15

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Rancangan Penelitian Adapun jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental. Penelitian ini dirancang menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan menggunakan 6 kelompok yang terdiri dari 4 kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol. Kelompok perlakuan terdiri dari P1, P2, P3 dan P4 masing-masing pemberian ekstrak etanol kulit buah delima dengan konsentrasi 60%, 45%, 30% dan 15%. Sedangkan kelompok kontrol terdiri dari P0 dan P5 masing-masing adalah pemberian akuades sebagai kontrol negatif dan kloramfenikol sebagai kontrol positif. Jumlah pengulangan dilakukan sebanyak 4 kali sesuai dengan rumus ulangan Hanafiah (2008), sebagai berikut: (t-1)(r-1) 15 (6-1)(r-1) 15 5(r-1) 15 (r-1) 3 r4 Jadi, jumlah ulangan yang diperlukan dengan percobaan dengan 6 kelompok perlakuan minimal dilakukan sebanyak 4 kali ulangan. Pengulangan dilakukan pada waktu yang bersamaan antara perlakuan yang satu dan yang lainnya dengan menggunakan ekstrak yang sama dan isolat yang sama. Rancangan tersebut dapat dilihat pada tabel 3.1. Tabel 3.1 Rancangan Penelitian Ulangan I II III IV Perlakuan P0 P0I P0II P0III P0IV P1 P1I P1II P1III P1IV P2 P2I P2II P2III P2IV P3 P3I P3II P3III P3IV P4 P4I P4II P4III P4IV P5 P5I P5II P5III P5IV Keterangan: t = jumlah perlakuan r = jumlah ulangan

16

Keterangan : P0 P1 P2 P3 P4 P5
: Akuades

sebagai kontrol negatif

: Ekstrak etanol kulit buah delima dengan konsentrasi 60% : Ekstrak etanol kulit buah delima dengan konsentrasi 45% : Ekstrak etanol kulit buah delima dengan konsentrasi 30% : Ekstrak etanol kulit buah delima dengan konsentrasi 15% : Kloramfenikol sebagai kontrol positif

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Klinik bagian Patologi Rumah Sakit Umum Daerah dr. Zainoel Abidin (RSUDZA) sebagai tempat pengambilan sampel bakteri, di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran (FK) Universitas Syiah Kuala sebagai tempat uji aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah delima terhadap E. coli, dan di Laboratorium Kimia Organik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Syiah Kuala sebagai tempat pembuatan ekstrak kulit buah delima dan uji fitokimia ekstrak kulit buah delima. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2011-Februari 2012.

3.3 Alat dan Bahan Penelitian Alat-alat yang digunakan adalah vacum rotary evaporator, oven, labu erlenmeyer, cawan petri, gelas ukur, tabung reaksi, vortex, tabung eppedorf, rak tabung, kaca objek, jarum ose, batang pengaduk, pipet tetes, lidi penyebar, mikroskop, kompor listrik, inkubator, freezer, autoklaf, timbangan digital, lampu bunsen, sarung tangan, spektrofotometer, test plate, korek api, gunting, penggaris, aluminium foil, kapas, kertas label, kertas saring, selotip dan kertas tisu. Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak etanol kulit buah delima, isolat E. coli, media Nutrient Broth (NB), media MacConkey, media Nutrient Agar (NA), media Mueller Hinton Agar (MHA), media Sulfide Indol Motility, media Methyl Red (MR), media Triple Sugar Ion Agar (TSIA), media Simmons Citrate Agar (SCA), media urea, reagen merah metil, reagen kovacs, glyserol, alkohol 70%, akuades, etanol 96%, NaCl 0,9%, cakram antibiotik kloramfenikol,

17

kertas cakram kosong diameter 5 mm, minyak emersi, larutan kristal violet, larutan lugol, larutan safranin, reagen Mayer, reagen Dragendorf, reagen Wagner, pereaksi Libermann-Buchard, larutan FeCl3 1%, logam magnesium 0,5 mg dan larutan H2SO4.

3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Ekstrasi kulit buah delima dengan metode maserasi Buah delima yang masih segar diperoleh dari pohon yang ada di halaman FMIPA Universitas Syiah Kuala. Dipilih buah yang masih muda dengan ukuran mencakup sedang dan kecil yang berada di ujung percabangan dengan kulit berwarna hijau muda. Buah delima kemudian dibersihkan dan dikupas, lalu kulit dan isinya dipisahkan, yang diambil hanya kulitnya saja, dipotong kecil-kecil lalu diambil sebanyak 250 gram. Kemudian dikeringanginkan pada suhu kamar selama 5 hari menjadi 40 gram. Kulit tersebut dihaluskan dengan blender sehingga menjadi serbuk kering. Ekstraksi serbuk kering kulit buah delima dilakukan dengan metode maserasi menggunakan etanol 96%. Ekstrak direndam dan disaring menggunakan kertas saring. Ampasnya direndam kembali sampai 3 kali perendaman hingga diperoleh filtrat yang jernih. Masing-masing perendaman dilakukan selama 24 jam. Ekstrak dipekatkan dengan vacum rotary evaporator pada suhu 40oC hingga diperoleh ekstrak yang kental. Ekstrak padat 100% murni kemudian diencerkan dengan akuades untuk membuat stok larutan konsentrasi 60%, 45%, 30% dan 15%. Pengenceran dilakukan dengan menggunakan rumus: V1 . M1 = V2 . M2

Keterangan : V1 = Volume awal V2 = Volume yang diinginkan M1 = Konsentrasi awal M2 = Konsentrasi yang diinginkan

18

3.4.2 Uji Fitokimia Uji fitokimia dilakukan pada sampel ekstrak etanol kulit buah delima. a. Uji Alkaloid Sampel ekstrak etanol kulit buah delima digerus terpisah kemudian ditambahkan 1 ml amonia. Selanjutnya ditambahkan 10 ml kloroform, digerus kembali dan disaring. Filtrat yang terbentuk ditambahkan dengan 10 ml H2SO4 2 N lalu dikocok kuat-kuat, didiamkan sampai larutan asam sulfat dan kloroform terpisah. Lapisan asam sulfat diambil dan dipisahkan menjadi tiga bagian kedalam test plate untuk mengetahui adanya kandungan alkaloid, dipisahkan menjadi tiga bagian kedalam test plate. Positif alkaloid bila penambahan dengan reagen Mayer akan menyebabkan endapan putih, dengan reagen Dragendorf menyebabkan endapan kemerahan dan dengan reagen Wagner menyebabkan endapan berwarna coklat. b. Uji Steroid, Terpenoid, Saponin Sampel ekstrak etanol kulit buah delima kemudian diekstraksi lagi dengan dietil eter. Ekstrak dietil eter diuji dengan reagen Liberman Burchard pada test plate. Warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan warna merah menunjukkan adanya terpenoid. Residu yang tidak larut dalam dietil eter dituang ketabung reaksi dan ditambahkan dengan akuades lalu dikocok kuat-kuat. Adanya busa yang stabil selama 30 menit menunjukkan adanya saponin. c. Uji Flavonoid Sampel ekstrak etanol kental diekstraksi lagi dengan n-heksana. Residu yang terbentuk diekstraksi dengan 10 ml etanol 80%, selanjutnya ditambahkan 0,5 mg logam magnesium dan HCl 0,5 M. Warna merah muda atau ungu menunjukkan adanya flavonoid. d. Uji Tanin Sampel ekstrak etanol kulit buah buah delima dicampur dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Selanjutnya diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1-2

19

tetes pereaksi besi (III) klorida. Bila timbul warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin.

3.4.3 Sterilisasi Alat dan Bahan Alat seperti tabung reaksi, cawan petri, kapas lidi dan labu erlenmeyer disterilisasikan di dalam oven selama 2 jam dengan suhu 150oC, sedangkan bahan cair seperti media agar, akuades, NaCl 0,9% disterilisasikan di dalam autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit. Sterilisasikan jarum ose dengan menggunakan pijaran api.

3.4.4 Pembuatan Media a. Media Nutrient Broth (NB) Nutrient broth sebanyak 3,25 gram dicampurkan dengan 250 ml akuades steril, kemudian dipanaskan hingga larut. NB disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC selanjutnya dituang kedalam tabung reaksi 5 ml.

b. MacConkey Agar Agar serbuk MacConkey sebanyak 2,5 gram dicampurkan dengan 250 ml akuades steril, panaskan hingga larut. Kemudian disterilkan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC. MacConkey dituang ke dalam cawan petri secara steril 20 ml dan diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 35oC.

c. Media Nutrient Agar (NA) Agar serbuk Nutrient agar sebanyak 7 gram dicampurkan dengan 250 ml akuades steril, panaskan hingga larut. Kemudian disterilkan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC. Nutrient agar dituang ke dalam tabung reaksi 10 ml kemudian dimiringkan atau dituang ke dalam cawan petri 20 ml. Lalu diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 35oC.

d. Media Mueller Hinton Agar (MHA) Agar serbuk Mueller hinton agar sebanyak 9,5 gram dicampurkan dengan 250 ml akuades steril, panaskan hingga larut. Kemudian disterilkan menggunakan

20

autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121oC. MHA dituang ke dalam cawan petri 25 ml, tunggu hingga mengeras. Lalu inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 35oC.

3.4.5 Reidentifikasi Bakteri Escherichia coli a. Isolasi Bakteri Shigella sp. ATCC berasal dari Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) Unsyiah. Setelah itu, bakteri ditanam ke dalam Salmonella Shigella Agar (SSA) menggunakan ose bulat dengan teknik goresan kuadran (streak quadrant) hingga diperoleh koloni tunggal. Salmonella Shigella Agar yang telah ditanami bakteri diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37oC. Koloni tunggal yang tumbuh lalu dibiakkan pada media NA miring sebagai stok kultur.

b. Pemeriksaan Makroskopis Bakteri yang tumbuh dalam media Salmonella Shigella Agar

diidentifikasi secara makroskopis berdasarkan bentuk koloni, permukaan, tepi dan warna koloni.

c. Pemeriksaan Mikroskopis Pemeriksaan mikroskopis yang dilakukan adalah pewarnaan gram. Kaca benda dibersihkan dengan menggunakan alkohol 96%, kemudian membuat sediaan suspensi kuman dengan NaCl fisiologis steril pada kaca benda dengan menggunakan ose bulat steril, kemudian fiksasi 3-4 kali diatas Bunsen. Sediaan ditetesi zat warna kristal violet pada seluruh permukaan sediaan suspensi kuman dan biarkan selama 1 menit, lalu bilas dengan air yang mengalir. Selanjutnya ditetesi larutan lugol pada seluruh permukaan sediaan suspensi kuman dan biarkan selama 1 menit, lalu bilas dengan air yang mengalir. Lunturkan zat warna pada sediaan dengan alkohol 96% selama 10-15 detik, lalu bilas dengan air yang mengalir. Kemudian ditetesi zat warna safranin pada seluruh permukaan sediaan suspensi kuman dan biarkan selama 15-30 detik, lalu bilas dengan air yang mengalir. Lalu keringkan sisa-sisa air pada kaca benda dengan cara diangin-

21

anginkan. Tetesi sediaan dengan minyak emersi, lalu amati dibawah mikroskop dengan lensa objektif perbesaran 100 kali (Pelczar and Chan, 2005).

d. Uji Biokimia 1. Methyl Red (MR) Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan

diinokulasikan pada media MR dengan memasukkan ose sampai ke dalam permukaan tabung, kemudian dihomogenkan. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, lalu ditambahkan reagen merah metil sebanyak 5 tetes. Bila positif maka adanya asam ditandai dengan perubahan warna biakan menjadi warna merah yang nyata. 2. Sulfate Indol Motility (SIM) Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan

diinokulasikan pada media SIM dengan cara menusuk ose tegak lurus sampai sepertiga dasar tabung. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Lalu tambahkan 1-2 ml reagen kovacs, bila positif akan ditandai dengan adanya bentuk cincin berwarna merah pada bagian permukaan atasnya. 3. Simmons Citrate Agar (SCA) Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan diinokulasi pada media SCA dengan cara digoreskan secara zig-zag pada permukaannya. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Bila positif maka tidak ada perubahan warna. 4. Urease Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan suspensikan inokulum dengan media urea. Kocok tabung biakan dengan hati-hati agar inokulum dapat tersuspensi dengan baik pada media tersebut. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, bila positif maka ditandai dengan tidak ada perubahan warna. 5. Triple Sugar Ion Agar (TSIA) Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan inokulasikan pada media TSIA dengan cara ditusuk pada bagian bawah agar miring, lalu dilanjutkan dengan menggoreskan secara zig-zag pada bagian

22

permukaan. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, bila positif maka bakteri akan tumbuh namun tidak berubah warna.

3.4.6 Penyiapan Bakteri Uji Escherichia coli diinokulasikan ke dalam media NA yang dibuat membentuk miring dengan cara menggoreskan biakan stok E. Coli menggunakan jarum ose ke dalam media agar miring NA. Lalu diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37oC. Bakteri yang sudah diregenerasi tersebut diswab dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,9% untuk diukur kepadatannya dengan menggunakan spektrofotometer pada derajat absorpsi 0,080,1 dan panjang gelombang 625 nm. 3.4.7 Prosedur Uji Antibakteri Pelaksanaan uji aktivitas antibakteri ini menggunakan metode difusi cakram Kirby Bauer dengan cara kerja sebagai berikut : a. Escherichia coli yang dibiakkan pada NA miring diswab, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi NaCl 0,9% steril. Biakan E. Coli yang digunakan sudah diukur kepadatannya dengan menggunakan spektrofotometer pada derajat absorpsi 0,08-0,1 dan panjang gelombang 625nm. b. Kertas cakram direndam di dalam ekstrak kulit buah delima pada konsentrasi 20%, 40%, 60% dan 80%. c. Perendaman dilakukan selama 30 menit (Adnyana et al., 2004). d. Suspensi bakteri tadi diswab dengan menggunakan kapas lidi steril secara merata pada media MHA. e. Kertas cakram yang telah direndam kemudian dikeringkan agar tidak merembes pada media dan kemudian diletakkan diatas media dengan menggunakan pinset steril. f. Cakram antibiotik yang mengandung kloramfenikol 30 g (kontrol positif) dan cakram yang telah direndam akudes (kontrol negatif) diletakkan dalam media. g. Media di inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37oC.

23

h. Daerah bening disekitar cakram menunjukkan zona hambat. Diameter daerah bening yang diperoleh kemudian diukur menggunakan penggaris dalam satuan (mm).

3.5 Parameter yang diuji Parameter yang diukur adalah diameter zona hambat ekstrak etanol kulit buah delima terhadap pertumbuhan E. coli dalam satuan milimeter.

3.6 Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini terlebih dahulu dianalisis normalitas menurut Liliefors dan homogenitas keragaman. Apabila data tidak berdistribusi normal dan homogen, maka dilakukan transformasi data. Apabila normalitas dan homogenitas data juga belum terpenuhi, maka analisis data dilakukan dengan uji nonparametrik. Namun, bila data berdistribusi normal dan homogen, maka dapat dilanjutkan dengan uji Analisis Varian (ANOVA). Apabila terdapat pengaruh antara perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) (Hanafiah,2008).