contaminados autoclavados antes de ser desechados. deben el ser

8. SIEMPRE debe lavarse cuidadosamente las manos con un jabn desinfectante despus de manejar cultivos con hongos. 9. Las reas de trabajo deben limpiarse con un desinfectante

por lo menos diariamente. 10. Debe llevarse puesta la bata de laboratorio en todo momento. 11. Nunca debe pipetear con la boca.

12. No se debe fumar, beber, comer, aplicarse cosmticos o colocarse lentes de contacto en el laboratorio. 13. NUNCA olfatee una medio de cultivo con hongos para determinar si tiene un olor caracterstico.

Recoleccin y preparacin de especmenes No importa cuan experimentado sea el laboratorista, el aislamiento e identificacin de los hongos presentes en una muestra clnica no se lograr a menos que la misma sea recolectada apropiadamente y enviada inmediatamente al laboratorio. El mdico veterinario debe notificar al laboratorista si sospecha de un hongo especfico, ya que pueden requerirse procedimientos culturales especiales e igualmente esta informacin es til para garantizar la seguridad del personal de laboratorio. Sangre Mdula sea Fluido Cerebro Espinal (FCE) Especmenes Cutneos Piel Uas Cuero cabelludo y Pelo

Exudados, pus, y drenajes Ojos Fluidos Esputo Heces Tejidos Orina Mtodos para el Exmen Microscpico Directo de los Especmenes Todos los especmenes sometidos a cultivo fngico deben ser examinados microscpicamente buscando elementos fngicos. Este examen se hace en adiccin, pero nunca en lugar de un cultivo fngico. As como le suministra informacin temprana al mdico veterinario para el tratamiento, puede ser til en la determinacin de la importancia del organismo que se pretende identificar con el cultivo posterior. Preparacin con Hidrxido de Potasio (KOH) Reactivos (Agente clarificador y colorante): Preparacin de la lmina: Preparacin de Tinta India Otras coloraciones: 1. Coloracin de Gram 2. Coloracin cida rpida modificada de Kinyoun 3. Coloracin de Wright (normalmente empleada en el laboratorio de hematologa) o coloracin de Giemsa

4. El cido periodico de Schift (habitualmente realizado en el laboratorio de histologa) y la coloracin de Gomori metamina de plata Aislamiento Primario Los especmenes que son cultivados para descartar o confirmar la presencia de hongos, deben ser inoculados en medios de cultivo que, en combinacin, garanticen el crecimiento de todos los hongos que pueden tener significado clnico. Pueden emplearse diferentes medios de cultivo, y la ltima opcin depende a menudo de factores como: Costo, disponibilidad, y la preferencia personal. Rutinariamente se usan medios de cultivo comerciales, de fcil adquisicin en el mercado, que cumplen los requisitos para el cultivo primario a partir de especmenes clnicos, entre ellos se pueden mencionar: SDA (Agar Desxtrosa Sabouraud), SDA con cicloheximida y cloranfenicol ( Agar micobitico o Agar Micosel), Agar Moho Inhibitorio y Agar BHI (Agar infusin cerebro corazn) La temperatura ptima para el crecimiento de la mayora de los hongos clnicamente importantes es de 30C. Si no se dispone de una incubadora que garantice los 30C, se deben incubar a temperatura ambiente (aproximadamente 25C). No ofrece ninguna ventaja adicional la incubacin simultanea de los medios rutinarios de aislamiento primario a 35-37C. Es aconsejable colocar un recipiente con agua en la incubadora para proporcionar el nivel de humedad adecuado. La mayora de los medios de cultivos debe incubarse durante al menos 4 semanas antes de ser considerados negativos para el hongo. Los medios de cultivo sospechosos de contener hongos termalmente dimrficos deben incubarse durante al menos 8 semanas antes de ser reportados como negativos.

Exmen Macroscpico de los medios de Cultivo Despus de la inoculacin inicial e incubacin, se deben examinar los medios de cultivo cada 2-3 das para evidenciar el crecimiento fngico. Los de crecimiento rpido aparecen segunda oportunidad en que los tubos chequeados, mientras que los hongos de pueden no ser evidenciados durante 2-3 tiempo. en la primera o de cultivo son lento crecimiento semanas o ms

Es imperativo que cualquier levadura, moho o actinomiceto que crezca en un medio primario sea subcultivado inmediatamente para asegurar la viabilidad y aislamiento del organismo. Cuando el crecimiento y maduracin se realice sobre Agar Dextrosa Sabouraud, debe anotarse cuidadosamente la textura y el color de la superficie de la colonia. El color del reverso (parte inferior) de la colonia tambin debe anotarse, as como cualquier pigmento que difunda en el medio. Igualmente debe anotarse si se observa la intensificacin del crecimiento en un medio enriquecido, y sospechar de un hongo termalmente dimrfico. Tambin es til observar si un hongo crece o no en un medio que contiene cicloheximida. Para asegurar el aislamiento de todos hongos presentes un espcimen (sobre todo de los patgenos de creciente ms lento), es aconsejable en muchos casos mantener el cultivo por lo menos un mes, aun cuando se hayan aislado algunos hongos. Cuando se observa mas de un hongo en el bisel de un medio de cultivo, es necesario sembrar cuidadosamente una placa para lograr el aislamiento.

La tapa puede ser encintada en varios lugares por seguridad y prevenir la deshidratacin, pero debe tenerse cuidado para no crear condiciones anaerbicas. Como previamente se mencion, para prevenir la deshidratacin de los medios en placas, ellos deben contener 40 ml de agar, y un recipiente con agua debe colocarse en el fondo de la incubadora. Si se sospecha de Coccidioides, no deben usarse medios en placas de Petri. Exmen Microscpico del Crecimiento Es mejor examinar un hongo microscpicamente cuando el cultivo empieza a crecer y formar conidias o esporas, repitiendo la observacin de nuevo unos das despus. En muchos casos la manera de conidiacin o esporulacin, la cual es importante para la identificacin, se ve disimulada en los cultivos viejos. Hay varios mtodos para examinar microscpicamente los cultivos de hongos: Preparacin en lmina con lactofenol Este mtodo no siempre permite la preservacin de la posicin original y estructura de las conidia y las esporas, pero es un mtodo rpido y una prueba que siempre tiene valor. Preparacin con cinta de celofn. Este mtodo es usualmente exitoso en conservar la posicin original de las estructuras fngicas caractersticas. Cultivo en lmina. El mejor mtodo para la preservacin y observacin de la estructura real de un hongo es el cultivo en lamina. No es una tcnica rpida, pero es una tcnica excelente para el

estudio rutinario detallado de la morfologa microscpica de los hongos. Siempre debe realizarse una preparacin de azul de lactofenol antes de un cultivo en lmina: No debe realizarse un cultivo en lmina cuando se sospeche de organismos tales como: Histoplasma, Blastomyces o Coccidioides.