USO Y APLICACIN DE MOLECULARES EN GANADERA Resumen

MARCADORES

Se trata de hacer una revisin de las aplicaciones de la biotecnologa a la produccin animal, especialmente en la ganadera. Se resumen las caractersticas de los marcadores moleculares ms empleados en este campo (los que evalan polimorfismos de longitud tanto de fragmentos de restriccin, como de secuencias simples o amplificadas, los basados en oligonucleotidos alelo especficos, los que tienen secuencias arbitrarias, los SNPs entre otros.). Se muestran sus aplicaciones fundamentales as como algunos de los resultados obtenidos en Cuba relacionados con el tema.

Introduccin
En los ltimos 60 aos las aplicaciones de la gentica molecular en la evaluacin de los caracteres hereditarios y la identificacin animal se han desarrollado aceleradamente. En el ganado, nuevos marcadores de ADN relacionados con caractersticas productivas, contribuirn a mejorar laeficiencia y la intensidad de la seleccin para el rendimiento y la calidad de la leche o carne, mientras que marcadores de enfermedades genticas proveern un medio para el control y la erradicacin de las mismas en las poblaciones de especies domsticas, as como la determinacin de la pureza racial y de relaciones filogenticas en ejemplares de inters comercial y animales afectivos. Las tcnicas de anlisis molecular que permiten la deteccin de la variabilidad gentica directamente a nivel de la molcula de ADN, se basan en diferentes tipos de marcadores moleculares. Estos marcadores genticos se utilizan en la construccin de mapas genmicos de las diferentes especies animales, con vistas a la deteccin y manipulacin de efectos gnicos individuales de naturaleza cuantitativa (locus de rasgo cuantitativos o QTL) enprogramas de mejoramiento animal, o cualitativos en estudios de resistencia a enfermedades, pureza racial o verificacin de la ascendencia. La ganadera, y en especial lo relacionado con la industria lechera, ha sido lder de la produccin animal al aprovechar los frutos de las nuevas tcnicas biotecnolgicas, lo que contribuir indudablemente en los prximos aos, a lograr un aumento de la produccin de leche. En esta industria la implementacin de la inseminacin artificial y la transferencia de embriones han extendido el mercado gentico, a lo que se une la distribucin del germoplasma de un simple parental para la realizacin de pruebas de progenies con el fin de estudiar de la evolucin gentica en diferentes

condiciones de manejo y desarrollo. En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar enfermedades genticas humanas, el uso de animales para la produccin de drogas y como fuente donante de clulas y rganos, por ejemplo el uso de animales para la produccin de protenas sanguneas humanas o anticuerpos. Para las enfermedades animales, la biotecnologa provee de numerosas oportunidades para combatirlas, y estn siendo desarrolladas vacunas contra muchas enfermedades bovinas y porcinas, que en los ltimos tiempos han hecho mella en estos animales (Garca, 2005). Esto se hace posible hoy en da, gracias a las nuevas tecnologas moleculares desarrolladas, con las cuales se logra la identificacin de genotipos y el monitoreo de animales en poblaciones a partir de marcadores ligados a rasgos cuantitativos.

1. Biotecnologa aplicada a la produccin animal

El trmino "biotecnologa" se refiere a un grupo de herramientas que utiliza a los organismos vivos o partes de estos, para hacer o modificar productos, mejorar plantas y/o animales o construir microorganismos por ingeniera gentica, con un objetivo determinado (BIO 2000; Martin, 2000). Esta es una industria en crecimiento que puede ofrecer un medio importante para incrementar la eficiencia de la produccin de alimentos y mejorar la salud de las poblaciones mundiales. Son numerosos los ejemplos del enorme potencial que ofrece la biotecnologa en el aumento de la eficiencia y la confiabilidad de la produccin animal, as como la seguridad, la calidad y la utilidad de los productos provenientes de la ganadera. En el campo de la gentica animal se ha producido una verdadera revolucin en todas las vertientes de la investigacin relacionadas con la produccin con calidad y con la mejora de agrupaciones animales. Por una parte, se encuentra la Gentica Cuantitativa, con una concepcin y estudio integrales de los factores que inciden en la mejora. En su metodologa se utiliza ampliamente la recopilacin de datos, con una gran velocidad de clculo y mayores posibilidades de almacenamientodinmico de datos en bases interactivas. Por otro lado, est la Citogentica que aporta nuevos enfoques e informaciones para su aplicacin en las producciones animales. Tambin se encuentran las metodologas de que disponen la Biologa Molecular y la Gentica Bioqumica, que se basan en el estudio del material gentico y tienen un papel imprescindible en la identificacin gentica y pruebas de parentesco, en el diagnstico de enfermedades hereditarias y en el aporte de los marcadores genticos para el apoyo a la seleccin dirigida a caracteres cuantitativos o econmicos (Zaragoza et al.,1994).

La mayora de estas aplicaciones en el campo de la produccin animal est basada en la variabilidad gentica, detectada por marcadores entre individuos y poblaciones lo que lleva al estudio de los polimorfismos genticos.

2. Mtodos de deteccin de polimorfismo gentico

La variacin de naturaleza cuantitativa y de origen gentico dentro de las poblaciones se presenta en dos formas bsicas: mutantes raros y polimorfismo gentico. Atendiendo al valor de la frecuencia, si la variante ms escasa aparece con una frecuencia menor del 1% se denomina mutante raro, pero si sta es mayor que este valor estamos en presencia de un polimorfismo gentico (Clarke, 1975). As pues, Berovides y Alfonso (1987) definieron este ltimo como la ocurrencia dentro de una poblacin de variantes discontinuas de origen gentico, con una frecuencia del gen que no puede ser explicada por la accin exclusiva de mutaciones, por ser este un evento sumamente raro. La variabilidad gentica es un atributo que no puede ser exhaustivamente medido. Es imposible examinar cada gen en cada individuo de una especie dada para obtener una enumeracin completa de la variacin gentica de la especie; sin embargo, si se toma una muestra de una poblacin es posible estimar su variabilidad gentica (Ayala, 1984), al utilizar un carcter o marcador que propicie la medicin de dicha variabilidad. El polimorfismo gentico o variacin de origen gentico ha sido muy estudiado en poblaciones naturales, pues permite el anlisis de fenmenos como cantidad de variabilidad gentica y frecuencia de mutaciones a travs de caracteres de fcil medicin y de base gentica conocida, con poca influencia del ambiente en su expresin fenotpica (Berovides y Alfonso, 1987). Hasta mediados de la dcada de los 60?, los marcadores usados en gentica y mejora animal estaban controlados por genes asociados a caracteres polimrficos, en general fciles de identificar visualmente (Ferreira y Grattapaglia, 1995). Pero solo un pequeo nmero de marcadores morfolgicos permitan encontrar asociaciones significativas entre estos y los caracteres con importancia econmica. Por sus limitaciones surgieron los marcadores isoenzimticos que eran accesibles a un mayor nmero de especies y brindaban mejores resultados. Con el advenimiento de las tcnicas de biologa molecular aparecieron diversos mtodos de deteccin de polimorfismo gentico directamente a nivel deADN. Inicialmente el descubrimiento de las enzimas de restriccin permiti el anlisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin (Grodzicker et al., 1974).

Posteriormente, con el desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction (PCR), Mullis y Faloona, 1987; Saiki et al.,1988), se desarrollaron nuevos mtodos de deteccin de marcadores moleculares; estos ltimos se definen como todo aquel fenotipo molecular proveniente de un gen expresado, como en el caso de las isoenzimas o las protenas (marcadores bioqumicos), o de un segmento especfico de ADN (correspondiente a regiones expresadas o no del genoma) (Ferreira y Grattapaglia, 1995). En las determinaciones de la variabilidad gentica, los marcadores "ideales" cumplen una serie de caractersticas, entre las que se encuentran: elevada capacidad de detectar altos niveles de polimorfismo, alta heredabilidad, gran capacidad para acceder a todas las regiones del genoma, independenciadel estado fsico y de desarrollo del individuo, facilidad de obtencin, deteccin por mtodos econmicos, independencia de las condiciones ambientales y la posibilidad de determinacin en cualquier tipo de clulas que contenga ncleo (Ferreira y Grattapaglia, 1995). Estas constituyen algunas de las ventajas de los marcadores moleculares sobre los morfolgicos e isoenzimas; otras radican en su capacidad de deteccin de mutaciones silenciosas, que no originan cambios de aminocidos. Los polimorfismos detectados en el ADN estn ocasionados por diferencias en cuanto al nmero de determinadas regiones no codificantes, que se encuentran dispersas en el genoma (regiones repetidas) o por mutaciones puntuales. En funcin de estas caractersticas se pueden clasificar los diferentes mtodos de deteccin de polimorfismos: los marcadores asociados a variaciones debidas al nmero de repeticiones en su secuencia y los marcadores que detectan cambios puntuales en el genoma, que pueden ser detectables o n, por enzimas de restriccin. 2.1. Polimorfismos de longitud de secuencia simple (SSLPs) Los SSLPs son arreglos de secuencias repetidas que muestran variaciones en su longitud, con alelos que difieren en el nmero de unidades repetidas, pueden ser multiallicos y cada SSLP puede tener un nmero de variantes de longitudes diferentes; existen dos tipos de estos marcadores que se clasifican como DNA satlite, aunque no aparezcan con bandas "satlite" en gradiente de densidad:

Minisatlites, tambin conocidos como repeticiones en tandem de nmero variable (variable number of tandem repeats (VNTRs)), en los cuales la unidad repetida es de hasta 25pb de longitud. Microsatlites o repeticiones simples en tandem (simple tandem repeats (STRs)), cuyas repeticiones son menores, usualmente de unidades de dinucleotidos o trinucleotidos.

Los microsatlites son ms populares que los minisatlites como marcadores moleculares por dos razones: primero los minisatlites no se encuentran repartidos por todo el genoma, encontrndose fundamentalmente en las regiones telomricas al final de los cromosomas. En trminos geogrficos, esto es equivalente a intentar utilizar un mapa de faros para encontrar una casa alrededor del centro de una isla. Los microsatlites estn ms convenientemente espaciados a travs del genoma. Segundo, la va ms rpida de tipificar el polimorfismo de longitud es por PCR, pero esta tcnica es mucho ms exacta cuando se amplifican secuencias de longitud menor a 300pb. La mayora de los alelos de minisatlites tienen tallas superiores debido a que sus unidades de repeticin son relativamente grandes y con una sola copia, por lo que se requeriran productos de PCR de varias kb para tipificarlos. Los microsatlites tpicos constan de 10-30 copias de una repeticin que usualmente no son superiores a 4pb de longitud, por lo tanto son mucho ms fciles de analizar por PCR. 2.1.1. Marcadores basados en loci hipervariables de minisatlites (VNTR) Se conoce que una gran proporcin variable del genoma eucariota est compuesto por secuencias repetitivas de ADN, las cuales difieren en el nmero y la composicin de nucletidos. Los primeros marcadores de este tipo en ser utilizados fueron los minisatlites o VNTR ("Variable Number of Tandem Repeats") (Jeffreys et al., 1985), que estn ubicados en regiones centromricas y telomricas de los cromosomas (Moyzis et al., 1988). Estn constituidos por un nmero variable de secuencias idnticas repetidas. Estas poseen de 15 a 100 pares de bases y en cada locus hipervariable estn repetidas hasta 50 veces. El nombre de minisatlites se debe al hecho de que las secuencias repetitivas forman un pico satlite diferente al pico principal de ADN genmico despus de la separacin en gradientes de cloruro de cesio, por contener una proporcin de pares de bases G+C diferente a la media del resto del genoma (Lewin, 1997). De esta observacin surgi el concepto de huella dactilar gentica o "genetic fingerprint" y este tipo de marcador constituy durante un tiempo la base gentica de la identificacin de individuos. Los minisatlites estn asociados con caractersticas estructurales de los cromosomas. El DNA telomrico, que en humanos comprende cientos de copias con el motivo 5-TTAGGG-3 es un ejemplo de minisatlite, de cuyo origen y funcin se conoce algo y que estn relacionados de manera importante en el proceso de replicacin. Existen otros ejemplos de genomas eucariotas que contienen varios cluster de minisatlites, de los cuales la mayora, aunque no todos se ubican al final de los cromosomas, cuyas funciones an no se conocen totalmente (Strachan y Read, 1999).

El principio gentico de la obtencin de estos marcadores se basa en la digestin del ADN de los individuos analizados con enzimas de restriccin, separado electroforticamente, inmovilizado en una membrana y detectado por hibridacin con sondas y autorradiografa (Figura 1). Cuando la enzima de restriccin corta las secuencias adyacentes a un locus hipervariable, la longitud de los fragmentos de restriccin producidos en diferentes individuos vara con el nmero de repeticiones del minisatlite, resultando en un patrn e bandas especfico para cada indoviduo. Esta variacin del nmero de elementos repetidos se genera posiblemente debido a fenmenos como deslices en la replicacin del ADN o an en la conversin gnica (Jeffreys et al., 1985). Por este mtodo se pueden detectar gran polimorfimo, que depende de la variacin en la distribucin de los sitios de restriccin y el nmero de secuencias repetidas (Cornide et al., 2002).

Estos se han utilizado cada vez menos, debido a causas como la gran complejidad de la tcnica y su elevado costo, que limitan su utilizacin, por ejemplo, para la deteccin de genes ligados a loci de rasgos cuantitativos ("Quantitative Traits Loci", QTL): loci con una gran influencia sobre rasgos comercialmente importantes, marcados por polimorfismos de ADN, cuya variacin puede ser empleada en la seleccin, de forma semejante a los genes simples y que se caracterizan por estar ligados a marcadores genticos (Distl, 2000). 2.1.2. Marcadores basados en la amplificacin de microsatlites Los loci microsatlites (Litt y Luty, 1989; Koreth et al., 1996), tambin conocidos como SSR ("Simple Sequence Repeat": Secuencias Simples Repetidas), consisten en pequeas secuencias con 2-6 nucletidos repetidos en tndem, altamente variables en tamao, en un rango alrededor de los 100-200pb. En genomas eucariotas las secuencias de los microsatlites son

muy frecuentes, bien distribuidas y mucho ms polimrficas que los locihipervariables formados por minisatlites, constituyendo la clase de marcadores moleculares ms polimrficos que se conocen (Ferreira y Grattapaglia, 1995, Cornide et al., 2002). Se ha sealado que los elementos ms repetidos en mamferos son extensiones de dinucletidos CA. Por el momento, se desconoce exactamente el origen y la funcin de estas secuencias repetidas. Respecto a su origen, la aparicin inicial de los microsatlites pudo deberse al azar, o podran haber surgido como producto de mutaciones en la secuencia poli-A en el extremo 3? de las secuenciasAlu adyacentes. Por otra parte, la prevalencia selectiva de CA puede explicarse por metilacin de los residuos de citosina en el extremo 5? de GC, secuencias normalmente presentes en el genoma. Por ltimo, los residuos metilados pueden ser desaminados produciendo una transicin C/T (Korethet al., 1996). En relacin con su funcin, se cree que no son ms que un reflejo interno de mecanismos genmicos con tendencia a producir y cortar estas secuencias (, y existen evidencias de que no son necesarios para la expresin gnica (Stalling, 1994). Anteriormente se haban propuesto como puntos calientes en la recombinacin gentica, en los cuales se producen entrecruzamientos con intercambios desiguales de cromtidas (Weber y May, 1989) y como reguladores de genes (Hamada et al., 1984). Por ltimo, Kashi et al., (1997) lanzaron la hiptesis de que los microstelites son una fuente de variacin cuantitativa. Estos autores se basaron en una serie de caractersticas de estas regiones como son su dispersin a lo largo del genoma, su asociacin a genes como elementos de control de transcripcin o como componentes codificantes, las variaciones observadas en el nmero de repeticiones que pueden causar cambios cuantitativos en la expresin gnica y funcin, as como cambios fenotpicos, entre otras. As, el cambio en el nmero de repeticiones puede ser un medio exquisitamente especfico y sensible de regulacin cuantitativa de variacin. Esta fuente de mutacin y cambio en el nmero de repeticiones podra proveer una fuente de variacin cuantitativa para una rpida adaptacin evolutiva de las especies a cambios ecolgicos. As, se ha descrito (Rosenberg et al., 1994) que la nutricin y el estrs podran incrementar la velocidadde mutacin en los microsatlites debido a un descenso de la regulacin de reparacin de errores. De esta forma, el estrs que acompaa al cambio evolutivo podra inducir en una poblacin el incremento de mutaciones requeridas para adaptarse al cambio. Los microsatlites han demostrado ser los marcadores ms informativos para estudios poblacionales a nivel de subespecie. La mayora de los estudios

realizados hasta el momento con este tipo de marcadores se basa en el anlisis de frecuencias allicas, con la finalidad en un principio de la creacin demapas genticos y posteriormente para la determinacin de QTLs (Georges et al., 1995; Velmala et al., 1999). Weber y May (1989) propusieron la PCR como mtodo general para el estudio del polimorfismo de estas regiones, las que se amplifican individualmente utilizando un par de oligonucletidos especficos (2030mer) complementarios a las secuencias nicas que flanquean el microsatlite (figura 2). Los fragmentos amplificados, casi invariablemente, presentan un polimorfismo extensivo resultante de la diferencia en el nmero de elementos simples repetidos. As, cada regin microsatlite, independientemente de la secuencia repetida, constituye un locus altamente variable, multiallico y de gran contenido informativo.

Figura 2. Esquema que ilustra la composicin de una regin microsatlite en una cadena de ADN Cada segmento amplificado representa un alelo diferente del mismo locus. La deteccin de estas secuencias se ha realizado en geles de poliacrilamida altamente resolutivos debido a que las diferencias entre uno y otro alelo pueden ser de uno o dos nucletidos y ms recientemente en secuenciadotes automticos utilzando fluorforos diferentes para cada microstlite (figura 3) (Womack, 1993). Adems, pueden analizarse muchos genotipos simultneamente por ser los marcadores ms adecuados para el desarrollo de mapas de ligamiento.

Figura 3. Anlisis fluorescencia

de

genotipos

de

microsatlites

marcados

con

Debido a la importancia que estos marcadores han tomado en el desarrollo de mapas genticos, las formas de deteccin son muy variables y constantemente aparecen nuevas tcnicas. En un primer momento se pueden dividir en dos: unas basadas en el anlisis de las bases de datos de los genes existentes y otras en su deteccin en el laboratorio. La bsqueda en bases de datos como EMBL, GenBank, etc., han permitido caracterizar algunos microsatlites bovinos (Fries y et al.., 1993). Actualmente la mayora de los estudios de deteccin de microsatlites tiene lugar en el laboratorio. Inicialmente se trabajaba en el monitoreo de una librera de ADN genmico bovino (clones bacterianos con distintos fragmentos de ADN) mediante sondas de dinucletidos (ej. (TG)n y (CA)n) marcadas con 32P y posteriormente se realizaba la secuencian de los clones positivos. Utilizando esta metodologa se han detectado un gran nmero de microsatlites en esta especie (Vaiman et al., 1992; Kemp et al., 1993). Por las ventajas que poseen estos marcadores, se ha trabajado ampliamente en la bsqueda y empleo en diferentes especies de inters en ganadera, tales como ovino (Buchanan et al., 1998; Dietz et al., 1993), caprino (Kemp et al., 1995), porcino (Moran, 1993), bovino (Fries et al., 1990; Vaiman et al., 1992; Usha et al., 1995; Giovambatista et al., 2000; Hansen et al., 2002) , etc. Se han realizado estudios en distintas especies ganaderas y por supuesto en bovinos (MacHugh et al., 1994; Ciampolini et al., 1995; Moazami-Goudarzi et al., 1997; Martn-Burriel et al., 1999; Rusell et al., 2000; Uffo, 2003) que han tomado como base las investigaciones realizadas relacionadas con la caracterizacin de poblaciones humanas. 2.2. Marcadores que presentan cambios puntuales en el genoma. 2.2.1 Marcadores moleculares basados en el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) A finales de la dcada del ?60 el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin de bacterias (enzimas de restriccin con muy alta especificidad), las cuales cortaban el ADN en secuencias definidas de usualmente 4-8pb, conllev al desarrollo de tcnicas para el aislamiento y la manipulacin dirigida de fragmentos de ADN. Una de las mayores aplicaciones de esta tcnica (ampliamente utilizada en el campo de la gentica humana) fue el ensamblaje de los mapas genticos con el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (Restriction Fragments Length Polymorphism, RFLP) (Grodzicker et al., 1974).

Esta tcnica explota las variaciones en las secuencias del ADN por la creacin o abolicin de sitios para el corte de las endonucleasas de restriccin, dadas por los cambios de bases, las adiciones o deleciones de fragmentos de ADN entre y en estos sitios. Adems, algunas endonucleasas son incapaces de cortar el ADN si la secuencia de reconocimiento contiene uno o ms sitios de citosina metilada, por lo tanto tales enzimas pueden detectar polimorfismo si hay variaciones en los patrones de metilacin. El estudio de los polimorfismos de este tipo consiste en el anlisis en cuanto a nmero y tamao de los fragmentos de ADN al ser digeridos con distintas enzimas de restriccin. Los patrones de bandas resultantes se generan por la presencia o ausencia de los sitios de corte de la enzima producidos por mutaciones: cambios, delecciones o inserciones de bases. Por lo tanto, la variabilidad est dada por las distintas tallas de los fragmentos que se originan al digerir con las mencionadas enzimas el material genmico o un fragmento amplificado del genoma, de manera que un sitio de restriccin polimrfico o una deleccin o insercin entre dos sitios de corte ser detectado como un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin generados a nivel fenotpico (Botstein et al., 1980). La tcnica consta de las siguientes etapas (figura 4): digestin del ADN con enzimas de restriccin; separacin por electroforesis de los fragmentos resultantes de la digestin; transferencia de los fragmentos separados a membranas de nitrocelulosa (Southern Blotting) e hibridacin con sondas moleculares radiactivas y exposicin de la membrana a un filme de rayos X. La identificacin delpolimorfismo tambin puede hacerse por PCR (Leveziel et al., 1988; Cornide et al., 2002). Este mtodo se ha empleado en la caracterizacin de los genes de algunas de las protenas lcteas bovinas (Rodellar et al., 1992; Osta, 1994; Uffo 2002a y b, 2003).

Figura 4: A: Representacin esquemtica del principio gentico del RFLP. B: Gel de azarosa 1.5% teido con bromuro de etidio contenieno los productos obtenidos de ADN de diferentes individuos, amplificados por PCRy digeridos con la enzima TaqI, M: marcador de peso molecular de 1Kb El uso de los RFLP como marcadores para trazar la transmisin de los genes asociados a ellos, es de una utilidad considerable en gentica pues tienen como ventajas el no estar influenciados por el ambiente, no depender del estado ontognico del animal, permitir un anlisis de todo el genoma, poderser detectados en estadios muy tempranos del desarrollo

independientemente de la expresin del gen, una vez heredados, y adems poseen la caracterstica de ser codominantes en la expresin fenotpica, es decir, permiten discernir entre el individuo homocigtico dominante y el heterocigtico; son muy comunes y cualquier gen debe tener sitios de restriccin polimrficos en una vecindad de varios cientos de pares de bases. Pero tienen como desventajas que son muy costosos, necesitan de un personal calificado y entrenado para trabajarlo, precisan el uso de radioactividad y adems, consumen mucho tiempo (Asmussen y Clegg, 1985; Ferreira y Grattapaglia, 1995). En animales domsticos se ha realizado este tipo de anlisis del ADN desde 1985, con numerosos trabajos en una amplia diversidad de especies: perros(Jeffreys et al., 1987); cerdos (Davies et al., 1988); gatos (Hillel et al., 1989); cabras (Bergensen, 1990); ovinos (Leveziel et al., 1991); bovinos (Rodellaret al., 1992, Uffo, 2003); aves (Bumstead, et al., 1992; Cheng, 1997). En la actualidad su mayor utilizacin se basa en la combinacin con la tcnica de PCR Otras de las aplicaciones de esta tecnologa ha sido el desarrollo de detallados mapas de ligamiento en una amplia variedad de organismos. Aunque sta es la ms conocida, el RFLP se ha empleado tambin en la caracterizacin del genoma de organelos, en la identificacin de lneas o individuos y en las investigaciones sobre el tema de la diversidad gentica (Tanksleet al., 1989; Van der Beek et al., 1992; Uffo, 2003). La identificacin y el mapeo de RFLPs han revolucionado la gentica humana por el desarrollo del diagnstico asistido por marcadores y la deteccin de una amplia variedad de enfermedades hereditarias. A pesar de haber sido ignorados este tipo de marcadores en sus inicios por los genetistas veterinarios, los mismos mtodos para el mapeo en humanos son empleados para estudios de diferentes especies animales, respecto a los sitios polimrficos, producindose una revolucin en el mejoramiento animal por la introduccin de la seleccin asistida por marcadores (Marker Asisted Selection: MAS) (Womack, 1983). 2.2.2. Oligonucletidos alelos Oligonucleotides", ASOs) especficos ("Allele Specific

Su metodologa de identificacin consiste en la deteccin de la variabilidad mediante sondas especficas para los alelos. Pueden usarse marcados con radiactividad para detectar la variabilidad en un "dot blot" tras una amplificacin (Pinder et al., 1991) o como oligonucletidos para PCR que amplificarn un alelo especficamente (Leveziel et al., 1994; Okimoto y Dogson, 1996; Braunschweirg et al., 1999).

Presentan el inconveniente de que cuando se usan sondas, cada anlisis deber realizarse tantas veces como alelos sean detectados, ya que cada sonda ser capaz de reconocer si el alelo est presente o no, pero no se puede determinar el genotipo del animal. El procedimiento general de dot-blot involucra tomar una solucin acuosa del ADN blanco, por ejemplo ADN genmico total bovino, y simplemente depositarlo en forma de manchas ("spot") sobre una membrana de nitrocelulosa o de nylon, dejndolas secar. El ADN blanco se desnaturaliza, ya sea por exposicin al calor o por tratamiento con lcalis; luego una vez inmovilizado sobre la membrana, este se expone entonces a una solucin que contiene las sondas marcadas. Despus transcurrido un determinado tiempo de reaccin que permita la formacin de los heteroduplex "sonda-blanco", se elimina la solucin de la sonda, se lava la membrana para eliminar el exceso de sonda marcada que haya quedado sin reaccionar o que pueda constituir enlaces inespecficos con la membrana y finalmente, esta se seca y se expone a una pelcula de autorradiografa. Para el uso de esta tcnica en la deteccin de alelos especficos, se construyen sondas que abarcan las diferentes variantes de un sitio de inters. As las sondas ASO tienen una longitud entre 15 y 20 nucleotidos, y normalmente se utuilizan bajo condiciones de hibridacin a las cuales el duplex entre estas y el ADN blanco es estable solo si existe una complementariedad perfecta entre sus secuencias; un simple error de complementariedad puede producir un heteroduplex pequeo e inestable. Tpicamente, esto involucra el diseo de oligonucleotidos en los cuales la diferencia entre los alelos se identifica con un nucleotido ubicado en el segmento central de su secuencia, de tal modo que se maximisa la inestabilidad de un duplex mal ensamblado. Estapropiedad de discriminacin puede usarse en una gran variedad de objetivos de investigacin y diagnstico. Un ejemplo de esto lo constituye la identificacin de individuos con anemia A-ASO; se muestra inmediatamente debajo).-globina (arriba) (falciforme o siclemia. En la figura 5 aparece la representacin esquemtica del alelos normal de la S globina, respectivamente, alrededor del sitio de mutacin. Este es una sustitucin de un nucleotido simple (AA y S-ASO en este caso fueron diseadas de manera tal que tuvieran 19 nucleotidos de longitud, abarcando de los codones 3 al 9 de las secuencias del gen de la A-ASO y S-ASO; se muestra inmediatamente debajo), y en este caso resulta que el individuo es positivo cuando son heterocigotos u homocigotos recesivos (crculos azules) y negativos cuando son normales. Las sondas Los resultados son positivos cuando se identifican individuos normales o heterocigticos (crculos negros) y negativos cuando se encuentran individuoa homociigticos recesivos

(crculos en blanco). El dot-blot de abajo muestra la identificacin de la mutacin cuando se utiliza un oligonucleotido especfico para la misma ( globina, resultando en una sustitucin de GAG (Glu)T) en el codn 6 del gen de la GTG (Val) (se observa en la secuencia central) (Strachan y Read, 1999).

Figura 5. Identificacin de oligonucltido alelo especfico (ASO) por hibridacin de dot-blot (ejemplo: identificacin de individuos con siclemia). Otro mtodo de identificacin de ASOs por dot-blot utiliza unan aplicacin inversa. Esto significa que las sondas de oligonucleotidos no estan marcadas y se fijan sobre la membrana o el filtro mientras que el ADN blanco, esta vez marcado, se coloca en solucin. Las uniones positivas del ADN blanco con el oligonucleotido especfico sobre la membrana se corresponden con la existencia de una secuencia especfica en el ADN blanco. Esta aplicacin se relaciona con el mtodo de microarreglos (microarrays) y actualmente tiene innumerables aplicaciones en el diagnstico de enfermedades, sobre todo en humanos, la cual es una tcnica novedosa basada en la utilizacin de genosensores o ADN-chips que contienen cientos de sondas ordenadas y adheridas a la superficie, donde posteriormente se hibrida la secuencia complementaria del ADN en estudio. Se puede utilizar

para el anlisis de mutaciones especficas o de polimorfismo, identificacin de especies, ene l anlisis de la expresin gnica y para la secuenciacin. El uso ms importante es el anlisis de marcadores polimrficos; si se conoce la secuencia nucleotidica del fragmento polimrfico, entonces se pueden incluir sondas especficas en el genosensor para cada alelo delmarcador de ADN. El patrn de hibridacin producido con los fragmentos que contienen los maracdoresde inters revelar rpidamente el genotipo (Cornide et al., 2002) 2.2.3. ADN polimrfico amplicado al azar: RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) La tcnica RAPD, conocida tambin como AP-PCR (Arbitrary primed PCR, Welsh y McClelland, 1990) es bsicamente una variacin del protocolo de la PCR con dos caractersticas distintivas: utiliza un cebador nico en lugar de un par de primers y este tiene secuencia arbitraria, por lo tanto su secuencia es desconocida, se pueden seleccionar un nmero infinito de cebadores y su diseo debe estar regido por tres condiciones bsicas: %C+G alrededor de 50-70%, que no tenga palndromes mayores de 6 bases y que no exista complementariedad en el extremo 3 (Williams et al., 1993). Para que ocurra la amplificacin, dos secuencias complementarias al cebador arbitrario deben estar lo suficientemente adyacentes (~400pb) y en orientacin opuesta que permita la amplificacin exponencial por la ADN-polimerasa (Figura 6).

Figura 6: Deteccin de un loci polimrfico a travs de la tcnica RAPD. El ejemplo muestra esquemticamente los cromosomas B6 y C3H (lneas horizontales). A: Los recuadros sobre las lneas representan fragmentos genmicos (loci RAPD) que pueden ser amplificados con un primer en particular. El locus B es polimrfico. B: Ilustracin del patron de bandeo que sera obtenido de la electroforesis de los productos de B6 y CH3. Durante la fase de alineamiento de la reaccin de PCR-RAPD, el primer arbitrario se unir a los sitios de la secuencia complementaria en el ADN molde desnaturalizado. Si dos molculas se alinean con el molde en cadenas opuestas, con la orientacin apropiada y con una distancia amplificable (menor o igual a 2500 bases) entonces ser amplificado un fragmento discreto de ADN. Cada primer es potencialmente capaz de amplificar un nmero de fragmentos (1-10 o ms) de diferentes loci durante la misma reaccin de PCR resultando en varias bandas en el gel. Los segmentos amplificados pueden ser visualizados en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio o en geles de poliacrilamida de alta resolucin visualizados por autorradiografa o teidos con plata (Waugh y Powell, 1992) detectndose el polimorfismo como ausencia o presencia de bandas de un fragmento particular. Los polimorfismos RAPD resultan de la diferencia de secuencias en uno o ambos sitios de unin de los primers, los cuales evitan el alineamiento de la secuencia molde. Otras fuentes de polimorfismo RAPD pueden incluir diferencias de apenas un par de bases (mutaciones puntuales) que son suficientes para causar complementariedad del primer en el sitio de iniciacin; delecciones o inserciones adyacentes en el sitio de iniciacin de modo que provoquen la accin de la ADN-polimerasa, por lo que los marcadores RAPD tienen naturaleza binaria, el segmento amplificado est presente o no; son marcadores dominantes porque solo se amplifica una variante allica, aquella que cumple con los requisitos de complementariedad entre el cebador y las cadenas de ADN a una distancia menor o igual a 2Kb (Cornide et al., 2002). Dichas mutaciones pueden variar tambin la talla de la regin entre los sitios o evitar la amplificacin. Algunos autores (Bowditch y et al.., 1993) sugieren que pueden ocurrir tambin si se forman estructuras secundarias alrededor de los sitios de unin de los primers durante ciclos de alineamiento con temperaturas relativamente bajas. Estas estructuras secundarias pueden interferir con el alineamiento de los primers y/o la extensin por la ADN polimerasa. Las mutaciones en estas regiones pueden estabilizar o desestabilizar la formacin de estructuras para originar polimorfismos RAPD.

La distribucin de marcadores RAPD a lo largo del genoma es una consideracin importante cuando se evala la utilidad de estos marcadores, los cuales estn ampliamente ubicados ms o menos al azar por todo el genoma. Existen reportes que verifican su presencia en el genoma de numerosas especies, (Cheah et al., 1994; Postlethwait et al., 1994; Hunt y Page, 1995; Cushwa y Medrano, 1996; Rincon et al., 2000; Alves et al., 2003). Los RAPDs se han utilizado tambin para la caracterizacin racial en ganado bovino (Parejo et al., 2002), Una caracterstica importante en cualquier marcador gentico es que posean una reproducibilidad consistente. En este tipo de marcadores factores como calidad y concentracin del ADN molde, presencia de contaminantes precipitables con etanol, concentracin de cloruro de magnesio, contenido de G+C en los primers y su concentracin y la eficiencia del termociclador, influyen en la amplificacin y afectan la sensibilidad de la reaccin, adems de la fuente de la ADN polimerasa (Cushwa y Medrano, 1996). Esta tcnica se diferencia fundamentalmente de otras y muestra ventajas, por ejemplo, sobre RFLP (Lynch and Milligan 1994), en que no se basa en hibridacin sino en la amplificacin de ADN, lo que implica simplicidad y rapidez, lo cual se debe a la posibilidad de detectar polimorfismo por la visualizacin directa de las bandas en el gel, eliminando todas las etapas de transferencia de ADN para membranas (Southern Blot), hibridacin con sondas especficas y autorradiografa; no requiere del desarrollo de una librera de sondas especficas, sino que un conjunto de primers arbitrarios puede utilizarse para cualquier organismo; se elimina la necesidad de istopos radiactivos, se requiere 10-3 veces menos concentracin de ADN que para RFLP y la principal desventaja es el bajo contenido de informacin gentica por loci asociado a la dominancia de los marcadores RAPD (Williamset al., 1990, 1993), adems de que para su desarrollo requiere que se garanticen condiciones de adecuada repetibilidad, adems de ser un mtodo muy trabajoso y costoso. Cuando los productos de la amplificacin se separan en electroforesis empleando gradiente desnaturalizante donde los fragmentos de ADN migran desde una concentracin baja hasta la mayor (80%), entonces se denomina RAPD-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis). Esta variante se emplea para la deteccin del polimorfismo dek ADN en situaciones donde el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin es bajo, pero se espera encontrar variaciones en su secuencia (Dweikat y McKenzie, 1997) 2.2.4. Polimorfismo de Conformacin de las Cadenas Simples ("Single Strand Conformations Polymorphism", SSCPs) El ADN de cadena simple tiende a doblarse y formar estructuras complejas estabilizadas por enlaces intramoleculares dbiles, especialmente por

puentes de hidrgeno. La mobilidad electrofortica de dichas estructuras sobre geles no desnaturalizantes depender no solo de la longitud de las cadenas, sino tambin de su conformacin, la cual esta determinada por la secuencia de ADN. Consiste en la deteccin de las diferencias en la estructura secundaria o terciaria entre fragmentos de ADN amplificados, con distinta secuencia (Oritaet al., 1989). Esto permite la deteccin de mutaciones puntuales de ADN sin necesidad de conocer su secuencia (Berta et al., 1990) y son capaces de identificar entre el 30 y 70% de todos los polimorfismos debidos a una mutacin simple (Larsen y Nielsen, 1992). Su deteccin se lleva a cabo en un gel de acrilamida en condiciones no desnaturalizantes. Los primer pueden estar radiaoctivamente marcados, o puede realizarse la deteccin de los productos amplificados por tincin con plata y siempre deben incluirse muestras controles para identificar el tipo salvaje del mutado (Figura 7).

Figura 7: Monitoreo de una mutacin por anlisis de SSCP. El Exon 3 del gen CFTR gene se amplific por PCR partiendo de ADN genmico de 9 individuos no relacionados entre s y se incluyeron 6 muestras controles que contenan la mutacin en dicho exn. El ADN de conformacin simple migra ms lentamente en el mismo gel (panel superior). SSCP es simple y adecuadamente sensible para fragmentos de hasta 200pb de longitude, y han sido utilizados en la identificacin de variantes allicas de las protenas lcteas (Barroso et al., 1999a y b, Prinzenberg et al., 1999; Klauzinska et al., 2001) as como en estudios de expresin de ellas (Robitaille y Petitclere, 2000), pero para el desarrollo de esta metodologa se requiere una amplia batera de oligonucleotidos que encarece su utilizacin.

2.2.5. Polimorfismo de longitud de los fragmentos amplificados (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) Consiste en la amplificacin de mltiples regiones arbitrarias del gnoma (Vos et al., 1995). Se basa en la amplificacin arbitraria de fragmentos de restriccin de ADN ligados a adaptadores: se utilizan cebadores semiespecficos con secuencia complementaria al adaptadpr en el extremo 5. Involucra cuatro etapas: digestin con dos enzimas de restriccin, una de corte raro (reconoce secuencias de 6pb) y otra de cirte frecuente (reconoce secuencias de 4pb); acoplamiento de adaptadores especficos de doble cadena a los extremos de los fragmentos de restriccin; amplificacin selectiva de fragmentos con cebadores especficos y separacin de los fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida (figura 8). Se pueden utilizar varios mtodos para revelar elpatrn de bandas: empleo de istopos radiactivos, fragmentos biotinilaos y la tincin con nitrato de plata. Mediante la seleccin del nmero de nucleotidos selectivos es posible controlar el nmero de fragmentos a amplificar, en una relacin inversamente proporcional. El polimorfismo es detectado por la presencia o ausencia de bandas debido a mutaciones en los sitios de restriccin o en secuencias adyacentes a estos, los cuales se complementan o se diferencian de los nucleotidos selectivos aadidos a los cebadores de la PCR, y por inserciones o delecciones dentro del fragmento amplificado (Savelkoul et al., 1999). Tiene como ventajas que se obtiene un alto grado de polimorfismo, un mayor nmero de marcadores por gel analizado y no requiere del conocimientode la secuencia de ADN. Dedido a la cantidad de marcadores que pueden ser generados, el mapero gentico puede realizarse con mayor rpidez y ms fcilmente. Es una tcnica para estudios de biodiversidad. Comparado con RFLP es ms rpido, menos laborioso y provee mayor informacin. Revela fundamentalmente el polimofismo dominante, que puede ser por la presencia o ausencia del sitio de restriccin o por un simple variacin de un n ucleotido en el genoma (Cornide et al., 2002). Los marcadores AFLP pueden ser aislados del gel y usarlo como sondas para caracterizar nuevos clones, o secuenciarlos para disear cebadores y emplearlos en otras tcnicas basadas en PCR.

Figura 8. Representacin esquemtica de AFLP 2.2.6. Deteccin de los SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) Se consideran la ms reciente generacin de marcadores moleculares, basados en la identificacin de la sustitucin de un nucletido por otro, representando solamente dos alelos simples. Ellos incluyen la tcnica clasica de RFLPs pero no exactamente detectando la aparicin o abolicin de un sitio de restriccin. Constituye una ventaja el hecho de que puedan ser detectados sobre "arrays" de fase slida sin necesidad del empleo de electroforesis en geles (Rafalski, 2002). El mtodo ms directo para detectarlos es la secuenciacin de segmentos de ADN, previamente amplificados por PCR, de varios individuos que representen la diversidad de la poblacin. Se disean cebadores para amplificar fragmentos de ADN de 400-700pb, derivados fundamentalmente de genes de inters o de secuencias reportadas en bases de datos correspondientes a secuencias expresadas (expressed sequence tag, EST). Los productosamplificados se secuencian en ambas direcciones y sus secuencias se comparan en busca de polimorfismos (Cornide et al., 2002)

La mayora de los mtodos de deteccin de SNPs se basan en la amplificacin usando "multiplex"de una secuencia diana y la hibridacin con oligonucltidos anclados al "array", cada uno de los cuales est terminado en un nucleotido polimrfico. Un paso sencillo de extensin del primer se lleva a cabo sobre el "array", usando una mezcla de cuatro dideoxinucleotidos marcados con fluorescencia. Las marcas se adicionan a los cebadores que se unen perfectamente al ADN, no siendo as con aquellos que no lo hacen en el extremo 3. La lectura de la presencia o ausencia de flourescencia en el "array" permite obtener el tipo de cada SNP sobre el "array". Cualquiera de los cuatro nucleotidos puede estar presente en cualquier posicin en el genoma, por lo tanto se debe suponer que cada SNP tendra cuatro alelos. Tericamente esto es posible, pero en la prctica la mayora de los SNP tienen solamente dos variantes, la secuencia original y la versin mutada. Esto se debe a la va en que estos aparecen y se distribuyen en una poblacin. Un SNP se origina cuando una mutacin puntual ocurre en el genoma, convirtiendo un nucleotido en otro. Si la mutacin ocurre en las clulas reproductivas de un individuo, pudiendo ser heredada por uno ms descendientes y despus de muchas generaciones, el SNP puede establecerse en la poblacin. Para que se produzca un tercer alelo, una nueva mutacin debe ocurrir en la misma posicin en el genoma de otro individuo, y este individuo y su descendencia deben reproducirse de forma tal que el nuevo alelo quede establecido. Esto no es imposible, pero es poco probable, por lo tanto la mayoria de los SNP son bialelicos. Los SNP pueden aparecer tanto en regiones fuera de los genes (que no afecten la produccin o funcin de alguna protena) como en un gen especfico, donde pueden ubicarse en regiones codificantes (relacionados con cambios en la cantidad de protena producidas) o no codificantes (que afectan solo la secuencia de aminocidos. Estos han sido empleados como marcadores para el diagnstico de rasgos especficos (Jordan y Humphries, 1994) por ser abundantes en el genoma bovino (Heaton et al., 2002), genticamente estables (Markovstka et al., 2000) y de anlisis fcilmente automatizable (Lindblan-Toh, 2000), lo que ha permitido adems, su utilizacin como marcadores para la identificacin animal y pruebas de paternidad en ganado bovino (Heaton et al., 2002). Precisamente la necesidad de la automatizacin, sin la cual sera muy engorrosa la aplicacin de esta metodologa, por una parte simplifica el anlisis, pero en nuestras condiciones lo encarece.

3. Criterios para seleccionar el tipo de tcnica.

La seleccin de la tcnica depende del objetivo trazado. Las tcnicas moleculares brindan informacin a diferentes niveles taxonmicos. Todas tienen sus limitaciones y su aplicacin estar

determinada en gran medida, por la informacin que estamos buscando con la utilizacin de un sistema de marcadores moleculares, as como la disponibilidad de recursos necesarios para el desarrollo de este tipo de tcnicas. Entre los factores ms importantes a considerar se encuentran el contenido de informacin y el radio mltipleque cada tcnica puede brindar. El contenido de informacin refleja el nmero de alelos que pueden ser detectados por el marcador en un nmero e individuos. El radio mltiple lo constituyen el nmero de marcadores que pueden ser generados por una reaccin simple (Breyne et al., 1997). La seleccin del mtodo depende de la aplicacin especfica que se desea. Si el objetivo es identificar el genoma o evaluar la diversidad gentica, los mtodos con radio mltiple de elevado o alto volumen (ej. AFLP), son apropiados debido a que pueden ser detectados muchos loci distribuidos al azar po el genoma. Este tipo de marcadores tambin son muy tiles en anlisis genotpicos y taxonmicos para construir mapas genticos y para identificar marcadores unidos a un caracter en particular. Para varios aspectos de la biologa poblacional (anlisis de paternidad, flujo de genes, etc.) y mejoramiento gentico, los mtodos con alto contenido de informacin son ms tiles (Cornide et al., 2000).

4. Algunas aplicaciones moleculares en ganadera

de

los

marcadores

El incremento demogrfico, el aumento de los ingresos y la urbanizacin muestran actualmente un notable crecimiento de la demanda de alimentos de origen animal en los pases en desarrollo: la "revolucin ganadera". En el pasado estos pases hicieron frente a los aumentos de la demanda principalmente ampliando sus poblaciones de ganado. Sin embargo, la reduccin de la superficie de tierras disponible para la poblacin agrcola los obliga ahora a intensificar su produccin ganadera, y los animales monogstricos, cerdos y sobre todo aves de corral, constituyen hoy la fuente ms importante de crecimiento del sector ganadero. La importancia de las enfermedades animales como principal obstculo para el aumento de laproductividad de la ganadera crecer considerablemente, al intensificarse la produccin animal y a crecer la densidad pecuaria en zonas ecolgicas ms clidas y hmedas. La aplicacin de la biotecnologa del ADN a la salud animal, mediante vacunas ms eficaces, baratas y resistentes combinadas con mejores instrumentos de diagnstico, podra contribuir en medida importante a mejorar el control de las enfermedades, estimulando as la produccin nacional de alimentos y la participacin en el comercio ganadero. La biotecnologa ofrece tambin considerables posibilidades de mejorar la elaboracin de productos agroindustriales, sobre todo mediante procesos inocuos para el medio ambiente y de elevado

rendimiento energtico. Aunque probablemente la mayor parte de estas tecnologas no estarn al alcance de la produccin pecuaria tradicional, resultarn considerablemente accesibles para el sector comercial e industrial emergente de muchos pases en desarrollo (FAO, 2000). La biotecnologa se est utilizando en diversos campos de la produccin y sanidad animal. Entre sus principales aplicaciones en ganadera se encuentran la identificacin y chequeo de parentesco, la contruccin de mapas genticos, el desarrollo de nuevos tratamientos de enfermedades. Los marcadores moleculares constituyen hoy una herramient moderna y poderosa para el viejo arte de la seleccin (Cornide et al., 2000). Entre sus aplicaciones ms inmediatas se encuentran la identificacin de parentesco o de identidad y la caracterizacin de la diversidad gentica. En pases de alto desarrollo ganadero y especialmente en especies de inters econmico, especficamente en vacunos y equinos, la identificacin gentica y el obligado establecimiento de pruebas de paternidad, queda lejos de cualquier duda como argumento para la fiabilidad y credibilidad de loslibros genealgicos en las distintas razas (Zaragoza et al, 1994). En esos pases, todo aquel que se dedique directa o indirectamente a la seleccin ganadera, debe aceptar el anlisis de conformidad. En vacunos, cerdos y caballos principalmente, el control de parentesco se ha realizado de forma rutinaria en la mayora de los pases mediante la metodologa de grupos sanguneos y polimorfismos bioqumicos, dirigida su estandarizacin por laSociedad Internacional de Gentica Animal (ISAG). En Europa, desde hace ms de una dcada, la legislacin acerca del tema exige la obligatoriedad de acompaar todos los registros e intercambios de material gentico vivo, semen o embriones, con documentos que acrediten la veracidad y contrastacin de paternidad del mencionado material gentico. Estos mtodos clsicos de polimorfismos bioqumicos y grupos sanguneos presentan limitaciones, debido a que estos representan del 5 al 10% del genoma, no se detectan mutaciones silenciosas, se requieren tcnicas especficas para cada marcador y la exclusin de paternidad solo suele llegar al 95% si el nmero de marcadores es elevado (Ferreira y Grattapaglia, 1995). La ISAG, en la XXIII Conferencia Internacional sobre Gentica Animal, decidi el estudio y estandarizacin de las tcnicas de anlisis de ADN para su posible uso futuro en las pruebas de paternidad (http://www.inmgen.com), sobre todo de microsatlites, debido a las caractersticas que los han convertido en marcadores de eleccin para este tipo de estudios (Craighead et al., 1995; Schnabel et al., 2000). Estos marcadores constituyen una herramienta fundamental en la construccin de mapas genticos (Todd, 1992). Dichos mapas, adems de

su indudable inters cientfico, son herramientas fundamentales para la identificacin y aislamiento tanto de genes responsables de enfermedades como otros de inters econmico (ej. QTLs)(Rodrguez-Zas et al., 2002) para posteriormente utilizar esta informacin en programas de mejoramiento animal a travs de la llamada Seleccin Asistida por Marcadores (Marker Assisted Selection, MAS). Grisat et al., (2002) y Brunner et al., (2003) entre otros, han desarrollado metodologas para la identificacin de QTL en bovinos. En esta ltima lnea de aplicacin utilizando marcadores ligados a genes mejoradores, se puede aumentar la eficiencia de la seleccin en la medida en que estos se introduzcan en los programas de seleccin. Esto a su vez facilita el aislamiento de genes o grupos de genes para la obtencin de animales transgnicos. El esfuerzo realizado a nivel mundial para la construccin de los mapas genticos de distintas especies est dando sus frutos en la actualidad, ofreciendo hoy verdaderas aplicaciones prcticas, tanto en el campo de la salud como en el productivo e industrial. En la especie humana (Weissenbach et al., 1992) y en el ratn (Dietrich et al., 1992), se utilizaron secuencias annimas de microsatlites para la construccin de mapas con una distancia media entre marcadores consecutivos de 5cM. En ratas, se public un mapa compuesto exclusivamente por microsatlites asociados a secuencias codificantes (Serikawa et al., 1992). En la especie bovina, se estim que se necesitara un mnimo de 150-200 marcadores para construir un mapa de 20 cM de resolucin (Lange y Boehnke, 1982; Steele y Georges, 1991). En la actualidad se ha pasado de la asignacin de los genes con herencia mendeliana a grupos de ligamiento, mediante cruces de estirpes de ratones con fenotipos mutantes, a las nuevas tecnologas como el "clonaje posicional" o "gentica inversa", en el que una vez encontrado un marcador asociado a una enfermedad, se busca el gen responsable de ella (Takeda et al.,2002), y al "clonaje funcional", basado en el conocimiento previo de la basebioqumica de la protena o enzima causante, por ejemplo, de una enfermedad, para posteriormente localizar el gen (Collins, 1992; Permyakov et al.,2001). De esta forma, en la especie humana se han encontrado los genes responsables de la anemia falciforme (Saiki et al., 1985), la distrofia muscular de Duchenne (Chamberlain et al., 1988), y la fibrosis qustica (Estivill et al., 1989), entre otros. A pesar de que este campo no se encuentra tan desarrollado en las especies productivas, este tipo de metodologa tambin se ha utilizado. Un ejemplo es la deteccin del gen responsable de la acondroplasia en bovinos (Takeda et al., 2002). Una vez conocido, se ha realizado un test mediante PCR que permite identificar la enfermedad en cualquier muestra que contenga ADN.

Otro ejemplo lo representa el conocido sndrome BLAD (Bovine Leucocite Adhesion Deficience) o "LAD bovine" (Kehrli et al., 1992) que ha sido propagado por la utilizacin del semen de un semental canadiense portador de la enfermedad. Esta se debe a un defecto de la expresin de la protena CD18 causado por una mutacin en el gen que origina una alteracin en eltransporte de los leucocitos desde la sangre a los lugares de infeccin (Smith et al., 1989; Shuster et al., 1992). El mtodo de diagnstico desarrollado por Kehrli et al., (1992a), consiste en la amplificacin especfica de un fragmento del gen CD18 mediante la tcnica de PCR (Tammen et al., 1996; Zsolnai y Fess, 1996; Mukhopadyaya et al., 2000). En el campo de la sanidad animal se han utilizado estas metodologas moleculares en el desarrollo de nuevos tratamientos de enfermedades, en la creacin de vacunas como la de la fiebre aftosa, primer producto de la biologa molecular, la de la tuberculosis bovina (Buddle, 1996) o de la brucelosis bovina (Al-mariri et al., 2002), as como en la creacin de anticuerpos monoclonales (utilizados en vacunas y tratamientos), inmunoglobulinas, etc. Pero no solo se han aplicado en lo relacionado con la salud veterinaria, sino tambin en lo referente a los aspectos que influyen en la produccin ycalidad de la leche, sobre todo en el ganado bovino. De los resultados obtenidos investigaciones realizadas en ganado bovino autctono cubano para determinar la estructura gentica de los loci de lasprotenas lcteas y de los microsatlites se han identificado tres elementos fundamentales en los que se puede resumir la importancia de ese trabajo(Uffo, 2003): En primer lugar, se identific un grupo de alelos que pueden ser utilizados como marcadores raciales de las poblaciones estudiadas, tanto para las protenas lcteas como para 30 loci microsatlites recomendados por FAOISAG para estudios de biodiversidad, que no han sido descritos en laliteratura consultada, distribuidos en las tres razas cubanas, permitir contar con un perfil allico especfico para cada raza. Estos resultados son de gran utilidad para los genetistas y los criadores de ganado bovino. El hecho de que en cada una de las razas cubanas existan alelos "nicos", es un elemento importante para la realizacin de estudios de caracterizacin racial, que permitirn discriminaciones entre individuos de una raza u otra. Aqu los genetistas tiene una herramienta para la planificacin de los cruzamientos entre razas, el diseo de nuevos cruzamientos y laevaluacin de la seleccin gentica, por la identificacin de alelos caractersticos de Bos indicus, que pueden estar asociados con caractersticas deresistencia. En segundo lugar, se tiene la gran diversidad gentica en tres poblaciones cubanas analizadas, de suma importancia para la ganadera cubana. El

Criollo de Cuba, ganado autctono cubano, descendiente de los primeros bovinos introducidos en el pas en pocas de la colonizacin, en cuyo genofondo hay valiosa informacin acerca de los procesos de adaptacin al ambiente tropical y de produccin en condiciones difciles. En cambio el Ceb cubano, es la base gentica que ha aportado la resistencia a las nuevas razas cubanas que contienen sus genes y que se sigue usando como genotipo de resistencia al ambiente tropical. Por su parte, el Siboney de Cuba es una raza sinttica en la cual se combinan las caractersticas productivas del ganado Holstein y las de rusticidad del Ceb. Los valores de los indicadores utilizados para la caracterizacin poblacional evidencian una elevada variabilidad en cada una de las razas cubanas estudiadas, lo que permite a los genetistas manejar adecuadamente esta informacin para ser utilizada al trazar estrategias de cruzamientos y programas de mejora gentica, as como en el mantenimiento y conservacin de la diversidad gentica. Como tercer elemento de inters, est la confirmacin de la estrecha relacin del Criollo de Cuba con algunas razas espaolas. La menor distancia gentica encontrada entre el Siboney y el Criollo es una evidencia de que comparten genes de la misma especie (Bos taurus) aunque provenientes de razas diferentes. Esto constituye una informacin til si se trata de investigar las relaciones de nuestro ganado con sus ancestros, sobre todo del ganado Criollo. En este caso, la confirmacin de la cercana filogentica con las razas Asturianas y Morenas permite corroborar las rutas de migracin de los colonizadores hacia Amrica, pues dichas razas estn ubicadas geogrficamente en zonas donde entonces se encontraban los principales puertos de navegacin de la pennsula. Nuestros resultados contribuyen tambin a corroborar la composicin gentica de las razas espaolas que se utilizaron como material de referencia (Martin-Burriel et al., 1999). Este anlisis filogentico ofrece tambin la posibilidad de la realizacin de estudios de la biodiversidad del ganado bovino cubano, al permitir la comparacin de sus genofondos propios con otros de la regin y de Europa. Adems de estos tres elementos fundamentales, la utilizacin de las tcnicas moleculares en la ganadera cubana tiene otras posibilidades de aplicaciones. Tanto las protenas lcteas como los microsatlites, se estn haciendo cada vez ms imprescindibles en la caracterizacin de animales valiosos ya sea por su desempeo productivo o porque se presuma que contengan en su genoma combinaciones de genes difciles de reproducir en un futuro. Una aplicacin actual muy importante en nuestra ganadera es la seleccin de individuos para el programa de fertilizacin in vitro y clonacinbovinas. Por estos mtodos moleculares es posible hoy en Cuba, identificar los genotipos que portan los animales preseleccionados por sus caractersticas

productivas y recomendar que sean seleccionados finalmente o rechazados por su valor gentico. Tambin, conociendo los patrones allicos de los individuos que se seleccionen, es posible realizar una comparacin individual (identificacin de individuos) una vez que se obtenga la descendencia clonada, incluso en edades tan tempranas del desarrollo como en el embrin. De hecho, algunos de los animales incluidos en esta investigacinpertenecen al grupo de las madres de sementales de la raza Siboney que han sido preseleccionas para ser donantes de clulas para la clonacin y/o fertilizacin in vitro. Este es un elemento que contribuye en gran medida a incrementar la eficiencia en la seleccin de los individuos y a la utilizacin de la amplia gama de recursos necesarios para estas investigaciones. Otra de las aplicaciones inmediatas que tiene la utilizacin de estos marcadores, es la determinacin de paternidad en ganado bovino con unaprobabilidad de exclusin del 99% (Osta, 1993). Estos mtodos son relativamente costosos si se comparan con los tradicionales de grupos sanguneos, pero estn plenamente justificados si se trata de animales valiosos. En esta categora de animales valiosos se pueden incluir las donantes de clulas parala clonacin o los sementales para la fertilizacin in vitro, de los cuales, en algunos casos, ya se cuenta con sus genotipos, por lo que se pueden utilizar como referencia e incluso, como controles positivos. Tambin es posible la introduccin a mediano plazo, de la seleccin asistida por marcadores para la produccin de leche en los programas de mejora, dado que en las tres razas se identificaron alelos que se describen con efectos que favorecen una mejor composicin de la leche. Este aspecto es importante pues, si bien es cierto que el pas est necesitado de incrementar la produccin de leche, esta debe ser una leche con adecuada calidad. La determinacin de los genotipos de las protenas lcteas contribuir tambin a reducir los intervalos entre generaciones al brindar la posibilidad de seleccin en edades muy tempranas de desarrollo y en ambos sexos. Los costos se pueden reducir utilizando eficientemente los recursos e insumos de que dispone nuestra ganadera para el mantenimiento de los animales que potencialmente pueden ser mejores para la produccin de leche, mediante laintegracin del comportamiento reproductivo, sanitario y de manejo.

5. Glosario
ADN Acido desoxirribonucleico, es la fuente de informacin gentica para todas las actividades celulares durante toda la vida de la clula o del organismo. Es una molcula formada por una doble hlice de dos cadenas complementarias de polmeros de bases nitrogenadas que se han denominado: adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G) y que se

unen a un esqueleto de azcares y fosfatos, siendo el material constituyente de los genes en los cromosomas. Alelo Una de las dos alternativas en que puede manifestarse un gen en un cromosoma. Forma particular de un gen de un locus especfico. Oligonucleotido alelo-especfico (ASO) Oligonucleotido sinttico, a menudo de alrededor de 20 bases de longitude, el cual hibrida con una secuencia blanco especfica y cuya hibridacin puede verse afectada por werrores de acoplamiento bajo condiciones cuidadosamente controladas. A menudo estn marcados y se usan como sondas para hibridacin especfica. Annealing Asociacin de cadenas complementarias de AND o ARN para formar una doble hlice. ANTICUERPO MONOCLONAL Anticuerpos estructuralmente idnticos que reconocen nicamente un tipo de antgeno. ANTICUERPO Protena de gran especificidad producida por el sistema inmune en respuesta a una inmunizacin o invasin del cuerpo por algnmicroorganismo. Estas protenas reciben el nombre de inmunoglobulinas. ARN Acido ribonucleico. Permite la transmisin de informacin gentica codificada en el ADN, especificando el orden de los aminocidos en una protena. Biotecnologa Utilizacin de organismos vivos en procesos industrials. CEBADOR (ver oligonucleotido). Oligonucleotido que se utiliza para iniciar la reaccin de PCR. Su especificidad depende de la homologa de su secuencia con la regin flanqueante de aquella que se quiere amplificar. Cdigo Gentico Su fuente de informacin es la secuencia de bases. Cromosomas Formados por una molcula de ADN, asociados a protenas pequeas. Se localizan en el ncleo de la clula. CHIPS DE DNA. Dispositivo miniaturizado, del tamao de un portaobjetos de microscopio, que contiene impresos miles de fragmentos de DNA. Estos fragmentos pueden llegar a representar el genoma completo. Desnaturalizacin Disociacin de las cadenas complementarias para dar cadenas simples de AND o ARN. DNA fingerprinting Mtodo que produce un patrn de bandas de hibridacin (huella gentica) en Southern blot que pueden usarse para laidentificacin individual

DNA MICROSATLITE Secuencias (fragmentos) de ADN de pequea longitud que se encuentran muy repetidas en determinadas regiones del genoma de las clulas eucariotas y cuya funcin es por el momento desconocida. Las variaciones que se observan en el nmero de repeticiones sirven para diferenciar a dos individuos de la misma especie. Dominancia Efectos genticos debidos a interacciones entre aelos dentro de un locus. Por ejemplo, cuando hay dominancia completa, los genotipos que contienen una o dos copias del alelo dominante tienen el mismo fenotipo. ENZIMAS Un grupo de protenas que realizan una determinada funcin con actividad cataltica que favorece la reaccin de dos molculas o compuestos para dar lugar a una tercera molcula diferente. Expressed sequence tag (EST) Secuencia corta de cDNA parcial (generalmente de 100 300 bp) Gametos Clulas reproductivas, vulos y espermatozoides Gen Es una secuencia de bases de ADN que contiene la informacin para sintetizar una cadena polipeptdica especfica o un polmero de aminocidos que conforman una protena. Unidad fundamental fsica y funcional de informacin gentica o de la herencia. Se localizan linealmente en los cromosomas y se calcula que en los genomas de animales superiores existen de 50 000 a 100 000 genes funcionales. Genoma Todo el material gentico presente en una clula de un organismo. Genotipo Conjunto de genes contenido en cada uno de los ncleos de las clulas de un individuo. Heterocigtico Se origina por la unin de gametos que difieren respecto a la clase, cantidad o disposicin de sus genes. Se usa generalmente respecto a diferencias gnicas particulares. Homocigtico Derivado de la unin de gametos idnticos respecto a la clase, cantidad y disposicin de sus genes o de parte de ellos. INMUNOGLOBULINA (ver anticuerpo). Protenas producidas por los linfocitos B del sistema inmune. Tambin llamadas anticuerpos. Loci Plural de locus. Locus Posicin ocupada por un gen en un cromosoma en relacin con su orden lineal. Marcadores Puntos de referencia en los cromosomas que evidencian rasgos de variabilidad gentica. Son cualquier fenotipo molecular oriundo de un gen especfico. Son secuencias de ADN o de protenas

polimrficas derivadas de una ubicacin cromosmica simple. Si cumplen con las leyes bsicas de la herencia de Mendel son Marcadores Genticos. MOLCULA Compuesto qumico formado por la reaccin de varios elementos qumicos. Mutaciones Fuente de variabilidad gentica de la poblacin. Pueden o no generar cambios en la secuencia de protenas que codifican los genes y por supuesto afectar o no las funciones de los organismos. NUCLETIDO Son las unidades bsicas del DNA. Hay 4 nucletidos: adenosina (A), guanosina (G), citosina (C) y timidita (T). Cada uno de ellos esta constituido por una molcula de desoxirribosa a la que se une un grupo fosfato y una base nitrogenada. OLIGONUCLETIDO (ver tambin cebadores). Una cadena corta de nucletidos. Se suelen obtener por sntesis qumica. Punto de mutacin Mutacin originada por una pequea alteracin en la secuencia de ADN en un locus POLIMERASA (DNA polimerasa). Enzima responsable de la sntesis del DNA por "polimerizacin" de nucleotidos en cadenas de tamao variable. Polymorfismo (1) Estrictamente, la existencia de dos o ms variants (alelos, fenotipos, variants de secuencias, variants de estructurascromosmicas) en una frecuencia de aparicin significativa en una poblacin. (2) Cualquier variante de secuencia presente en una poblacin con una frecuencia >1%, (3) cualquier variante de secuencia no patognica, independientemente de su frecuencia de aparicin. Puede estar originado por una mutacin en un gen, donde la nueva forma del gen o alelo se hereda en la misma manera que el gen original. Primer (cebador) oligonuclotido corto, de a menudo 15-25 bases de longitude, los cuales se unen especficamente a una secuencia blanco para permitir que una polimerasainicie la sntesis de una cadena complementaria. Sonda Fragmento de ADN o ARN conocido (o una coleccin de diferentes fragmentos conocidos) los cuales se usan en los ensayos de hibridacin para identificar secuencias de ADN o ARN muy relacionadas (molcula "blanco" o "diana") Protenas Productos de los genes. QTL Loci de efecto cuantitativo, son genes con efectos mayores en caractersticas afectadas por muchos loci con efectos generalmente pequeos (poligenes), importantes en la determinacin de caracteres continuos

ADN repetitivo Secuencia de ADN que se presenta en muchas copias idnticas o similares en el genoma. Las copias pueden estar repetidas en grupos (tandem) o dispersas por el genoma. Estructura secundaria Regiones de cidos nucleicos de cadena simple o molculas de protenas o polipptidos donde ocurren enlaces qumicos entre nucleotidos SNP (single nucleotide polymorphism) Cualquier variacin de un nucleotido simple. SNPs incluyen RFLPs y otros polimorfismos que no alteren ningn sitio de restriccin. Aunque menos informativos que los microsatlites, los SNP son mas factibles para monitoreos automatizados y a grandes SSCP o SSCA Polimorfismo o anlisis de conformacin de cadena simple, mtodo comnmente utilizado para elmonitoreo de mutaciones puntuales. TERMOCICLADOR Instrumento computerizado que permite calentar o enfriar de forma controlada una mezcla de sustancias reactivas. Con este instrumento se lleva a cabo la produccin de mltiples copias (amplificacin) del ADN mediante la reaccin de la polimerasa en cadena (PCR), por lo que a los termocicladores se les denomina coloquialmente PCRs. Transcripcin La informacin gentica contenida en el ADN es copiada al ARN mensajero (ARNm).