Manual da Oficina Prtica de Gentica, Genoma e Biotecnologia

Transformao de bactrias - pGLO

cpia esto reservados DNA goes to School, Inc. 2004
O fenmeno conhecido como transformao bacteriana de importncia central na biologia molecular. Por esse processo possvel a introduo de plasmdeos carregando genes de outros organismos (plasm[ideos so pequenas molculas de DNA circular) fabricados ou naturais dentro das bactrias, que podem ento expressar etes genes. O processo de transformao involve a introduo de DNA exgeno (que no pertence a bactria) nas clulas bacterianas e este DNA passa ento a fazer parte do material gentico da bactria, podendo ser herdado pelas novas clulas todas as vezes que a bactria se multiplicar. Atravs da manipulao gentica podemos criar um carter presente na bactria que passar a ser hereditrio. No entanto, para permitir a entrada de DNA plasmidial nas clulas bacterianas as bactrias devem apresentar condies fisiolgicas especiais. Este estado fisiolgico especial chamado de competncia. Uma bacteria competente uma bacteria que est apta a receber DNA exgeno. A competncia pode ocorrer naturalmente ou pode ser produzida atravs de diferentes tcnicas. Estas tcnicas envolvem tratamento com cloreto de clcio e mudanas bruscas de temperatura. Os ons de metal e as mudanas bruscas de temperatura alteram a permeabilidade da parede celular fazendo com que estas clulas permitam a entrada de DNA exgeno atravs da membrana celular. As bactrias competentes so bastante frgeis e devem ser manusiadas com cuidado. A quantidade de clulas transformadas por 1 micrograma de DNA chamada eficincia da transformao. Na prtica pouca quantidade de DNA usado (5 a 100 nanogramas) uma vez que muito DNA pode inibir a transformao. Muitos plasmdeos servem como instrumentos teis para o bilogo molecular. Um exemplo o pGLO. Este plasmdeo foi modificado por tcnicas de engenharia gentica (veja a figura do mapa circular do pGLO no final desta apostila). Na clula, este plasmdeo no se junta ao cromossomo bacteriano e se replica independentemente. Modificaes neste plasmdeo incluem adio do gene GFP (Green Fluorescent Protein) obtido da gua-viva Aequora victoria. Este gene produz uma protena florescente visvel quando submetida luz utra-violeta. Contedo deste mdulo Transformao bacteriana Clonagem gnica Operon ARA Expresso gentica

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A presena da protena GFP (produzida pelo gene GFP) faz com que a colnia da bactria que tem em seu interior este plasmdeo seja florescente. Quando adicionamos um fragmento de DNA dentro do plasmdio (que pode at mesmo ser um gene humano) fazemos atravs de uma reao chamada de ligao. Antes da reao de ligao cortamos o DNA circular do plasmdeo com uma enzima de restrio e utilizamos a mesma enzima de restrio para cortar o fragmento de DNA exgeno que pretende-se introduzir no plasmdeo. Assim, tanto plasmdeo como fragmento de DNA iro possuir o que chamamos de extremidades coesivas, ou seja, as extremidades dos fragmentos de DNA e do plasmdeo so complementares. O stio de restrio da enzima utilizada para cortar o plasmideo se localiza exatamente na regio onde est o gene que codifica a protena GFP. Assim, quando o plasmideo cortado e introduzimos um fragmento de DNA exgeno nesta regio, o gene que produz a protena GFP destrudo. As colonias de bactrias que possurem o plasmideo com o gene GFP intacta em seu interior iro produzir colonias florescentes enquanto as colonias de bactria que possuirem o plasmideo que teve ogene GFP destrudo iro prodizir colonias brancas. As bactrias utilizadas neste experimento no possuem este gene, sendo assim, na falta do plasmdeo contendo este gene, as bactrias iro produzir colnias brancas. Geralmente o cientista est interessado nas colnias brancas, pois indica que o gene exgeno de interesse foi introduzido no plasmdeo no mesmo local onde antes se encontrava o gene GFP. Todo esse processo de ligao de um gene dentro de um plasmdeo e subsequente introduo do mesmo em outros organismos como bactrias e leveduras chamado de clonagem molecular, ou clonagem gnica. Outro importante instrumento utilizado em experimentos de clonagem o antibitico. As bactrias utilizadas neste experimento no so resistentes ao antibitico ampicilina. No entanto o plasmdeo utilizado possui o gene de resistncia ampicilina. Deste modo apenas as bactrias possuindo plasmdeos em seu interior iro ser resistentes ampicilina. As que no possuem o plasmdeo iro morrer na presena da ampicilina e deste modo no formaro colonias na placa de agar. No laboratrio de pesquisa, o cientista utiliza o mtodo cientfico para obter respostas s suas perguntas. Para cada pergunta feita pelo cientista, deve haver pelo menos uma resposta obtida atravs de resultados de experimentos. De modo geral, experimentos de clonagem e transformao em bactrias utilizam dois marcadores de modo que o cientista possa responder duas perguntas. O cientista est interessado em saber se (1) obteve sucesso na introduo de plasmdeos dentro da bactria e caso positivo, (2) que tipo de plasmdeo existe dentro da bactria em questo -plasmdeos contendo o gene GFP intacto ou plasmdeos contendo o gene de interesse. Nesta aula iremos observar como podemos transferir um plasmdeo contendo um gene de um organismo (agu-viva) para outro organismo (bactria).

Alm dos genes GFP e bla (que confere resistncia ampicilina), o plasmdeo pGLO contm tambm um outro gene, chamado Ara-c. A presena deste gene no plasmdeo pGLO permite o controle da expresso do gene GFP, j que o gene GFP s ativado quando o gene Ara-c tambm ativado. A ativao do gene Ara-c controlada pela presena de um nutriente especfico no meio de crescimento da bactria. Este nutriente a aucar arabinose. Na presena de arabinose, o gene Ara-c ativado, ativando tambm o gene GFP. Assim, quando a arabinose adicionada ao meio, as colnias de bactrias so florescentes devido a ativao do gene GFP. Na ausncia de arabinose as colnias sero brancas, porque o gene GFP no ser ativado. A linhagem de bactria usada neste experimento no possui em seu DNA o gene Ara-c. No entanto, muitas bactrias possuem normalmente este gene, o que permite que as mesmas possam crescer em meios contendo arabinose, que usada como fonte de energia. Outros aucares que podem ser utilizados pela bctria so a maltose e galactose. Em bactrias, a arabinose catalisada por um grupo de genes, que so ativados apenas quando h arabinose no meio nutritivo da bactria. Este sistema composto de vrios genes, que so ativados ou no dependendo da presena de nutrientes especficos (neste caso arabinose) chamado de operon. Operons so grupos de genes dispostos em sequncia e transcritos por uma nica fita de RNA mensageiro. O operon AraC possui 3 genes estruturais e um gene regulador que regula a transcrio dos outros. Quando h arabinose no meio onde est inserida a bactria, o gene regulador permite a transcrio dos outros genes de modo que seja permitida a utilizao da arabinose. Quando no h arabinose no meio, a gene regulador inibe a transcrio dos genes do operon arabinose. Este mecanismo garante que os genes necessrios para o metabolismo de arabinose s sejam transcritos na presena da mesma, de modo que no haja desperdcio de energia com a produo de genes desnecessrios para a sobrevivncia da bactria.

Franois Jacob e Jacques Monod

Foi atravs da descoberta de um outro sistema bacteriano conhecido como peron Lac que os cientistas obtiveram as primeiras pistas de como os genes so regulados. O Operon Lac, descoebrto em 1959 pelos cientistas do Instituto Pasteur Fanois Jacob e Jaques Monod, revelou que os genes podem ser controlados por um outro grupo de genes, chamados genes reguladores.

ATIVIDADE DE LABORATRIO Preparao para transformao (por grupo) 1) Em um tubo eppenddorf escreva DNA+. Em outro tubo escreva DNA-. Escreva o nome de seu grupo nos dois tubos. 2) Usando uma pipeta plstica estril descartvel, transfira 250ul da soluo de transformao (CaCl2) para cada tubo. 3) Coloque os tubos no gelo 4) Usando uma ala estril, pegue uma colnia isolada da placa inicial preparada por seu instrutor. Adicione esta colnia no tubo escrito DNA+, mergulhando a ala no tubo. Usando uma nova pipeta, adicione uma colnia no tubo escrito DNA-. Tenha cuidado para adicionar apenas 1 colnia (veja figura).

5) Examine a soluo contendo o plasmdio pGLO DNA na luz UV. O que voc observa? 6) Imerse uma nova ala estril no tubo estoque de plasmdios. Retire a ala e veja se h um filme de soluo na ala. Adicione a ala SOMENTE ao tubo escrito +DNA. No adicionar ao tubo escrito -DNA. 7) Coloque os tubos no gelo por 10 minutos. 8) Enquanto os tubos esto no gelo, identifique as quatro placas de agar, marcando no fundo da placa (no marque na tampa da placa-veja a figura) LB-amp +DNA LB-amp-ara +DNA LB-amp -DNA LB -DNA

Procedimento para a transformao

1) Coloque os tubos marcados +DNA e -DNA a 420C por EXATAMENTE 50 segundos 2) Coloque os tubos de volta no gelo por 2 minutos 3) Remova os tubos do gelo e deixe temperatura ambiente. Usando uma pipeta estril, adicione 250ul de meio LB cada um dos dois tubos. Deixe a temperatura ambiente por 10 minutos Plaqueamento e seleo de bactrias 1) Usando uma pipeta estril, adicione 100ul de cada um dos tubos nas placas de agar de acordo com a descrio no fundo da placa 2) Use uma nova ala para cada placa. Use a ala para espalhar o volume da placa o mximo possvel. Veja as intrues dadas por seu instrutor-veja tambm a figura.

Em 1 litro de meio LB (Luria-Bertani) h: 10g Bacto-triptone. 5g de extrato de levedura 10g NaCl. Esse o prato preferido da bactria!

Deixe as placas secando por uns 5 minutos 3) Deixe as placas a 37 0C, ou sob luz direta durante a noite. As placas devem ficar DE CABEA PARA BAIXO.

Porque usar controles em experimentos? O controle utilizado pelo cientista como uma demonstrao de que os resultados obtidos em um experimento esto dentro das possibilidades previstas e que os mesmos podem ser considerados significativos (ou no). Por exemplo, se quisermos demonstrar que o plasmdeo pGLO tem a capacidade de se inserir dentro da bactria e deste modo torn-la resistente `a ampicilina e se ao realizarmos o experimento de introduo do pGLO dentro da bactria tambm introduzimos o meio no qual est o pGLO (meio LB), como podemos demonstrar que de fato o pGLO, e no o meio LB, que vai junto com o pGLO, que proporciona a resistncia ampicilina? Se usarmos apenas o meio LB sem o pGLO para transformar a bactria, seremos capazes de dizer se o pGAL, ou o meio LB, que confere tal resistncia.

Perguntas 1) Porque as bactrias que no receberam o plasmdeo no conseguem crescer no meio contendo ampicilina?

2) Porque as bactrias da placa +DNA LB-Amp no so florescentes?

3) Porque as bactrias na placa +DNA LB-Amp-Ara so florescentes?