Vrus

Virologia - So agentes infecciosos, no celulares. Virologistas

So parasitas intracelulares obrigatrios e infectam hospedeiros especficos

- Animais - Insectos (alguns, so vectores na transmisso a animais e humanos) - Plantas

Doenas
(impacto na Saude Pblica, na Agricultura, Economia, etc.)

Bactrias (chamam-se bacterifagos ou fagos)

- Fungos

- Outros microrganismos

Principais vias de transmisso de infecces virais aos seres humanos.

Preocupaes em Sade Pblica: - Vrus emergentes (HIV, Ebola, etc,) - Facilidade de viajar e alterao do meio Ambiente, podem contribuir para espalhar novos virus para novas reas

(Maier, Pepper e Gerba, Environmental Microbiology, Academic Presss, 2000

- Muitas epidemias de doenas virais ocorreram antes de se ter percebido a natureza dos agentes causadores.
(Ex. colonizao da Amrica pelos europeus (sec. XVI) P. ex. Varola (small pox) contribuiu para dizimar populaes nativas)

1884 Charles Chamberland (colaborador de Pasteur; inventor da autoclave) inventou um filtro de porcelana para bactrias possibilitou a 1 descoberta de um virus. 1892 Dimitri Ivanowski descobriu o virus mosaico do tabaco;
Extractos de folhas infectadas, filtrados atravs do filtro de Chamberland, causavam a doena de mosaico do tabaco em plantas saudveis.

(Tortora, Funke e Case, Microbiology an Introduction, 6th edition)

Aspectos que distinguem os virus de organismos celulares:

Organizao estrutural simples Um nico tipo de cido nucleico, DNA ou RNA Incapazes de se reproduzir fora das clulas vivas; usam a maquinaria biossinttica da clula hospedeira Parasitas intracelulares obrigatrios

A Estrutura dos virus

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

VIRIO OU PARTCULA VIRAL vrus completo, fora da clula hospedeira

Ex. Virus icosadrico

Propriedades estruturais gerais

Nucleocpside Genoma viral (1 ou mais molculas de DNA ou RNA) envolvido por camada proteica (cpside) Cpside Camada de protenas que envolve o genoma viral Protege o genoma e medeia a transferncia do virus para a clula hospedeira Constituida por muitas cpias de um ou mais tipos de unidades proteicas denominadas capsmeros (cada capsmero pode ser constituido por 5 ou 6 subunidades - protmeros). Capsmeros Unidades proteicas que se auto-associam para formar a cpside.

Tipos morfolgicos da cpside

icosadrico helicoidal

com invlucro
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

complexo

Morfologia de um virus icosadrico sem envelope (n)

Adenovirus
(Alguns causam infeces respiratrias em humanos; alguns causam tumores em animais)

Cpside icosadrica
- Poliedro regular com 20 faces triangulares com lados iguais e 12 vrtices - Cada tingulo pode conter uma ou mais unidades protecas - capsmeros - Cada capsmero contm 5 ou 6 protenas

Morfologia de um virus helicoidal sem envelope (n)

Ebola virus

Cpside helicoidal
- Com forma de tubo oco, com paredes constitudas por um ou mais tipos de protenas; p.ex. a cpside do vrus mosaico do tabaco contem apenas um tipo de subunidade proteica com 158 aminocidos - O material gentico encontra-se em espiral dentro da cpside e o tamanho desta depende do tamanho do cido nucleico

Morfologia de vrus com envelope

(Ex. muitos virus de animais, alguns de plantas e pelo menos 1 de bactrias)

- Nucleocpside (icosadrico ou helicoidal) envolvido por uma membrana externa (constituida por lpidos, protenas e hidratos de carbono) - lpidos e hidratos de carbono tm origem na membrana plasmtica ou na membrana do ncleo da clula hospedeira; as protenas so especficas do vrus - muitos possuem espiges de glicoprotenas que lhes conferem forma de aderir superfcie das clulas infectadas.

(Fago T4 / E. coli - colifago)

Vrus com estrutura complexa

- Tem componentes com estrutura icosadrica e helicoidal - Cabea icosadrica contem o genoma viral - Alguns tm caudas contrcteis, com uma estrutura em hlice e vrias fibras proteicas responsveis pela aderncia do virus superfcie da bactria - S encontrado em bacterifagos (p.ex. colifagos T2, T4 e T6 - infectam E. coli)

Genoma viral - natureza do cido nucleico

. Dimenso varivel mas pequena: maior genoma viral conhecido 670 kbp . Pode ser DNA ou RNA, em cadeia simples (ss) ou cadeia dupla (ds), linear ou circular (maior parte dos virus tm genomas lineares); alguns virus usam ambos, DNA e RNA, como material genmico em diferentes fases do seu ciclo de vida.

Em geral: Vrus de animais dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA Vrus de plantas ssRNA Vrus de bactrias dsDNA (mais usual), ssDNA, ssRNA, dsRNA

. Muitos genomas apresentam as bases azotadas caractersticas do RNA ou do DNA; outros tm bases menos ususais como hidroximetilcitosina em vez de citosina

Formao de mRNA e replicao dos genomas em (a) virus de DNA e (b) virus de RNA (passos essenciais nos ciclos de vida dos virus).
(a) (b)

Conveno (virologia): mRNA configurao plus(+); cadeia complementar configurao minus(-)) . Designao de vrus com RNA ou DNA em cadeia simples: - plus(+) - virus com cadeia no sentido positivo (a sequncia de bases do RNA genmico do virus tem a mesma orientao que a do mRNA viral) - minus(-) virus com cadeia no sentido negativo (o RNA genmico do virus complementar do mRNA viral)

De acordo com: - Natureza do hospedeiro

Classificao e taxonomia dos vrus

- Tipo e tamanho do cido nucleico - Simetria e dimetro da cpside - Nmero de capsmeros em vrus icosadricos - Presena ou no de envelope a envolver a nucleocpside - Tipo e composio (lipidos, proteinas, hidratos de carbono) do envelope (quando existente) - Propriedades imunolgicas - N de genes e mapa gentico - Modo de transmisso do vrus ao hospedeiro - Localizao intracelular do vrus na clula hospedeira (aps infeco) - Forma como o vrus sai da clula (aps replicao) - Doena causada, mtodo de transmisso, - Etc. viridae famlia (ssRNA) (dsDNA)

Ex. Retroviridae Herpesviridae

BACTERIFAGOS OU FAGOS vrus que infectam bactrias

Famlias principais
(E. coli)

Especificidade virus-hospedeiro
Depende da especificidade da ligao do virus a locais receptores na superfcie da clula hospedeira; Consoante o fago e a bactria hospedeira, os receptores podem ser: - LPS (lipopolissacrido) - protenas - cidos teicicos - flagelo - pili

(T2, T4)

(lambda, T5)

(Pseudomonas sp)

(E. coli)

(Mycoplasma sp)

PERDA DESTES RECEPTORES

Resistncia da bactria infeco pelo fago

(Pseudomonas sp)

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

REPRODUO DE FAGOS COM dsDNA Exemplo. Fago T4 / E. coli

Attachment of T4 bacteriophage virion to the cell wall of Escherichia coli and injection of DNA. (a) Landing and attachment, by the long tail fibers interacting with core polysaccharide (b) Contact of cell wall by the tail fibers (electrostatic interactions; influenced by Mg2+ e Ca2+ ions) (c) Contraction of the tail sheath and injection of the T4 genome

CICLO LTICO
Fagos virulentos Ciclo de vida culmina na lise da clula hospedeira, para libertao dos viries novos Lise enzimtica: -Endolisina (ataca peptidoglicano) -Holina (leses nas membranas celulares) - usa RNA polimerase da clula - Sintese de protenas que permitem ao fago bloquear o metabolismo da clula hospedeira,

Degradar DNA da clula hospedeira e - DNA T4 contm hidroximetilcitosina (HMC) em vez de citosina; - HMC glucosilado Glucosilao protege DNA do fago da aco de endonucleases de restrio das clulas infectadas (mecanismo de defesa contra infeco viral)

produzir cpias novas do DNA viral - Sntese de protenas do capsdeo, da cauda e outras necessrias para a montagem do virio
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

. Fase latente (entre adsoro do virus e libertao dos viries maduros): 22 min . Libertao de cerca de 100 viries a partir de 1 clula infectada por 1 virus (colifago T4)

Cultivo de vrus de bactrias (bacterifagos)

- so cultivados em culturas de clulas bacterianas - quantificao:

Bacterifagos Lticos : - Em meio lquido - Em meio lquido causam clarificao da suspenso celular de bactrias levam formao de placas (ou halos) de lise

- Em meio slido - Em meio slido

PFU Plaque Forming Units

(Madigan, Martinko e Parker, Brock Biology of microorganisms, 10th ed)

FAGOS TEMPERADOS E CICLO LISOGNICO

Ex. Fago lambda / E. coli

Excision

Induo do ciclo ltico um fenmeno raro e pode ser estimulado por radiao UV, temperaturas altas ou stresse qumico

(vantagens)

GENOMA DO FAGO

Repressor lambda
Produto do gene cI Bloqueia a transcrio dos genes do ciclo ltico, incluindo do gene cro

Proteina Cro
Envolvida na regulao dos genes do ciclo ltico Bloqueia a sintese do repressor lambda

Taxa de produo dos produtos dos genes cro e cI determina se ocorre o ciclo lisognico ou o ltico.
Induo est associada a reduo nos nveis do repressor lambda - pode ser causada por radiao UV ou qumicos que causam danos no DNA

Consequncias principais da lisogenia

1. Clulas lisognicas so imunes a reinfeco pelo mesmo fago;

2. Clulas hospedeiras lisognicas podem exibir fentipo alterado. Por exemplo: - modificao da estrutura do lipopolisacrido (LPS) de Salmonella sp. - produo de toxinas por bactrias patognicas (exotoxina da difteria por Corynebacterium diphtheriae; toxina de Staphylococcus aureus escarlatina toxina de Clostridium botulinum - botulismo) 3. Transduo

especializada

Transduo transferncia de material gentico entre bactrias mediada por virus (ver tambm transduo generalizada em aula sobre transferncia de material gentico)

Transduo especializada

Aps induo, quando o profago sofre exciso do cromossoma da clula hospedeira, uma poro deste pode permanecer ligado ao DNA do fago; aps o ciclo ltico, os fagos resultantes infectam novas clulas bacterianas e ao incorporar o seu DNA no cromossoma destas, podem transportar um ou mais novos genes que podem ser expressos pelas clulas infectadas e conduzir a alteraes fenotpicas.

(Pelczar, Chan and Krieg, Microbiology, Concepts and Aplications, 1993)

Biotech News International, Vol. 10. N1, 1-2 / 2005

(www.BiotechDaily.com)

Purificao de partculas virais: por centrifugao de gradiente de densidade

1) rotura das clulas infectadas suspensas em tampo adequado 2) Centrifugao:
MISTURA DE PARTICULAS (viries e macromolculas, organelos, etc. provenientes das clulas hospedeiras)

Particulas menos densas

Particulas mais densas

- Gradiente de sacarose linear

- Centrifugao pode separar as partculas com base na sua densidade e no seu coeficiente de sedimentao (funo do tamanho
e densidade da particula virus, macromolecula ou estrutura biolgica).
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

Purificao de partculas virais: por centrifugao diferencial

Sobrenadante, com molculas solveis

Partculas virais icosadricas

Organelos das clulas hospedeiras

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

Purificao de partculas virais: digesto enzimtica de constituintes celulares das clulas hospedeiras
P.ex. Remoo de cidos nucleicos e proteinas celulares (das clulas hospedeiras) das preparaes de viries por aco de nucleases e proteases (particulas virais completas so muito resistentes aco desses agentes)

Principais familias de virus que infectam animais

(varola)

(Hepatite B) (Herpes simplex; varicela)

(cancro)
(constipao; isolados de adenides) (raiva)

(gripe)

(Ebola; Marbourg)

(rubola)

(poliomielite; hepatite A)

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

Isolamento e cultivo de virus

O cultivo de virus requer um hospedeiro vivo. Vrus de animais: - animal (cobaia de laboratrio) - ovo de galinha fertilizado - Linhas celulares; cultura de tecidos de clulas animais

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

As clulas infectadas podem sofrer degenerescncia, observvel por microscopia (EFEITO CITOPTICO)

As clulas infectadas por CERTOS VIRUS tambm podem sofrer LISE quando lisam forma-se uma rea, localizada, de destruio denominada placa (HALO DE LISE)

Photomicrograph of a cell culture Cell cultures in monolayers grown on a Petri plate and plaques due to virus-induced cell lysis

Efeitos possveis da infeco por virus em clulas animais hospedeiras

(Ex. Cancro)

(Ex. hepatite A)

(Ex. sarampo; hepatite B; papeira; rubola, gripe)

(Ex. Herpes simplex virus; varicela; citomegalovirus)

Virus de animais
Penetrao do virus na clula hospedeira
1.

Ex. poliomaviridae

Plasma membrane

2.

Plasma membrane
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

Ex. HIV

3.

Ex. Gripe (influenza)

Endossome

citoplasm
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

(Tortora, Funke e Case, Microbiology an Introduction, 6th edition)

Movimento de um vrus no citoplasma de uma clula

Libertao de um virus com invlucro (Ex. influenza) - por gemulao da membrana citoplasmtica da clula hospedeira
1) Hemaglutidina e neuraminidase (protenas virais) so inseridas na membrana plasmtica da clula hospedeira 2) nucleocpside liga-se membrana e proteinas da membrana (a verde) so afastadas 3) membrana sofre gemulao e liberta virio maduro

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

Neuraminidase enzima que ajuda o virus a penetrar clulas do epitlio respiratrio do hospedeiro infectado Hemaglutinina permite ao virus aderir aos glbulos vermelhos do sangue causando a aglutinao destes; participa na adsoro do virus clula hospedeira.

(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

Diagrama simplificado do ciclo de vida de virus Influenza ( negative ssRNA)

. Entrada por endocitose e transferncia da molcula (-) ssRNA viral para o nucleo da clula infectada; . Transcrio do RNA viral (passo 1) (molculas RNA da clula hospedeira so cortadas na extermidade 5 e os fragmentos resultantes (10-13 nucleotideos) capped so usados como iniciadores (primers) na sntese de mRNA viral (+)) mRNA viral medeia: . Passos A - sntese da RNA Polimerase (replicase PBI, que cataliza a replicao do RNA viral) e sntese das protenas da cpside (NP); . Passos B sntese das protenas do envelope externo do novo virus, HA hemaglutinina e NA Neuramidase, que so inseridas na membrana citoplasmtica da clula hospedeira. . Replicao do RNA viral (passo 2) (A replicase viral (PBI) converte o (-)ssRNA viral numa molcula de RNA em cadeia dupla, que designada forma replicativa, e a cadeia (+) desta medeia a sntese de vrias cpias de novo RNA viral (-ssRNA). . Associao de cpias novas da cpside e do RNA viral. (Passos C) . Sada dos viries maduros da clula por gemulao

FIG. 18.7
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)

RETROVIRUSES
Retroviruses are RNA viruses
that replicate through a DNA intermediate. The retrovirus called human immuno deficiency virus (HIV) causes AIDS. The retrovirus virion contains an enzyme, reverse transcriptase, that copies the information from its RNA genome into DNA, a process called reverse transcription. Structure of a retrovirus The retrovirus DNA can be transcribed to yield mRNA (and new genomic RNA) Genetic map of a typical retrovirus genome
Gag large primary gag protein core proteins (due to protease activity) Pol reverse transcriptase and integrase Env envelope proteins R direct repeats (replication process) Some retroviruses have a 4th gene envolved in cellular transformation and cancer

ssRNA(+) ssDNA dsDNA mRNA (ssRNA +) or may remain in a latent state. Examples of retroviruses: - Some exist that cause cancer - HIV human immunodeficiency virus (infects a specific kind of T lymphocyte; immune system)

Processo de replicao em retrovirus:

(so virus com envelope; a partcula viral contm enzimas: transcriptase reversa, integrase de DNA e protease).
Passos principais:
Entrada na clula por fuso entre o envelope do virus e a membrana plasmtica da clula, em locais da memebrana plasmtica com receptores especficos; o envelope do virus fica na membrana plasmtica, e o nucleocpside, contendo o genoma e as enzimas, libertado no citoplasma; Transcrio reversa do ssRNA em dsRNA, por aco da transcriptase reversa viral, e entrada do dsDNA resultante no ncleo da clula hospedeira; Integrao do DNA retroviral (Provirus) no genoma da clula hospedeira (pode permanecer nesse estado estvel indefinidamente); Transcrio do DNA retroviral, levando formao de molculas de mRNA viral e do genoma viral (ssRNA); Montagem e encapsidao do RNA genmico em nucleocpsides, no citoplasma; Aquisio do envlucro na membrana plasmtica e sada do virus completo por gemulao. R direct repeats LTR Long terminal repeats

AGENTES QUIMIOTERAPUTICOS ANTIVIRAIS

Genricamente, drogas antivirais clinicamente efectivas incluem anlogos de nuclesidos e outras drogas que inibem a polimerizao de cidos nucleicos e a replicao do genoma do virus.

Inibidores de proteases interferncia nos passos de maturao do virus Anlogos de nuclesidos inibio do enlongamento da cadeia de cidos nucleicos virais Interfero paragem do processo de replicao viral; so glicoprotenas de baixo peso molecular (17.000 Da) que so produzidas pelas clulas animais em resposta infeco por certos virus; as molculas de interfero induzem a sntese de protenas antivirais na clula infectada que especificamente inibem o processo de traduo do mRNA do vrus.

(Lim, D, Microbiology, 2nd ed, 2002, WCB/McGraw-Hill)